WO2022045273A1 - α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの変異体 - Google Patents

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acid residues
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健一 高橋
紗希 久保田
フィオドール ゾロタリョフ
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    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
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    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/0105—Alpha-N-acetylglucosaminidase (3.2.1.50)

Definitions

  • the present invention relates to a mutant of human ⁇ -N-acetylglucosaminidase (hNAGLU). Specifically, by adding a mutation to the amino acid sequence of hNAGLU, the expression level of hNAGLU in a host cell into which a gene encoding hNAGLU has been introduced is determined. It relates to a novel hNAGLU mutant that can be enhanced as compared with the case of introducing a gene encoding wild-type hNAGLU.
  • hNAGLU human ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • Mucopolysaccharidosis type IIIB which is a type of lysosomal disease, is also known as Sanfilippo syndrome type B and is required for the degradation of heparan sulfate (HS), which is a type of glycosaminoglycan (GAG), in lysosomes.
  • HS heparan sulfate
  • GAG glycosaminoglycan
  • NAGLU ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • the accumulation of HS in various organs including the brain causes serious neurological disorders such as cognitive decline and behavioral disorders and tissue disorders around the age of 2 to 6 years, resulting in behavioral disorders such as hyperactivity.
  • Enzyme replacement therapy is performed to replace deficient or deficient enzymes in patients with Sanfilippo syndrome type B.
  • the enzyme ⁇ -N-acetylglucosaminidase (NAGLU) has the effect of catalyzing the reaction of hydrolyzing the non-reducing terminal ⁇ -N-acetylglucosamine residue of heparan sulfate, and when administered to patients, it is used in lysosomes in patients.
  • the accumulated HS can be decomposed.
  • HNAGLU wild-type human NAGLU
  • An object of the present invention is to increase the expression level of hNAGLU in a host cell into which a gene encoding hNAGLU has been introduced by mutating the amino acid sequence of hNAGLU as compared with the case where a gene encoding wild-type hNAGLU is introduced. It is to provide a novel hNAGLU mutant that can be used.
  • the present inventors have introduced a gene encoding the hNAGLU mutant obtained by modifying the amino acid sequence of hNAGLU, which is described in detail in the present specification, as a result of diligent studies.
  • the host cell expresses more hNAGLU than the host cell into which the gene encoding the wild-type hNAGLU has been introduced, and completed the present invention. That is, the present invention includes the following. 1. 1.
  • a mutant of human ⁇ -N-acetylglucosaminidase selected from the group consisting of the following (1) to (7): (1)
  • the wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in which lysine at position 36 is replaced with glutamic acid and proline at position 37 is replaced with serine.
  • the wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in which serine is added between leucine at position 44 and glycine at position 45; (3) The wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in which glutamine at position 209 is replaced with arginine; (4) The wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 in which glutamic acid at position 228 is replaced with lysine; (5) The wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, in which threonine at position 320 is replaced with proline and glutamic acid at position 321 is replaced with aspartic acid.
  • (1'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (1'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (1'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • (2'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (2'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (2'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • the hNAGLU mutant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a hNAGLU mutant to which the mutation was added while preserving the arginine at position 209 of the amino acid sequence to the hNAGLU mutant of 1 above, which is the following (3'-a).
  • amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • the hNAGLU mutant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 11 was mutated while preserving the lysine at position 228 of the amino acid sequence to the hNAGLU variant of 1 above, which is the following (4'-a). )-(4'-h) selected from the group: (4'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces; (4'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces; (4'-c) A combination of the above 4'-a substitution and 4'-b deletion; (4'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues
  • (5'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (5'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (5'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • the hNAGLU mutant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 is mutated while preserving alanine at position 505 and valine at position 506 of the amino acid sequence to the hNAGLU mutant according to the following.
  • (6'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (6'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (6'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the
  • the hNAGLU mutant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 is a hNAGLU mutant to which a mutation has been added while preserving asparagine at position 526 and threonine at position 528 of the amino acid sequence.
  • the hNAGLU mutant of 4 above which is selected from the group consisting of the following (8) to (15): (8)
  • the hNAGLU variant having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 the hNAGLU variant to which the mutation was added while preserving the arginine at position 209 of the amino acid sequence, and the lysine at position 36 was converted to glutamate.
  • Proline at position 37 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 25 substituted with serine, respectively;
  • the hNAGLU variant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a hNAGLU variant in which the arginine at position 209 of the amino acid sequence is preserved and mutated, and is at positions 44 and 45.
  • Glutamic acid at position 321 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 29 substituted with aspartic acid, respectively; (11) In the hNAGLU variant having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9, the hNAGLU variant to which the mutation was added while preserving the arginine at position 209 of the amino acid sequence, and the lysine at position 36 was converted to glutamic acid.
  • Arginine at position 620 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 substituted with lysine, respectively; (13)
  • valine at position 54 is replaced with isoleucine and arginine at position 620 is replaced with lysine, respectively, and between leucine at position 44 and glycine at position 45.
  • the hNAGLU mutant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25 is mutated while preserving arginine at position 209, glutamic acid at position 36, and serine at position 37 of the amino acid sequence.
  • the hNAGLU mutant having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 27 is a hNAGLU mutant in which a mutation is added while preserving arginine at position 210 and serine at position 45 of the amino acid sequence to the hNAGLU mutant according to 9 above.
  • (9'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (9'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (9'-c) A combination of the above 9'-a substitution and 9'-b deletion;
  • (9'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • the hNAGLU mutant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 was mutated while preserving arginine at position 209, proline at position 320, and aspartic acid at position 321 of the amino acid sequence.
  • the amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (10'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal
  • the hNAGLU mutant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 31 is mutated while preserving arginine at position 210, glutamic acid at position 36, serine at position 37, and serine at position 45 of the amino acid sequence.
  • the hNAGLU mutant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 is mutated while preserving arginine at position 209, isoleucine at position 54, and lysine at position 620 of the amino acid sequence.
  • the hNAGLU mutant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 35 is mutated while preserving arginine at position 210, isoleucine at position 55, and serine at position 45 of the amino acid sequence.
  • (13'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (13'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal
  • the hNAGLU mutant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 is mutated while preserving arginine at position 210, lysine at position 621, and serine at position 45 of the amino acid sequence.
  • (14'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (14'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal
  • the hNAGLU variant according to 9 above having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39 is mutated while preserving arginine at position 210, isoleucine at position 55, lysine at position 621, and serine at position 45 of the amino acid sequence.
  • (15'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (15'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (15'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • a method for producing an hNAGLU variant which comprises the step of culturing the above 20 mammalian cells in a serum-free medium. 22.
  • BBB blood-brain barrier
  • the hNAGLU mutant is bound to either the C-terminal side or the N-terminal side of the light chain of the antibody, or to either the C-terminal side or the N-terminal side of the heavy chain via a linker sequence.
  • the fusion protein according to any one of 22 to 27 above. 29. 28.
  • the fusion protein according to 28 above, wherein the linker sequence consists of 1 to 50 amino acid residues.
  • the linker sequence includes one glycine, one serine, amino acid sequence Gly-Ser, amino acid sequence Ser-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Ser, amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and sequence. 29.
  • the fusion protein according to 29 above which comprises the amino acid sequence of No. 5 and an amino acid sequence selected from the group consisting of 1 to 10 consecutive amino acid sequences.
  • 31. A DNA comprising a gene encoding the fusion protein according to any one of 22 to 30 above.
  • 32. An expression vector comprising the DNA according to 31 above.
  • 33. Mammalian cells transformed with the expression vector according to 32 above.
  • 34. 33. A method for producing a fusion protein of an hNAGLU variant and an antibody, which comprises the step of culturing the mammalian cells in a serum-free medium.
  • hNAGLU which can be administered as enzyme replacement therapy for the treatment of patients with mucopolysaccharidosis type IIIB, can be efficiently produced by using gene recombination technology.
  • the figure which shows the result of the confirmation experiment of the hNAGLU mutant expression level by transient expression (Example 6).
  • the vertical axis of the bar graph shows the fluorescence intensity.
  • (1) is K36E / P37S hNAGLU mutant, (2) is L44_G45insS hNAGLU mutant, (3) is R129Q hNAGLU mutant, (4) is Q209R hNAGLU mutant, (5) is E228K hNAGLU mutant, (6) Is a T240V hNAGLU mutant, (7) is a T320P / E321D hNAGLU mutant, (8) is an S505A / I506V hNAGLU mutant, (9) is an S526N / A528T hNAGLU mutant, and (10) is a D613Q hNAGLU mutant.
  • (1) is K36E / P37S hNAGLU mutant, (2) is L44_G45insS hNAGLU mutant, (3) is R129Q hNAGLU mutant, (4) is Q209R hNAGLU mutant, (5) is E228K hNAGLU mutant, (6) Is a T240V hNAGLU mutant, (7) is a T320P / E321D hNAGLU mutant, (8) is an S505A / I506V hNAGLU mutant, (9) is an S526N / A528T hNAGLU mutant, (10) is a D613Q hNAGLU mutant, (11).
  • (1) is wild-type hNAGLU, (2) is Q209R hNAGLU mutant, (3) is K36E / P37S / Q209R hNAGLU mutant, (4) is L44_G45insS / Q209R hNAGLU mutant, (5) is Q209R / T320P / E321D.
  • the hNAGLU mutant and (6) show the expression level data of K36E / P37S / L44_G45insS / Q209R hNAGLU mutant, respectively.
  • the figure which shows the result of the confirmation experiment of the hNAGLU mutant expression level by transient expression (Example 16).
  • the vertical axis of the bar graph shows the fluorescence intensity.
  • (a) shows the pattern on the SDS-page of the band corresponding to the wild-type hNAGLU or hNAGLU mutant.
  • (1) is wild-type hNAGLU
  • (2) is Q209R hNAGLU mutant
  • (3) is L44_G45insS / Q209R hNAGLU mutant
  • (4) is V54I / Q209R / R620K hNAGLU mutant
  • (5) is L44_G45insS / V54I / Q209R.
  • the hNAGLU mutant, (6) is the L44_G45insS / Q209R / R620K hNAGLU mutant, (7) is the L44_G45insS / V54I / Q209R / R620K hNAGLU mutant, and (8) is the expression level data of the negative control.
  • hNAGLU human ⁇ -N-acetylglucosaminidase
  • hNAGLU heparan sulfate is decomposed in addition to the usual wild-type hNAGLU consisting of 720 amino acid residues shown in SEQ ID NO: 1.
  • hNAGLU a normal wild-type hNAGLU such as having an enzymatic activity capable of
  • one or more amino acid residues are substituted or deleted from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • variants of hNAGLU corresponding to those that have been lost and / or added in the present specification, "addition" of an amino acid residue means adding a residue to the end or inside of the sequence).
