JP2018535213A - IgG軽鎖におけるN末端切断の防止 - Google Patents
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Abstract
Description
発現コンストラクト
特定のリーダーおよび/または変更されたN末端可変Lc領域をコードするDNAを用いて、一過性および安定したトランスフェクションのためにプラスミドを構築した(Gene Art(登録商標)、Life Technologies、Carlsbad、CA)。DNAを制限消化およびライゲーションに供して、必要な機能的構成要素を適切なプラスミド骨格に組み立てた。
ヒトmAb MEDI8490、mAb AおよびmAb B(すべてのIgG γ1 TM、λ;Organesyanら、Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.、64:700〜704、2008)の発現プラスミドを、一過性発現によって評価した。一過性トランスフェクションは、Daramolaら、(Biotechnol.Progress、30:132〜141、2014)によって記載された方法に従って、HeおよびLcベクター、ポリエチレンイミン(PEI;Polysciences Inc.、Warrington、PA)およびCHO細胞をCD−CHO培地(Life Technologies、Carlsbad、CA)または独自の培地中で使用して実行した。独自の栄養供給を、培養期間中急速静注添加として補充した。
CHOKISV細胞中で、Amaxa(登録商標)Nucleofector(登録商標)システムおよび試薬(Lonza Group、Basel、Switzerland)を用いて安定なトランスフェクションを実行した。トランスフェクトした細胞を選択し、メチオニンスルホキシイミン(MSX)の存在下のCDCHOにおいて維持した。細胞のプールを拡大し、次いで、CD CHOを用いた14〜17日フェドバッチプロセスでの組換えタンパク質産生のために使用した。独自の栄養供給を、培養期間中急速静注添加として補充した。
安定なプールについて上記したように、CHOKISV細胞をトランスフェクトすることにより、安定なCHO一次トランスフェクタントを生成した。次いで、トランスフェクトした細胞を希釈し、MSXの存在下のCD CHO中で選択した。個々のコロニーを増殖させ、次いで、上記のプールについて記載したように、フェドバッチプロセスにおける力価、細胞密度および生存率について評価した。クローン細胞株は、96ウェルプレート中でMSXの存在下のCD CHO中で限界希釈法クローニングによって、一次トランスフェクタントから単離された。独自の栄養供給を急速静注添加した独自の培地を用いて、個々のコロニーを増殖させ、14日間のフェドバッチプロセスで増殖および生産性について評価した。
細胞培養上清を遠心分離によって採取した。浄化された採取物を、MabSelect SuRe(商標)(GE Healthcare Life Sciences、Piscataway、NJ)を用いた標準Protein Aアフィニティクロマトグラフィによって精製した。細胞培養上清中のIgGは、Lc切断の有無を検出するためのQTOF質量分析によって特徴付けられ、または各試料からのピークサイズを校正曲線と比較することによって、Agilent HP1100 SeriesもしくはHP1200 Series(Agilent Technologies、Santa Clara、CA)でのProtein A HPLCアフィニティクロマトグラフィにより定量化された。
SYNAPT(登録商標)G1 QTOFスペクトロメーター(Waters Corporation、Milford、CT)と連結したACQUITY UPLC(登録商標)システムを用いて逆相LC−MS解析を行った。1mg/mlの精製したタンパク質を、10mM DTT、10mMトリスHC1、pH8で37℃、30分間インキュベーションすることによって還元し、2μgを50mm×2.1mm BEHC4分析カラム(粒径1.7μm)に注入し、65℃で保持した(Waters Corporation、Milford、CT)。タンパク質は、15分間のバイナリグラジエントを用いて0.15mL/分の一定流速で溶出した;溶媒Bを最初に5%で3分間保持し、続いて25%に増加させ、次いで45%で10分以上増加させた後、最終時間にわたって95%に増加させた。高濃度(95%)と低濃度(5%)の間で7分間溶媒Bを振動させることにより、次の注入前にカラムを洗浄した。溶媒A(水)および溶媒B(アセトニトリル)に0.01%(v/v)トリフルオロ酢酸および0.1%(v/v)ギ酸を添加した。スペクトルは500〜4500Thの間で取得した。機器パラメータには、+veイオン化モード、3.4kVの電源電圧、50Vの試料コーン電圧、140℃のイオン源温度、および400℃の脱溶媒温度が含まれた。タンパク質電荷エンベロープを、MaxEnt1を用いてデコンボリューションした。所与のサンプルについて、非切断LCおよび切断種の定量的評価は、SYE切断種について検出されたイオン電流を、非切断LCおよび切断種について検出されたイオン電流の合計で除すことによって決定した。切断されたLCの割合は全LCの%で報告され、他のLC修飾を考慮しなかった。
