JP6920293B2 - ＩｇＧ軽鎖におけるＮ末端切断の防止 - Google Patents

Description

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体は、２つの重鎖（Ｈｅ）および２つの軽鎖（Ｌｃ）からなる。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、過去３０年間にわたって医薬品としてますます開発されており、治療薬の最も急速に成長するクラスを代表する（非特許文献１；非特許文献２）。これは、抗体発見のための技術、例えばファージおよびリボソームディスプレイ、ならびにヒト抗体レパートリーを有するトランスジェニックマウスの開発によって可能になった（非特許文献３）。バイオ医薬品環境においては、抗体を、ＤＮＡの分子操作および哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションによって産生し、特異的に標的化された生物療法剤を産生することができる。発見プロセスから得られるリード抗体分子は、開発および臨床応用に使用するために、かなりの量で産生する必要がある。一般的に、組換え抗体の大規模産生には、ＣＨＯまたはＮＳ０のような安定な組換え哺乳動物細胞株を用いるが、これらの宿主細胞が抗体を正確に折り畳み、組み立てる能力および必要な翻訳後修飾を行うためである（非特許文献１）。一般に、目的の抗体遺伝子をコードする発現プラスミドの組み込みのために、トランスフェクションおよび選択することによって、宿主細胞株を操作する。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＬｃおよびＨｅ可変ドメインおよび定常ドメインのコード領域を含むＤＮＡでトランスフェクトすることができる。このＤＮＡは、ＣＨＯ宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ、次いで転写され翻訳されて、それぞれが分泌リーダー配列を含むＬｃおよびＨｅポリペプチドを産生する。

分泌リーダー配列は、新生ポリペプチドを細胞質からトランスロコンを介して小胞体（ＥＲ）に向ける、ペプチドの「郵便番号」として働く。詳細には、新生ポリペプチドが細胞質中のリボソームから出現すると、シグナルペプチドはシグナル認識粒子（ＳＲＰ）に結合し、この複合体は小胞体のトランスロコンを標的とする（非特許文献４）。次いで、ポリペプチドが膜を横切って細胞質からＥＲに移行すると、シグナルペプチド自体がシグナルペプチダーゼによって切断され、したがってシグナルペプチドは成熟タンパク質の一部ではない。ＨｅおよびＬｃポリペプチドは、細胞機構によって最終の抗体タンパク質産物にプロセシングされ、抗体は細胞上清中に分泌される。

真核生物シグナルペプチドは、有意な配列保存ではなく、構造的相同性によって特徴付けられ、３つのドメイン構造：正電荷を持つＮ末端ドメイン（Ｎ−ドメイン）、中心疎水性領域（ｈ−ドメイン）およびより極性のＣ末端領域（Ｃ−ドメイン）を持つ（非特許文献５）。ｈドメインはＳＲＰ認識および結合の主要な特徴であり、疎水性はＥＲ膜を横切る移行にとって重要である（非特許文献６）。Ｃ−ドメインは切断部位を規定し、「−３、−１規則」を満たさなければならず（非特許文献７；非特許文献８）、ここでシグナルペプチドの−１位（すなわち、切断部位の前の最後の残基）がＡ／Ｓ／Ｇ／Ｃ／Ｔ／Ｑアミノ酸残基によって占有されなければならず、−３位に芳香族化合物（Ｆ／Ｈ／Ｗ）、荷電（Ｄ／Ｑ／Ｋ／Ｒ）、または巨大極性残基（Ｎ／Ｑ）があってはならず、ならびに−３から＋１までにＰはない。切断部位の直前の同様のシグナルペプチダーゼ認識部位Ａ−Ｘ−Ｂもまた仮定されている（非特許文献９）。位置Ａは、Ａ／Ｇ／Ｓ残基またはより大きな脂肪族アミノ酸Ｌ／Ｖ／Ｉからなり、位置ＢはＡ／Ｇ／Ｓによって占有されている。シグナルペプチドの−１位を占めるアミノ酸は、シグナルペプチダーゼ切断部位にとって重要である（非特許文献１０）。さらに、−１位および−３位ならびにｈ／Ｃドメイン接合の上流のアミノ酸残基の同一性は、切断の部位および効率に影響を及ぼす（非特許文献１１）。ＮドメインとＨドメインとの間の接合部の位置もまた、切断部位に影響を与える（非特許文献１２）。

治療用抗体が着実に産生されることが必須である；トランスフェクトされた細胞株は、安定であり、再現可能な製品品質特性を有するタンパク質を産生しなければならない。例えば、最終的な治療用タンパク質製品中に不純物（すなわち、最終的な無傷のモノクローナル抗体または最終製剤緩衝液の一部ではない任意の物質）を有することは望ましくない。不純物は、製品の不安定性につながる可能性があり、免疫原性を引き起こし、製品の有効性を低下させ、および／または患者の安全性を損なうオフターゲット効果を有する可能性がある。不純物は、未加工細胞培養採取物の後工程によって除去することができる；しかし、このプロセスは、時間および費用の両方において高価である。したがって後工程の前に、最終的な培養採取物に存在する不純物を、できる限り確実に少なくすることが有益である。ＩｇＧ製品に非常に似ている不純物を検出および除去することも困難である。このように、これらの製品関連の変異体は、培養採取において最小限に抑えることが望ましい。

シグナルペプチドの切断プロセスは、一般に、抗体に対して非常に効率的であり、正確に切断された重鎖および軽鎖ポリペプチドの割合を高くする。しかし、切断部位が可変であり、その結果、ｍＡｂ重鎖および軽鎖の切断または伸長を生じる例がいくつか確認された（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。本発明者らは、多種多様なヒト抗体の重鎖および軽鎖の分泌のために、マウス重鎖シグナルペプチド配列（非特許文献１７；非特許文献１８）を使用し、非常に均一なＮ末端配列をもたらすシグナルペプチドの正確なプロセシングを観察した。ここで本発明者らは、マウス重鎖シグナルペプチド配列とＮ末端ＳＹＥアミノ酸モチーフを有するラムダ軽鎖との組合せに関連する、以前に文献に詳述されていない組換えヒトＩｇＧ軽鎖切断の特徴付けおよび防止を記載する。

具体的には、（特許文献１）に開示され、その内容全体を参照によって本明細書に組み入れる、治療用ＩｇＧ（ＭＥＤＩ８４９０）の開発の過程で、本発明者らは、約３〜８％の最終抗体製品は切断されたＬｃペプチドを含むことを観察した。切断されたＬｃは、そのＮ末端の３つのアミノ酸：セリン−チロシン−グルタミン酸（ＳＹＥ）を欠いていた。切断されたＬｃは、脱グリコシル化ＩｇＧの液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析によって検出され、還元ペプチドマッピング解析によって確認された。切断されたＬｃは、製品関連変異体であると考えられる。製品の均質性を高め、製品開発の危険性を低減するために、本発明者らは、ＬｃＳＹＥ切断が生成されないようにする方法を研究した。２つの異なるタンパク質工学的解決策を探索した：（１）ＬｃＮ末端ＳＹＥアミノ酸配列の他の選択肢への変更；（２）分泌リーダーペプチド配列に変化させる。本発明者らは、これらの解決策の両方が、ＭＥＤＩ８４９０抗体および他のＩｇＧタンパク質におけるＮ末端Ｌｃ切断を防止するのに有効であることを示した。このことは、これらがＩｇＧ産生に関するこの問題点に対して広く適用可能な解決策であることを実証する。

