KR20220054689A - 재조합적으로 조작된, 리파제/에스테라제-결핍 포유동물 세포주 - Google Patents

재조합적으로 조작된, 리파제/에스테라제-결핍 포유동물 세포주 Download PDF

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Abstract

리파제/에스테라제의 감소된 발현 및/또는 활성을 갖는 포유동물 세포주, 및 그를 생산하는 방법이 제공된다. 또한, 개선된 폴리소르베이트 안정성을 갖는, 폴리소르베이트 및 상기 포유동물 세포에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 조성물이 제공된다.

Description

재조합적으로 조작된, 리파제/에스테라제-결핍 포유동물 세포주
본 발명은 조작된 포유동물 세포주, 그를 생산하는 방법, 상기 세포주에서 재조합 단백질을 생산하는 방법 및 그에서 생산된 재조합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포와 같은 포유동물 세포는 치료 단백질, 펩티드 및 모노클로날 항체 (mAb)를 포함한 재조합 단백질을 생산하기 위해 바이오제약 산업에서 널리 사용된다. 바이오산물 제조 공정에서, 재조합 단백질을 함유하는 안전하고 효과적인 약물, 진단제 및/또는 연구 시약 산물을 생산하기 위해서는 부수적으로 생산된 숙주 세포 단백질 (HCP)을 제거하거나 또는 감소시켜야 한다. 바이오산물 제조에서 재조합 단백질을 정제하기 위해 다양한 정제 기술이 이용되었다. 그러나, HCP는 포유동물 세포에서 생산된 재조합 단백질로부터 분리하기 어려울 수 있다. 따라서, HCP는, 특히 치료 바이오산물의 제조를 위한 재조합 단백질의 생산에 중대한 도전과제를 제시할 수 있다. 바이오산물 제조에 사용되는 포유동물 세포에서 문제가 있는 HCP의 발현 또는 활성을 감소시키는 방법은 재조합 단백질을 제조하는데 필요한 정제 공정의 복잡성을 크게 감소시킬 수 있다. 감소된 HCP를 갖는 세포주를 사용하면 종종 더 안정하고/거나 더 안전하고/거나 더 효과적인 재조합 단백질-기반 약물, 진단제, 및/또는 진단 연구 시약이 생산된다.
재조합 단백질 산물의 생산에서, 폴리소르베이트는 종종 제조, 수송, 및 보관 동안 단백질의 안정성을 개선하기 위해 바이오의약 제형에 사용된다. 폴리소르베이트는, 특히 계면 응력 및 활성 성분의 표면 점착에 기인하여 응집 및 입자 형성을 감소시킴으로써 바이오산물의 안정성을 개선할 수 있다. 그러나, 특정 리파제/에스테라제의 존재 하에 폴리소르베이트 (폴리옥시에틸렌 소르비탄의 지방산 에스테르)는 분해되어 장쇄 지방산을 방출할 수 있다. 이것은 예를 들어 에스테르 가수분해에 의해 발생할 수 있다. 폴리소르베이트 분해는 활성 제약 성분 (API)을 보호하는데 있어서 계면활성제의 효과를 감소시키고 시간 경과에 따라 제형을 혼탁하게 하고 이에 입자를 형성하여 산물을 부적합하게 하고 저장 수명을 제한할 수 있으며, 폴리소르베이트 분해 산물은 환자 안전 위험에 대한 위험을 나타낼 수 있다. 폴리소르베이트 세제의 효소적 분해를 담당하는 세포 리파제/에스테라제를 감소시키거나 또는 제거함으로써, 폴리소르베이트 세제를 함유하는 재조합적으로 생산된 바이오산물 제형의 저장 수명이 증가될 수 있다. 증가된 저장 수명은 폐기물을 감소시키고 유통망을 용이하게 하는 재조합 산물의 효율적인 공급에 중요하다.
국제 특허 출원 공개 WO 2017/053482, WO 2016/138467, WO 2018/039499, 및 WO 2015/095568은 포유동물 세포에서 다양한 리파제/에스테라제를 포함하는 문제가 있는 HCP의 발현을 감소시키는 방법을 기재한다. 그러나, 어떤 리파제/에스테라제가 폴리소르베이트 분해와 관련된 특정 문제를 일으키는지는 종종 불분명하다. 따라서, 재조합 단백질 생산 방법 및 폴리소르베이트 함유 바이오산물 제형에서 잔류 포유동물 세포 리파제/에스테라제 활성의 문제를 보다 효과적으로 해결하는 조작된 리파제/에스테라제-결핍 포유동물 세포에 대한 큰 요구가 남아 있다. 본 발명은, 특히, 상당히 적은 폴리소르베이트-분해 숙주 세포 단백질 오염물을 갖는 바이오산물의 제조를 가능하게 하여 폴리소르베이트 함유 바이오산물 제형에서 안정성을 상당히 개선하는 유전자 조작된 숙주 세포를 제공한다.
한 측면에서, 적어도 하나의 내인성 팔미토일-단백질 티오에스테라제 (PPT), 및 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 A2 및 포스포리파제 D로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP의 감소된 발현 및/또는 활성을 갖는 포유동물 세포가 제공된다.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 단백질 제형에서 폴리소르베이트 분해를 감소시키는 방법이 제공된다:
(a) 숙주 세포를 변형시켜 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
(b) 숙주 세포를 변형시켜 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 D3 (PLD3) 및/또는 포스포리파제 A2 (LPLA2)의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
(c) 세포를 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;
(d) 숙주 세포로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 분획을 추출하는 단계;
(e) 단백질 분획을 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
(f) 매질로부터 관심 단백질을 수집하는 단계;
(g) 바이오산물을 지방산 에스테르와 조합하는 단계; 및
(h) 임의적으로, 버퍼를 첨가하는 단계; 및
(i) 임의적으로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하는 단계.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 단백질 제형에서 응집 또는 입자 형성을 감소시키는 방법이 제공된다:
(a) 숙주 세포를 변형시켜 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
(b) 숙주 세포를 변형시켜 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 D3 (PLD3) 및/또는 포스포리파제 A2 (LPLA2)의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
(c) 세포를 관심 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;
(d) 숙주 세포로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 분획을 추출하는 단계;
(e) 단백질 분획을 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
(f) 매질로부터 관심 단백질을 수집하는 단계; 및
(g) 관심 단백질을 지방산 에스테르와 조합하는 단계; 및
(h) 임의적으로, 버퍼를 첨가하는 단계; 및
(i) 임의적으로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하는 단계.
또 다른 측면에서, 하기 단계를 포함하는, 안정한 제형화된 바이오산물을 생산하는 방법이 제공된다:
(a) 숙주 세포를 변형시켜 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
(b) 숙주 세포를 변형시켜 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 D3 (PLD3) 및/또는 포스포리파제 A2 (LPLA2)의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
(c) 세포를 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;
(d) 숙주 세포로부터 바이오산물을 포함하는 단백질 분획을 추출하는 단계;
(e) 단백질 분획을 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
(f) 매질로부터 바이오산물을 수집하는 단계;
(g) 바이오산물을 지방산 에스테르와 조합하는 단계;
(h) 임의적으로, 버퍼를 첨가하는 단계; 및
(i) 임의적으로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하는 단계.
본원에 사용된 용어 "항체"는 항원에 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 항체의 실시양태는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 항체, 또는 접합된 항체를 포함한다. 항체는 임의의 부류 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA) 및 임의의 하위부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)일 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 항체는 4개의 폴리펩티드 쇄: 쇄간 디술피드 결합을 통해 가교된 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)로 구성된 이뮤노글로불린 G (IgG) 유형 항체이다. 4개의 폴리펩티드 쇄 각각의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100-125개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 4개의 폴리펩티드 쇄 각각의 카르복실 말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. IgG 이소타입은 하위부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로 추가로 구분될 수 있다.
VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 더 세분화될 수 있다. CDR은 단백질의 표면에 노출되어 있으며, 항원 결합 특이성에 대한 항체의 중요한 영역이다. 각각의 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복실-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된다. 본원에서 중쇄의 3개의 CDR은 "HCDR1, HCDR2 및 HCDR3"으로 지칭되고, 경쇄의 3개의 CDR은 "LCDR1, LCDR2 및 LCDR3"으로 지칭된다. CDR은 항원과 특이적 상호작용을 형성하는 대부분의 잔기를 함유한다. CDR에 대한 아미노산 잔기의 할당은 카바트(Kabat) (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), 코티아(Chothia) (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)), 노쓰(North) (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)), 또는 IMGT (www.imgt.org에서 사용할 수 있는 인터내셔널 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) 데이터베이스; 문헌 [Lefranc et al., Nucleic Acids Res. 1999; 27:209-212] 참조)에 기재된 것들을 포함하여 널리 공지된 계획에 따라 수행될 수 있다.
본 개시내용의 실시양태는 또한 Fc 단편, 또는 본원에 사용되는 바와 같이 항원 또는 항원의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 능력을 보유하는 항체의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 단편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 단편, scFv 항체 단편, scFab, 디술피드-연결된 Fvs (sdFv), Fd 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 항체 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "지방산 히드롤라제" 또는 "FAH"는 카르보닐 기를 절단하여 카르복실산이 친지성 또는 그렇지 않으면 소수성인 R-기를 포함하는 카르복실산 산물을 생산하는 임의의 가수분해 효소를 지칭하도록 의도된다. 경우에 따라, 카르복실산 산물은 지방산이다.
용어 "폴리소르베이트"는 폴리에톡실화된 소르비탄의 지방산 에스테르인 비이온성 계면활성제를 지칭한다. 바이오의약 제형에 사용되는 폴리소르베이트의 예는 폴리소르베이트 80 (PS80), 폴리소르베이트 20 (PS20), 폴리소르베이트 40 (PS40), 폴리소르베이트 60 (PS60), 폴리소르베이트 65 (PS65), 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 제약 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 본 발명의 조성물 중 중량으로 약 0.01% 내지 약 1%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.10%, 보다 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.05%, 보다 더 바람직하게는 약 0.02% 내지 약 0.05%일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "리파제/에스테라제"는 "에스테라제" 및 "리파제" 둘 다로 이루어진 포유동물 세포 효소의 군을 의미하도록 의도된다. "에스테라제"는 지방산 에스테르를 지방산 및 알콜로 절단하는 지방산 히드롤라제의 아속이다. "리파제"는 지질 (지방, 왁스, 스테롤, 글리세리드 및 인지질)을 절단하는 에스테라제의 아속이다. "포스포리파제"는 인지질을 절단하는 리파제의 아속이다.
팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1)은 팔미토일 단백질 티오에스테라제 계열의 구성원이며, 리소좀 분해 동안 지질-변형된 단백질의 이화작용에 관여하고 단백질의 시스테인 잔기로부터 지방산 팔미테이트로부터 형성된 티오에스테르를 절단하는 리소좀 효소이다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 PPT1은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PPT1은 서열식별번호: 8의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다. 리소좀 리파제, 리파제 A, 리소좀 산 및 콜레스테롤 에스테라제로도 공지된 리소좀 산 리파제 (LAL)는 리소좀에서 기능하는 세포내 리파제이다. LAL은 콜레스테릴 에스테르 결합 절단을 촉매한다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 LAL은 서열식별번호: 2의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LAL은 서열식별번호: 7의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
지단백질 리파제 이소형 X2 (본원에서 LPL로 지칭됨)는 실질 세포에 의해 분비되고 모세관 내강의 내피 세포와 관련된 글리코실화된 동종이량체이다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 LPL은 서열식별번호: 3의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LPL은 서열식별번호: 6의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
그룹 XV 리소좀 포스포리파제 A2 이소형 X1 (본원에서 LPLA2로 지칭됨)은 주요 지질-대사 효소 계열의 구성원이며, 막 인지질의 sn-2 위치로부터 지방산을 절단한다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 LPLA2는 서열식별번호: 4의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, LPLA2는 서열식별번호: 5의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
PLD3은 포스포리파제 D (PLD) 지질-신호전달 효소 슈퍼계열의 구성원이다. PLD 계열 구성원은 포스파티딜콜린을 가수분해하여 포스파티드산 및 콜린을 제공하는 것으로 공지되어 있다. PLD3은 다른 PLD 계열 구성원 (예를 들어, PLD1 및 PLD2)에서 포스포디에스테르 가수분해 활성을 부여하는 것으로 나타난 HKD 모티프를 보유하는 N-글리코실화된 유형 II 막횡단 단백질이다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 PLD3은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PLD3은 서열식별번호: 10의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
용어 "포유동물 세포" 및 "숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 재조합 DNA 기술을 이용하여 바이오산물의 생산에 일반적으로 사용되는 포유동물 세포를 지칭한다. 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 배아 신장 293 (HEK 293), 및 NS0 및 Sp2/0 세포를 포함하는 마우스 골수종 세포는 단백질 발현을 위해 일반적으로 사용되는 포유동물 세포이다. 바람직하게는, 포유동물 세포는 CHO-K1, CHO pro-3, DUKX-X11, DG44, CHOK1SV 또는 CHOK1SV GS-KO를 포함하나 이에 제한되지는 않는 CHO이다. 모 세포주는 또한 재조합 바이오산물 폴리펩티드의 중요한 품질 속성 또는 다른 번역후 변형, 또는 재조합 바이오산물을 코딩하는 유전자의 발현에 영향을 미치는 유전자의 삽입, 녹-아웃 또는 녹-다운에 의해 변형될 수 있다. 실시양태에서, 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포이다. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 CHO-K1 세포, CHOK1SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHO-S, CHO GS 녹-아웃 세포 (글루타민 신테타제), CHOK1SV FUT8 녹-아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래된 세포이다. CHO GS 녹-아웃 세포 (예를 들어, GSKO 세포)는, 예를 들어, CHO-K1SV GS 녹아웃 세포 (론자 바이올로직스, 인크.(Lonza Biologics, Inc.))이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는, 예를 들어, 포텔리전트(Potelligent)® CHOK1SV FUT8 녹-아웃 (론자 바이올로직스, 인크.)이다. 실시양태에서, 숙주 세포는 HeLa, MDCK, Sf9, Sf21, Tn5, HT1080, NB324K, FLYRD18, HEK293, HEK293T, HT1080, H9, HepG2, MCF7, Jurkat, NIH3T3, PC12, PER.C6, BHK (베이비 햄스터 신장), VERO, SP2/0, NS0, YB2/0, Y0, EB66, C127, L 세포, COS (예를 들어, COS1 및 COS7), QC1-3, CHOK1, CHOK1SV, 포텔리전트™ (CHOK1SV FUT8-KO), CHO GS 녹아웃, Xceed™ (CHOK1SV GS-KO), CHOS, CHO DG44, CHO DXB11, 또는 CHOZN 세포, 또는 이들로부터 유래된 임의의 세포이다.
본원에서 용어 "모 세포주"는 단백질 발현을 조작하기 위해 일반적으로 사용되는 비-트랜스제닉 단백질 산물 발현 포유동물 세포를 지칭한다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 모 세포주는 CHO, HEK293, 또는 NS0 세포주이다. 바람직하게는, 모 세포주는 GS-CHO (CHOK1SV 또는 CHOK1SV GS-KO) 세포주를 포함하나 이에 제한되지는 않는 CHO 세포주이다.
용어 "산물 발현 세포주"는 적어도 하나의 바이오산물을 코딩하는 하나 이상의 유전자가 삽입되고 이러한 단백질 또는 단백질들을 발현할 수 있는 "모 세포주"를 지칭한다. 바람직하게는, "산물 발현 세포주"는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 발현한다.
용어 "indel"은 세포의 게놈에서 핵산 염기의 삽입 또는 결실을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "바이오산물"은 재조합 DNA 기술을 이용하여 유전자 조작된 포유동물 세포로부터 유래되는 관심 재조합 단백질-기반 산물을 지칭한다. 예를 들어, 바이오산물은 항체, 그의 항원-결합 단편, 백신, 성장 인자, 시토카인, 호르몬, 펩티드, 효소, 융합 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 바이오산물은 치료, 진단, 산업, 및/또는 연구 적용에 유용하다.
용어 "불활성화된 유전자"는 1) 비변경된 야생형 유전자에 의해 원래 코딩되는 단백질을 검출가능한 수준으로 발현하지 않고/거나; 2) 변경된 유전자에 의해 코딩되는 단백질이 변경되지 않은 야생형 유전자에 의해 원래 코딩되는 단백질과 비교하여 표현형적으로 비-기능적인 방식으로 변경된 유전자를 지칭한다.
용어 "파괴된 유전자"는 1) 원래 코딩되는 변경되지 않은 야생형 유전자에 의한 단백질의 발현이 감소되고/거나, 2) 변경된 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성이 비변경된 야생형 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 활성과 비교하여 감소되는 방식으로 변경된 유전자를 지칭한다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 표지 성분과의 접합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함) 뿐만 아니라 관련 기술분야에 공지된 다른 변형을 함유하는 단백질도 정의 내에 포함된다. 단백질의 예는 항체, 펩티드, 효소, 수용체, 호르몬, 조절 인자, 항원, 결합제, 시토카인, Fc 융합 단백질 (예를 들어, 관심 펩티드/단백질에 유전자조작으로 연결된 IgG의 Fc 도메인), 이뮤노어드헤신 분자 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 측면에서, 적어도 하나의 내인성 팔미토일-단백질 티오에스테라제 (PPT), 및 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 A2 및 포스포리파제 D로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP의 감소된 발현 및/또는 활성을 갖는 포유동물 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 포유동물 세포는 적어도 하나의 바이오산물을 발현하도록 추가로 변형된다. 바이오산물은, 예를 들어, 1) 폴리펩티드, 2) 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 단편, 3) Fc-융합 단백질을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단백질-단백질 융합물일 수 있다.
본 발명의 한 측면에서, 내인성 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1), 및 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 A2 (LPLA2) 및 포스포리파제 D3 (PLD3)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP의 감소된 발현 및/또는 활성을 갖는 포유동물 세포가 제공된다.
본 발명의 한 측면에서, 리소좀 산 리파제 (LAL) 단백질, 지단백질 리파제 (LPL) 단백질, 포스포리파제 A2 (LPLA2) 단백질 및 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에서의 변형을 가지며, 여기서 변형은 상기 변형 중 어떠한 것도 갖지 않는 세포의 발현 수준에 비해 변형을 갖는 세포에서의 LAL 단백질, LPL 단백질, LPLA2 단백질 및 PPT1 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인 포유동물 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 포유동물 세포는 적어도 하나의 바이오산물을 발현하도록 추가로 변형된다. 바이오산물은, 예를 들어, 1) 폴리펩티드, 2) 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 그의 단편, 또는 3) Fc-융합 단백질일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 내인성 PPT, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 폴리소르베이트 분해 HCP를 코딩하는 세포의 유전자가 변형되어 내인성 PPT1 및 다른 선택된 HCP의 발현 및/또는 활성이 감소된 것인 포유동물 세포가 제공된다. 바람직하게는, 내인성 PPT1, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP의 활성 및/또는 발현이 실질적으로 감소되거나 완전히 제거되었다. 또 다른 측면에서, 내인성 PPT1, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 코딩하는 유전자가 변형되어 이들 HCP의 발현 및/또는 활성이 감소된 것인 포유동물 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 바람직하게는, 내인성 PPT1, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP의 활성 및/또는 발현이 실질적으로 감소되거나 완전히 제거되었다. 본 발명의 또 다른 측면에서 본원에 기재된 바와 같은 포유동물 세포의 실시양태에서 재조합 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 포유동물 세포 실시양태로부터 생산된 물질은 가수분해적 폴리소르베이트 분해를 전혀 나타내지 않거나 상당히 감소된 가수분해적 폴리소르베이트 분해를 나타내고, (예를 들어, 지질분해 활성 검정으로) 본질적으로 어떠한 관련 리파제 활성도 측정될 수 없다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포로부터 생산된 바이오산물은 어떠한 변형도 갖지 않는 본질적으로 유사한 세포에서 생산된 동일한 바이오산물의 폴리소르베이트 분해 활성에 비해 실질적으로 감소된 폴리소르베이트 분해 활성을 갖는 단백질 A-결합 분획을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상응하는 비변형된 산물 발현 세포주에서 생산된 동일한 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에 비해 본 발명의 산물 발현 세포주에서 생산된 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에서의 감소는 약 20% 초과, 25% 초과, 약 30% 초과, 약 35% 초과, 약 40% 초과, 약 45% 초과, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 또는 약 80% 초과이다. 일부 실시양태에서, 상응하는 비변형된 산물 발현 세포주에서 생산된 동일한 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에 비해 본 발명의 산물 발현 세포주에서 생산된 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에서의 감소는 20% 초과, 25% 초과, 30% 초과, 35% 초과, 40% 초과, 45% 초과, 50% 초과, 55% 초과, 60% 초과, 65% 초과, 70% 초과, 75% 초과, 또는 80% 초과이다.
일부 실시양태에서, 상응하는 비변형된 산물 발현 세포주에서 생산된 동일한 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에 비해 본 발명의 산물 발현 세포주에서 생산된 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에서의 감소는 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 75%, 약 35% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 65%, 또는 약 45% 내지 약 60%이다.
일부 실시양태에서, 상응하는 비변형된 산물 발현 세포주에서 생산된 동일한 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에 비해 본 발명의 산물 발현 세포주에서 생산된 바이오산물로부터 발생하는 온전한 폴리소르베이트의 분해에서의 감소는 20%-80%, 30%-75%, 35%-70%, 40%-65%, 및 45%-60%이다.