  • the wild-type hNAGLU is encoded by, for example, a gene having the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the number of amino acid residues to be replaced is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3, for example, 1 or 1.
  • the number of amino acid residues to be deleted is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3, for example, 1 or 2.
  • the N-terminal amino acid residue may be deleted. In that case, the number of amino acid residues to be deleted is 1 to 10, and 1 to 5 is used. Yes, or 1 to 3, for example, 1 or 2.
  • substitutions and deletions of these amino acid residues may be combined.
  • the amino acid residue is one or more amino acids in the amino acid sequence of hNAGLU or on the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence. Residues are added.
  • the number of amino acid residues added at this time is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3, for example, 1 or 2. Further, the addition and substitution of amino acid residues may be combined, the addition and deletion of amino acid residues may be combined, and the addition, substitution and deletion of amino acid residues may be combined.
  • the normal wild-type hNAGLU is biosynthesized as a precursor consisting of 743 amino acid residues, and the leader peptide consisting of 23 amino acid residues is removed from the N-terminal shown in SEQ ID NO: 67 to obtain hNAGLU.
  • the amino acid may be derived from a leader peptide.
  • the amino acid added to the N-terminal is Gly when there is one amino acid, Ala-Gly when there are two amino acids, and Ala-Ala-Gly when there are two amino acids. ..
  • the hNAGLU mutants introduced by combining at least two types of mutations include (i) to (iv) shown below. Not limited: (I) For the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, deletion of 0 to 10 amino acid residues, substitution of 0 to 10 amino acid residues with other amino acid residues, and further 0 to 10 Those having an amino acid sequence consisting of addition of amino acid residues; (Ii) For the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, deletion of 0 to 5 amino acid residues, substitution of 0 to 5 amino acid residues with other amino acid residues, and further 0 to 5 Those having an amino acid sequence consisting of addition of amino acid residues; (Iii) For the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, deletion of 0 to 3 amino acid residues, substitution of 0 to 3 amino acid residues with other amino acid residues, and further 0 to 3 Those having an amino acid sequence consisting of addition of amino acid residues;
  • the above-mentioned wild-type or mutant hNAGLU in which the amino acids constituting the hNAGLU are modified with sugar chains, is also hNAGLU.
  • the above-mentioned wild-type or mutant hNAGLU in which the amino acids constituting the hNAGLU are modified with phosphoric acid, is also hNAGLU.
  • HNAGLU is also modified with substances other than sugar chains and phosphoric acid.
  • the above-mentioned wild-type or mutant hNAGLU in which the side chains of the amino acids constituting the hNAGLU are converted by a substitution reaction or the like, is also hNAGLU.
  • Such conversions include, but are not limited to, conversion of cysteine residues to formylglycine.
  • hNAGLU modified by a sugar chain shall be included in hNAGLU having the amino acid sequence before the modification.
  • hNAGLU modified with phosphoric acid shall be included in hNAGLU having the original amino acid sequence before being modified with phosphoric acid.
  • those modified with substances other than sugar chains and phosphoric acid shall also be included in hNAGLU having the original amino acid sequence before the modification.
  • the side chains of amino acids constituting hNAGLU that have been converted by a substitution reaction or the like are also included in hNAGLU that has the original amino acid sequence before the conversion. Such conversions include, but are not limited to, conversion of cysteine residues to formylglycine.
  • hNAGLU variant human ⁇ -N-acetylglucosaminidase variant
  • hNAGLU variant is one or more with respect to the amino acid sequence of normal wild-type hNAGLU (amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1). Amino acid residues are substituted, deleted, and / or added (in the present specification, "addition" of an amino acid residue means adding a residue to the end or inside of the sequence). Moreover, it has a function as a normal wild-type hNAGLU, such as having an enzymatic activity capable of decomposing heparan sulfate.
  • the preferred hNAGLU variant in the present invention is an amino acid sequence in which one or more amino acid residues are replaced with other amino acid residues, deleted or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Including those that are.
  • the number of amino acid residues to be replaced is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3.
  • the number of amino acid residues to be deleted is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3, for example, 1 or 2. ..
  • the hNAGLU mutant may be a combination of substitutions and deletions of these amino acid residues.
  • the amino acid residue is one or more amino acids in the amino acid sequence of hNAGLU or on the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence. Residues are added.
  • the number of amino acid residues added at this time is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3, for example, 1 or 2.
  • the addition and substitution of amino acid residues may be combined, the addition and deletion of amino acid residues may be combined, and the addition, substitution and deletion of amino acid residues may be combined. That is, the hNAGLU mutant is introduced by combining at least two types of mutations out of the three types of amino acid substitutions, deletions, and additions into the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the hNAGLU mutants introduced by combining at least two types of mutations include (i) to (iv) shown below. Not limited: (I) For the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, deletion of 0 to 10 amino acid residues, substitution of 0 to 10 amino acid residues with other amino acid residues, and further 0 to 10 Those having an amino acid sequence consisting of the addition of individual amino acid residues (excluding wild-type hNAGLU); (Ii) For the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, deletion of 0 to 5 amino acid residues, substitution of 0 to 5 amino acid residues with other amino acid residues, and further 0 to 5 Those having an amino acid sequence consisting of the addition of individual amino acid residues (excluding wild-type hNAGLU); (Iii) For the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, deletion of 0 to 3 amino acid residues, substitution of 0 to 3 amino acid residues with other amino
  • the amino acid sequence of the hNAGLU variant preferably shows 80% or more identity, 85% or more identity, and 90% or more identity with the amino acid sequence of the normal wild-type hNAGLU shown in SEQ ID NO: 1. , Or show 95% or more identity, for example, 98% or more, or 99% identity.
  • the identity between the amino acid sequence of the wild-type hNAGLU and the amino acid sequence of the hNAGLU mutant can be easily calculated using a well-known homology calculation algorithm.
  • BLAST Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)
  • Pearson and Lipman similarity search method Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)
  • Smith and Waterman's local homology algorithm (Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)).
  • substitution of amino acids in the amino acid sequence of wild-type hNAGLU or hNAGLU variants with other amino acids occurs, for example, within their side chains and chemistries of the amino acids. Substitutions within such amino acid families are not expected to result in significant changes in the function of the original protein (ie, conservative amino acid substitutions).
  • Such amino acid families include, for example, those represented by the following (1) to (12): (1) Acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid, (2) The basic amino acids histidine, lysine, and arginine (3) The aromatic amine acids phenylalanine, tyrosine, and tryptophan, (4) Serine and threonine, which are amino acids having hydroxyl groups (hydroxy amino acids), (5) Hydrophobic amino acids methionine, alanine, valine, leucine, and isoleucine, (6) Neutral hydrophilic amino acids cysteine, serine, threonine, asparagine, and glutamine, (7) Glycine and proline, which are amino acids that affect the orientation of peptide chains, (8) Asparagine and glutamine, which are amide-type amino acids (polar amino acids), (9) Aliphatic amino acids, alanine, leucine, isoleucine, and valine, (10) Alanine, glycine, serine, and th
  • the highly expressed hNAGLU mutant is when expressed in a host cell as a recombinant protein and when wild-type hNAGLU is expressed in the host cell as a recombinant protein under the same conditions. At least 1.1 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 4 times or more, 5 times or more, or 6 times or more, for example, 1.5 to 4 times, 2 to 5 times, 2 It is an hNAGLU mutant characterized by obtaining an expression level of up to 8 times.
  • the same conditions mean that the expression vector, host cells, culture conditions, etc. are the same.
  • Preferred embodiments of such a highly expressed hNAGLU mutant include the following (1) to (7): (1) In the amino acid sequence of wild-type hNAGLU shown in SEQ ID NO: 1, lysine at position 36 is replaced with glutamic acid and proline at position 37 is replaced with serine, respectively, having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. (2) Those having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in which serine is added between leucine at position 44 and glycine at position 45 in the amino acid sequence of wild-type hNAGLU shown in SEQ ID NO: 1.
  • the wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in which glutamine at position 209 is replaced with arginine.
  • the wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 11 in which glutamic acid at position 228 is replaced with lysine.
  • the wild-type hNAGLU amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15, in which threonine at position 320 is replaced with proline and glutamic acid at position 321 is replaced with aspartic acid.
  • preferred embodiments of the highly expressed hNAGLU mutant include the following (1') to (7').
  • (1') Without mutating glutamic acid at position 36 and serine at position 37 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3:
  • (1'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (1'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (1'-c) A combination of the above 1'-a substitution and 1'-b deletion;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • 5'-c A combination of the above 5'-a substitution and 5'-b deletion;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • (6') Without mutating alanine at position 505 and valine at position 506 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17: (6'-a) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces; (6'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces; (6'-c) A combination of the above 6'-a substitution and 6'-b deletion; (6'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • hNAGLU mutant having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 in which glutamine at position 209 in the amino acid sequence of wild-type hNAGLU shown in SEQ ID NO: 1 of (1) above is replaced with arginine.
  • Specific embodiments of the introduced highly expressed hNAGLU mutant include the following (8) to (15): (8) In the amino acid sequence of wild-type hNAGLU shown in SEQ ID NO: 1, glutamine at position 209 is replaced with arginine, lysine at position 36 is replaced with glutamic acid, and proline at position 37 is replaced with serine.
  • preferred embodiments of the highly expressed hNAGLU mutant include the following (8') to (15').
  • amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • (11') Without mutating arginine at position 210, glutamic acid at position 36, serine at position 37, and serine at position 45 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 31 :, (11'-a)
  • the amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (11'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces; (11'-c) A combination of the above 11'-a substitution and the 11'-b deletion; (11'-d)
  • One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • (12') Without mutations to arginine at position 209, isoleucine at position 54, and lysine at position 620 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 33: (12'-a)
  • the amino acid residues constituting the amino acid sequence are substituted with other amino acid residues, and the number of substituted amino acid residues is 1 to 10, and 1 to 5 Or 1 to 3 pieces, for example, 1 or 2 pieces;
  • (12'-b) The amino acid residues constituting the amino acid sequence are deleted, and the number of deleted amino acid residues is 1 to 10, 1 to 5, or 1 to 3 pieces, for example, 1 piece or 2 pieces;
  • (12'-c) A combination of the above 12'-a substitution and the 12'-b deletion;
  • (12'-d) One or more amino acid residues are added to the amino acid sequence or to the N-terminal side or C-terminal side of the amino acid sequence, and the number of added amino acid residues.
  • the hNAGLU mutant in one embodiment of the present invention is compared with the case where wild-type hNAGLU is expressed as a recombinant protein in a host cell under the same conditions when expressed in a host cell as a recombinant protein. It is characterized by a high expression level.