米国特許出願第１４／４３５，５２０号

Ｗａｌｓｈ、Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ、２０１４ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、ｍＡｂｓ、２：８４〜１００、２０１０ Ｓｔｒｏｈｌ、Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１１：１〜２、２０１４ Ｎｙａｔｈｉら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、１８３３：２３９２〜２４０２、２０１３ Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１８４：９９〜１０５、１９８５ Ｎｉｌｓｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、４２７：１１９１〜１２０１、２０１５ Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１７３：２４３〜２５１、１９８４ Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３３：１７〜２１、１９８３ Ｐｅｒｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．、１６７：３９１〜４０９、１９８３ Ｆｏｌｚら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：２０７０〜２０７８、１９８８ Ｎｏｔｈｗｅｈｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：３９７９〜３９８７、１９８９ Ｎｏｔｈｗｅｈｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：２１７９７〜２１８０３、１９９０ Ａｍｂｒｏｇｅｌｌｙら、ｍＡｂｓ、４：７０１〜７０９、２０１２ Ｋｏｔｉａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３９９：１９０〜１９５、２０１０ Ｙｉｎｇら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１１１：６６〜６８、２００７ Ｓｈａｗら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９：５２５〜５２９、１９９２ Ｐｅｒｓｉｃら、Ｇｅｎｅ、１８７：９〜１８、１９９７ Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：３８３３〜３８３７、１９８９

本発明の主な態様のいくつかは、以下に要約される。追加の態様は、本開示の発明を実施するための形態、実施例、図、および特許請求の範囲の節に記載される。本開示の各節における説明は、他の節と併せて読むことが意図されている。さらに、本開示の各節に記載された様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることができ、そのような組合せはすべて本発明の範囲内に含まれるものとする。

一態様では、本発明者らは、切断されていない成熟抗体Ｌｃポリペプチドを産生する方法であって、（ａ）配列番号５［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］に示された第１の新生Ｎ末端配列を含む第１の抗体Ｌｃアミノ酸配列を同定する工程；および（ｂ）第１の新生Ｎ末端配列の代わりに、第２の抗体Ｌｃポリペプチドは、配列番号６［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ］、配列番号７［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ］、配列番号８［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ］、配列番号９［マウスリーダー＋Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ］、配列番号１０［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ］、配列番号１１［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ］、配列番号１２［Ｖ−ラムダ３リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］、配列番号１３［Ｖ−ラムダ１リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］、および配列番号１４［Ｖ−カッパ１リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］からなる群から選択される第２の新生Ｎ末端配列を含むことを除いて、第１の抗体Ｌｃポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する第２の抗体Ｌｃポリペプチドを培養細胞中で発現させる工程を含み；それによって、第１の３つのアミノ酸（ＳＹＥ）を切断しない切断されていない成熟抗体Ｌｃポリペプチドを産生する方法を提供する。

別の態様では、本発明者らは、抗体ＬｃポリペプチドのＮ末端切断を防止する方法であって、（ａ）配列番号５［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］に示された第１の新生Ｎ末端配列を含むアミノ酸配列を有する第１の抗体Ｌｃポリペプチドを工程であって、第１の新生Ｎ末端配列は本質的にリーダー配列および成熟Ｎ末端トリペプチドからなり、培養細胞中での第１の抗体Ｌｃポリペプチドの発現は、培養細胞中で発現する第１の抗体Ｌｃポリペプチドの少なくとも約３％において成熟Ｎ末端トリペプチドの切断をもたらす工程；および（ｂ）第１の新生Ｎ末端配列の代わりに、第２の抗体Ｌｃポリペプチドは配列番号６［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ］、配列番号７［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ］、配列番号８［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ］、配列番号９［マウスリーダー＋Ｇｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ］、配列番号１０［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ］、配列番号１１［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ］、配列番号１２［Ｖ−ラムダ３リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］、配列番号１３［Ｖ−ラムダ１リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］、および配列番号１４［Ｖ−カッパ１リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］からなる群から選択される第２の新生Ｎ末端配列を含むことを除いて、第１の抗体Ｌｃポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する第２の抗体Ｌｃポリペプチドを培養細胞中で発現させる工程であって；第２の新生Ｎ末端配列は本質的にリーダー配列および成熟Ｎ末端トリペプチドからなり；培養細胞中での第２の抗体Ｌｃポリペプチドの発現は、成熟Ｎ末端トリペプチドの非切断をもたらす工程を含み；それによって、抗体ＬｃポリペプチドのＮ末端切断を防止する方法を提供する。

さらなる態様では、本発明者らは、抗体Ｌｃポリペプチドの均質集団を含む組成物を産生する方法であって：（ａ）配列番号５［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］に示された第１の新生Ｎ末端配列を含むアミノ酸配列を有する第１のＬｃポリペプチドを同定する工程；（ｂ）第２のＬｃポリペプチドを培養細胞中で発現させる工程であって、第２のＬｃポリペプチドは配列番号６［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ］、配列番号７［マウスリーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ］、配列番号８［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ］、配列番号９［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ］、配列番号１０［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ］、配列番号１１［マウスリーダー＋Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ］、配列番号１２［Ｖ−ラムダ３リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］、配列番号１３［Ｖ−ラムダ１リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］、および配列番号１４［Ｖ−カッパ１リーダー＋Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ］からなる群から選択される第２の新生Ｎ末端配列を含むことを除いて、第２のＬｃポリペプチドは第１のＬｃポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し；第２のＬｃポリペプチドは、培養細胞によって上清へ分泌され、上清は第２のＬｃポリペプチドのアミノ酸配列変異体を少なくとも９８％含まない工程；ならびに（ｃ）上清から第２のＬｃポリペプチドを採取する工程を含み；それによって、均質集団の抗体Ｌｃポリペプチドを含む組成物を産生する方法を提供する。好ましくは、組成物は医薬組成物である。一部の実施形態では、第１のＬｃポリペプチドおよび／または第２のＬｃポリペプチドは、抗体の一部である。好ましくは、抗体は治療用抗体である。好ましくは、上清は第２のＬｃポリペプチドのアミノ酸配列変異体を少なくとも９９％、または１００％含まない。アミノ酸配列変異体は、逆相液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を用いて検出できる。

培養細胞は、真核動物細胞であり、好ましくは哺乳動物細胞である。場合によっては、培養細胞はＣＨＯ細胞である。

場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号６である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号７である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号８である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号９である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１０である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１１である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１２である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１３である。場合によっては、第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１４である。