본 발명의 한 측면에서, 내인성 PPT1을 코딩하는 유전자, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 코딩하는 유전자(들)를 표적화하기 위해 유전자-편집 방법이 이용되며, 이는 예를 들어 게놈 로커스의 변형, 삽입 또는 결실에 기인하여 이들을 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 내인성 숙주 세포 단백질인 PPT1, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP의 하나 또는 둘 다의 대립유전자는 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 게놈으로부터 녹아웃된다. 예를 들어, 유전자-편집 방법은 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN), 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부 (CRISPR), 전사 활성화제-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 및 메가뉴클레아제 시스템의 사용을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 한 측면에서, LAL 단백질, LPL 단백질, LPLA2 단백질 및 내인성 PPT1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에서의 변형을 포함하는 재조합적으로 조작된 포유동물 세포가 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 변형은 변형이 결여된 세포, 예를 들어, 야생형 포유동물 세포의 발현 수준과 비교하여 LAL 단백질, LPL 단백질, LPLA2 단백질 및 PPT1 단백질의 발현 수준을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자는 유전자 결실에 의해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화된다. 본원에 사용된 "유전자 결실"은 유전자로부터 또는 유전자에 근접한 DNA 서열의 적어도 일부의 제거를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유전자 결실되는 서열은 유전자의 엑손 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 결실되는 서열은 유전자의 프로모터 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 결실되는 서열은 유전자의 플랭킹 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 결실되는 서열은 표적화된 HCP의 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자 서열의 일부는 표적 HCP 유전자, 또는 표적 HCP 유전자에 비교적 근접한 영역으로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 완전한 표적 HCP 유전자 서열은 염색체로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 포유동물 세포는 표적 HCP 유전자에 근접한 유전자 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자는 유전자 결실에 의해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화되며, 여기서 유전자 서열에서 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 결실은 비-기능적 유전자 산물을 생산한다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자는 유전자 결실에 의해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화되며, 여기서 유전자 서열의 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실은 원래의 유전자 산물 기능 또는 활성을 더 이상 갖지 않거나 또는 기능장애가 있는 유전자 산물을 생산한다.
일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화된다. 본원에 사용된 "유전자 부가" 또는 "유전자 치환"은 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 삽입 또는 치환을 포함하는 표적 HCP 유전자 서열의 변경을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자의 인트론 서열이 변경된다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자의 엑손 서열이 변경된다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자의 프로모터 서열이 변경된다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자의 플랭킹 서열이 변경된다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP의 신호 펩티드를 코딩하는 서열이 변경된다. 일부 실시양태에서, 하나의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍이 표적 HCP 유전자 서열에 부가된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 연속적인 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍이 표적 HCP 유전자 서열에 부가된다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자는 유전자 부가 또는 치환에 의해 불활성화되며, 여기서 표적 HCP 유전자 서열로 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기쌍의 부가 또는 치환은 비-기능적 유전자 산물을 생산한다. 일부 실시양태에서, 표적 HCP 유전자는 유전자 불활성화에 의해 불활성화되며, 여기서 표적 HCP 유전자 서열에 적어도 하나의 뉴클레오티드의 편입 또는 치환은 원래의 유전자 산물 기능 또는 활성을 더 이상 갖지 않거나 또는 기능장애가 있는 유전자 산물을 생산한다.
일반적으로, CRISPR 시스템은 Cas9와 같은 카스파제 단백질, 및 관심 서열에 상보적인 가이드 서열로 지칭되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 서열을 포함한다. 카스파제 및 RNA 서열은 포유동물 세포의 DNA 서열을 확인하는 복합체를 형성하고, 이어서 카스파제의 뉴클레아제 활성은 DNA 가닥의 절단을 허용한다. 카스파제 이소타입은 단일-가닥 DNA 또는 이중-가닥 DNA 뉴클레아제 활성을 갖는다. 가이드 RNA 서열 및 CRISPR 시스템에 사용되는 가이드 RNA 서열의 수의 설계는 유전자의 특정 스트레치의 제거 및/또는 DNA 서열의 부가를 허용한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 CRISPR, TALEN, ZFN 및 메가뉴클레아제 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 게놈 편집 시스템을 이용하여 내인성 PPT1을 코딩하는 유전자, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 코딩하는 유전자(들)를 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, TALEN 시스템은 DNA 서열의 인식 및 후속적인 이중-가닥 DNA 절단을 허용하는 하나 이상의 제한 뉴클레아제 및 2개 이상의 단백질 복합체를 포함한다. TALEN 시스템의 단백질 복합체는 각각 특정 뉴클레오티드를 인식하는 다수의 전사 활성화제-유사 이펙터 (TALE), 및 제한 뉴클레아제의 도메인을 포함한다. 일반적으로, TALEN 시스템은, 제한 뉴클레아제의 2개의 도메인 (각각의 단백질 복합체에 대해 하나씩)이 활성 뉴클레아제를 형성하고 특정 DNA 서열을 절단하는 것을 가능하게 하는 방식으로, 각각 TALE 및 제한 뉴클레아제의 도메인을 포함하는 2개의 단백질 복합체가 DNA 서열에 개별적으로 결합하도록 설계된다. 단백질 복합체의 수 및 TALEN 시스템에서 절단될 서열의 설계는 유전자의 특정 스트레치의 제거 및/또는 DNA 서열의 부가를 허용한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 내인성 PPT1을 코딩하는 유전자, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 코딩하는 유전자(들)를 TALEN 시스템을 이용하여 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 감소된 수준의 내인성 PPT1 및 감소된 수준의 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 갖는 포유동물 세포를 생산하는 방법은, 내인성 PPT1, 및 다른 표적 HCP 유전자 (즉, LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3) 중 적어도 하나를 TALEN 시스템을 이용하여 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, ZFN 시스템은 DNA 서열의 인식 및 후속적인 이중-가닥 DNA 절단을 허용하는 하나 이상의 제한 뉴클레아제 및 2개 이상의 단백질 복합체를 포함한다. ZFN 시스템의 단백질 복합체는 각각 특정 뉴클레오티드 코돈을 인식하는 다수의 징크 핑거, 및 제한 뉴클레아제의 도메인을 포함한다. 일반적으로, ZFN 시스템은, 제한 뉴클레아제의 2개의 도메인 (각각의 단백질 복합체에 대해 하나씩)이 활성 뉴클레아제를 형성하고 특정 DNA 서열을 절단하는 것을 가능하게 하는 방식으로, 각각 징크 핑거 및 제한 뉴클레아제의 도메인을 포함하는 2개의 단백질 복합체가 DNA 서열에 개별적으로 결합하도록 설계된다. 단백질 복합체의 수 및 ZFN 시스템에서 절단될 서열의 설계는 유전자의 특정 스트레치의 제거 및/또는 DNA 서열의 부가를 허용한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 내인성 PPT1을 코딩하는 유전자, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 코딩하는 유전자(들)를 ZFN 시스템을 이용하여 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 감소된 수준의 내인성 PPT1 및 감소된 수준의 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 갖는 포유동물 세포를 생산하는 방법은, 내인성 PPT1, 및 다른 표적 HCP 유전자 (즉, LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3) 중 적어도 하나를 ZFN 시스템을 이용하여 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, 메가뉴클레아제 시스템은 DNA 서열의 인식 및 후속적인 이중-가닥 DNA 절단을 가능하게 하는 하나 이상의 메가뉴클레아제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 내인성 PPT1을 코딩하는 유전자, 및 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 코딩하는 유전자(들)를 메가뉴클레아제 시스템을 이용하여 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 감소된 수준의 내인성 PPT1 및 감소된 수준의 LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 HCP를 갖는 포유동물 세포를 생산하는 방법은, 내인성 PPT1, 및 다른 표적 HCP 유전자 (즉, LAL, LPL, LPLA2 및 PLD3) 중 적어도 하나를 메가뉴클레아제 시스템을 이용하여 편집, 파괴, 및/또는 불활성화시키는 단계를 포함한다.
본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 이들 세포에서 생산된 항체의 글리코실화 패턴을 변경하기 위한 추가의 게놈 변형을 포함할 수 있다. 감소된 푸코실화와 같은 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 항체-의존적 세포 세포독성 (ADCC) 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 예를 들어, FUT8 (푸코실트랜스퍼라제 8, 또는 a-1,6-푸코실트랜스퍼라제)의 대립유전자 둘 다가 녹아웃된 숙주 세포는 ADCC 활성이 향상된 항체를 생산할 수 있다 (미국 특허 번호 6946292 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 항체의 푸코실화를 감소시키는 유전자 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는, 예를 들어, FUT8 게놈 로커스의 변형, 삽입 또는 결실로 인해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화된 FUT8 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, FUT8의 하나 또는 둘 다의 대립유전자는 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 게놈으로부터 녹아웃된다. 이러한 FUT8 녹아웃 숙주 세포에서 생산된 항체는 증가된 ADCC 활성을 가질 수 있다. 글리코실화를 담당하는 다른 효소는 GDP-만노스 4,6-데히드라타제, GDP-케토-6-데옥시만노스 3,5-에피머라제 4,6-리덕타제, GDP-베타-L-푸코스 피로포스포릴라제, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III, 및 푸코키나제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 이들 효소 중 하나 이상을 코딩하는 불활성화된 유전자를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 FUT8은 서열식별번호: 11의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 또한 이들이 발현하는 재조합 단백질의 안정성에 영향을 미치는 추가적인 게놈 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 카텝신 D (CatD)는 Fc-융합 재조합 단백질의 분해에 관여하는 CHO HCP로 확인되었다 (문헌 [Robert, F.; et al. "Degradation of an Fc-Fusion Recombinant Protein by Host Cell Proteases: Identification of a CHO Cathepsin D Protease." Biotechnology and Bioengineering 2009, 104(6), 1132-114] 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는, 예를 들어, CatD 게놈 로커스의 변형, 삽입 또는 결실로 인해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화된 CatD 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, CatD의 하나 또는 둘 다의 대립유전자는 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 게놈으로부터 녹아웃된다. 이러한 녹아웃 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질은 생산 동안 분해를 덜 경험할 수 있다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 CatD는 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CatD는 서열식별번호: 13의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 또한 이들이 발현하는 재조합 단백질의 이질성에 영향을 미치는 추가적인 게놈 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 카르복시펩티다제 D (CpD)는 IgG1, IgG2 및 IgG4 모노클로날 항체 이소타입으로부터 C-말단 리신을 절단할 수 있다 (국제 특허 출원 공개 WO 2017/053482 참조). 이는 전하 변이체를 초래할 수 있으며, 이는 제조 제어 전략에 복잡성을 추가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는, 예를 들어, CpD 게놈 로커스의 변형, 삽입 또는 결실로 인해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화된 CpD 유전자를 포함한다. 일부 실시양태에서, CpD의 하나 또는 둘 다의 대립유전자는 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 게놈으로부터 녹아웃된다. 이러한 녹아웃 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질은 감소된 전하 변이체 이질성을 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 CpD는 서열식별번호: 14의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, CpD는 서열식별번호: 15의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 또한 재조합 단백질을 제조하는데 사용되는 다운스트림 공정에 영향을 미치는 추가적인 게놈 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 포스포리파제 B-유사 2 (PLBL2) 및 퍼옥시레독신-1 (PRDX1)은 단백질 포획 크로마토그래피 후 CHO 세포에서 생산된 재조합 단백질에서 오염물질로 확인된 HCP이다 (WO 2016/138467 및 문헌 [Doneanu, C.; et al. "Analysis of host-cell proteins in biotheraputic proteins by comprehensive online two-dimensional liquid chromatography/mass spectrometry." mAbs 2012, 4(1), 24-44] 참조). 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)는, 예를 들어, 게놈 로커스 또는 로커스들의 변형, 삽입, 또는 결실로 인해 편집, 파괴, 및/또는 불활성화된, PLBL2 및 PRDX1로 이루어진 군의 하나 또는 둘 다의 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자들을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLBL2 및 PRDX1로 이루어진 군의 하나 또는 둘 다의 단백질을 코딩하는 유전자 또는 유전자들의 하나 또는 둘 다의 대립유전자는 본원에 기재된 조작된 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)의 게놈으로부터 녹아웃된다. 이러한 녹아웃 숙주 세포에서 생산된 재조합 단백질은 야생형에 비해 감소된 HCP 오염을 가질 수 있으며, 더 적은 다운스트림 정제 단계를 필요로 할 수 있다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 PLBL2는 서열식별번호: 16의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PLBL2는 서열식별번호: 17의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다. 한 실시양태에서, 차이니즈 햄스터 PRDX1은 서열식별번호: 18의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, PRDX1은 서열식별번호: 19의 결합/절단 영역 핵산 서열에서 ZFN에 의해 변형된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 타네주맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2004/058184 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 레브리키주맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2005/062967 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 미리키주맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2014/137962 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 솔라네주맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2001/62801 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 도나네맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2012/021469 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 자고테네맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2016/137811 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 라무시루맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2003/075840 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 갈카네주맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2011/156324 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 익세키주맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2007/070750 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 둘라글루티드인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2005/000892 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 네시투무맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2005/090407 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 올라라투맙인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2006/138729 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 세툭시맙인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 안지오포이에틴 2 mAb인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2015/179166 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 인슐린-Fc 융합 단백질인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2016/178905 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 CD200R 효능제 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2020/055943 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 에피레귤린/전환 성장 인자 알파 (에피레귤린/TGFα) mAb인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2012/138510 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 안지오포이에틴-유사 3/8 (ANGPTL 3/8) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2020/131264).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 B- 및 T-림프구 감쇠자 (BTLA) 항체 효능제인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2018/213113 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 CXC 케모카인 수용체 1/2 (CXCR1/2) 리간드 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2014/149733 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 성장/분화 인자 15 (GDF15) 효능제인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2019/195091 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 인터류킨 33 (IL-33) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2018/081075 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제-활성화 폴리펩티드-38 (PACAP38) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2019/067293 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 프로그래밍된 세포 사멸-1 (PD-1) 항체 효능제인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2017/025016 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 피로글루타메이트-A베타 (pGlu-A베타, N3pG A베타로도 불림) mAb인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2012/021469 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 종양 괴사 인자 알파/인터류킨 23 (TNFα/IL-23) 이중특이적 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2019/027780 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 항-알파-시누클레인 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2020/123330 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 분화 클러스터 226 (CD226) 효능제 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2020/023312 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 모노카르복실레이트 수송체 1 (MCT1) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다 (예를 들어, WO 2019/136300 참조).