  • this type of hNAGLU mutant is referred to as a highly expressed hNAGLU mutant.
  • the highly expressed hNAGLU mutant is produced as a recombinant protein, the production efficiency can be increased as compared with the wild-type hNAGLU, so that the production cost can be reduced.
  • the same conditions mean that the expression vector, host cells, culture conditions, etc. are the same.
  • the gene encoding the hNAGLU mutant whose expression level is increased as compared with the wild-type hNAGLU when expressed as a recombinant protein in a host cell can be obtained by the following method.
  • the mutant-introduced hNAGLU and the wild-type hNAGLU-encoding gene were integrated into the same type of expression vector, and the same type of host cell was transformed using this to transform the cells into which each expression vector was introduced. To get. Then, these cells are cultured under the same conditions, and the hNAGLU obtained in the culture supernatant is quantified.
  • the gene introduced into the cells showing a large quantified value compared with the quantified value of the cell into which the gene encoding the wild-type hNAGLU was introduced was identified as the gene encoding the target highly expressed hNAGLU mutant.
  • the enzyme activity value of hNAGLU can be used in addition to the quantitative value of hNAGLU as a protein.
  • the total amount of hNAGLU enzyme activity contained in the culture supernatant can be used as a quantitative value.
  • the introduction of mutations into wild-type hNAGLU can be performed by using a method of randomly introducing mutations into the gene encoding wild-type hNAGLU.
  • a gene encoding wild-type hNAGLU is integrated into a vector, and a mutagen (radiation, mutagenic substance, etc.) is allowed to act on a host cell transformed using this gene to encode wild-type hNAGLU. Mutations can be introduced into the gene.
  • the introduction of the mutation into the wild-type hNAGLU can also be performed by using the method of introducing the mutation into a predetermined location of the gene encoding the wild-type hNAGLU.
  • a gene mutation can be introduced by chemically synthesizing a gene having a mutation at a predetermined location.
  • the highly expressed hNAGLU mutant can be produced as a recombinant protein by culturing a host cell transformed with an expression vector incorporating a gene encoding the mutant.
  • the host cell used at this time is not particularly limited as long as it can express a highly expressed hNAGLU variant by introducing such an expression vector, and is not particularly limited, and is a mammalian cell, yeast, plant cell, or insect cell. It may be any of eukaryotic cells such as Eukaryotic cells such as Eukaryotic cells and prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, but mammalian cells are particularly suitable.
  • the type of the mammalian cell is not particularly limited, but human, mouse, and Chinese hamster-derived cells are preferable, and Chinese hamster ovary cell-derived CHO cells or mouse myeloma are particularly preferable.
  • NS / 0 cells derived from are preferred.
  • the expression vector used for incorporating and expressing the DNA fragment encoding the highly expressed hNAGLU mutant may be used without particular limitation as long as it brings about the expression of the gene when introduced into mammalian cells. can.
  • the gene integrated into the expression vector is placed downstream of a DNA sequence (gene expression control site) capable of regulating the frequency of gene transcription in mammalian cells.
  • Examples of the gene expression control site that can be used in the present invention include a cytomegalovirus-derived promoter, an SV40 early promoter, a human elongation factor-1 ⁇ (EF-1 ⁇ ) promoter, a human ubiquitin C promoter, and the like.
  • GS glutamine synthase
  • IVS internal ribosome entry site
  • an expression vector for expressing a target protein which is a first gene expression control site, a gene encoding the protein downstream thereof, an internal ribosome binding site further downstream, and glutamine synthesis further downstream.
  • An expression vector containing a gene encoding an enzyme and further containing a dihydrofolate reductase gene or a drug resistance gene downstream of the first gene expression control site or another second gene expression control site. Can be suitably used for the production of highly expressed hNAGLU variants.
  • the first gene expression control site or the second gene expression control site includes a promoter derived from cytomegalovirus, an SV40 initial promoter, a human elongation factor-1 ⁇ promoter (hEF-1 ⁇ promoter), and human ubiquitin C.
  • a promoter is preferably used, but the hEF-1 ⁇ promoter is particularly preferred.
  • the internal ribosome binding site includes viruses of the family Picornavirus, mouth-foot disease virus, hepatitis A virus, hepatitis C virus, corona virus, bovine intestinal virus, siler murine encephalomyelitis virus, and coxsackie B virus.
  • a virus genome selected from the group consisting of, or a gene derived from the 5'untranslated region of a gene selected from the group consisting of human immunoglobulin heavy chain binding protein gene, Drosophila antennapedia gene, and Drosophila ultrabitrax gene is preferable.
  • an internal ribosome binding site derived from the 5'untranslated region of the mouse encephalomyelitis virus genome is particularly suitable.
  • the drug resistance gene preferably used in this expression vector is preferably a puromycin or neomycin resistance gene, and more preferably a puromycin resistance gene.
  • an expression vector for expressing a target protein which is a human elongation factor-1 ⁇ promoter, a gene encoding the protein downstream thereof, and a 5'untranslated region of the mouse encephalomyelitis virus genome further downstream.
  • An expression vector in which a part of a plurality of initiation codons contained in a wild-type internal ribosome binding site is disrupted can be suitably used for producing a highly expressed hNAGLU mutant.
  • Examples of such an expression vector include the expression vector described in WO2013 / 161958.
  • an expression vector for expressing a target protein which is a human elongation factor-1 ⁇ promoter, a gene encoding the protein downstream thereof, and a 5'untranslated region of the mouse encephalomyelitis virus genome further downstream.
  • an expression vector in which a part of a plurality of initiation codons contained in the wild-type internal ribosome binding site is disrupted can be suitably used for the production of a highly-expressed hNAGLU mutant. Examples of such expression vectors include pE-mIRES-GS-puro described in WO2012 / 063799 and pE-mIRES-GS-mNeo described in WO2013 / 161958.
  • ATGs Three start codons (ATGs) are present at the 3'end of the internal ribosome binding site derived from the 5'untranslated region of the wild-type mouse cardiovirus virus genome.
  • the above pE-mIRES-GS-puro and pE-mIRES-GS-mNeo are expression vectors having IRES in which some of the start codons are disrupted.
  • the hNAGLU mutant (including the highly expressed hNAGLU mutant) can be expressed in cells or in a medium by culturing a host cell into which an expression vector incorporating a gene encoding the hNAGLU mutant has been introduced.
  • the expression method of the hNAGLU mutant when the mammalian cell is a host cell is described in detail below.
  • any medium can be used as long as it can cultivate and proliferate the mammalian cells, but a serum-free medium is preferably used.
  • a serum-free medium used as the medium for producing recombinant protein, for example, amino acids are 3 to 700 mg / L, vitamins are 0.001 to 50 mg / L, and monosaccharides are 0.3 to 10 g / L.
  • Inorganic salts 0.1 to 10000 mg / L, trace elements 0.001 to 0.1 mg / L, nucleosides 0.1 to 50 mg / L, amino acids 0.001 to 10 mg / L, biotin 0.01 ⁇ 1 mg / L, hydrocortisone 0.1-20 ⁇ g / L, insulin 0.1-20 mg / L, vitamin B12 0.1-10 mg / L, ptolessin 0.01-1 mg / L, sodium pyruvate
  • a medium containing 10 to 500 mg / L and a water-soluble iron compound is preferably used. If desired, thymidine, hypoxanthine, conventional pH indicators, antibiotics and the like may be added to the medium.
  • DMEM / F12 medium mixed medium of DMEM and F12
  • the serum-free medium contains sodium hydrogencarbonate, L-glutamine, D-glucose, insulin, sodium selenite, diaminobutane, hydrocortisone, iron (II) sulfate, asparagine, aspartic acid, serine and polyvinyl alcohol, DMEM.
  • HG HAM improved (R5) medium may be used.
  • serum-free medium for example, CD OptiCHO TM medium, CHO-S-SFM II medium or CD CHO medium (Thermo Fisher Scientific, formerly Life Technologies), IS cho- VTM medium (Irvine Scientific), EX-CELL TM 302 medium or EX-CELL TM 325-PF medium (SAFC Biosciences) or the like can also be used as the basic medium.
  • the highly expressed hNAGLU mutant is a wild-type under the same conditions when mammalian cells into which an expression vector incorporating a gene encoding it has been introduced are cultured in the above serum-free medium and expressed as a recombinant protein. At least 1.1 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 4 times or more, 5 times or more, or 6 times or more, for example, 1.5 times or more, as compared with the case where hNAGLU is expressed as a recombinant protein. It is characterized in that an expression level of up to 4 times, 2 to 5 times, 2 to 8 times, etc. can be obtained.
  • the mammalian cells used at this time are CHO cells, NS / 0 cells and the like, and are particularly CHO cells.
  • the recombinant hNAGLU mutant expressed in the cell or medium can be separated from impurities by a method such as column chromatography and purified.
  • the purified hNAGLU mutant can be used as a pharmaceutical.
  • the hNAGLU mutant can be used as a drug for the target disease of mucopolysaccharidosis type IIIB (MPS-IIIB) known as Sanfilippo syndrome type B.
  • MPS-IIIB mucopolysaccharidosis type IIIB
  • a drug containing the hNAGLU mutant as an active ingredient can be administered intravenously, intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously or intraventricularly as an injection.
  • injections can be supplied as lyophilized preparations or aqueous liquids.
  • it When it is an aqueous solution, it may be filled in a vial, or it may be supplied as a prefilled-type preparation that is pre-filled in a syringe. In the case of lyophilized preparation, dissolve it in an aqueous medium and restore it before use.
  • the hNAGLU mutant in one embodiment of the present invention can be bound to an antibody.
  • the hNAGLU mutant in one embodiment of the present invention can be a conjugate with an antibody capable of specifically binding to a receptor on cerebrovascular endothelial cells.
  • the hNAGLU variant is made to cross the blood-brain barrier (BBB) and in the central nervous system (CNS). It can be made to exert its function.
  • BBB blood-brain barrier
  • CNS central nervous system
  • the receptor is preferably a human-derived receptor.
  • the term "antibody” mainly refers to human antibody, mouse antibody, humanized antibody, antibody derived from camel family (including alpaca), chimeric antibody between human antibody and antibody of other mammals, and mouse.
  • a chimeric antibody between an antibody and an antibody of another mammal but is not limited to these as long as it has the property of specifically binding to a specific antigen, and is not limited to the animal species of the antibody. There are no particular restrictions on.
  • human antibody refers to an antibody in which the entire protein is encoded by a human-derived gene.