各試料について、1.6mg/mlのタンパク質100μgを変性させ、5.2Mグアニジン、85mMトリス、0.7mM EDTAおよび16mM DTT、pH7.6で30分間、37℃で還元した。還元後、試料を40mMヨードアセトアミドと共に暗所、室温で30分間インキュベートした。還元されアルキル化されたタンパク質を、2M尿素、100mMトリス、pH7.6に緩衝液交換し、トリプシンを用いて酵素対基質比1:20、37℃で4時間インキュベートした。
安定にトランスフェクトされたCHO細胞株からの個々のMEDI8490 Lc転写物の配列解析を、RNeasy Mini Kit(Qiagen、Germantown、MD)を用いてCHO細胞からRNAを単離することによって実行し、続いてTranscriptor One−Step RT−PCR Kit(Roche Diagnostics Corporation、Indianapolis、IN)を用いてLc mRNAのRT−PCRを、Invitrogen(商標)TOPO(登録商標)−TAクローニングキット(Thermo Fisher Scientific,Inc.、Waltham、MA)を用いて得られたcDNAのクローニングを、および大腸菌(E.coli)の形質転換を行い、すべては製造業者の取扱説明書に従った。得られた個々のコロニー中のクローニングされた配列を、配列決定のためのサンガー法を用いて配列検証した。
MEDI8490は、一過性トランスフェクションによってマウスHeリーダーとともに発現し、この分子の所定の発展性評価研究を支援した(Yangら、mAbs、5:787〜794、2013)。トランスフェクトされたCHO細胞をCD−CHO(Life Technologies、Carlsbad、CA)で13日間培養し、遠心分離により細胞上清を採取することにより材料を生成した。浄化した採取物を、MabSelectSuRe(商標)(GE Healthcare Life Sciences、Piscataway、NJ)を用いたProtein Aアフィニティクロマトグラフィによって精製し、還元LC−MSによって分析した(図1A)。検出された主要ピークは、無傷mAb Lcの理論的質量と一致した。異常にも、最初の3つのアミノ酸(SYE)を欠く切断されたLc変異体と一致する低分子量種も検出され、総シグナルの8%を占めた。ペプチドマッピング解析は、Lc切断を確認した(図1Bおよび図1C)。
切断されたLc変異体の生成がプロセス駆動型であるかどうかを調べるために、5Lスケールでの一過性トランスフェクションからのMEDI8490を発現するCHO細胞、ならびに50Lおよび250Lスケールでの2つの独立した安定な一次トランスフェクタントをフェドバッチプロセスで実行した。さらに、5Lスケールで6つの独立した安定な一次トランスフェクタントから単離されたMEDI8490を発現する7つのクローンから材料を生成し、クローン系統のLc切断への影響を調べた。すべてのスケールからの細胞培養物は14日目に採取した。MEDI8490を精製し、還元された抗体LC−MS解析によって特徴付けた(図2Aおよび図2B)。結果は、Lcの2つの形態:92〜97%の所望の完全長Lcおよび全Lc分子の3〜8%の切断されたLc変異体が検出されたことを示す。すべてのバイオリアクタースケール、発現プラットフォームおよびクローン系統において、2つのLcの形態の割合における変動は最小限であり、切断されたLc変異体の生成は、これらの因子から独立していることを示す。
MEDI8490の一過性および安定な発現プラスミドは、LcおよびHeのシグナルペプチドコード領域内にイントロン配列を含んでいた(Persicら、1997;Orlandi、1989)。Lc SYE切断が、Lc mRNAの非効率的または誤ったスプライシングのために転写産物でコードされたかどうかを評価するために、MEDI8490を発現する安定なクローンCHO細胞株についてcDNA配列解析が実行された。RNAを4つの細胞株から単離し、続いてLcmRNAのRT−PCRおよび個々の得られたcDNA分子のTOPO(登録商標)ベクターへのクローニングを行った。327個の個々のクローンのシークエンシングは、N末端「SYE」アミノ酸モチーフを含む完全長軽鎖配列はLc転写産物によってコードされることを示した。さらに、GeneSplicerスプライス部位予測アルゴリズムによって分析した場合、MEDI8490Lc配列内に代替スプライス部位は同定されなかった(Perteaら、Nucleic Acids Res.、29:1185〜1190、2001)。