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 중증 급성 호흡 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2) 중화 항체인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 항-Fc 감마 수용체 IIB (FcgRIIB 또는 FcγRIIB) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 항-인터류킨 34 (IL-34) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 항-분화 클러스터 19 (CD19) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 골수 세포 2에서 발현되는 트리거링 수용체 (TREM2) 항체인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 렐락신 유사체인 재조합 단백질을 코딩한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 포유동물 세포 (예를 들어, CHO 세포)는 타네주맙, 레브리키주맙, 미리키주맙, 솔라네주맙, 도나네맙, 자고테네맙, 라무시루맙, 갈카네주맙, 익세키주맙, 둘라글루티드, 네시투무맙, 올라라투맙, 세툭시맙, 안지오포이에틴 2 mAb, 인슐린-Fc 융합 단백질, CD200R 효능제 항체, 에피레귤린/TGFα mAb, ANGPTL 3/8 항체, BTLA 항체 효능제, CXCR1/2 리간드 항체, GDF15 효능제, IL-33 항체, PACAP38 항체, PD-1 효능제 항체, N3pG A베타 mAb로도 불리는 pGlu-A베타, TNFα/IL-23 이중특이적 항체, 항-알파-시누클레인 항체, CD226 효능제 항체, MCT1 항체, SARS-CoV-2 중화 항체, FcgRIIB 항체, IL-34 항체, CD19 항체, TREM2 항체 및 렐락신 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 재조합 단백질을 코딩한다.
본 발명의 한 실시양태는 또한 폴리소르베이트, 및 타네주맙, 레브리키주맙, 미리키주맙, 솔라네주맙, 도나네맙, 자고테네맙, 라무시루맙, 갈카네주맙, 익세키주맙, 둘라글루티드, 네시투무맙, 올라라투맙, 세툭시맙, 안지오포이에틴 2 mAb, 인슐린-Fc 융합 단백질, CD200R 효능제 항체, 에피레귤린/TGFα mAb, ANGPTL 3/8 항체, BTLA 항체 효능제, CXCR1/2 리간드 항체, GDF15 효능제, IL-33 항체, PACAP38 항체, PD-1 효능제 항체, N3pG A베타 mAb로도 불리는 pGlu-A베타, TNFα/IL-23 이중특이적 항체, 항-알파-시누클레인 항체, CD226 효능제 항체, MCT1 항체, SARS-CoV-2 중화 항체, FcgRIIB 항체, IL-34 항체, CD19 항체, TREM2 항체 및 렐락신 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오산물을 포함하는 제약 조성물로서, 여기서 바이오산물은 본 발명의 재조합 포유동물 세포에 의해 생산된 것인 제약 조성물을 제공한다. 다양한 실시양태에서, 폴리소르베이트는 폴리소르베이트 80 (PS80), 폴리소르베이트 20 (PS20), 폴리소르베이트 40 (PS40), 폴리소르베이트 60 (PS60), 폴리소르베이트 65 (PS65), 또는 이들의 조합이다. 본 발명의 제약 조성물 중 폴리소르베이트의 농도는 본 발명의 조성물 중 중량/부피 (w/v)로 0.01% 내지 약 1%, 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.10%, 보다 바람직하게는 약 0.01% 내지 약 0.05%, 보다 더 바람직하게는 약 0.02% 내지 약 0.05%일 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함한다. 본 발명의 세포주를 사용하여 생산된 바이오산물을 포함하는 제약 조성물은 관련 기술분야 (예를 들어, Remington: The Science and Practice a/Pharmacy, 19th edition (1995), (A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.))에 널리 공지된 방법에 의해 추가로 제형화될 수 있다.
도 1: 시간 경과에 따른 PPT1 존재 하의 PS80 모노-올레에이트 에스테르의 온도-의존적 분해를 도시하는 그래프로서, 이는 PPT1이 온도-의존적 방식으로 시간 경과에 따라 PS80을 분해한다는 것을 입증한다.
도 2: 제형화된 mAb 샘플 (대조군 (A) 및 (B) LAL - 1 ppm, (C) LPL - 1 ppm, (D) PPT1 - 1 ppm, 및 (E) LPLA2 - 0.1 ppm로 별도로 스파이킹됨)에서 시간 경과에 따른 PS80 모노-올레에이트 에스테르의 분해를 도시하는 그래프로서, 이는 제형에 존재하는 PS80 모노-올레에이트 에스테르가 제형화된 mAb 대조군보다 이러한 단백질의 존재 하에 시간 경과에 따라 더 큰 정도로 분해된다는 것을 입증한다.
도 3: 대조군 샘플 (A)에서 및 0.25 UN/mL PLD4 (B), 2.5 UN/mL PLD4 (D), 0.25 UN/mL PLD7 (C), 및 2.5 UN/mL PLD7 (E)의 존재 하에 시간 경과에 따른 PS80 모노-올레에이트 에스테르의 분해를 도시하는 그래프이다. 이 데이터는 PLD 계열 구성원이 시간 경과에 따라 PS80을 분해하는 능력을 정성적으로 입증한다.
본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 하기 제제 및 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물의 제조 및 사용 수단을 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 제공한다.
실시예
실시예 1 - PPT1의 폴리소르베이트 가수분해 활성의 특징규명
액체 크로마토그래피-질량 분광측정 (LCMS)에 의한 폴리소르베이트 분해 분석 - 일반 절차 A
LCMS 분석을 워터스(Waters) 시냅트(SYNAPT)® G2-Si 질량 분광측정기가 장착된 워터스 액퀴티 UPLC(Waters ACQUITY UPLC) (I 클래스); 칼럼: 애질런트 (Agilent) PLRP-S 2.1 × 50 mm, 1000 Å, 5 μm 입자 크기; 이동상: A - 물 중 0.05% 트리플루오로아세트산 (TFA), B - 아세토니트릴 중 0.04% TFA에서 수행한다. 표준 용액을 2% PS80 및 10 mM 시트레이트 버퍼로 제조하여 0.001, 0.002, 0.005, 0.01, 0.025, 0.05% PS80 용액을 수득한다. 10 mM 시트레이트 버퍼에서 제조된 PS80 용액의 표준 곡선을 수득하여 폴리소르베이트 모노-올레에이트에 대한 LCMS 추출된 이온 크로마토그램에 의해 샘플에서의 온전한 PS80을 정량화한다. 표준 곡선을 사용하여, 각각의 샘플에 대한 모노-올레에이트 에스테르로서의 온전한 PS80의 상대적 퍼센트 (%)를 시간 = 0에 대해 계산한다.
실시예 1a - PPT1 존재 하의 폴리소르베이트 80 분해
폴리소르베이트 80 (PS80) 및 PPT1의 샘플을 하기와 같이 제조한다: 10 mM 시트레이트 버퍼 (pH 6) 중 0.5 mL의 0.02% w/v PS80을 5.6 μL의 0.3 mg/mL PPT1 용액 (재조합 발현에 의해 제조됨)과 혼합하고, 샘플을 연구 동안 4, 15, 25, 및 35℃에서 유지한다. 이러한 용액의 샘플 (50 μL)을 시간 간격을 두고 채취하고, LCMS 분석을 위해 물 중 5 μL의 5% 포름산과 혼합한다. 모노-올레에이트 에스테르로서의 잔류하는 온전한 PS80의 퍼센트를 일반 절차 A를 이용하여 시간 경과에 따라 LCMS에 의해 모니터링한다. 이들 데이터는 도 1에 제시되어 있으며, PPT1이 온도-의존적 방식으로 시간 경과에 따라 PS80을 분해한다는 것을 입증한다.
실시예 1b - LAL, LPL, PPT1 및 LPLA2로 스파이킹된 mAb 제형 샘플에서의 폴리소르베이트 80 분해
제형화된 mAb의 샘플 (항체 1, 20 mM 나트륨 아세테이트 버퍼 중 100 mg/mL, pH 5.0, 0.03% w/v PS80 포함)을 1 ppm LAL, LPL, 및 PPT1 및 0.1 ppm LPLA2 (재조합 발현에 의해 수득됨)로 별도로 스파이킹한다. 샘플을 연구 기간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 각각의 샘플을 1:2 비율로 20 mM 나트륨 아세테이트 버퍼로 희석하고, 이어서 일반 절차 A를 이용하여 LCMS로 분석한다. 시간 경과에 따른 모노-올레에이트 에스테르로서의 잔류하는 온전한 PS80의 퍼센트가 표 1 및 도 2에 제시되어 있다.
표 1: LAL, LPL, PPT1 및 LPLA2로 스파이킹된 항체 1의 샘플에서의 온전한 PS80의 시간 0 대비 상대적 퍼센트 (%)
Figure pct00001
참조: 표 1에서의 모든 결과는 n=2를 나타냄
이들 데이터는 제형에 존재하는 PS80 모노-올레에이트 에스테르가 제형화된 mAb 대조군보다 이러한 단백질의 존재 하에 시간 경과에 따라 더 많은 정도로 분해된다는 것을 입증한다.