  • human antibodies also include antibodies encoded by genes that have been mutated from the original human gene without changing the original amino acid sequence for the purpose of increasing the expression efficiency of the gene. ..
  • An antibody produced by combining two or more genes encoding human antibodies and replacing a part of one human antibody with a part of another human antibody is also a "human antibody”.
  • Human antibodies have three complementarity determining regions (CDRs) of the light chain and three complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain. The three CDRs of the light chain are referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the one on the N-terminal side.
  • the three CDRs of the heavy chain are also referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the one on the N-terminal side.
  • An antibody obtained by modifying the antigen specificity, affinity, etc. of a human antibody by replacing the CDR of a human antibody with the CDR of another human antibody is also included in the human antibody.
  • an antibody in which a mutation such as substitution, deletion, or addition is added to the amino acid sequence of the original antibody by modifying the gene of the original human antibody is also included in the "human antibody".
  • the amino acid in the amino acid sequence of the original antibody is replaced with another amino acid, the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Antibodies to which mutations are added by combining substitutions and deletions of these amino acids are also human antibodies.
  • amino acids preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the original antibody or to the N-terminal or C-terminal.
  • Antibodies to which mutations are added by combining additions, substitutions and deletions of these amino acids are also human antibodies.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably exhibits 80% or more identity, more preferably 90% or more identity, and even more preferably 95% or more identity with the amino acid sequence of the original antibody. It exhibits sex, and even more preferably 98% or more identity.
  • the mutation can be added to the variable region of the antibody.
  • the mutation may be added to either the CDR or the framework region of the variable region, but is particularly added to the framework region. That is, in the present invention, the term "human-derived gene” includes not only the original human-derived gene but also a gene obtained by modifying it.
  • the term "humanized antibody” means that the amino acid sequence of a part of the variable region (for example, all or part of CDR) is derived from a non-human mammal, and the other region is derived from a human. It refers to a certain antibody.
  • a humanized antibody the three complementarity determining regions (CDRs) of the light chain and the three complementarity determining regions (CDRs) of the heavy chain constituting the human antibody are replaced with CDRs of other mammals. Examples of the antibody produced by.
  • the species of other mammals from which the CDRs to be implanted at appropriate positions of human antibodies are derived are not particularly limited as long as they are non-human mammals, but are preferably mice, rats, rabbits, horses, or Non-human primates, more preferably mice and rats, and even more preferably mice.
  • an antibody in which a mutation similar to the mutation that can be added to the above-mentioned human antibody is added to the amino acid sequence of the original humanized antibody is also included in the "humanized antibody".
  • chimeric antibody refers to an antibody in which fragments of two or more different antibodies derived from two or more different species are linked.
  • a chimeric antibody between a human antibody and an antibody of another mammal is an antibody in which a part of the human antibody is replaced by a part of the antibody of a non-human mammal.
  • the antibody consists of an Fc region, a Fab region and a hinge region described below.
  • Specific examples of such chimeric antibodies include chimeric antibodies in which the Fc region is derived from a human antibody while the Fab region is derived from an antibody of another mammal.
  • the hinge portion is derived from either a human antibody or another mammalian antibody.
  • a chimeric antibody in which the Fc region is derived from another mammal while the Fab region is derived from a human antibody can be mentioned.
  • the hinge portion is derived from either a human antibody or another mammalian antibody.
  • the antibody consists of a variable region and a constant region.
  • the constant region of the heavy chain ( CH ) and the constant region of the light chain ( CL ) are derived from the human antibody, while the variable region of the heavy chain ( VH ) and the light chain.
  • the variable region ( VL ) is derived from antibodies of other mammals, and conversely, the constant region of heavy chain ( CH ) and the constant region of light chain ( CL ) are derived from antibodies of other mammals.
  • the variable region of the heavy chain ( VH ) and the variable region of the light chain ( VL ) may be derived from a human antibody.
  • the species of other mammals is not particularly limited as long as it is a mammal other than humans, but is preferably mice, rats, rabbits, horses, or primates other than humans, for example, mice. ..
  • the antibody in one embodiment of the invention consists of two immunoglobulin light chains (or simply “light chains”) and two immunoglobulin heavy chains (or simply “heavy chains”), for a total of four polypeptide chains.
  • the term "antibody” is used in addition to those having this basic structure. (1) A total of two polypeptide chains, one light chain and one heavy chain, (2) Those consisting of a Fab region in which the Fc region is deleted from the basic structure of the antibody in the original sense, and those consisting of the Fab region and all or part of the hinge portion (Fab, F (ab').
  • It consists of an Fc region in which the Fab region is deleted from the basic structure of the antibody in the original sense, and the amino acid sequence of the Fc region specifically binds to a specific antigen. Modified to have (Fc antibody), (6) A single domain antibody described later is also included in the "antibody" in the present invention.
  • the antibody in one embodiment of the present invention is an antibody derived from a camelid (including alpaca). Some camelid antibodies consist of two heavy chains linked by disulfide bonds. An antibody consisting of these two heavy chains is called a heavy chain antibody.
  • VHH is an antibody consisting of one heavy chain containing a variable region of a heavy chain constituting a heavy chain antibody, or an antibody consisting of a single heavy chain lacking a constant region (CH) constituting a heavy chain antibody.
  • VHH is also one of the antibodies in the embodiment of the present invention.
  • an antibody consisting of two light chains linked by a disulfide bond is also one of the antibodies in the embodiment of the present invention. An antibody consisting of these two light chains is called a light chain antibody.
  • an antibody having a mutation in the amino acid sequence of the camelid antibody is also an antibody in one embodiment of the present invention. Is. When a mutation is added to an amino acid of an antibody of a camelid, a mutation similar to the mutation that can be added to the antibody described herein can be added.
  • the antibody in one embodiment of the present invention is a shark-derived antibody.
  • Shark antibodies consist of two heavy chains linked by disulfide bonds. An antibody consisting of these two heavy chains is called a heavy chain antibody.
  • VNAR is an antibody consisting of one heavy chain containing a variable region of a heavy chain constituting a heavy chain antibody, or an antibody consisting of a single heavy chain lacking a constant region (CH) constituting a heavy chain antibody.
  • VNAR is also one of the antibodies in the embodiment of the present invention.
  • An antibody in one embodiment of the present invention is also obtained by modifying the amino acid sequence of a shark antibody in order to reduce the antigenicity when a shark-derived antibody (including VNAR) is administered to a human. When mutating the amino acids of a shark antibody, the same mutations that can be added to the antibodies described herein can be mutated.
  • a humanized shark antibody is also one of the antibodies in the embodiment of the present invention.
  • An antibody having a basic structure consisting of two light chains and two heavy chains, for a total of four polypeptide chains, has three complementarity determining regions (CDRs) in the variable region ( VL ) of the light chain. It has three complementarity determining regions (CDRs) in the variable region ( VH ) of the chain.
  • the three CDRs of the light chain are referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the one on the N-terminal side.
  • the three CDRs of the heavy chain are also referred to as CDR1, CDR2 and CDR3 in order from the one on the N-terminal side.
  • FR framework regions
  • FR1 FR2, FR3 and FR4 in order from the one on the N-terminal side.
  • CDR and FR exist in the order of FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 from the N-terminal side.
  • the antibody also includes an antibody in which mutations such as substitution, deletion, and addition are added to the amino acid sequence of the original antibody.
  • mutations such as substitution, deletion, and addition are added to the amino acid sequence of the original antibody.
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Antibodies are also mutated by combining substitutions and deletions of these amino acids.
  • amino acids preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the original antibody or to the N-terminal or C-terminal.
  • Antibodies are also mutated by combining additions, substitutions and deletions of these amino acids.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably exhibits 80% or more identity with the amino acid sequence of the original antibody, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more, 95. % Or more, or 98% or more identity.
  • the antibody also includes an antibody in which mutations such as substitution, deletion, and addition are added to the amino acid sequence of the variable region of the original antibody.
  • mutations such as substitution, deletion, and addition are added to the amino acid sequence of the variable region of the original antibody.
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Antibodies are also mutated by combining substitutions and deletions of these amino acids.
  • amino acids preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the original antibody or to the N-terminal or C-terminal.
  • Antibodies are also mutated by combining additions, substitutions and deletions of these amino acids.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably exhibits 80% or more identity with the amino acid sequence of the original antibody, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more, 95. % Or more, or 98% or more identity.
  • the mutation may be added to either the CDR or the framework region of the variable region, but in particular to the framework region.
  • the antibody also includes an antibody in which mutations such as substitutions, deletions, and additions are added to the amino acid sequence in the framework region of the variable region of the original antibody.
  • mutations such as substitutions, deletions, and additions are added to the amino acid sequence in the framework region of the variable region of the original antibody.
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3.
  • Antibodies are also mutated by combining substitutions and deletions of these amino acids.
  • amino acids preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3 amino acids are added to the amino acid sequence of the original antibody or to the N-terminal or C-terminal.
  • Antibodies are also mutated by combining additions, substitutions and deletions of these amino acids.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably exhibits 80% or more identity with the amino acid sequence of the original antibody, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more, 95. % Or more, or 98% or more identity.
  • the antibody also includes an antibody in which mutations such as substitutions, deletions, and additions to amino acid sequences are added to the CDR regions of the variable regions of the original antibody.
  • mutations such as substitutions, deletions, and additions to amino acid sequences are added to the CDR regions of the variable regions of the original antibody.
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2.
  • Antibodies are also mutated by combining substitutions and deletions of these amino acids.
  • amino acids preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2 amino acids are added to the amino acid sequence of the original antibody or to the N-terminal or C-terminal.
  • Antibodies are also mutated by combining additions, substitutions and deletions of these amino acids.
  • the amino acid sequence of the mutated antibody preferably exhibits 80% or more identity with the amino acid sequence of the original antibody, more preferably 85% or more, and even more preferably 90% or more, 95. % Or more, or 98% or more identity.
  • the identity between the amino acid sequence of the original antibody and the amino acid sequence of the mutated antibody can be easily calculated using a well-known homology calculation algorithm.
  • BLAST Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)
  • Pearson and Lipman similarity search method Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)
  • Smith and Waterman's local homology algorithm (Adv. Appl. Math. 2. 482-9 (1981)).
  • a Fab is a light chain that includes a variable region and a CL region (constant region of a light chain), and a variable region and a CH 1 region (part 1 of the constant region of a heavy chain).
  • the heavy chain may further include a part of the hinge portion in addition to the variable region and the CH 1 region (part 1 of the constant region of the heavy chain), but in this case, the hinge portion is in the hinge portion. It lacks the cysteine residue that is present and binds the heavy chains of the antibody to each other.