ＳＹＥ ＬｃおよびマウスＨｅリーダー配列（配列番号５）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃのデコンボリューションされた質量分析解析を示す図である。切断されていないＬｃと一致する主要ピーク（２２，６９２Ｄａ）に加えて、切断されたＬｃ種の理論的分子量と一致する２２，３１３Ｄａの種が検出された。 一過性発現したＣＨＯ材料のペプチドマッピング解析を示す図であり、切断は最初の３つのＮ末端アミノ酸（ＳＹＥ）を欠いていることが確認される。 マウスシグナルペプチド（灰色の配列）の正しいおよび代替切断部位（↓）を有するＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃ（黒色の配列）のＮ末端を図式的に示す図である。 異なるバイオリアクタースケールおよび発現プラットフォームから産生されたＭＥＤＩ８４９０の切断されたＬｃ（黒棒）および完全長Ｌｃ（灰色棒）の相対割合（％）を示す図である。５Ｌスケールにおける一過性発現、２つの独立した初代形質転換体の５０Ｌおよび２５０Ｌスケールにおける安定な発現を示す。 ５Ｌバイオリアクタースケールの６つの独立した安定な形質転換体系統由来の７クローンから産生されたＭＥＤ１８４９０を示す図である。切断されたＬｃ（黒棒）および完全長Ｌｃ（灰色棒ｓ）の相対割合（％）を還元ＩｇＧのＬＣ−ＭＳ解析によって測定した。 ＳＹＥ Ｌｃおよびイントロンを除去したマウスＨｅリーダー配列（配列番号５）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 ＳＳＥ Ｌｃおよびイントロンを除去したマウスＨｅリーダー配列（配列番号６）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 ＳＹＶ Ｌｃおよびイントロンを除去したマウスＨｅリーダー配列（配列番号７）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 ＱＳＶ Ｌｃおよびイントロンを除去したマウスＨｅリーダー配列（配列番号８）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 ＳＹＥ Ｌｃおよびイントロンを除去したＶ−ラムダ３リーダー配列（配列番号１２）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 ＳＹＥ Ｌｃおよびイントロンを除去したＶ−ラムダ１リーダー配列（配列番号１３）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 ＳＹＥ Ｌｃおよびイントロンを除去したカッパリーダー配列（配列番号１４）をコードする発現コンストラクトから産生されたＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの電荷デコンボリューションされたマススペクトルを示す図である。 異なるシグナルペプチド（表５に列挙した）を用いて、一過性および安定な発現システムによって産生されたＭＥＤＩ８４９０の切断された（黒棒）および完全長（灰色棒）Ｌｃの相対割合（％）を示す図である。 異なるＬｃ Ｎ末端アミノ酸配列を用いた、ＭＥＤＩ８４９０の切断された（黒棒）および完全長（灰色棒）Ｌｃの相対割合（％）を示す図である。 マウス（シグナルペプチド１、配列番号１）または代替（シグナルペプチド、配列番号３）シグナルペプチドのいずれかを有するＳＹＥ Ｎ末端を有する２つの関係がないｍＡｂｓ（ＡおよびＢ）の切断された（黒棒）および完全長（灰色棒）Ｌｃの相対割合（％）を示す図である。切断されたおよび完全長Ｌｃの相対割合を還元ＩｇＧのＬＣ−ＭＳ解析によって測定した。 ＭＥＤＩ８４９０ ＳＹＥ Ｌｃ（配列番号１５）のアミノ酸配列を示す図である。Ｎ末端ＳＹＥモチーフに下線を引いた。ＳＹＥモチーフは、ＳＳＥ ＬｃのＳｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕに、ＳＹＶ ＬｃのＳｅｒ−Ｔｙｒ−Ｖａｌに、ＱＳＶ ＬｃのＧｌｎ−Ｓｅｒ−Ｖａｌに、ＱＡＶＬｃのＧｉｎ−Ａｌａ−Ｖａｌに、ＱＳＡＬｃのＧｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａに、およびＱＹＶ ＬｃのＧｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌに置換される。

本発明は、ＬｃポリペプチドのＮ末端切断を防止する方法を提供する。治療用ｍＡｂの開発の初期段階では、分子の品質に関連する特性が、開発および製造の適合性を確実にするための日常的な評価中に評価される。そのような発展性評価の間、ＭＥＤＩ８４９０の切断された軽鎖変異体、組換えヒトＩｇＧ１が還元ＩｇＧのＬＣ−ＭＳ解析によって観察された。ＬＣ−ＭＳおよびペプチドマッピング解析は、成熟軽鎖のＮ末端からの最初の３つのアミノ酸（ＳＹＥ）は分子の約３〜８％で切断され、一過性の安定した発現プラットフォームならびに異なるバイオリアクタースケールおよびＣＨＯ細胞系統由来の製品に一貫して存在することを明らかにした。シグナルペプチドのＣ末端に隣接するアミノ酸は切断部位に影響を及ぼす可能性があることが実証された（Ｎｏｔｈｗｅｈｒら、１９９０；Ｎｏｔｈｗｅｈｒら、１９８９；Ｆｏｌｚら、１９８８）。

切断されたＬｃを生じさせた元のリーダー配列は、アミノ酸配列ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号１）を有していた。これはマウス重鎖リーダーであり、多くの場合組換えｍＡｂ生産に使用される（Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７）。マウスシグナルペプチドは、それぞれ−３またはＡにＶ、および−１またはＢにＳを有する、切断部位の「−３、−１」および「Ａ−Ｘ−Ｂ」規則に従う（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ、１９８３、１９８４；ＰｅｒｌｍａｎおよびＨａｌｖｏｒｓｏｎ、１９８３）。Ｌｃ切断はＮ末端にＳＹＥモチーフを有する分子（ＳＹＥ Ｌｃ）に特異的である。この発見は予想外であった；マウスＨｅリーダー配列は、広い範囲の治療用ＩｇＧ分子のためのヒトＨｅおよびＬｃポリペプチドの産生に広く使用されており、切断の問題は以前に観察されていない。

切断されたポリペプチドが存在することは、除去するための追加の後工程を必要とする可変量の製品関連変異体を創出し、それによって製品収量が低減されて不都合である。さらに、いくつかの抗体について、Ｎ末端でのＨｅの切断は、結合特異性に影響を及ぼすことが報告されている（Ｓｈａｗら、１９９２）。ＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃにおける切断は、有効性に影響を及ぼさなかった。しかしＭＥＤＩ８４９０製品関連の変異体は、製品品質特性による潜在的なバッチ間の変動があるため望ましくない（Ａｍｂｒｏｇｅｌｌｙら、２０１２；Ｋｏｔｉａら、２０１０；Ｙｉｎｇら、２００７）。好ましい戦略は、精製中にＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃタンパク質を制御または除去するのではなく、供給源、すなわち細胞培養プロセスにおけるＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃタンパク質の切断を防止することであった。したがって、本発明者らは、この切断の発生を回避するための２つの方法として、代替的なＶ−ラムダ３生殖細胞系列Ｌｃ Ｎ末端および３つの代替シグナルペプチドの使用を研究した。