종합하면, 이 실시예에서의 데이터는 시간 경과에 따라 용액 중의 PS80을 분해하는 이들 단백질 (LAL, LPL, PPT1, 및 LPLA2)의 능력을 입증한다.
실시예 2 - Fc-융합 단백질 제형에서의 PPT1의 확인
Fc-융합 단백질 (Fc-융합 단백질 1)의 2개의 개별 배양 배치를 단백질 A 크로마토그래피에 적용한다. 분취량 (25 μL)의 단백질 A 메인스트림을 1 M 트리스-HCl 버퍼, pH 8 (5 μL), 반스테드(Barnstead) 물 (172 μL), 단백질 표준 혼합물 (0.8 μL), 및 2.5 mg/mL 소 r-트립신 (2 μL)과 혼합한다. 샘플을 37℃에서 16시간 동안 인큐베이션한다. 샘플을 2 μL의 50 mg/mL 디티오트레이톨 (DTT) 용액과 혼합하고, 이어서 90℃에서 10분 동안 가열한다. 샘플을 10,000 g에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 바이알로 옮긴다. 이어서, 샘플을 H2O (5 μL) 중 5% TFA로 산성화하고, LCMS로 분석한다. LCMS 분석을 빙수에 잠긴 칼럼과 함께 써모피셔 Q 이그잭티브(ExactivThermoFisher Q Exactivee)™ 플러스 질량 분광측정기가 장착된 워터스 액퀴티 UPLC; 칼럼: 워터스 UPLC CSH C18, 2.1 × 50 mm, 1.7 μm 입자 크기; 이동상: A - 물 중 0.10% 포름산 (FA), B - 아세토니트릴 중 0.10% FA에서 수행한다. 이 실험에서, PPT1이 0.5 ± 0.1 ppm (n=2)에서 비-표적 프로테오믹스 (DDA) 접근법에 의한 단백질 A 정제 후 Fc-융합 단백질 1의 샘플에서 확인된다.
실시예 3 - 재조합적으로 조작된 LPLA2, LAL, LPL 및 PPT1 녹아웃 CHO 세포주의 생산
달리 언급되지 않는 한, 사용된 세포 배양 배지는 8 mM 글루타민이 보충된 무혈청 세포 배양 배지를 지칭한다. 추가로, 달리 언급되지 않는 한, 사용된 포유동물 세포는 글루타민 신타제 결핍 CHO (GS-CHO) 세포주이다.
세포주의 조작을, 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) (콤포Zr(CompoZr)® 커스텀 징크 핑거 뉴클레아제(Custom Zinc Finger Nuclease), 카탈로그 번호 CSTZFN, 시그마 알드리치, 미주리주 세인트 루이스)에 의해 구축된, 각각의 표적 HCP 유전자에 특이적이도록 설계된 맞춤 제작된 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시약을 사용하여 달성한다. LPLA2, LPL, LAL 및 PPT1에 대한 ZFN 결합/절단 영역 핵산 서열은 표 2에 제공되어 있다.
표 2: LPLA2, LPL, LAL 및 PPT1에 대한 ZFN 결합/절단 영역
Figure pct00002
유전자 파괴를 위한 세포의 제조 - 일반 절차 B
세포를 함유하는 바이알을 얼음 조각만 남을 때까지 36℃ 수조에서 해동한다. 세포를 진탕-플라스크 배양물 중 세포 배양 배지에 시딩한다. 모 세포주의 배양물을 세포 배양 배지로 계대-배양하고, 3일/4일 스케줄로 유지 및 계대한다. 세포 배양물을 상기에서 언급된 바와 같이 30 mL의 적절한 유지 배지에서 0.2 × 106 vc/mL의 시드 밀도로 시딩한다. 형질감염 당일에 세포를 계수하고, 적절한 부피의 세포를 수확한다.
ZFN 형질감염 및 벌크 배양물 회수 - 일반 절차 C
ZFN 형질감염을 뉴클레오펙터(Nucleofector)™ 기술 및 관련 cGMP 뉴클레오펙터™ 키트 V (카탈로그 번호 VGA-1003, 론자, 스위스 바젤)를 사용하여 수행한다. 간단히 설명하면, 단일 뉴클레오펙션 반응 (2 - 4.5 × 106 vc)에 충분한 세포를 원심분리에 의해 수집한다. 상층액을 완전히 제거한 후, 세포 펠릿을 제조업체의 프로토콜에 따라 보충제가 첨가된 100 μL의 뉴클레오펙터™ 용액 V에 현탁시킨다. 현탁된 세포를 연화처리에 의해 부드럽게 혼합하고, 분취량의 ZFN mRNA를 함유하는 바이알 [시그마 알드리치 (미주리주 세인트 루이스)에 의해 생산된 맞춤형 ZFN 키트의 일부]에 옮긴다. 이어서, 세포/mRNA 혼합물을 뉴클레오펙터™ 키트에 제공된 2 mm 큐벳으로 옮기고, 큐벳을 뉴클레오펙터™ 장치에 삽입하고, 세포를 전기천공한다. 전기천공 후, 세포를 큐벳에서 30-60초 동안 실온에 둔 다음, 멸균 이송 피펫을 사용하여 3 mL 세포 배양 배지를 함유하는 표지된 6-웰 플레이트 (팔콘(Falcon) 카탈로그 번호 351146, 코닝(Corning), 노쓰 캐롤리나주 더럼)의 웰에 옮긴다. 형질감염된 세포를 36℃, 6% CO2에서 1 - 4일 동안 가습 인큐베이터에서 6-웰 플레이트에서 정적 상태로 유지하고, 그 후 생존율이 >90%가 될 때까지 세포 배양 배지, 36℃, 6% CO2에서 125 rpm으로 진탕하는 진탕-플라스크 배양물로 옮긴다. 세포가 형질감염으로부터 완전히 회수되면 (진탕-플라스크 배양물에서의 생존율에 의해 측정됨), 벌크 배양물을 FACS 기술을 이용하여 단일-세포 분류한다.
각각의 표적 HCP에 대한 ZFN 형질감염을 단일-세포 분류 전에 1회 수행할 수 있다. 대안적으로, 임의의 특정한 표적 HCP에 대한 ZFN 형질감염을 제2 ZFN 형질감염 전에 완전한 세포 회수와 함께 2회 수행할 수 있다. 1회 초과의 ZFN 형질감염은 각각의 표적 HCP에서 이중-대립유전자 돌연변이를 함유하는 세포의 수를 증가시켜 스크리닝을 보다 효율적으로 만들 수 있다.
벌크 배양물에서의 ZFN-매개된 표적 HCP 서열 변형의 검출 - 일반 절차 D
형질감염 후 2 내지 7일에, 부분-내지-완전 회수된 ZFN 벌크 배양물로부터의 세포를 수확하여 형질감염된 ZFN의 활성을 평가한다. 서베이어(Surveyor)® 돌연변이 검출 검정 (MDA) (트랜스게노믹 인크.(Transgenomic Inc.), 네브래스카주 오마하)을 이용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 표적 HCP 부위에서 변형을 생성하는데 있어서 ZFN 절차의 효율을 검출한다. 간단히 말해서, ZFN-결합 영역을 콤포Zr® 커스텀 징크 핑거 뉴클레아제 키트 (시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스)에 제공된 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 이어서, PCR 산물을 변성시키고 다시 어닐링한다. MDA 키트에 제공된 Cel-I 엔도뉴클레아제 (서베이어 뉴클레아제 S)를 사용하여 Cel-I가 불일치의 "버블"을 인식하고 DNA를 절단할 것이기 때문에 천연 또는 야생형 서열 및 indel을 함유하는 것으로 이루어진 PCR 산물의 어닐링으로부터 생기는 DNA 불일치 "버블"을 검출한다. Cel-I 분해 후, 산물을 2% 또는 4% TBE 아가로스 겔 (릴라이언트 겔(Reliant Gel), 론자, 스위스 바젤)에서 분해한다. DNA 불일치 "버블"의 부재 하에, 어떠한 DNA 절단도 발생하지 않을 것이고, PCR 산물을 나타내는 하나의 밴드만 나타날 것이다. ZFN 활성을 나타내는 임의의 비-상동성 말단-연결 (NHEJ)이 발생하는 경우, 절단 산물은 2개 (또는 그 초과)의 밴드 형태로 겔에서 관찰될 것이다. MDA에서 양성 반응을 나타내는 ZFN 벌크 배양물만을 단일-세포 분류로 정방향-프로세싱한다.
형광-활성화된 세포 분류에 의한 단일-세포 분류 - 일반 절차 E
회수된 벌크 배양물을 형광-활성화된 세포 분류 (FACS) 기술을 통해 분류한다. 단일-세포 클로닝을 위한 프로토콜 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 클로닝의 경우, 세포 분류기 (모플로(MoFlo)™ XDP, 베크만 코울터(Beckman Coulter))를 사용하여 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라 전방 및 측면-산란 방향의 레이저 회절을 측정함으로써 단일의 생존가능한 세포를 확인하고 분류한다 (예를 들어, 문헌 [Krebs, L., et al. (2015) "Statistical verification that one round of fluorescence-activated cell sorting (FACS) can effectively generate a clonally-derived cell line." BioProcess J 13(4): 6-19] 참조).
세포를 동물 성분이 없는 분류 배지 (엑스-셀(Ex-Cell) CHO 클로닝 배지, SAFC C6366) + 20% 조건화된 세포 배양 배지 + 페놀 레드 (시그마 P0290)를 함유하는 96-웰 미세역가 플레이트 (팔콘, 카탈로그 번호 35-3075)로 분류한다. 조건화된 세포 배양 배지를 제조하기 위해, 모 세포를 글루타민이 없는 세포 배양 배지에 1 × 106 vc/mL의 밀도로 시딩하고, 36℃, 6% CO2, 125 rpm에서 20 - 24시간 동안 진탕-플라스크에서 인큐베이션한다. 배양물을 원심분리하여 세포를 제거하고, 조건화된 배지를 멸균 0.22 μm 필터를 통해 여과시킨다. 단일-세포 분류 후 7 내지 10일에, 모든 플레이트에 웰당 50 μL 세포 배양 배지를 공급한다. 단일-세포 분류 후 14일 - 15일에, 플레이트를 클론 증식에 대해 분석한다. 증식을 클론셀렉트 이미저(CloneSelect Imager) (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices), 캘리포니아주 서니베일)를 사용하여 분류 플레이트를 이미징하거나 수동적으로 거울을 사용하고/거나 적색에서 주황색/황색으로의 배지 색상 변화를 관찰함으로써 결정한다.
ZFN-매개된 표적 HCP 서열 변형을 위한 클론-유래된 세포주 스크리닝 - 일반 절차 F
클론-유래된 세포주 (CDCL)는 가시적인 콜로니가 되기 때문에 이를 회수된 ZFN 벌크 배양물로부터 유래하는 96-웰 플레이트로부터 선택하고, 세포 배양 배지를 함유하는 딥 96-웰 플레이트 (그라이너(Greiner), 카탈로그 번호 780271)로 옮긴다. 클론-유래된 세포주를 150 μL 세포 배양 배지를 함유하는 딥-웰 플레이트로 통합한다. 배양물을 스크리닝 및 특징규명이 완료될 때까지 3일/4일 공급/통과 스케줄에 따라 정적 조건 하에 세포 배양 배지에서 유지한다.