  • the light chain and the heavy chain are a cysteine residue existing in the constant region ( CL region) of the light chain and a cysteine residue existing in the constant region ( CH 1 region) or the hinge portion of the heavy chain. It is bound by the disulfide bond formed between them.
  • the heavy chain that forms a Fab is called a Fab heavy chain.
  • Fab is composed of one light chain and one heavy chain because it is present in the hinge portion and lacks a cysteine residue that binds the heavy chains of the antibody to each other.
  • the light chain constituting the Fab includes a variable region and a CL region.
  • the heavy chain constituting the Fab may be composed of a variable region and a CH 1 region, or may include a part of a hinge portion in addition to the variable region and the CH 1 region.
  • the hinge portion is selected so as not to contain a cysteine residue that binds between the heavy chains so that a disulfide bond is not formed between the two heavy chains at the hinge portion.
  • the heavy chain contains all or part of the hinge portion containing the cysteine residue that binds the heavy chains together, in addition to the variable region and the CH1 region.
  • F (ab') 2 refers to a molecule in which two F (ab') are bonded by a disulfide bond between cysteine residues existing at the hinge portions of each other.
  • a heavy chain that forms F (ab') or F (ab') 2 is called a Fab'heavy chain.
  • a polymer such as a dimer or a trimer in which a plurality of antibodies are bound directly or via a linker is also an antibody.
  • any antibody that contains a part of an antibody molecule and has a property of specifically binding to an antigen is included in the "antibody" in the present invention.
  • the term "light chain” in the present invention includes those derived from the light chain and having an amino acid sequence of all or part of the variable region thereof.
  • the term heavy chain includes those derived from the heavy chain and having an amino acid sequence of all or part of the variable region. Therefore, as long as it has the amino acid sequence of all or part of the variable region, for example, the one in which the Fc region is deleted is also a heavy chain.
  • the Fc or Fc region is a fragment of the antibody molecule consisting of a CH 2 region (part 2 of the heavy chain constant region) and a CH 3 region (part 3 of the heavy chain constant region). It refers to the area that includes it.
  • the antibody in one embodiment of the present invention is (7)
  • the light chain and heavy chain constituting Fab, F (ab') or F (ab') 2 shown in (2) above were bound via a linker sequence to form a single-chain antibody.
  • Also included are scFab, scF (ab'), and scF (ab') 2 .
  • scFab, scF (ab'), and scF (ab') 2 a linker sequence is bound to the C-terminal side of the light chain, and a heavy chain is further bound to the C-terminal side thereof.
  • a linker sequence may be bound to the C-terminal side of the variable region of the light chain, and a variable region of the heavy chain may be further bound to the C-terminal side thereof, or C of the variable region of the heavy chain may be bound. It may consist of a linker sequence attached to the terminal side and a variable region of the light chain attached to the C-terminal side thereof.
  • antibody as used herein is a broader concept that includes (1) to (7) in addition to the full-length antibody and those shown in (1) to (7) above. Any form of an antigen-binding fragment (antibody fragment) in which a part of a long antibody is deleted is included. Antigen-binding fragments also include heavy chain antibodies, light chain antibodies, VHH, VNAR, and those lacking some of them.
  • antigen-binding fragment refers to a fragment of an antibody that retains at least a portion of its specific binding activity to an antigen.
  • binding fragments include Fab, Fab', F (ab') 2 , variable region (Fv), heavy chain variable region ( VH ) and light chain variable region ( VL ) linked with an appropriate linker.
  • a linker sequence is bound to the C-terminal side of an amino acid sequence containing all or part of the variable region of the light chain, and the linker sequence is further attached to the C-terminal side.
  • the linker sequence is bound to the C-terminal side of the amino acid sequence containing all or part of the variable region of the heavy chain, and the amino acid sequence containing all or part of the variable region of the light chain is further bound to the C-terminal side.
  • the protein capable of specifically binding to a specific antigen is also the "single-chain antibody" in the present invention.
  • the heavy chain In a single-chain antibody in which a light chain is bound to the C-terminal side of the heavy chain via a linker sequence, the heavy chain usually lacks the Fc region.
  • the variable region of the light chain has three complementarity determining regions (CDRs) involved in the antigen specificity of the antibody.
  • the variable region of the heavy chain also has three CDRs. These CDRs are the main regions that determine the antigen specificity of an antibody. Therefore, it is preferable that the single-chain antibody contains all three CDRs of the heavy chain and all three CDRs of the light chain. However, as long as the antigen-specific affinity of the antibody is maintained, it may be a single-chain antibody in which one or more CDRs are deleted.
  • the number of linker sequences arranged between the light chain and the heavy chain of the antibody is preferably 2 to 50, more preferably 8 to 50, still more preferably 10 to 30, and even more preferably. It is a peptide chain composed of 12 to 18 or 15 to 25 amino acid residues, for example, 15 or 25 amino acid residues.
  • Such a linker sequence is not limited in its amino acid sequence as long as the anti-hTfR antibody to which both chains are linked retains the affinity for hTfR, but is preferably composed of glycine alone or glycine and serine.
  • amino acid sequence Gly-Ser amino acid sequence Gly-Gly-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Gly, amino acid sequence Gly-Gly-Gly, amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 3), amino acid sequence Gly- Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 4), amino acid sequence Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 5), or these amino acid sequences are repeated 2 to 10 times or 2 to 5 times. It contains an array.
  • variable region of the light chain is bound to the C-terminal side of the amino acid sequence consisting of the entire variable region of the heavy chain via the linker sequence
  • amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser SEQ ID NO: 3
  • a linker sequence containing a total of 15 amino acids corresponding to 3 consecutive amino acids in is suitable.
  • a single domain antibody refers to an antibody having the property of specifically binding to an antigen in a single variable region.
  • Single domain antibodies include antibodies whose variable region consists only of heavy chain variable regions (heavy chain single domain antibodies) and antibodies whose variable regions consist only of light chain variable regions (light chain single domain antibodies). Is done. VHH and VNAR are a kind of single domain antibody.
  • the term "human transferrin receptor” refers to a membrane protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 57.
  • the antibody of the present invention is applied to the portion from the cysteine residue 89th from the N-terminal side to phenylalanine at the C-terminal (extracellular region of the transferrin receptor) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 57.
  • it is not limited to this.
  • a recombinant protein is produced using a cell into which an expression vector incorporating a gene encoding the protein has been introduced, and the recombinant protein is used to immunize an animal such as a mouse.
  • the method of obtaining the protein is common.
  • the animal species from which the immune system cells are derived is not particularly limited, but primates including mice, rats, rabbits, guinea pigs, dogs, cats, horses, and humans are preferable. It is preferably mice, rats and humans, and more preferably mice and humans.
  • the immune system cells of the mouse for example, splenocytes prepared from the spleen of the mouse can be used.
  • the human immune system cells cells prepared from human peripheral blood, bone marrow, spleen and the like can be used.
  • hybridoma cells capable of producing antibodies can be produced by fusing the cells with myeloma cells.
  • mRNA is extracted from post-immunized cells to synthesize cDNA, and DNA fragments containing genes encoding the light and heavy chains of immunoglobulin are amplified by PCR reaction using this cDNA as a template, and artificially used. It is also possible to reconstruct the antibody gene.
  • hybridoma cells as obtained by the above method also include cells that produce antibodies that recognize unintended proteins as antigens. Further, not all hybridoma cells that produce an antibody against a desired protein produce an antibody that exhibits desired characteristics such as having a high affinity for the protein.
  • the artificially reconstructed antibody gene also includes a gene encoding an antibody that recognizes an unintended protein as an antigen. Further, not all genes encoding an antibody against a desired protein encode an antibody exhibiting desired properties such as having a high affinity for the protein.
  • a step of selecting a hybridoma cell that produces an antibody having a desired characteristic from the hybridoma cell as obtained above is required.
  • a step of selecting a gene encoding an antibody having a desired characteristic from the antibody gene is required.
  • the method described in detail below is effective. be.
  • the protein when selecting a hybridoma cell that produces an antibody having high affinity for a desired protein, the protein is added to a plate and retained in the plate, and then the culture supernatant of the hybridoma cell is added, and then the said.
  • a method is used in which the antibody that is not bound to the protein is removed from the plate and the amount of antibody retained on the plate is measured. According to this method, the higher the affinity of the antibody contained in the culture supernatant of the hybridoma cells added to the plate to the protein, the greater the amount of antibody retained on the plate. Therefore, the amount of antibody retained on the plate is measured, and the hybridoma cell corresponding to the plate on which more antibody is retained is used as a cell line that produces an antibody having a relatively high affinity for the protein.
  • the cells used as host cells may be proto-nuclear cells or eukaryotic cells as long as they can express the antibody gene by introducing an expression vector incorporating an artificially reconstructed antibody gene.
  • cells derived from mammals such as humans, mice, and Chinese hamsters are preferable, and CHO cells derived from Chinese hamster ovary or NS / 0 cells derived from mouse myeloma are particularly preferable.
  • the expression vector used for incorporating and expressing the gene encoding the antibody gene can be used without particular limitation as long as it expresses the gene when introduced into a mammalian cell.
  • the gene integrated into the expression vector is placed downstream of a DNA sequence (gene expression control site) capable of regulating the frequency of gene transcription in mammalian cells.
  • a DNA sequence capable of regulating the frequency of gene transcription in mammalian cells.
  • the gene expression control site that can be used in the present invention include a cytomegalovirus-derived promoter, an SV40 early promoter, a human elongation factor-1alpha (EF-1 ⁇ ) promoter, a human ubiquitin C promoter, and the like.
  • Mammalian cells into which such an expression vector has been introduced will express the above-mentioned artificially reconstructed antibody incorporated into the expression vector.
  • the protein is added to the plate.
  • the method is to contact the protein with the culture supernatant of the cells, then remove the antibody that is not bound to the protein from the plate, and measure the amount of antibody retained on the plate. Be done. According to this method, the higher the affinity of the antibody contained in the cell culture supernatant for the protein, the greater the amount of antibody retained on the plate.
  • the amount of antibody retained on the plate is measured, and the cell corresponding to the plate on which more antibody is retained is selected as a cell line that produces an antibody having a relatively high affinity for the protein.
  • a gene encoding an antibody having a high affinity for the protein can be selected.
  • a gene encoding a high affinity antibody can also be isolated by amplifying a DNA fragment containing a gene encoding an antibody against the protein from the cell line selected in this manner by using the PCR method. ..
  • Non-peptide linkers include polyethylene glycol, polypropylene glycol, copolymers of ethylene glycol and propylene glycol, polyoxyethylated polyols, polyvinyl alcohol, polysaccharides, dextran, polyvinyl ether, biodegradable polymers, lipid polymers, etc. Chitins and hyaluronic acid, derivatives thereof, or a combination thereof can be used.