本発明者らは、ＬｃのＮ末端で分泌リーダーペプチド配列を変化させることにより、この切断の発生を防止できることを見出した。本発明者らは標準的なマウスリーダー配列を３つの異なるリーダー配列：Ｖ−ラムダファミリーからの２つのリーダー配列、ＭＡＷＴＰＬＬＬＰＬＬＴＦＣＴＳＥＡ（配列番号２）およびＭＡＧＦＰＬＬＬＴＬＬＴＨＣＡＧＳＷＡ（配列番号３）、ならびにカッパＬｃリーダー配列、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＫＣ（配列番号４）と置換した。これらの代替リーダー配列ではＳＹＥ切断は起こらず、いずれの場合も１００％の所望の生成物となった。本発明者らは、軽鎖切断を回避するこの方法を、ＳＹＥＮ末端配列を有する他のＩｇＧ軽鎖へ適用し、これらの分子についてはＬｃ切断は検出されず、この解決策は一般に適用可能であり、元のＭＥＤＩ８４９０分子に特異的ではないことを示す。

標準的なマウスリーダー配列を保持し、ＬｃＮ末端の最初の３つのアミノ酸を、例えばＳＹＶ、ＳＳＥ、ＱＳＶ、ＱＡＶ、ＱＳＡ、またはＱＹＶに変更することによって、切断を防ぐことも可能である。さらに、当業者は、当技術分野で一般的に使用されるＳＹＥではない他の３つのアミノ酸開始配列が、本発明によって企図されることを理解するであろう。さらに、この方法を使用して、分子の特性、例えば特異性、標的結合、および／または製品安定性を著しく変化させない３つのアミノ酸配列を選択することにより、アミノ酸配列の変化に影響されない追加の配列を開発することができる。

つまり、本発明者らは、Ｎ末端Ｌｃ切断を防止し、配列番号５を含む新生Ｎ末端Ｌｃ配列を配列番号６〜１４のいずれか１つを含む新生Ｎ末端Ｌｃ配列に置換することによって、切断されていない、すなわち完全長成熟抗体Ｌｃを産生する、幅広く適用可能な方法を提供する。本発明者らはまた、配列番号５を含む新生Ｎ末端Ｌｃ配列を、配列番号６〜１４のいずれか１つを含む新生Ｎ末端Ｌｃ配列で置換することによって、抗体分子の均質集団を含む組成物を製造し、培養細胞中に置換された新生配列を含むＬｃポリペプチドを発現させ、細胞培養上清からＬｃポリペプチドを採取する方法を提供し、それらのすべては当業者に公知の方法を用いて達成することができる。抗体が産生される実施形態では、抗体重鎖もまた培養細胞中で発現する。

本研究の結果として、「ＳＹＥ」Ｌｃ Ｎ末端配列は、ＩｇＧ分子の開発のための配列障害として同定されている。リード単離および最適化工程中に分子に有害作用を及ぼさずに「ＳＹＥ」を変更することができる場合は、変更される。これが不可能である場合、「ＳＹＥ」Ｎ末端 Ｌｃモチーフが出現する場合、マウスＨｅリーダー配列ではなく、代替リーダー配列（例えばＶ−ラムダ１ファミリーリーダー配列）が使用される。結果として、Ｌｃ切断が防止される。

本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、状況が明らかに別の方法で指示しなければ、複数の指示対象を含む。「ａ」（または「ａｎ」）という用語、ならびに「１つまたはそれ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、同じ意味で使用することができる。

さらに、「および／または」は、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれが、他者の有無にかかわらず、具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、「Ａおよび／またはＢ」のようなフレーズで使用される「および／または」という用語は、ＡおよびＢ、ＡまたはＢ、Ａ（単独）およびＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」のようなフレーズで使用される「および／または」という用語は、Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；ＡおよびＢ；ＡおよびＣ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を含むことが意図される。

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第５版、Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ編、２０１３）、Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋら編、２００８）、およびＴｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２版、Ｐ−Ｓ．Ｊｕｏ、２００２）は本明細書で使用されるいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供することができる。

単位、接頭辞および記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）に受け入れられた形式で示されている。数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって有することができる本発明の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下に定義された用語は、明細書の内容全体を参照することにより十分に定義される。

実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語で記載される場合は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および／または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される別の類似の実施形態が含まれる。

アミノ酸は、本明細書では、一般的に知られている３文字の記号またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨された１文字の記号によって表される。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている１文字コードによって表される。

「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では同じ意味で使用される。代表的な抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、Ｃ１を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域と、フレームワーク（ＦＷ）領域と呼ばれるより保存された領域が点在する領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＷから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫システムの種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体システムの第１成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。

「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質またはこれらの組合せのような標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を表すことができる。本明細書において使用する場合、「抗体」という用語は、無傷ポリクローナル抗体、無傷モノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、少なくとも２つの無傷抗体から生成された二重特異性抗体のような多特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を含む。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマおよびミューとそれぞれ呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）の５つの主要クラスの免疫グロブリンのいずれかであり可能性がある。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なった周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。哺乳類の軽鎖にはラムダとカッパという２つのクラスがある。抗体は、むき出しであるか、または、毒素、放射性同位元素、その他のような他の分子に結合している可能性がある。

「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書では同じ意味で使用される。ポリマーは直鎖状または分枝鎖状である場合があり、修飾されたアミノ酸を含むことができ、非アミノ酸はそれを中断することができる。これらの用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との抱合のような他の任意の操作もしくは修飾が挙げられる。この定義には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸、その他を含む）の１つまたはそれ以上のアナログ、ならびに当技術分野で既知の他の修飾を含むポリペプチドも含まれる。ある特定の実施形態では、ポリペプチドは一本鎖または関連鎖として存在することができる。

「リーダー配列」は、細胞膜を横切って輸送される新たに合成されたポリペプチドのＮ末端に存在する短いペプチド（一般的に約５〜３０アミノ酸長）である。リーダー配列は、ポリペプチドを小胞体（ＥＲ）に、トランスロコンと呼ばれるタンパク質透過チャネルを介して誘導する。リーダー配列はＥＲ中のポリペプチドから切断され、成熟タンパク質の一部を形成しない。リーダー配列は、時々、分泌配列、リーダーペプチド、分泌リーダーペプチド、シグナルペプチド、シグナル配列、標的シグナル、局在化シグナル、局在化配列または輸送ペプチドと呼ばれる；これらの用語は本明細書で同じ意味で使用される。

「成熟」ポリペプチドまたは配列（例えば、成熟抗体Ｌｃ）は、分泌リーダー配列を除去するために細胞内翻訳後プロセシングを受けたものを意味する。「新生」ポリペプチドまたは配列（例えば新生Ｎ末端配列）は、リーダー配列が切断されていないものを意味する。「切断されていない」ポリペプチドは、リーダーペプチドが切断されているが、成熟ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は翻訳後プロセシングの過程で切断されていないものである。