클론-유래된 세포주 (CDCL)를 서베이어® MDA를 사용하여 indel에 대해 스크리닝한다. 게놈 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 프로메가 위저드(Promega Wizard)® SV 96 게놈 DNA 정제 키트 (카탈로그 번호 A2371, 프로메가(Promega), 위스콘신주 메디슨)를 사용하여 각각의 세포주로부터 단리한다. ZFN PCR 반응을 제조업체의 프로토콜에 따라 푸션(Phusion)® 고-충실도 DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs), 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 수행한다. MDA 분해 산물을 2% TBE 아가로스 겔에서 분해한다. MDA에서 양성으로 확인된 세포주를 일반 절차 G 또는 일반 절차 H를 통해 특징규명한다.
RT-PCR을 이용하여 CDCL에서 indel 특징규명 - 일반 절차 G:
CDCL을 표적 유전자 RT-PCR 반응을 이용하여 ZFN PCR 산물을 시퀀싱함으로써 특징규명한다. 총 RNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 RNeasy 마이크로 키트 (퀴아젠(Qiagen), 카탈로그 번호 74004, 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 각각의 잠재적 KO 세포주로부터 단리한다. 역전사 반응을 제조업체의 프로토콜에 따라 RT-PCR을 위한 슈퍼스크립트(SuperScript)™ III 제1-가닥 합성 시스템 (카탈로그 번호 18080-051, 인비트로겐(Invitogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 수행하고, 이어서 푸션® 고-충실도 DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 PCR 반응을 수행한다. RT-PCR 산물을 1% TAE 아가로스 겔에서 분해하여 변경된 RT-PCR 산물을 갖는 세포주를 확인한다. 정방향-프로세싱을 위해 선택된 세포주는 LCMS에 따라 RT-PCR 산물이 없고 표적 HCP 단백질을 함유하지 않는다.
차세대 시퀀싱 (NGS)을 이용하여 CDCL에서 indel 특징규명 - 일반 절차 H:
MDA-양성 CDCL을 추가 유지 관리를 위해 96-웰 딥-웰 플레이트로 통합한다. 통합 시, "비정상" PCR 및/또는 MDA 결과를 나타내는 세포주를 진위즈(GENEWIZ)에서 제공되는 차세대 시퀀싱 (NGS)을 이용하여 특징규명한다. 표적 HCP 유전자 로커스에서 허용되는 이중-대립유전자 indel을 함유하는 세포주를 LCMS에 의해 평가하고 표적 HCP 단백질을 함유하지 않는 세포주를 이월한다.
녹아웃 세포주의 스케일링 및 뱅킹 - 일반 절차 I:
초기 스크린/특징규명 작업을 기반으로 추가 평가를 보장하는 CDCL을 96-웰 딥-웰 플레이트 (DWP)로부터 진탕-플라스크로 확장하고, 연구 세포 뱅크 (RCB)를 생성한다. DWP로부터, 적절한 웰로부터의 세포를 3 mL 세포 배양 배지를 함유하는 6-웰 플레이트의 적절하게 표지된 웰로 옮긴다. 스케일링 CDCL을 36℃, 6% CO2에서 3 내지 4일 동안 가습 인큐베이터에서 6-웰 플레이트에서 정적 상태로 유지하고, 이후 15 mL의 세포 배양 배지를 함유하고 36℃ 및 6% CO2이고 125 rpm으로 진탕하는 진탕-플라스크로 옮긴다. 진탕-플라스크 배양물을 적어도 1회 계대하여 뱅킹에 적합한 세포 매스를 구축한다. 각각의 세포주에 대해, 프리징 멘스트룸(Freezing Menstrum) (90 : 10 세포 배양 배지 : DMSO)에서 바이알당 10 - 13 × 106 vc로 3 - 10개의 바이알 RCB를 생성한다. 바이알을 세포의 제어된-속도 동결을 허용하기 위해 -80℃에서 적어도 24시간 동안 스티로폼 랙 "샌드위치"에 배치한다. 바이알이 완전히 동결되면 -80℃에서 보관한다.
실시예 3a - LPLA2 녹아웃 CHO 세포주
CHO 세포를 일반 절차 B에 따라 유전자 파괴를 위해 제조한다. 이어서, 세포를 일반 절차 C에 따라 단일 ZFN 형질감염 및 벌크 배양물 회수에 적용한다. 일반 절차 D를 이용하여, 벌크 배양물에서의 서열 변형을 검출한다. MDA에서 양성 반응을 나타내는 벌크 배양물을 일반 절차 E에 따라 단일-세포 분류로 정방향-프로세싱한다. 이로부터 수득되는 클론-유래된 세포주를 일반 절차 F에 따라 표적 HCP 서열 변형에 대해 스크리닝한다. indel을 일반 절차 G에 따라 특징규명하고, LCMS에 의해 검출가능한 양의 LPLA2 단백질을 함유하지 않는 세포주를 선택한다. RCB를 일반 절차 I에 따라 생성하여 LPLA2 녹아웃 CHO 세포주를 제공한다.
실시예 3b - LPLA2 / LPL 녹아웃 CHO 세포주
실시예 3a로부터의 LPLA2 녹아웃 CHO 세포를 일반 절차 B에 따라 유전자 파괴를 위해 제조한다. 이어서, 세포를 일반 절차 C에 따라 2회의 ZFN 형질감염 및 벌크 배양물 회수에 적용한다. 일반 절차 D를 이용하여, 벌크 배양물에서의 서열 변형을 검출한다. MDA에서 양성 반응을 나타내는 벌크 배양물을 일반 절차 E에 따라 단일-세포 분류로 정방향-프로세싱한다. 이로부터 수득되는 클론-유래된 세포주를 일반 절차 F에 따라 표적 HCP 서열 변형에 대해 스크리닝한다. indel을 일반 절차 H에 따라 특징규명하고, LCMS에 의해 검출가능한 양의 LPL 단백질을 함유하지 않는 세포주를 선택한다. RCB를 일반 절차 I에 따라 생성하여 LPLA2 / LPL 녹아웃 CHO 세포주를 제공한다.
실시예 3c - LPLA2 / LPL / LAL 녹아웃 CHO 세포주
실시예 3b로부터의 LPLA2 / LPL 녹아웃 CHO 세포를 일반 절차 B에 따라 유전자 파괴를 위해 제조한다. 이어서, 세포를 일반 절차 C에 따라 2회의 ZFN 형질감염 및 벌크 배양물 회수에 적용한다. 일반 절차 D를 이용하여, 벌크 배양물에서의 서열 변형을 검출한다. MDA에서 양성 반응을 나타내는 벌크 배양물을 일반 절차 E에 따라 단일-세포 분류로 정방향-프로세싱한다. 이로부터 수득되는 클론-유래된 세포주를 일반 절차 F에 따라 표적 HCP 서열 변형에 대해 스크리닝한다. indel을 일반 절차 H에 따라 특징규명하고, LCMS에 의해 검출가능한 양의 LAL 단백질을 함유하지 않는 세포주를 선택한다. RCB를 일반 절차 I에 따라 생성하여 LPLA2 / LPL / LAL 녹아웃 CHO 세포주를 제공한다.
실시예 3d - LPLA2 / LPL / LAL / PPT1 녹아웃 CHO 세포주
실시예 3c로부터의 LPLA2 / LPL / LAL 녹아웃 CHO 세포를 일반 절차 B에 따라 유전자 파괴를 위해 제조한다. 이어서, 세포를 일반 절차 C에 따라 2회의 ZFN 형질감염 및 벌크 배양물 회수에 적용한다. 일반 절차 D를 이용하여, 벌크 배양물에서의 서열 변형을 검출한다. MDA에서 양성 반응을 나타내는 벌크 배양물을 일반 절차 E에 따라 단일-세포 분류로 정방향-처리한다. 이로부터 수득되는 클론-유래된 세포주를 일반 절차 F에 따라 표적 HCP 서열 변형에 대해 스크리닝한다. indel은 일반 절차 H에 따라 특징규명되지만, 어떠한 세포주도 표적화된 PPT1 영역에서 이중-대립유전자 돌연변이를 함유하지 않는다. 단일- 또는 이중-대립유전자 indel을 함유하는 세포주를 LCMS에 의해 평가하고 LCMS 평가에 의해 검출가능한 양의 PPT1 단백질을 함유하지 않는 세포주를 이월한다. RCB를 일반 절차 I에 따라 생성하여 LPLA2 / LPL / LAL / PPT1 녹아웃 CHO 세포주를 제공한다.
실시예 4 - 대조군 대비 LPLA2 / LPL / LAL / PPT1 녹아웃 CHO 세포주에서 발현된 제형화된 mAb에서의 폴리소르베이트 안정성의 비교
Fc-융합 단백질 (Fc-융합 단백질 1) 및 항체 (항체 2)를 녹아웃된 LPLA2, LPL, LAL 및 PPT1을 갖는 산물 발현 CHO 세포주 ("리파제/에스테라제 KO 세포주"로도 지칭됨) 및 또한 대조군으로서의 LPLA2, LPL, LAL 또는 PPT1 녹아웃이 없는 산물 발현 CHO 세포주로부터 생산한다. Fc-융합 단백질 1을 0.02% PS80으로 제형화하기 전에 단백질 A 크로마토그래피, 낮은 pH 바이러스 불활성화, 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX), 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 및 접선 유동 여과 (TFF) 농축을 통해 프로세싱한다. 항체 2를 0.02% PS80으로 제형화하기 전에 단백질 A 크로마토그래피, 낮은 pH 바이러스 불활성화, CEX 크로마토그래피, 및 TFF 농축을 통해 프로세싱한다. Fc-융합 단백질 1 및 항체 2의 제형화된 샘플을 연구 기간 동안 25℃에서 유지하고, 일반 절차 A를 이용하여 LCMS 분석에 직접적으로 사용하여 시간 경과에 따른 모노-올레에이트 에스테르로서의 잔류하는 온전한 PS80의 퍼센트를 모니터링한다. 결과는 표 3에 나열되어 있으며, KO 세포주를 사용하여 생산된 Fc-융합 단백질 1 및 항체 2에서 PS80이 대조군 샘플보다 더 안정적이라는 것을 나타낸다.
표 3: 항체 2 및 Fc-융합 단백질 1의 샘플에서의 온전한 PS80의 시간 0 대비 상대적 퍼센트 (%)
Figure pct00003
참조: 모든 결과는 n=3을 나타냄
실시예 5 - 모노클로날 항체 제형에서의 PLD3의 확인
150 mg/mL의 농도로 단백질 A 포획, 낮은 pH 바이러스 불활성화, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피, 및 접선 유동 여과 (TFF)에 의한 농축을 통해 프로세싱된 1 mg의 항체 3을 함유하는 샘플을 트리스-HCl 버퍼 (1 M, pH 8, 5 μL) 및 물과 혼합하여 195 μL의 부피를 달성한다. 각각의 용액을 5 μL의 트립신 및 단백질 표준 혼합물 (20 μL의 2.5 mg/mL r-소 트립신, 20 μL의 단백질 표준 혼합물 및 60 μL의 물)로 37℃에서 밤새 처리한다. 각각의 샘플을 1,4-디티오트레이톨 (DTT, 50 mg/mL, 2 μL)과 혼합하고, 90℃로 10분 동안 가열하여 백색 침전물을 관찰한다. 이어서, 샘플을 13000 g에서 2분 동안 원심분리하고, 상청액을 HPLC 바이알로 옮긴다. 샘플을 본질적으로 실시예 2에 대해 기재된 바와 같이 LCMS 분석 전에 물 중 5 μL의 10% 포름산으로 산성화한다. 이 실험에서, PLD3은 항체 3의 샘플에서 17 ± 6 ng/mg (n=2)의 항체 3으로 확인된다.