  • a peptide linker is a peptide chain consisting of 1 to 50 amino acids bound to a peptide or a derivative thereof, and its N-terminal and C-terminal respectively form a covalent bond with any of the antibodies of the hNAGLU variant. , It binds the hNAGLU variant to the antibody.
  • the antibody and the hNAGLU variant bind the N-terminal or C-terminal of the hNAGLU variant to the C-terminal or N-terminal side of the heavy or light chain of the antibody via a linker sequence or directly, respectively, by peptide bond. You can also do it.
  • the conjugate formed by binding the antibody to the hNAGLU variant in this way is a DNA fragment encoding the linker sequence directly on the 3'end side or the 5'end side of the cDNA encoding the heavy chain or the light chain of the antibody.
  • a DNA fragment in which the cDNA encoding the hNAGLU variant is arranged in frame is incorporated into an expression vector for mammalian cells, and the mammalian cells into which this expression vector has been introduced are cultured as a fusion protein. Obtainable.
  • the expression vector for the mammalian cell incorporating the cDNA fragment encoding the light chain of the antibody is also the same host.
  • An expression vector for mammalian cells that can be introduced into cells and that incorporates a cDNA fragment encoding the heavy chain of an antibody when the DNA fragment encoding the hNAGLU variant is bound to the light chain.
  • the fusion protein that binds the antibody to the hNAGLU variant encodes the linker sequence directly or on the 5'end or 3'end of the cDNA encoding the hNAGLU variant.
  • a DNA fragment in which a cDNA encoding a single-chain antibody is ligated is incorporated into an expression vector (for mammalian cells, eukaryotic cells such as yeast, or prokaryotic cells such as Escherichia coli), and this expression is expressed. It can be obtained by expression in these cells into which the vector has been introduced.
  • the fusion protein of the antibody and the hNAGLU mutant can be produced as a recombinant protein by the above method.
  • any medium can be used as long as the animal cells can be cultured and proliferated, but a serum-free medium is preferably used. Be done.
  • the serum-free medium used as the medium for producing recombinant protein for example, amino acids are 3 to 700 mg / L, vitamins are 0.001 to 50 mg / L, and monosaccharides are 0.3 to 10 g / L.
  • Inorganic salts 0.1 to 10000 mg / L, trace elements 0.001 to 0.1 mg / L, nucleosides 0.1 to 50 mg / L, amino acids 0.001 to 10 mg / L, biotin 0.01 ⁇ 1 mg / L, hydrocortisone 0.1-20 ⁇ g / L, insulin 0.1-20 mg / L, vitamin B12 0.1-10 mg / L, ptolessin 0.01-1 mg / L, sodium pyruvate
  • a medium containing 10 to 500 mg / L and a water-soluble iron compound is preferably used. If desired, thymidine, hypoxanthine, conventional pH indicators, antibiotics and the like may be added to the medium.
  • DMEM / F12 medium (mixed medium of DMEM and F12) may be used as the basic medium as the serum-free medium used as the medium for producing the fusion protein of the antibody and the hNAGLU variant, and each of these media is well known to those skilled in the art. be.
  • the serum-free medium contains sodium hydrogencarbonate, L-glutamine, D-glucose, insulin, sodium selenite, diaminobutane, hydrocortisone, iron (II) sulfate, asparagine, aspartic acid, serine and polyvinyl alcohol, DMEM.
  • HG HAM improved (R5) medium may be used.
  • serum-free medium for example, CD OptiCHO TM medium, CHO-S-SFM II medium or CD CHO medium (Thermo Fisher Scientific, formerly Life Technologies), IS cho- VTM medium (Irvine Scientific), EX-CELL TM 302 medium or EX-CELL TM 325-PF medium (SAFC Biosciences) or the like can also be used as the basic medium.
  • Preferred embodiments of the fusion protein of the antibody and the hNAGLU mutant include the following (1) to (7). That is: (1) A conjugate containing the hNAGLU mutant bound directly to the C-terminal of the heavy chain of the antibody or via a linker, and the light chain of the antibody; (2) A conjugate containing the hNAGLU mutant bound directly to the N-terminal of the heavy chain of the antibody or via a linker, and the light chain of the antibody; (3) A conjugate containing the hNAGLU mutant bound directly to the C-terminal of the light chain of the antibody or via a linker, and the heavy chain of the antibody; (4) A conjugate containing a conjugate in which the hNAGLU mutant is bound to the N-terminal of the light chain of the antibody directly or via a linker, and a heavy chain of the antibody.
  • the number of linker sequences arranged between the antibody and the hNAGLU mutant is preferably 1 to 60 or 1 to 50, more preferably 1 to 1. It is a peptide chain composed of 17, more preferably 1 to 10, and even more preferably 1 to 5 amino acids, but the number of amino acids constituting the linker sequence is 1, 2, or 3. It can be appropriately adjusted from 1 to 17, 1 to 10, 10 to 40, 20 to 34, 23 to 31, 25 to 29, 27 and the like.
  • Such a linker sequence is such that the ligated antibody retains its affinity for the receptor on cerebrovascular endothelial cells, and the hNAGLU variant ligated by the linker sequence is such hNAGLU under physiological conditions.
  • its amino acid sequence is not limited, but it is preferably composed of glycine and serine.
  • amino acid sequence Gly-Ser amino acid sequence Ser-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Ser, amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 58), amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 59), amino acid sequence Ser-Gly-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 60), or 1 to 10 of these amino acid sequences, Alternatively, those containing 2 to 5 consecutive sequences can be mentioned.
  • those containing the amino acid sequence Gly-Ser can be suitably used as a linker sequence.
  • a linker sequence containing a total of 27 amino acid sequences in which the amino acid sequence Gly-Ser is followed by the amino acid sequence Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 58) is preferably used.
  • a linker sequence containing a total of 25 amino acid sequences having five consecutive amino acid sequences Gly-Gly-Gly-Gly-Ser can be preferably used.
  • each linker sequence is named as a first linker sequence and a second linker sequence in order from the N-terminal side for convenience.
  • anti-hTfR antibody anti-human transferrin receptor antibody
  • An anti-hTfR antibody wherein the light chain of the antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 and the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62
  • anti-hTfR anti-human transferrin receptor antibody
  • An antibody that is an antibody and is a Fab antibody wherein the light chain of the antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61 and the heavy chain comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63. Is.
  • the anti-hTfR antibody of the above (1) and (2) is a humanized anti-hTfR antibody.
  • the number of amino acids to be replaced is preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5. , More preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. , Even more preferably one or two. Mutations that combine substitutions and deletions of these amino acids can also be added.
  • amino acid When an amino acid is added to the amino acid sequence of the light chain of the above anti-human transferrin receptor antibody, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 in the amino acid sequence of the light chain or on the N-terminal side or the C-terminal side. 13 amino acids, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2 amino acids are added. Mutations that combine additions, substitutions and deletions of these amino acids can also be added.
  • the mutated light chain amino acid sequence has preferably 80% or more identity, more preferably 90% or more identity, and even more preferably 95% identity with the original light chain amino acid sequence. The above identity is shown.
  • the number of amino acids to be substituted is preferably 1 to 10, and more preferably 1 to 5. , More preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2.
  • the number of amino acids to be deleted is preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, and even more preferably 1 to 3. , Even more preferably one or two. Mutations that combine substitutions and deletions of these amino acids can also be added.
  • amino acid When an amino acid is added to the amino acid sequence of the heavy chain of the above anti-human transferrin receptor antibody, preferably 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to 5 in the amino acid sequence of the heavy chain or on the N-terminal side or the C-terminal side. 13 amino acids, more preferably 1 to 3, and even more preferably 1 or 2 amino acids are added. Mutations that combine additions, substitutions and deletions of these amino acids can also be added.
  • the mutated heavy chain amino acid sequence has preferably 80% or more identity with the original heavy chain amino acid sequence, more preferably 90% or more identity, and even more preferably 95%. The above identity is shown.
  • the hNAGLU variant of the present invention is caused by NAGLU deficiency because it can cross the blood-brain barrier and exert its function in the brain by binding to an antibody against a receptor on cerebrovascular endothelial cells. It can be used for the production of drugs for blood administration for the treatment of disease states of the central nervous system.
  • the hNAGLU mutant bound to the antibody is administered in the blood to the relevant patient in a therapeutically effective amount for the disease state of the central nervous system caused by NAGLU deficiency (including intravenous injection such as intravenous drip infusion). Can be used in therapeutic methods, including.
  • the hNAGLU mutant bound to the antibody administered in the blood can reach not only the brain but also other organs / organs expressing NAGLU.
  • the drug can also be used to prevent the onset of the disease state.
  • the hNAGLU variant of the present invention can be administered into the blood and used as a drug to exert its medicinal effect in the central nervous system (CNS) by binding to an antibody against a receptor on cerebrovascular endothelial cells.
  • CNS central nervous system
  • Such a drug is generally administered to a patient by intravenous injection such as intravenous drip injection, subcutaneous injection, or intramuscular injection, but the route of administration is not particularly limited.
  • the hNAGLU mutant in one embodiment of the present invention is not limited to an antibody, but can also be a conjugate with other proteins.
  • the other proteins are not particularly limited, but the proteins are, for example, human-derived proteins.
  • a conjugate of the hNAGLU mutant and the other protein can be obtained by the above-mentioned method for producing a conjugate of the hNAGLU mutant and an antibody.
  • the fusion protein of the hNAGLU mutant and the other protein can be obtained as a recombinant protein by the method for producing the fusion protein with the above-mentioned antibody.
  • One embodiment of the invention includes a gene encoding a fusion protein of a hNAGLU variant and another protein, an expression vector incorporating the gene, and a host cell into which the expression vector has been introduced.
  • the hNAGLU mutant in one embodiment of the present invention is not limited to the anti-hTfR antibody, but can also be a conjugate with a substance capable of binding to human hTfR.
  • the substance is not particularly limited, but the protein is, for example, human transferrin.
  • Human transferrin is not limited to the wild type, and may be a partial fragment or a mutant thereof as long as it has an affinity for hTfR.
  • conjugates can cross the blood-brain barrier and exert their functions in the brain.
  • the fusion protein of the hNAGLU mutant and human transferrin can be obtained as a recombinant protein by the method for producing the fusion protein with the above-mentioned antibody.
  • One embodiment of the present invention includes a gene encoding a fusion protein of an hNAGLU variant and human transferase, an expression vector incorporating the gene, and a host cell into which the expression vector has been introduced.