本発明者らは、LcのN末端の配列は、MEDI8490 Lc変異体の生産に影響を及ぼすかどうか研究した。MEDI8490のLc配列とN末端の1つのアミノ酸(SYVおよびSSE)が異なる、V−ラムダ3ファミリーからの2つの代替Lc配列が、MEDI8490の生産のために選択された。MEDI8490 Lcの遺伝的に切断された型も、N末端SYEアミノ酸をコードするDNA配列が欠失したLc切断の対照として構築された。
結果を表1に要約し、代表的な結果を図1Aおよび図3〜6に示す。
Lcの「SYE」N末端アミノ酸開始配列を用いて代替リーダー配列を研究するための一過性トランスフェクションを行った。V−ラムダ1、V−ラムダ3およびV−カッパ1ファミリー由来の3つの異なる天然に存在するヒトシグナルペプチドを、マウスシグナルペプチドと並行して解析のために選択した。表2に示すように、すべてのLc配列が「SYE」N末端モチーフを含み、リーダー配列が変化したことを除いて、上記の方法を用いて材料を産生し、分析した。イントロンの有無は、切断された材料の産生と無関係であることが以前に示されているので、マウス標準スタンダードを除いて、すべてのリーダー配列はcDNA型式であった(すなわち、イントロンを含まなかった)。上記のように、N末端アミノ酸配列は、シグナルペプチドとして同定され、予測された切断部位は位置−1と+1との間(すなわち、シグナルペプチドの最後の残基および成熟タンパク質の最初の残基)にあることを解析は示し、シグナルペプチドは完全に無傷のLcを残して切断されることを示している。V−ラムダ3、V−ラムダ1またはV−カッパ1ファミリー由来の代替リーダー配列を使用した場合、Lcの切断は観察されなかった。
上記の実施例は、LcのN末端アミノ酸配列を変更するか、または分泌リーダーペプチド配列を変化させることが、一過性トランスフェクションにおけるLcペプチドの「SYE」切断を防止する上で成功していることを示す。安定にトランスフェクトされたCHOプールも研究した。マウスおよび代替リーダーの両方は、可変Lc配列の存在下でコドン最適化され、プラスミドを構築するために、両方とも同一プラスミドに組み込まれたMEDI8490重鎖および軽鎖遺伝子と、安定な細胞株選択のための選択マーカーとともに使用された。リーダーはDNA型式(すなわちイントロンがない)であった。抗体材料はフェドバッチプロセスを用いて蓄積された。MEDI8490を精製し、LC−MSによってLc切断の存在を分析した(図10A)。マウスシグナルペプチドを用いて産生された材料について、マススペクトルデータは、それぞれプール1およびプール2についての全Lc分子の5%および7%の小さなピークを同定し、SYE Lc切断に起因した。一方、ヒトV−ラムダ1シグナルペプチドを用いて産生された材料においては、SYE Lc切断は検出されなかった。したがって、安定なプールは、一時的にトランスフェクトされた材料によって予測される発現は、安定な細胞株において確認されることを示した(表3)。
Lc切断の生産および防止がMEDI8490に独特であるかどうかを調べるために、本発明者らは、マウス(シグナルペプチド1、配列番号1)およびヒトV−ラムダ1(シグナルペプチド4、配列番号3)シグナルペプチドを、SYE Lc N末端モチーフを有する2つの関係がないモノクローナル抗体、mAb AおよびmAb B、で評価した。シグナルペプチドをコードするDNA配列を合成し、一過性mAb AおよびmAb B Lc発現プラスミドにクローニングした。それぞれの得られたLc発現プラスミドは、対応するHe発現プラスミドとともに、CHO細胞を一時的にトランスフェクトするために使用された。浄化されたフェドバッチ採取物は、Protein A アフィニティクロマトグラフィによって精製された。LC−MSによる解析(図10C)は、マウスシグナルペプチドを使用した場合、mAb AおよびmAb BにおいてLc切断が存在するが、ヒトV−ラムダ1シグナルペプチドを使用した場合には存在しないことを明らかにした。結果を表4に要約する。
さらにMEDI8490と同様に、マウスシグナルペプチドの代替物を用いることにより、他のmAbにおいてSYE切断の産生を防止することができる。
表5は、本明細書で使用されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列のリストを示す。
Claims (22)
- 切断されていない成熟抗体軽鎖(Lc)ポリペプチドを産生する方法であって:
a.配列番号5に示された第1の新生N末端配列を含む第1の抗体Lcアミノ酸配列を同定する工程;および
b.第1の新生N末端配列の代わりに、第2の抗体Lcポリペプチドは:
配列番号6、
配列番号7、
配列番号8、
配列番号9、
配列番号10、
配列番号11、
配列番号12、
配列番号13;および
配列番号14
からなる群から選択される第2の新生N末端配列を含むことを除いて、第1の抗体Lcポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する第2の抗体Lcポリペプチドを培養細胞中で発現させる工程