「治療用抗体」は、疾患または状態を治療または予防するために対象に投与することができるものである。「対象」は、診断、予後または療法が望まれる任意の個体、特に哺乳動物である。哺乳動物対象は、ヒト、家庭内動物、家畜、スポーツ動物および動物園の動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、その他を含む。「治療する」とは、診断された病状または疾患の治癒、減速、症状の緩和および／または進行の停止を意味する治療手段を表す。したがって、治療を必要とする対象には、既にその疾患がある対象が含まれる。「防止する」とは、標的とされた病状または疾患．の進行を防止および／または遅らせる予防的または防止手段を表す。したがって、防止が必要な対象には、その疾患に罹患しやすい対象が含まれる。

「医薬組成物」という用語は、活性成分の生物学的活性が効果的であるような形態であり、組成物が投与される対象に対して容認し難いほど毒性である追加の成分を含まない製剤を表す。そのような組成物は滅菌され、生理食塩水のような薬学的に許容される担体を含むことができる。適した医薬組成物は、１つまたはそれ以上の緩衝液（例えば酢酸緩衝液、リン酸緩衝液またはクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、安定剤（例えばヒトアルブミン）、防腐剤（例えばベンジルアルコール）、バイオアベイラビリティを増強するための吸収促進剤および／または他の従来の可溶化剤または分散剤を含むことができる。

本開示に引用されたすべての参考文献は、参照によってその全体を組み入れる。さらに、本明細書に引用または言及された製品の製造業者の取扱説明書またはカタログは、参照によって組み入れる。本明細書に参照によって組み入れられた文献またはその中の教示は、本発明の実施において使用可能である。本明細書に参照によって組み入れられた文献は、先行技術であると認められていない。

本発明は、以下の非限定的な実施例においてさらに記載される。

材料および方法
発現コンストラクト
特定のリーダーおよび／または変更されたＮ末端可変Ｌｃ領域をコードするＤＮＡを用いて、一過性および安定したトランスフェクションのためにプラスミドを構築した（Ｇｅｎｅ Ａｒｔ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。ＤＮＡを制限消化およびライゲーションに供して、必要な機能的構成要素を適切なプラスミド骨格に組み立てた。

一過性発現のためのｐＥＵベクターおよび安定な発現のためのＧＳタンデムベクターの酵素消化およびライゲーションを用いてプラスミドを構築した。ｐＥＵベクターは、以下の要素：ＡｍｐＲ、ｐｏｌｙＡ、ｏｒｉＰ、ｐＵＣｏｒｉ、ＥＢＮＡ−１、ＥＦ−１アルファプロモーターおよび適したＨｃ／ＬｃＤＮＡフラグメントを含んでいた。一過性トランスフェクションに使用したＩｇＧ発現プラスミドは、Ｐｅｒｓｉｃら、（１９９７）およびＤａｒａｍｏｌａら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、３０：１３２〜１４１、２０１４）によって記載された発現ベクターに基づいていた。安定なトランスフェクションに使用したＩｇＧ発現プラスミドは、ｐＥＥ１２．４発現プラスミドに基づいていた（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。ＧＳタンデムベクターは、以下の要素：ベータラクタマーゼ、ＳＶ４０およびＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ、グルタミンシンセターゼｃＤＮＡ、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター、ｐＥＥ６ ｏｒｉおよび適したＨｃ／ＬｃＤＮＡフラグメントを含んでいた。

一過性トランスフェクション
ヒトｍＡｂ ＭＥＤＩ８４９０、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂ（すべてのＩｇＧ γ１ ＴＭ、λ；Ｏｒｇａｎｅｓｙａｎら、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．、６４：７００〜７０４、２００８）の発現プラスミドを、一過性発現によって評価した。一過性トランスフェクションは、Ｄａｒａｍｏｌａら、（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、３０：１３２〜１４１、２０１４）によって記載された方法に従って、ＨｅおよびＬｃベクター、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）およびＣＨＯ細胞をＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）または独自の培地中で使用して実行した。独自の栄養供給を、培養期間中急速静注添加として補充した。

安定なＣＨＯプールトランスフェクション
ＣＨＯＫＩＳＶ細胞中で、Ａｍａｘａ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）システムおよび試薬（Ｌｏｎｚａ Ｇｒｏｕｐ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて安定なトランスフェクションを実行した。トランスフェクトした細胞を選択し、メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）の存在下のＣＤＣＨＯにおいて維持した。細胞のプールを拡大し、次いで、ＣＤ ＣＨＯを用いた１４〜１７日フェドバッチプロセスでの組換えタンパク質産生のために使用した。独自の栄養供給を、培養期間中急速静注添加として補充した。

安定なＣＨＯ一次トランスフェクタントおよびクローン細胞株
安定なプールについて上記したように、ＣＨＯＫＩＳＶ細胞をトランスフェクトすることにより、安定なＣＨＯ一次トランスフェクタントを生成した。次いで、トランスフェクトした細胞を希釈し、ＭＳＸの存在下のＣＤ ＣＨＯ中で選択した。個々のコロニーを増殖させ、次いで、上記のプールについて記載したように、フェドバッチプロセスにおける力価、細胞密度および生存率について評価した。クローン細胞株は、９６ウェルプレート中でＭＳＸの存在下のＣＤ ＣＨＯ中で限界希釈法クローニングによって、一次トランスフェクタントから単離された。独自の栄養供給を急速静注添加した独自の培地を用いて、個々のコロニーを増殖させ、１４日間のフェドバッチプロセスで増殖および生産性について評価した。

ＩｇＧの精製および定量
細胞培養上清を遠心分離によって採取した。浄化された採取物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いた標準Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティクロマトグラフィによって精製した。細胞培養上清中のＩｇＧは、Ｌｃ切断の有無を検出するためのＱＴＯＦ質量分析によって特徴付けられ、または各試料からのピークサイズを校正曲線と比較することによって、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ１１００ ＳｅｒｉｅｓもしくはＨＰ１２００ Ｓｅｒｉｅｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）でのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＨＰＬＣアフィニティクロマトグラフィにより定量化された。

質量分析：還元ＩｇＧ解析
ＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ１ ＱＴＯＦスペクトロメーター（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）と連結したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システムを用いて逆相ＬＣ−ＭＳ解析を行った。１ｍｇ／ｍｌの精製したタンパク質を、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭトリスＨＣ１、ｐＨ８で３７℃、３０分間インキュベーションすることによって還元し、２μｇを５０ｍｍ×２．１ｍｍ ＢＥＨＣ４分析カラム（粒径１．７μｍ）に注入し、６５℃で保持した（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）。タンパク質は、１５分間のバイナリグラジエントを用いて０．１５ｍＬ／分の一定流速で溶出した；溶媒Ｂを最初に５％で３分間保持し、続いて２５％に増加させ、次いで４５％で１０分以上増加させた後、最終時間にわたって９５％に増加させた。高濃度（９５％）と低濃度（５％）の間で７分間溶媒Ｂを振動させることにより、次の注入前にカラムを洗浄した。溶媒Ａ（水）および溶媒Ｂ（アセトニトリル）に０．０１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸および０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸を添加した。スペクトルは５００〜４５００Ｔｈの間で取得した。機器パラメータには、＋ｖｅイオン化モード、３．４ｋＶの電源電圧、５０Ｖの試料コーン電圧、１４０℃のイオン源温度、および４００℃の脱溶媒温度が含まれた。タンパク質電荷エンベロープを、ＭａｘＥｎｔ１を用いてデコンボリューションした。所与のサンプルについて、非切断ＬＣおよび切断種の定量的評価は、ＳＹＥ切断種について検出されたイオン電流を、非切断ＬＣおよび切断種について検出されたイオン電流の合計で除すことによって決定した。切断されたＬＣの割合は全ＬＣの％で報告され、他のＬＣ修飾を考慮しなかった。