  • Example 1 Construction of expression vector for hNAGLU mutant A DNA fragment having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 41 containing the wild-type hNAGLU gene was synthesized. Using this as a template, the MluI-added 5'primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 as a forward primer, and the primers shown in Table 1 as a reverse primer, PCR of Nos. 1 to 7 and 11 shown in Table 1 is used. Was done. Table 1 shows the sequence numbers corresponding to the base sequences of each reverse primer.
  • PCR products obtained by PCR of Nos. 1 to 7 and 11 shown in Table 1 as forward primers are shown in SEQ ID NO: 43 as reverse primers.
  • PCR was performed using the His tag-Not I addition 3'primer having the same nucleotide sequence, and a PCR product containing the gene encoding the hNAGLU variant shown in Table 2 was obtained.
  • Table 2 shows the sequence number corresponding to the amino acid sequence of each hNAGLU mutant, the sequence number corresponding to the base sequence encoding them, and the number (mutant number) of each hNAGLU mutant.
  • PCR was performed using the PCR product obtained by the above-mentioned PCR to obtain a PCR product containing the gene encoding the hNAGLU variant shown in Table 4.
  • Table 4 shows the sequence number corresponding to the amino acid sequence of each hNAGLU mutant, the sequence number corresponding to the base sequence encoding them, and the number (mutant number) of each hNAGLU mutant.
  • the PCR products obtained by PCR of Nos. 1 to 11 and the DNA fragment having the base sequence represented by SEQ ID NO: 41 encoding wild-type hNAGLU were treated with restriction enzymes with MluI and NotI (Takara Bio). , Separated by agarose gel electrophoresis. After EtBr staining, a band containing the target DNA fragment was excised under UV irradiation, and DNA was extracted from the gel using the QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN). Similarly, the pCI-neo vector (Promega) and the pEI-puro vector were also treated with restriction enzymes with MluI and NotI, and gel extraction and purification were performed.
  • Each PCR product treated with the restriction enzyme was mixed with each vector treated with the restriction enzyme, and a ligation reaction was carried out at 16 ° C. for 30 to 60 minutes using Ligation Mix (Takara Bio Inc.). A ligation reaction was also carried out for the DNA fragment containing the base sequence shown by SEQ ID NO: 41 containing the wild-type hNAGLU gene.
  • the pEI-puro vector was prepared by the following procedure.
  • the pEF / myc / nuc vector (Invitrogen) is digested with restriction enzymes (KpnI and NcoI), a DNA fragment containing the EF-1a promoter and its first intron is excised, and this DNA fragment is blunt-ended with T4 DNA polymerase.
  • restriction enzymes KpnI and NcoI
  • pCI-neo (Invitrogen) was digested with restriction enzymes (BglII and EcoRI), the region containing the enhancer / promoter and intron of CMV was excised, and then blunt-terminated with T4 DNA polymerase.
  • the pCAGIpuro vector (Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000)) is digested with restriction enzymes (NotI and BamHI) and derived from mouse encephalomyopathy virus (EMCV).
  • EMCV mouse encephalomyopathy virus
  • the pE-neo vector was digested with restriction enzymes (NotI and BamHI) to excise the region of about 2 kbp containing the neomycin resistance gene (Neo r ).
  • restriction enzymes NotI and BamHI
  • a DNA fragment containing polyA derived from the above IRES, PuroR and bGH was inserted into this. This was named the pEI-puro vector.
  • Escherichia coli (ECOS TM X Competent E. coli DH5 ⁇ , Nippon Gene Co., Ltd.) was transformed with each ligation reaction solution.
  • LB liquid medium LB Broth, Sigma-Aldrich
  • FastGene plasmid Mini Kit Nippon Genetics
  • the purified plasmid DNA was treated with restriction enzymes MluI and NotI, and separated by agarose gel electrophoresis. It was confirmed that the desired insert DNA was inserted. In addition, it was confirmed by Sanger sequence analysis that the desired modification was introduced into each hNAGLU gene.
  • Each plasmid confirmed to incorporate the target hNAGLU mutant or wild-type hNAGLU was purified by a conventional method.
  • Example 2 Transient expression of hNAGLU mutant
  • a plasmid in which a gene encoding each hNAGLU mutant was incorporated into the purified pCI-neo vector obtained in Example 1 was used. I went.
  • a plasmid in which a gene encoding wild-type NAGLU was incorporated into a pCI-neo vector was used.
  • ExpiCHO cells were transformed using a plasmid incorporating a gene encoding an hNAGLU mutant and a plasmid incorporating a gene encoding a wild-type hNAGLU according to the High titer protocol of the ExpiCHO Expression System (Thermo Fisher Scientific). .. After transformation, cells were cultured for 8 days, and each hNAGLU mutant and wild-type hNAGLU were expressed in the culture supernatant. After culturing, the culture broth was centrifuged to collect the culture supernatant.
  • Example 3 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (SDS page electrophoresis) 10 ⁇ L of the culture supernatant obtained in Example 2 was mixed with 8 ⁇ L of 2 ⁇ Sample Buffer (Biorad) and 2 ⁇ L of 2-Mercaptoethanol, and kept warm at 100 ° C. for 3 minutes under reducing conditions. It was heat-denatured. Place the heat-denatured sample in 5 ⁇ L each in wells of a 5-20% polyacrylamide gel placed in 50 mM Tris buffer / 380 mM glycine buffer (pH 8.3) containing 0.1% SDS, 25 mA. It was electrophoresed at a constant current.
  • the gel after electrophoresis was immersed in Oriole Fluorescent Gel Stain (Biorad) and shaken at room temperature for 90 minutes. After washing the gel with pure water, a protein band was detected with a lumino image analyzer (Amersham Imager 600RGB, Citiva).
  • Example 4 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (Western blotting method) Electrophoresis was performed in the same manner as in Example 3, and the nitrocellulose membrane and the gel after electrophoresis were sandwiched between blotting papers dipped in 25 mM Tris buffer / 192 mM glycine buffer containing 20% methanol. The protein was transferred to the nitrocellulose membrane by energizing with a blotting device at 1.0 A and 25 V for 10 minutes.
  • Example 5 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (enzyme activity measurement)
  • the culture supernatant obtained in Example 2 was diluted 10-fold with 100 mM citric acid buffer (pH 4.2) containing 0.1% BSA.
  • 4-MU 4-Methylumbelliferone, Sigma-Aldrich
  • the fluorescence intensity of 4-MU (4-Methylumbelliferone) released by a fluorescent plate reader was measured (excitation wavelength 355 nm, fluorescence wavelength 460 nm).
  • a calibration curve was prepared based on the measurement results of the standard solution, and the measured values of each sample solution were intercalated into the calibration curve to determine the amount of enzyme activity.
  • FIG. 1 shows the measurement results of the hNAGLU mutant expression level by transient expression measured in Examples 2 to 4.
  • Table 5 shows the expression level of each hNAGLU mutant based on the enzyme activity measurement result shown by the bar graph in FIG. 1 as a relative value when the expression level of the wild type is 1.
  • the expression level of the Q209R hNAGLU mutant (mutant No. 3) was 4.4 times higher than that of the wild-type hNAGLU.
  • the R129Q hNAGLU mutant (mutant number 16), S526N / A528T hNAGLU mutant (mutant number 17), D613Q hNAGLU mutant (mutant number 18), and H204K hNAGLU mutant (mutant number 19) are It showed a low transient expression compared to the wild type.
  • Example 7 Preparation of hNAGLU mutant-expressing bulk cells Using a gene transfer apparatus (super electroporator NEPA21, Neppagene), each hNAGLU obtained in Example 1 was applied to a serum-free conditioned strain of CHO-K1 cells. Expression plasmids incorporating mutants or genes encoding wild-type hNAGLU were introduced, and selective culture was performed on CD OptiCHO medium (Thermo Fisher Scientific) containing 10 ⁇ g / mL Puromycin (Thermo Fisher Scientific).
  • the volume of the culture medium was gradually increased by repeating the medium exchange every 3 to 4 days, and the cells were collected when the viability of the cells in culture exceeded 90%, and these were collected as hNAGLU mutant-expressing bulk cells and wild-type cells.
  • the hNAGLU-expressing bulk cells were used.
  • Example 8 Culturing of hNAGLU mutant-expressing bulk cells Two hNAGLU mutant-expressing bulk cells and wild-type hNAGLU-expressing bulk cells obtained in Example 7 were placed in a CD OptiCHO medium containing 10 ⁇ g / mL Puromycin. The cells were seeded at a cell density of ⁇ 10 5 cells / mL and statically cultured in the presence of 5% CO 2 at 37 ° C. Nine days after the start of the culture, the culture supernatant was centrifuged and the culture supernatant was collected.
  • Example 9 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by bulk cells (enzyme activity measurement)
  • the culture supernatant obtained in Example 8 was diluted 10-fold with a citric acid buffer solution (pH 4.2) containing 0.1% BSA to prepare a sample solution.
  • a citric acid buffer solution pH 4.2
  • 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminide which is an artificial substrate of hNAGLU, was diluted with citric acid buffer (pH 4.2) to 1 mmol / L.
  • a calibration curve was prepared based on the measurement results of the standard solution, and the measured values of each sample solution were intercalated into the calibration curve to determine the amount of enzyme activity.
  • the amount of enzyme activity was determined for each hNAGLU variant as the amount of hNAGLU enzyme activity (nmol / h / 1 ⁇ 10 6 cells) expressed from 1 ⁇ 10 6 cells during culture.
  • FIG. 2 shows the measurement results of the hNAGLU mutant expression level by the bulk cells measured in Example 9.
  • Table 6 shows the expression level of each hNAGLU mutant based on the enzyme activity measurement result shown by the bar graph in FIG. 2 as a relative value when the expression level of the wild type is 1. The bulk cell culture was repeated 4 times, and the enzyme activity was measured for each.
  • the expression levels of the seven mutants of the S526N / A528T hNAGLU mutant (mutant numbers 1 to 7) were higher than those of the wild type.
  • the expression level of the Q209R hNAGLU mutant (mutant No. 3) was 2.2 times higher than that of the wild-type hNAGLU.
  • mutant number 16 R129Q hNAGLU mutant
  • S526N / A528T hNAGLU mutant mutant number 17
  • D613Q hNAGLU mutant mutant number 18
  • H204K hNAGLU H204K hNAGLU
  • Example 11 Mutation introduction into Q209R hNAGLU mutant and construction of expression vector From the experimental results of Examples 1 to 10, it was found that the Q209R hNAGLU mutant showed the highest expression level among the hNAGLU mutants. .. Therefore, in order to obtain a higher expression hNAGLU mutant, further mutations were introduced into the Q209R hNAGLU mutant.