を含み、
それによって、切断されていない成熟抗体Lcポリペプチドを産生する前記方法。 - 抗体軽鎖(Lc)ポリペプチドのN末端切断を防止する方法であって:
a.配列番号5に示された第1の新生N末端配列を含むアミノ酸配列を有する第1の抗体Lcポリペプチドを同定する工程であって、該第1の新生N末端配列は本質的にリーダー配列および成熟N末端トリペプチドからなり;
培養細胞中での該第1の抗体Lcポリペプチドの発現は、培養細胞中で発現する第1の抗体Lcポリペプチドの少なくとも約3%において成熟N末端トリペプチドの切断をもたらす工程;および
b.第1の新生N末端配列の代わりに、第2の抗体Lcポリペプチドは:
配列番号6、
配列番号7、
配列番号8、
配列番号9、
配列番号10、
配列番号11、
配列番号12、
配列番号13、および
配列番号14
からなる群から選択される第2の新生N末端配列を含むことを除いて、第1の抗体Lcポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有する第2の抗体Lcポリペプチドを培養細胞中で発現させる工程であって;
該第2の新生N末端配列は本質的にリーダー配列および成熟N末端トリペプチドからなり;
培養細胞中での該第2の抗体Lcポリペプチドの発現は、成熟N末端トリペプチドの非切断をもたらす工程
を含み、
それによって、抗体LcポリペプチドのN末端切断を防止する前記方法。 - 抗体軽鎖(Lc)ポリペプチドの均質集団を含む組成物を産生する方法であって:
a.配列番号5に示された第1の新生N末端配列を含むアミノ酸配列を有する第1の抗体Lcポリペプチドを同定する工程;
b.第2のLcポリペプチドを培養細胞中で発現させる工程であって、該第2のLcポリペプチドは、
配列番号6、
配列番号7、
配列番号8、
配列番号9、
配列番号10、
配列番号11、
配列番号12、
配列番号13、および
配列番号14
からなる群から選択される第2の新生N末端配列を含むことを除いて、該第2のLcポリペプチドは第1のLcポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有し;
該第2のLcポリペプチドは、培養細胞によって上清へ分泌され、該上清は第2のLcポリペプチドのアミノ酸配列変異体を少なくとも98%含まない工程;ならびに
c.該上清から該第2のLcポリペプチドを採取する工程
を含み、
それによって、均質集団の抗体Lcポリペプチドを含む組成物を産生する前記方法。 - 第2の新生N末端配列は配列番号6である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号7である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号8である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号9である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号10である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号11である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号12である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号13である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 第2の新生N末端配列は配列番号14である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 培養細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- N末端切断は液体クロマトグラフィ−質量分析(LC−MS)解析によって検出される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- N末端切断は還元ペプチドマッピング解析によって確認される、請求項14に記載の方法。
- 第2のLcポリペプチドおよび上清中のアミノ酸配列変異体の割合はLC−MS解析によって測定される、請求項3に記載の方法。
- 上清は第2のLcポリペプチドのアミノ酸配列変異体を少なくとも99%含まない、請求項3に記載の方法。
- 上清は第2のLcポリペプチドのアミノ酸配列変異体を100%含まない、請求項3に記載の方法。
- 組成物は医薬組成物である、請求項3に記載の方法。
- 第1のLcポリペプチドは抗体の一部である、請求項3に記載の方法。
- 第2のLcポリペプチドは抗体の一部である、請求項3に記載の方法。
- 抗体は治療用抗体である、請求項21に記載の方法。
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