質量分析：還元ペプチドマップ解析
各試料について、１．６ｍｇ／ｍｌのタンパク質１００μｇを変性させ、５．２Ｍグアニジン、８５ｍＭトリス、０．７ｍＭ ＥＤＴＡおよび１６ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．６で３０分間、３７℃で還元した。還元後、試料を４０ｍＭヨードアセトアミドと共に暗所、室温で３０分間インキュベートした。還元されアルキル化されたタンパク質を、２Ｍ尿素、１００ｍＭトリス、ｐＨ７．６に緩衝液交換し、トリプシンを用いて酵素対基質比１：２０、３７℃で４時間インキュベートした。

ＳＹＮＡＰＴ（登録商標）Ｇ２ ＱＴＯＦスペクトロメーター（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）に連結したＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（登録商標）システムを用いて、逆相ＬＣ−ＭＳによってタンパク質消化物を分析した。各試料について、５μｇのＧｌｕ−Ｃトリプシン消化物を１５０ｍｍ×２．１ｍｍ ＢＥＨ３００ Ｃ１８分析カラム（粒径１．７μｍ）に注入し、５５℃で保持した（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）。ペプチドは７５分間のバイナリグラジエントを用いて０．２ｍＬ／分の一定流速で溶出した；溶媒Ｂを０％から３５％まで増加させた。高濃度（９５％）と低濃度（５％）の間で５分間溶媒Ｂを振動させることにより、次の注入前にカラムを洗浄した。溶媒Ａ（水）および溶媒Ｂ（アセトニトリル）に０．０２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸を添加した。スペクトルは、データ独立取得モードを用いて５０〜２５００ｍ／ｚの間で取得した。低エネルギーおよび高エネルギースペクトルは、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ（商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ）を用いて加工した。

ｃＤＮＡ配列解析
安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞株からの個々のＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃ転写物の配列解析を、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）を用いてＣＨＯ細胞からＲＮＡを単離することによって実行し、続いてＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を用いてＬｃ ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＴＯＰＯ（登録商標）−ＴＡクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いて得られたｃＤＮＡのクローニングを、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換を行い、すべては製造業者の取扱説明書に従った。得られた個々のコロニー中のクローニングされた配列を、配列決定のためのサンガー法を用いて配列検証した。

一過性発現したＭＥＤＩ８４９０の細胞培養採取における軽鎖切断の同定
ＭＥＤＩ８４９０は、一過性トランスフェクションによってマウスＨｅリーダーとともに発現し、この分子の所定の発展性評価研究を支援した（Ｙａｎｇら、ｍＡｂｓ、５：７８７〜７９４、２０１３）。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で１３日間培養し、遠心分離により細胞上清を採取することにより材料を生成した。浄化した採取物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元ＬＣ−ＭＳによって分析した（図１Ａ）。検出された主要ピークは、無傷ｍＡｂ Ｌｃの理論的質量と一致した。異常にも、最初の３つのアミノ酸（ＳＹＥ）を欠く切断されたＬｃ変異体と一致する低分子量種も検出され、総シグナルの８％を占めた。ペプチドマッピング解析は、Ｌｃ切断を確認した（図１Ｂおよび図１Ｃ）。

発現プラットフォーム、細胞培養プロセスおよびクローン系統のＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃ切断への影響
切断されたＬｃ変異体の生成がプロセス駆動型であるかどうかを調べるために、５Ｌスケールでの一過性トランスフェクションからのＭＥＤＩ８４９０を発現するＣＨＯ細胞、ならびに５０Ｌおよび２５０Ｌスケールでの２つの独立した安定な一次トランスフェクタントをフェドバッチプロセスで実行した。さらに、５Ｌスケールで６つの独立した安定な一次トランスフェクタントから単離されたＭＥＤＩ８４９０を発現する７つのクローンから材料を生成し、クローン系統のＬｃ切断への影響を調べた。すべてのスケールからの細胞培養物は１４日目に採取した。ＭＥＤＩ８４９０を精製し、還元された抗体ＬＣ−ＭＳ解析によって特徴付けた（図２Ａおよび図２Ｂ）。結果は、Ｌｃの２つの形態：９２〜９７％の所望の完全長Ｌｃおよび全Ｌｃ分子の３〜８％の切断されたＬｃ変異体が検出されたことを示す。すべてのバイオリアクタースケール、発現プラットフォームおよびクローン系統において、２つのＬｃの形態の割合における変動は最小限であり、切断されたＬｃ変異体の生成は、これらの因子から独立していることを示す。

Ｌｃ切断の原因としてのＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃ ｍＲＮＡプロセシングの研究
ＭＥＤＩ８４９０の一過性および安定な発現プラスミドは、ＬｃおよびＨｅのシグナルペプチドコード領域内にイントロン配列を含んでいた（Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７；Ｏｒｌａｎｄｉ、１９８９）。Ｌｃ ＳＹＥ切断が、Ｌｃ ｍＲＮＡの非効率的または誤ったスプライシングのために転写産物でコードされたかどうかを評価するために、ＭＥＤＩ８４９０を発現する安定なクローンＣＨＯ細胞株についてｃＤＮＡ配列解析が実行された。ＲＮＡを４つの細胞株から単離し、続いてＬｃｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲおよび個々の得られたｃＤＮＡ分子のＴＯＰＯ（登録商標）ベクターへのクローニングを行った。３２７個の個々のクローンのシークエンシングは、Ｎ末端「ＳＹＥ」アミノ酸モチーフを含む完全長軽鎖配列はＬｃ転写産物によってコードされることを示した。さらに、ＧｅｎｅＳｐｌｉｃｅｒスプライス部位予測アルゴリズムによって分析した場合、ＭＥＤＩ８４９０Ｌｃ配列内に代替スプライス部位は同定されなかった（Ｐｅｒｔｅａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２９：１１８５〜１１９０、２００１）。