실시예 6 - PLD4 및 PLD7의 폴리소르베이트 가수분해 활성의 특징규명
PLD4 및 PLD7은 PLD3과 마찬가지로 포스포리파제 D 계열 구성원이다. PLD4 및 PLD7의 가수분해 활성을 본질적으로 실시예 1에 기재된 바와 같은 방식으로 평가한다. 0.02% PS80을 함유하는 샘플을 35℃에서 PLD4 및 PLD7의 0.25 및 2.5 단위/밀리리터 (UN/mL)와 함께 인큐베이션하고, 모노-올레에이트 에스테르로서의 잔류하는 온전한 PS80의 퍼센트를 일반 절차 A를 이용하여 시간 경과에 따라 LCMS에 의해 모니터링한다. 이러한 조건 하에 35시간 인큐베이션 후, PS80는 각각 2.5 UN/mL PLD4 및 PLD7의 존재 하에 >30% 및 >80% 가수분해된다. 이들 데이터는 도 3에 제시되어 있으며, PLD 계열 구성원이 시간 경과에 따라 PS80을 분해하는 능력을 정성적으로 입증한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> RECOMBINANTLY ENGINEERED, LIPASE/ESTERASE-DEFICIENT MAMMALIAN CELL LINES <130> X21790 <150> 62/915,234 <151> 2019-10-15 <150> PCT/US2020/055572 <151> 2020-10-14 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 306 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 1 Met Ala Ser Pro Gly Ser Arg Trp Leu Leu Ala Val Ser Leu Leu Pro 1 5 10 15 Trp Cys Cys Ala Ala Trp Ser Leu Gly His Leu Asn Pro Pro Ser Leu 20 25 30 Thr Pro Leu Val Ile Trp His Gly Met Gly Asp Ser Cys Cys Asn Pro 35 40 45 Ile Ser Met Gly Ala Ile Lys Lys Met Val Glu Lys Glu Ile Pro Gly 50 55 60 Ile Tyr Val Leu Ser Leu Glu Ile Gly Lys Asn Met Met Glu Asp Val 65 70 75 80 Glu Asn Ser Phe Phe Leu Asn Val Asn Ser Gln Val Met Met Val Cys 85 90 95 Gln Ile Leu Glu Lys Asp Pro Lys Leu Gln Gln Gly Tyr Asn Ala Ile 100 105 110 Gly Phe Ser Gln Gly Gly Gln Phe Leu Arg Ala Val Ala Gln Arg Cys 115 120 125 Pro Ser Pro Arg Met Ile Asn Leu Ile Ser Val Gly Gly Gln His Gln 130 135 140 Gly Val Phe Gly Leu Pro Arg Cys Pro Gly Glu Ser Ser His Val Cys 145 150 155 160 Asp Phe Ile Arg Lys Met Ile Asn Ala Gly Ala Tyr Ser Lys Val Val 165 170 175 Gln Leu Arg Leu Val Gln Ala Gln Tyr Trp His Asp Pro Ile Lys Glu 180 185 190 Asp Val Tyr Arg Asn His Ser Ile Phe Leu Ala Asp Ile Asn Gln Glu 195 200 205 Arg Cys Val Asn Glu Thr Tyr Lys Lys Asn Leu Met Ala Leu Asn Lys 210 215 220 Phe Val Met Val Lys Phe Leu Asn Asp Ser Ile Val Asp Pro Val Asp 225 230 235 240 Ser Glu Trp Phe Gly Phe Tyr Arg Ser Gly Gln Ala Lys Glu Thr Ile 245 250 255 Pro Leu Gln Glu Ser Thr Leu Tyr Thr Glu Asp Arg Leu Gly Leu Lys 260 265 270 Gln Met Asp Lys Ala Gly Lys Leu Val Phe Leu Ala Lys Glu Gly Asp 275 280 285 His Leu Gln Leu Ser Lys Glu Trp Phe Asn Ala Tyr Ile Ile Pro Phe 290 295 300 Leu Lys 305 <210> 2 <211> 397 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 2 Met Gln Ile Leu Gly Leu Val Val Cys Leu Phe Leu Ser Val Leu Leu 1 5 10 15 Ser Gly Arg Pro Thr Gly Ser Ile Pro His Val Asp Pro Glu Ala Asn 20 25 30 Met Asn Val Thr Glu Met Ile Arg 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Lys Ser Asp Glu Asn Ile 1010 1015 1020 Pro Gly Gly Val Met Arg Gly Ala Glu Trp His Ser His Leu Gly 1025 1030 1035 Ser Met Lys Asp Tyr Ser Val Thr Tyr Gly His Cys Pro Glu Ile 1040 1045 1050 Thr Val Tyr Thr Ser Cys Cys Tyr Phe Pro Ser Ala Ala Gln Leu 1055 1060 1065 Pro Ala Leu Trp Ala Glu Asn Lys Arg Ser Leu Leu Ser Met Leu 1070 1075 1080 Val Glu Val His Lys Gly Val His Gly Leu Val Lys Asp Lys Thr 1085 1090 1095 Gly Lys Pro Ile Ser Lys Ala Val Ile Val Leu Asn Asp Gly Ile 1100 1105 1110 Lys Val His Thr Lys Glu Gly Gly Tyr Phe His Val Leu Leu Ala 1115 1120 1125 Pro Gly Val His Asn Ile Asn Ala Ile Ala Glu Gly Tyr Gln Gln 1130 1135 1140 Gln His Ser Gln Val Phe Val His His Asp Ala Ala Ser Ser Val 1145 1150 1155 Leu Ile Val Phe Asp Thr Asp Asn Arg Ile Phe Gly Leu Pro Arg 1160 1165 1170 Glu Leu Val Val Thr Val Ser Gly Ala Thr Met Ser Ala Leu Ile 1175 1180 1185 Leu Thr Ala Cys Ile Ile Trp Cys Ile Cys Ser Ile Lys Ser Asn 1190 1195 1200 Arg His Lys Asp Gly Phe His Arg Leu Arg Gln His His Asp Glu 1205 1210 1215 Tyr Glu Asp Glu Ile Arg Met Met Ser Thr Gly Ser Lys Lys Ser 1220 1225 1230 Leu Leu Ser His Glu Phe Gln Asp Glu Thr Asp Thr Glu Glu Glu 1235 1240 1245 Thr Leu Tyr Ser Ser Lys His 1250 1255 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 15 gtcagtggag tcaagagaac tgtatgtgat ggagatatc 39 <210> 16 <211> 585 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 16 Met Ala Ala Pro Met Asp Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Val Arg Ala 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ser Leu Thr Glu Val Leu Leu Asn 20 25 30 Cys Pro Ala Gly Ala Leu Pro Thr Gln Gly Pro Gly Arg Arg Arg Gln 35 40 45 Asn Leu Asp Pro Pro Val Ser Arg Val Arg Ser Val Leu Leu Asp Ala 50 55 60 Ala Ser Gly Gln Leu Arg Leu Val Asp Gly Ile His Pro Tyr Ala Val 65 70 75 80 Ala Trp Ala Asn Leu Thr Asn Ala Ile Arg Glu Thr Gly Trp Ala Tyr 85 90 95 Leu Asp Leu Gly Thr Asn Gly Ser Tyr Asn Asp Ser Leu Gln Ala Tyr 100 105 110 Ala Ala Gly Val Val Glu Ala Ser Val Ser Glu Glu Leu Ile Tyr Met 115 120 125 His Trp Met Asn Thr Met Val Asn Tyr Cys Gly Pro Phe Glu Tyr Glu 130 135 140 Val Gly Tyr Cys Glu Lys Leu Lys Ser Phe Leu Glu Ile Asn Leu Glu 145 150 155 160 Trp Met Gln Arg Glu Met Glu Leu Ser Gln Asp Ser Pro Tyr Trp His 165 170 175 Gln Val Arg Leu Thr Leu Leu Gln Leu Lys Gly Leu Glu Asp Ser Tyr 180 185 190 Glu Gly Arg Leu Thr Phe Pro Thr Gly Arg Phe Thr Ile Lys Pro Leu 195 200 205 Gly Phe Leu Leu Leu Gln Ile Ala Gly Asp Leu Glu Asp Leu Glu Gln 210 215 220 Ala Leu Asn Lys Thr Ser Thr Lys Leu Ser Leu Gly Ser Gly Ser Cys 225 230 235 240 Ser Ala Ile Ile Lys Leu Leu Pro Gly Ala Arg Asp Leu Leu Val Ala 245 250 255 His Asn Thr Trp Asn Ser Tyr Gln Asn Met Leu Arg Ile Ile Lys Lys 260 265 270 Tyr Gln Leu Gln Phe Arg Gln Gly Pro Gln Glu Ala Tyr Pro Leu Ile 275 280 285 Ala Gly Asn Asn Leu Val Phe Ser Ser Tyr Pro Gly Thr Ile Phe Ser 290 295 300 Gly Asp Asp Phe Tyr Ile Leu Gly Ser Gly Leu Val Thr Leu Glu Thr 305 310 315 320 Thr Ile Gly Asn Lys Asn Pro Ala Leu Trp Lys Tyr Val Gln Pro Gln 325 330 335 Gly Cys Val Leu Glu Trp Ile Arg Asn Ile Val Ala Asn Arg Leu Ala 340 345 350 Leu Asp Gly Ala Thr Trp Ala Asp Ile Phe Lys Gln Phe Asn Ser Gly 355 360 365 Thr Tyr Asn Asn Gln Trp Met Ile Val Asp Tyr Lys Ala Phe Ile Pro 370 375 380 Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu Thr Ile Leu Glu Gln Ile 385 390 395 400 Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr Glu Asp Leu Tyr Lys Thr 405 410 415 Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Phe Phe Glu Ile Val Phe Asn 420 425 430 Ala Ser Gly Leu Gln Asp Leu Val Ala Gln Tyr Gly Asp Trp Phe Ser 435 440 445 Tyr Thr Lys Asn Pro Arg Ala Gln Ile Phe Gln Arg Asp Gln Ser Leu 450 455 460 Val Glu Asp Met Asn Ser Met Val Arg Leu Ile Arg Tyr Asn Asn Phe 465 470 475 480 Leu His Asp Pro Leu Ser Leu Cys Glu Ala Cys Ile Pro Lys Pro Asn 485 490 495 Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp Leu Asn Pro Ala Asn Gly 500 505 510 Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Tyr Gln Arg Pro His Gly Gly Ile Asp 515 520 525 Val Lys Val Thr Ser Phe Ser Leu Ala Lys Arg Met Ser Met Leu Ala 530 535 540 Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro Pro Phe Gln Trp Ser Leu 545 550 555 560 Ser Pro Phe Arg Ser Met Leu His Met Gly Gln Pro Asp Leu Trp Thr 565 570 575 Phe Ser Pro Ile Ser Val Pro Trp Asp 580 585 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 17 cggttcctgc tccgctatca tcaagttgct gccaggcgca cg 42 <210> 18 <211> 199 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 18 Met Ser Ser Gly Asn Ala Lys Ile Gly Tyr Pro Ala Pro Asn Phe Lys 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Met Pro Asp Gly Gln Phe Arg Asp Ile Cys Leu Ser 20 25 30 Glu Tyr Arg Gly Lys Tyr Val Val Phe Phe Phe Tyr Pro Leu Asp Phe 35 40 45 Thr Phe Val Cys Pro Thr Glu Ile Ile Ala Phe Ser Asp Arg Ala Glu 50 55 60 Glu Phe Lys Lys Leu Asn Cys Gln Val Ile Gly Ala Ser Val Asp Ser 65 70 75 80 His Phe Cys His Leu Ala Trp Ile Asn Thr Pro Lys Lys Gln Gly Gly 85 90 95 Leu Gly Pro Met Asn Ile Pro Leu Val Ser Asp Pro Lys Arg Thr Ile 100 105 110 Ala Gln Asp Tyr Gly Val Leu Lys Ala Asp Glu Gly Ile Ser Phe Arg 115 120 125 Gly Leu Phe Ile Ile Asp Asp Lys Gly Ile Leu Arg Gln Ile Thr Ile 130 135 140 Asn Asp Leu Pro Val Gly Arg Ser Val Asp Glu Ile Leu Arg Leu Val 145 150 155 160 Gln Ala Phe Gln Phe Thr Asp Lys His Gly Glu Val Cys Pro Ala Gly 165 170 175 Trp Lys Pro Gly Ser Asp Thr Ile Lys Pro Asp Val Gln Lys Ser Lys 180 185 190 Glu Tyr Phe Ser Lys Gln Lys 195 <210> 19 <211> 43 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 19 cctgccccca acttcaaagc cacagctgtt atgccagatg gac 43

Claims (39)

  1. 적어도 하나의 내인성 숙주 세포 단백질 (HCP) 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 및 지단백질 리파제, 리소좀 산 리파제, 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 내인성 HCP의 감소된 발현 및/또는 활성을 갖는 재조합적으로 조작된 포유동물 세포.