代替Ｎ末端アミノ酸配列の研究：一過性トランスフェクションを使用
本発明者らは、ＬｃのＮ末端の配列は、ＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃ変異体の生産に影響を及ぼすかどうか研究した。ＭＥＤＩ８４９０のＬｃ配列とＮ末端の１つのアミノ酸（ＳＹＶおよびＳＳＥ）が異なる、Ｖ−ラムダ３ファミリーからの２つの代替Ｌｃ配列が、ＭＥＤＩ８４９０の生産のために選択された。ＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの遺伝的に切断された型も、Ｎ末端ＳＹＥアミノ酸をコードするＤＮＡ配列が欠失したＬｃ切断の対照として構築された。

代替Ｎ末端アミノ酸配列を研究するための一過性トランスフェクションを行った。内生の天然のリーダーイントロンの有無にかかわらず、マウスＨｅリーダー（配列番号１）を有する代替Ｌｃ配列をコードするＤＮＡ配列を合成し、一過性ＭＥＤＩ８４９０Ｌｃ発現プラスミドにクローニングした。材料は、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で１０〜１４日間、フェドバッチプロセスで培養することによって産生され、遠心分離によって細胞上清を採取した。浄化された採取物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ アフィニティクロマトグラフィによって精製し、ＱＴＯＦ質量分析によって特徴付けて、Ｌｃ切断の有無を検出した。

シグナルＰ４．１を用いて、マウスシグナルペプチドを含む各未成熟ポリペプチドのインシリコ解析を、代替Ｌｃ配列で行った。（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、８：７８５〜７８６、２０１１）。すべての場合において、Ｎ末端アミノ酸配列は、シグナルペプチドとして同定され、予測された切断部位は位置−１と＋１との間（すなわち、シグナルペプチドの最後の残基および成熟タンパク質の最初の残基）にあることを解析は示し、シグナルペプチドは完全に無傷のＬｃを残して切断されることを示している。
結果を表１に要約し、代表的な結果を図１Ａおよび図３〜６に示す。

Ｌｃ切断は、操作されたＬｃのＮ末端のいずれかを用いて産生された精製された材料では検出されなかった（図１０Ｂ）。分泌リーダー配列中のイントロンの有無は、ＳＹＥ切断が生じるかどうかに影響を及ぼさない。このことは、切断はイントロンを含むリーダーの転写産物のミススプライシングによるものではなく、リーダーＳＹＥアミノ酸配列の組合せに固有のものであることを示している。Ｎ末端Ｌｃアミノ酸配列がＳＳＥ、ＳＹＶ、またはＱＳＶへ突然変異した場合、切断は起きなかった。

ＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃの遺伝的に切断された型（ΔＳＹＥ）も検定した；これは、意図的に除去されたＳＹＥ Ｎ末端を有するように操作された。したがって、Ｌｃアミノ酸配列は、ＭＥＤＩ８４９０ Ｌｃ配列の第４番目のアミノ酸から開始した（配列番号１２）。この対照分子は、１００％の産物が切断されるという予測された結果をもたらした（図１０Ｂ）。本発明者らがＬｃのさらなる切断を観察しなかったことに注目するのは興味深かった。

一過性トランスフェクションを用いた代替リーダー配列の研究
Ｌｃの「ＳＹＥ」Ｎ末端アミノ酸開始配列を用いて代替リーダー配列を研究するための一過性トランスフェクションを行った。Ｖ−ラムダ１、Ｖ−ラムダ３およびＶ−カッパ１ファミリー由来の３つの異なる天然に存在するヒトシグナルペプチドを、マウスシグナルペプチドと並行して解析のために選択した。表２に示すように、すべてのＬｃ配列が「ＳＹＥ」Ｎ末端モチーフを含み、リーダー配列が変化したことを除いて、上記の方法を用いて材料を産生し、分析した。イントロンの有無は、切断された材料の産生と無関係であることが以前に示されているので、マウス標準スタンダードを除いて、すべてのリーダー配列はｃＤＮＡ型式であった（すなわち、イントロンを含まなかった）。上記のように、Ｎ末端アミノ酸配列は、シグナルペプチドとして同定され、予測された切断部位は位置−１と＋１との間（すなわち、シグナルペプチドの最後の残基および成熟タンパク質の最初の残基）にあることを解析は示し、シグナルペプチドは完全に無傷のＬｃを残して切断されることを示している。Ｖ−ラムダ３、Ｖ−ラムダ１またはＶ−カッパ１ファミリー由来の代替リーダー配列を使用した場合、Ｌｃの切断は観察されなかった。

精製されたＭＥＤＩ８４９０試料のＬＣ−ＭＳ解析は、Ｌｃ分子の９３〜９６％の間で測定された無傷のＬｃを主たる種として明らかにした。４％および７％の低レベルのＳＹＥ Ｌｃ切断は、天然に存在するイントロンを有する（シグナルペプチド１）または無い（シグナルペプチド２）マウスシグナルペプチドを用いて産生された材料においてのみ検出された（図１０Ａ）。ＳＹＥ切断のレベルは前の結果（図１Ａ）と一致し、マウスシグナルペプチド配列におけるイントロンの有無はＳＹＥ切断の存在に影響を与えなかった。Ｌｃ切断は、代替シグナルペプチドのいずれかを用いて産生された精製された材料では検出されなかった（図１０Ａ）。これらのデータは、切断はイントロンを含むリーダーのミススプライシングによるものではなく、マウスシグナルペプチド−ＳＹＥアミノ酸の組合せに固有のものであることをさらに示している。

安定なトランスフェクションを用いた代替Ｎ末端軽鎖アミノ酸配列および代替リーダー配列の研究
上記の実施例は、ＬｃのＮ末端アミノ酸配列を変更するか、または分泌リーダーペプチド配列を変化させることが、一過性トランスフェクションにおけるＬｃペプチドの「ＳＹＥ」切断を防止する上で成功していることを示す。安定にトランスフェクトされたＣＨＯプールも研究した。マウスおよび代替リーダーの両方は、可変Ｌｃ配列の存在下でコドン最適化され、プラスミドを構築するために、両方とも同一プラスミドに組み込まれたＭＥＤＩ８４９０重鎖および軽鎖遺伝子と、安定な細胞株選択のための選択マーカーとともに使用された。リーダーはＤＮＡ型式（すなわちイントロンがない）であった。抗体材料はフェドバッチプロセスを用いて蓄積された。ＭＥＤＩ８４９０を精製し、ＬＣ−ＭＳによってＬｃ切断の存在を分析した（図１０Ａ）。マウスシグナルペプチドを用いて産生された材料について、マススペクトルデータは、それぞれプール１およびプール２についての全Ｌｃ分子の５％および７％の小さなピークを同定し、ＳＹＥ Ｌｃ切断に起因した。一方、ヒトＶ−ラムダ１シグナルペプチドを用いて産生された材料においては、ＳＹＥ Ｌｃ切断は検出されなかった。したがって、安定なプールは、一時的にトランスフェクトされた材料によって予測される発現は、安定な細胞株において確認されることを示した（表３）。

ＳＹＥ Ｌｃを有する代替ｍＡｂにおけるＬｃ切断に対するシグナルペプチドの影響
Ｌｃ切断の生産および防止がＭＥＤＩ８４９０に独特であるかどうかを調べるために、本発明者らは、マウス（シグナルペプチド１、配列番号１）およびヒトＶ−ラムダ１（シグナルペプチド４、配列番号３）シグナルペプチドを、ＳＹＥ Ｌｃ Ｎ末端モチーフを有する２つの関係がないモノクローナル抗体、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂ、で評価した。シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を合成し、一過性ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ｂ Ｌｃ発現プラスミドにクローニングした。それぞれの得られたＬｃ発現プラスミドは、対応するＨｅ発現プラスミドとともに、ＣＨＯ細胞を一時的にトランスフェクトするために使用された。浄化されたフェドバッチ採取物は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ アフィニティクロマトグラフィによって精製された。ＬＣ−ＭＳによる解析（図１０Ｃ）は、マウスシグナルペプチドを使用した場合、ｍＡｂ ＡおよびｍＡｂ ＢにおいてＬｃ切断が存在するが、ヒトＶ−ラムダ１シグナルペプチドを使用した場合には存在しないことを明らかにした。結果を表４に要約する。

これらのデータは、Ｌｃ切断の生成はＭＥＤ１８４９０に固有ではなく、ＬｃがＮ末端ＳＹＥアミノ酸モチーフを有する他のｍＡｂでも起きる可能性があることを示している。
さらにＭＥＤＩ８４９０と同様に、マウスシグナルペプチドの代替物を用いることにより、他のｍＡｂにおいてＳＹＥ切断の産生を防止することができる。

配列
表５は、本明細書で使用されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のリストを示す。

特定の実施形態の前述の説明は、過度の実験をすることなく、当業者の通常の技術の範囲内にある知識を適用して、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、様々な応用のためのそのような特定の実施形態を容易に修正および／または適合させることができるように、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするであろう。したがって、そのような適合および修正は、本明細書に提示された教示および手引きに基づいて、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内にあることが意図される。本明細書の表現または用語は、本明細書の用語または表現が教示および指針に照らして当業者によって解釈されるように、限定ではなく説明のためのものであることを理解されたい。本発明は、次の特許請求の範囲にさらに記載される。

Claims (21)

1. 切断されていない成熟抗体軽鎖（Ｌｃ）ポリペプチドを産生する方法であって：
   ａ．配列番号５に示された第１の新生Ｎ末端配列を含む第１の抗体Ｌｃアミノ酸配列を同定する工程；および
   ｂ．第１の新生Ｎ末端配列の代わりに、第２の抗体Ｌｃポリペプチドは：
   配列番号６、
   配列番号７、
   配列番号８、
   配列番号９、
   配列番号１０、
   配列番号１１、
   配列番号１２、
   配列番号１３；および
   配列番号１４
   からなる群から選択される第２の新生Ｎ末端配列を含むことを除いて、第１の抗体Ｌｃポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する第２の抗体Ｌｃポリペプチドをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で発現させる工程
   を含み、
   それによって、切断されていない成熟抗体Ｌｃポリペプチドを産生する前記方法。
2. 抗体軽鎖（Ｌｃ）ポリペプチドのＮ末端切断を防止する方法であって：
   ａ．配列番号５に示された第１の新生Ｎ末端配列を含むアミノ酸配列を有する第１の抗体Ｌｃポリペプチドを同定する工程であって、該第１の新生Ｎ末端配列は本質的にリーダー配列および成熟Ｎ末端トリペプチドからなり；
   ＣＨＯ細胞中での該第１の抗体Ｌｃポリペプチドの発現は、ＣＨＯ細胞中で発現する第１の抗体Ｌｃポリペプチドの少なくとも約３％において成熟Ｎ末端トリペプチドの切断をもたらす、前記同定する工程；および
   ｂ．第１の新生Ｎ末端配列の代わりに、第２の抗体Ｌｃポリペプチドは：
   配列番号６、
   配列番号７、
   配列番号８、
   配列番号９、
   配列番号１０、
   配列番号１１、
   配列番号１２、
   配列番号１３、および
   配列番号１４
   からなる群から選択される第２の新生Ｎ末端配列を含むことを除いて、第１の抗体Ｌｃポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する第２の抗体ＬｃポリペプチドをＣＨＯ細胞中で発現させる工程であって；
   該第２の新生Ｎ末端配列は本質的にリーダー配列および成熟Ｎ末端トリペプチドからなり；
   ＣＨＯ細胞中での該第２の抗体Ｌｃポリペプチドの発現は、成熟Ｎ末端トリペプチドの非切断をもたらす工程
   を含み、
   それによって、抗体ＬｃポリペプチドのＮ末端切断を防止する前記方法。
3. 抗体軽鎖（Ｌｃ）ポリペプチドの均質集団を含む組成物を産生する方法であって：
   ａ．配列番号５に示された第１の新生Ｎ末端配列を含むアミノ酸配列を有する第１の抗体Ｌｃポリペプチドを同定する工程；
   ｂ．第２のＬｃポリペプチドをＣＨＯ細胞中で発現させる工程であって、該第２のＬｃポリペプチドは、
   配列番号６、
   配列番号７、
   配列番号８、
   配列番号９、
   配列番号１０、
   配列番号１１、
   配列番号１２、
   配列番号１３、および
   配列番号１４
   からなる群から選択される第２の新生Ｎ末端配列を含むことを除いて、該第２のＬｃポリペプチドは第１のＬｃポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し；
   該第２のＬｃポリペプチドは、ＣＨＯ細胞によって上清へ分泌され、該上清は第２のＬｃポリペプチドではない他のＬｃポリペプチドを少なくとも９８％含まない工程；ならびに
   ｃ．該上清から該第２のＬｃポリペプチドを採取する工程
   を含み、
   それによって、均質集団の抗体Ｌｃポリペプチドを含む組成物を産生する前記方法。
4. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号６である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号７である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
6. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号８である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
7. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号９である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
8. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１０である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
9. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
10. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１２である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
11. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１３である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
12. 第２の新生Ｎ末端配列は配列番号１４である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
13. Ｎ末端切断は液体クロマトグラフィ−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）解析によって検出される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
14. Ｎ末端切断は還元ペプチドマッピング解析によって確認される、請求項１３に記載の方法。
15. 上清中の第２のＬｃポリペプチドおよび前記他のＬｃポリペプチドの割合はＬＣ−ＭＳ解析によって測定される、請求項３に記載の方法。
16. 上清は第２のＬｃポリペプチドではない他のＬｃポリペプチドを少なくとも９９％含まない、請求項３に記載の方法。
17. 上清は第２のＬｃポリペプチドではない他のＬｃポリペプチドを１００％含まない、請求項３に記載の方法。
18. 組成物は医薬組成物である、請求項３に記載の方法。
19. 第１のＬｃポリペプチドは抗体の一部である、請求項３に記載の方法。
20. 第２のＬｃポリペプチドは抗体の一部である、請求項３に記載の方法。
21. 抗体は治療用抗体である、請求項２０に記載の方法。

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