  2. 제1항에 있어서, HCP 팔미토일-단백질 티오에스테라제를 코딩하는 파괴된 또는 불활성화된 유전자, 및 리소좀 산 리파제 단백질, 지단백질 리파제 단백질, 포스포리파제 D 및 포스포리파제 A2 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 HCP를 코딩하는 적어도 하나의 파괴된 또는 불활성화된 유전자를 포함하는 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 팔미토일-단백질 티오에스테라제가 PPT1이고, HCP를 코딩하는 적어도 하나의 불활성화된 유전자가 LAL, LPL, PLD3 및 LPLA2로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 리소좀 산 리파제 (LAL) 단백질, 지단백질 리파제 (LPL) 단백질, 포스포리파제 A2 (LPLA2) 단백질 및 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에서의 변형을 포함하는 것인 세포.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 리소좀 산 리파제 (LAL) 단백질, 지단백질 리파제 (LPL) 단백질, 포스포리파제 A2 (LPLA2) 단백질 및 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에서의 변형을 포함하며, 여기서 변형은 상기 변형 중 어떠한 것도 갖지 않는 세포의 발현 수준에 비해 변형을 갖는 세포에서의 LAL 단백질, LPL 단백질, LPLA2 단백질 및 PPT1 단백질의 발현 수준을 감소시키는 것인 세포.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 세포가 검출가능한 수준의 LAL 단백질, LPL 단백질, LPLA2 단백질 및 PPT1 단백질을 발현하지 않는 것인 세포.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 특정한 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 엑손 1 또는 2 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 세포.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 하기를 포함하는 것인 세포:
    a) LPL, LPLA2 및 PPT1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 엑손 1 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실, 및
    b) LAL 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 엑손 2 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실.
  9. 제8항에 있어서, PPT1 단백질이 서열식별번호: 1과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  10. 제9항에 있어서, 변형이 서열식별번호: 8 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 세포.
  11. 제8항에 있어서, LAL 단백질이 서열식별번호: 2와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  12. 제11항에 있어서, 변형이 서열식별번호: 7 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 세포.
  13. 제8항에 있어서, LPL 단백질이 서열식별번호: 3과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  14. 제13항에 있어서, 변형이 서열식별번호: 6 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 세포.
  15. 제8항에 있어서, LPLA2 단백질이 서열식별번호: 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  16. 제15항에 있어서, 변형이 서열식별번호: 5 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 변형이 PPT1, LAL, LPL 및 LPLA2로 구성된 목록으로부터의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열의 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4 내에서의 뉴클레오티드 삽입 또는 결실을 포함하는 것인 세포.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 세포.
  19. 제18항에 있어서, 바이오산물이 항체, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편, 항원-결합 단백질, 단백질-단백질 융합물 및 Fc-융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
  20. 제4항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 어떠한 변형도 갖지 않는 세포의 폴리소르베이트 분해 활성에 비해 실질적으로 감소된 폴리소르베이트 분해 활성을 갖는 단백질 A-결합 분획을 생산하는 것인 세포.
  21. 제20항에 있어서, 온전한 폴리소르베이트의 분해에서의 감소가 30% 초과인 세포.
  22. 제20항에 있어서, 온전한 폴리소르베이트의 분해에서의 감소가 30% 초과인 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 CHO 세포인 세포.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 CHO-K1 세포, CHOK1SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHO-S, CHO GS 녹-아웃 세포 (글루타민 신테타제), CHOK1SV FUT8 녹-아웃 세포, CHOZN, 또는 CHO-유래된 세포인 세포.
  25. 하기 단계를 포함하는, 바이오산물을 생산하는 방법:
    (a) 비변형된 세포와 비교하여 감소된 수준의 PPT1을 생산하도록 변형된 숙주 세포로부터 바이오산물 및 복수의 숙주 세포 단백질을 포함하는 샘플을 수득하는 단계; 및
    (b) 샘플을 적어도 하나의 정제 단계에 적용하여 적어도 하나의 숙주 세포 단백질을 제거하는 단계.
  26. 제25항에 있어서, 복수의 숙주 세포 단백질이 (a) 검출가능한 양의 PPT1 단백질을 포함하지 않고; (b) 검출가능한 양의 적어도 하나의 다른 리파제 또는 에스테라제를 포함하지 않는 것인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 숙주 세포가 하기를 포함하는 것인 방법:
    a) PPT1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에서의 변형; 및
    b) 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 A2 (LPLA2), 포스포리파제 D3 (PLD3), 또는 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산 히드롤라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에서의 변형.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 정제 단계가 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 방법.
  29. 하기 단계를 포함하는, 단백질 제형에서 폴리소르베이트 분해를 감소시키는 방법:
    (a) 숙주 세포를 변형시켜 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
    (b) 숙주 세포를 변형시켜 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 D3 (PLD3) 및/또는 포스포리파제 A2 (LPLA2)의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
    (c) 세포를 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;
    (d) 숙주 세포로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 분획을 추출하는 단계;
    (e) 단백질 분획을 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
    (f) 매질로부터 관심 단백질을 수집하는 단계;
    (g) 바이오산물을 지방산 에스테르와 조합하는 단계; 및
    (h) 임의적으로, 버퍼를 첨가하는 단계; 및
    (i) 임의적으로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하는 단계.
  30. 하기 단계를 포함하는, 단백질 제형에서 응집 또는 입자 형성을 감소시키는 방법:
    (a) 숙주 세포를 변형시켜 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
    (b) 숙주 세포를 변형시켜 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 D3 (PLD3) 및/또는 포스포리파제 A2 (LPLA2)의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
    (c) 세포를 관심 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;
    (d) 숙주 세포로부터 관심 단백질을 포함하는 단백질 분획을 추출하는 단계;
    (e) 단백질 분획을 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계; 및
    (f) 매질로부터 관심 단백질을 수집하는 단계; 및
    (g) 관심 단백질을 지방산 에스테르와 조합하는 단계; 및
    (h) 임의적으로, 버퍼를 첨가하는 단계; 및
    (i) 임의적으로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하는 단계.
  31. 하기 단계를 포함하는, 안정한 제형화된 바이오산물을 생산하는 방법:
    (a) 숙주 세포를 변형시켜 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 (PPT1) 단백질의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
    (b) 숙주 세포를 변형시켜 리소좀 산 리파제 (LAL), 지단백질 리파제 (LPL), 포스포리파제 D3 (PLD3) 및/또는 포스포리파제 A2 (LPLA2)의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계;
    (c) 세포를 바이오산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질감염시키는 단계;
    (d) 숙주 세포로부터 바이오산물을 포함하는 단백질 분획을 추출하는 단계;
    (e) 단백질 분획을 단백질 A 친화성 (PA) 크로마토그래피 또는 또 다른 친화성 크로마토그래피 방법, 양이온 교환 (CEX) 크로마토그래피, 음이온 교환 (AEX) 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)인 크로마토그래피 매질과 접촉시키는 단계;
    (f) 매질로부터 바이오산물을 수집하는 단계;
    (g) 바이오산물을 지방산 에스테르와 조합하는 단계;
    (h) 임의적으로, 버퍼를 첨가하는 단계; 및
    (i) 임의적으로, 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 첨가하는 단계.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포를 변형시켜 PPT1의 발현을 감소시키거나 또는 제거하는 단계가 PPT1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 엑손 2, 엑손 3 또는 엑손 4 내에 적어도 하나의 뉴클레오티드를 삽입하거나 또는 결실시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, PPT1 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 것인 방법.
  34. 제29항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의해 생산된 포스포리파제 중 임의의 것의 발현 및/또는 활성이 감소되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 감소된 발현 및/또는 활성이 지질분해 활성에 대한 검정에 의해 결정되는 것인 방법.
  36. 폴리소르베이트 및 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 포유동물 세포에 의해 생산된 바이오산물을 포함하는 제약 조성물.
  37. 폴리소르베이트 및 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 바이오산물을 포함하는 제약 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 바이오산물이 타네주맙, 레브리키주맙, 미리키주맙, 솔라네주맙, 도나네맙, 자고테네맙, 라무시루맙, 갈카네주맙, 익세키주맙, 둘라글루티드, 네시투무맙, 올라라투맙, 세툭시맙, 안지오포이에틴 2 mAb, 인슐린-Fc 융합 단백질, CD200R 효능제 항체, 에피레귤린/TGFα mAb, ANGPTL 3/8 항체, BTLA 항체 효능제, CXCR1/2 리간드 항체, GDF15 효능제, IL-33 항체, PACAP38 항체, PD-1 효능제 항체, N3pG A베타 mAb로도 불리는 pGlu-A베타, TNFα/IL-23 이중특이적 항체, 항-알파-시누클레인 항체, CD226 효능제 항체, MCT1 항체, SARS-CoV-2 중화 항체, FcgRIIB 항체, IL-34 항체, CD19 항체, TREM2 항체, 및 렐락신 유사체; 및 폴리소르베이트로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 바이오산물은 본 발명의 재조합 포유동물 세포에 의해 생산된 것인 제약 조성물.
  39. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 바이오산물.
KR1020227012072A 2019-10-15 2020-10-14 재조합적으로 조작된, 리파제/에스테라제-결핍 포유동물 세포주 KR20220054689A (ko)

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