  • the MluI-added 5'primer having the base sequence shown by SEQ ID NO: 42 as a forward primer is shown in Table 7 as a reverse primer. PCR of Nos. 12 to 15 shown in Table 7 was performed using primers. Table 7 shows the SEQ ID NOs corresponding to the base sequences of each reverse primer.
  • the His tag having the primer shown in Table 8 as a forward primer and the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 43 as a reverse primer- PCR of No. 16 shown in Table 8 was performed using the NotI-added 3'primer.
  • Table 8 shows the SEQ ID NOs corresponding to the base sequences of the forward primers.
  • Table 10 shows the sequence number corresponding to the amino acid sequence of each hNAGLU mutant, the sequence number corresponding to the base sequence encoding them, and the number (mutant number) of each hNAGLU mutant.
  • each PCR product obtained by PCR of Nos. 17-19, 21, and 23-26 was treated with restriction enzymes by MluI and NotI (Takara Bio Inc.), and separated by agarose gel electrophoresis. After EtBr staining, a band containing the target DNA fragment was excised under UV irradiation, and DNA was extracted from the gel using the QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN). Similarly, the pCI-neo vector (Promega) and the pEI-puro vector were also treated with restriction enzymes with MluI and NotI, and gel extraction and purification were performed. Each PCR product treated with the restriction enzyme was mixed with each vector treated with the restriction enzyme, and a ligation reaction was carried out at 16 ° C. for 30 to 60 minutes using Ligation Mix (Takara Bio Inc.).
  • Escherichia coli (ECOS TM X Competent E. coli DH5 ⁇ , Nippon Gene Co., Ltd.) was transformed with each ligation reaction solution.
  • LB liquid medium LB Broth, Sigma-Aldrich
  • FastGene plasmid Mini Kit Nippon Genetics
  • the purified plasmid DNA was treated with restriction enzymes MluI and NotI, and separated by agarose gel electrophoresis. It was confirmed that the desired insert DNA was inserted. In addition, it was confirmed by Sanger sequence analysis that the desired modification was introduced into each hNAGLU gene.
  • Each plasmid confirmed to incorporate the desired hNAGLU mutant was purified by a conventional method.
  • Example 12 Transient expression of hNAGLU mutant Transient expression of hNAGLU mutant was performed using a plasmid in which the hNAGLU mutant was incorporated into the pCI-neo vector purified in Example 11. As a control, a plasmid in which wild-type hNAGLU was incorporated into a pCI-neo vector was used.
  • ExpiCHO cells were transformed using a plasmid incorporating a gene encoding an hNAGLU mutant and a plasmid incorporating a gene encoding a wild-type hNAGLU according to the High titer protocol of the ExpiCHO Expression System (Thermo Fisher Scientific). .. After transformation, cells were cultured for 8 days, and each hNAGLU mutant and wild-type hNAGLU were expressed in the culture supernatant. After culturing, the culture broth was centrifuged to collect the culture supernatant. In addition, as a negative control, the culture supernatant of untransformed cells was collected in the same manner.
  • Example 13 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (SDS page electrophoresis) 10 ⁇ L of the culture supernatant obtained in Example 12 was mixed with 8 ⁇ L of 2 ⁇ Sample Buffer and 2 ⁇ L of 2-Mercaptoethanol, and heat-denatured under reducing conditions by keeping the temperature at 100 ° C. for 3 minutes. Apply 5 ⁇ L each of the heat-denatured sample to the wells of a 5-20% polyacrylamide gel placed in 50 mM Tris buffer / 380 mM glycine buffer (pH 8.3) containing 0.1% SDS, 25 mA. It was electrophoresed at a constant current. The gel after electrophoresis was immersed in Oriole Fluorescent Gel Stain (Biorad) and shaken at room temperature for 90 minutes. After washing the gel with pure water, a protein band was detected with a lumino image analyzer.
  • Example 14 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (Western blotting method) Electrophoresis was performed in the same manner as in Example 13, and the nitrocellulose membrane and the gel after electrophoresis were sandwiched between blotting papers dipped in 25 mM Tris buffer / 192 mM glycine buffer containing 20% methanol. The protein was transferred to the nitrocellulose membrane by energizing with a blotting device at 1.0 A and 25 V for 10 minutes.
  • the transferred nitrocellulose membrane was immersed in PBS containing 5% skim milk and shaken for 1 hour, and then immersed in Mouse anti-His tag mAb solution diluted to 0.4 ⁇ g / mL and shaken for 1 hour. After washing the membrane with PBST, the membrane was immersed in Anti-mouse IgG (H + L) and HRP Conjugate solution diluted to 0.4 ⁇ g / mL, shaken for 30 minutes, and washed again with PBST. The HRP detection reagent was added dropwise to the transfer surface of the membrane, reacted for 5 minutes, and detected with a lumino image analyzer.
  • Example 15 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (enzyme activity measurement)
  • the culture supernatant obtained in Example 12 was diluted 10-fold with a citric acid buffer solution (pH 4.2) containing 0.1% BSA to prepare a sample solution.
  • a citric acid buffer solution pH 4.2
  • 4-Methylumbelliferyl-N-acetyl- ⁇ -D-glucosaminide which is an artificial substrate of hNAGLU, was diluted with citric acid buffer (pH 4.2) to 1 mmol / L.
  • Example 16 Confirmation of hNAGLU mutant expression level by transient expression (result) 3 and 4 show the measurement results of the hNAGLU mutant expression level by transient expression measured in Examples 12 to 15.
  • Table 11 shows the expression levels of each hNAGLU mutant based on the enzyme activity measurement results shown in the bar graphs in FIGS. 3 and 4 as relative values when the wild-type expression level is 1.
  • the V54I / Q209R / R620K hNAGLU mutant showed a transient expression of about 1.8 times (5.9 times that of the wild type) compared with the Q209R hNAGLU mutant.
  • a positive correlation was observed between the amount of enzyme activity and the expression level of the hNAGLU mutant confirmed by SDS page electrophoresis shown in FIGS. 3 (b) and 4 (a).
  • a positive correlation was observed between the amount of enzyme activity and the expression level of the hNAGLU mutant confirmed by the Western blotting method shown in FIG. 4 (b).
  • Example 17 The above results indicate that when the recombinant hNAGLU is produced, the production amount can be 2 to 5 times higher by producing the recombinant Q209R hNAGLU mutant instead of the recombinant wild-type hNAGLU. show.
  • Example 18 Construction of cells for expression of fusion protein of anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) and hNAGLU variant
  • the fusion protein of anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) and hNAGLU variant is as follows. It can be manufactured by the method described in detail in.
  • the expression vectors pE-neo vector and pE-hygr vector are constructed by the method described in the patent document (WO2018 / 124121).
  • the pE-neo and pE-hygr vectors are digested with MluI and NotI, respectively.
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is connected to the C-terminal of the Fab heavy chain of the anti-hTfR antibody containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63 via a linker sequence consisting of a total of 15 amino acids.
  • a MluI sequence and a sequence encoding a leader peptide that functions as a secretory signal are arranged in order from the 5'end, and a NotI sequence is arranged on the 3'side.
  • This DNA fragment is digested with MluI and NotI and incorporated between MluI and NotI of the pE-neo vector to construct pE-neo (HC-mhNAGLU).
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 is connected to the C-terminal of the L44_G45insS / Q209R hNAGLU mutant (mutant No. 9) via a linker sequence consisting of a total of 15 amino acids in a row of SEQ ID NO: 63.
  • the DNA fragment encoding the protein represented by SEQ ID NO: 65 to which the Fab heavy chain of the anti-hTfR antibody comprising the amino acid sequence of is bound is synthesized. On the 5'side of this DNA fragment, a MluI sequence and a sequence encoding a leader peptide that functions as a secretory signal are arranged in order from the 5'end, and a NotI sequence is arranged on the 3'side.
  • This DNA fragment is digested with MluI and NotI and incorporated between MluI and NotI of the pE-neo vector to construct pE-neo (mhNAGLU-HC).
  • CHO cells obtained from CHO-K1: American Type Culture Collection
  • GenePulser Bio-Rad
  • pE-neo HC-mhNAGLU
  • pE-neo HC-mhNAGLU
  • transform with pE-neo HC-mhNAGLU
  • pE-neo mhNAGLU-HC
  • Cell transformation is generally performed by the following method. 5X10 5 CHO-K1 cells are seeded in a 3.5 cm culture dish supplemented with CD OptiCHO TM medium (Life Technologies) and cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Opti-MEM TM I medium Life Technologies
  • Opti-MEM TM I medium Life Technologies
  • the cells selected in the selective culture are seeded on a 96-well plate so that one or less cells are seeded per well, and each cell is about to form a monoclonal colony. Incubate for 10 days. The culture supernatant of the well in which the monoclonal colony was formed is collected, the humanized antibody content in the culture supernatant is examined by the ELISA method, and a cell line highly expressing humanized antibody is selected.
  • the ELISA method at this time is generally implemented by the following method.
  • a goat anti-human IgG polyclonal antibody solution diluted to 4 ⁇ g / mL with 0.05 M bicarbonate buffer (pH 9.6) at room temperature.
  • the antibody was adsorbed on the plate by allowing it to stand for at least 1 hour.
  • PBS Starting Block
  • Blocking Buffer Thermo Fisher Scientific
  • culture supernatant or human IgG standard product diluted to an appropriate concentration with PBS supplemented with 0.5% BSA and 0.05% Tween 20 (PBS-BT) was added to each well.
  • PBS-BT culture supernatant or human IgG standard product diluted to an appropriate concentration with PBS supplemented with 0.5% BSA and 0.05% Tween 20
  • Example 19 Production of fusion protein of anti-hTfR antibody and hNAGLU mutant
  • the fusion protein of anti-hTfR antibody and hNAGLU mutant can be produced by the following method.
  • the highly expressed cell line described in Example 18 was diluted with CD OptiCHO TM medium so that the cell concentration was about 2 ⁇ 10 5 cells / mL, and 200 mL of the cell suspension was added to a 1 L triangular flask. Incubate at 37 ° C. in a moist environment consisting of 5% CO 2 and 95% air at a stirring rate of about 70 rpm for 6-7 days.
  • the culture supernatant is collected by centrifugation and filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Millipore) to collect the culture supernatant.
  • To the culture supernatant add 20 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 150 mL NaCl, which is 5 times the volume of the column, and add 20 mM Tris buffer (pH 8.0), which contains 150 mL NaCl, which is 3 times the volume of the column.
  • Load the Protein A column (column volume: 1 mL, Bio-Rad) pre-equilibrated in 8.0).
  • the column was washed by supplying the same buffer solution having a volume of 5 times the volume of the column, and then adsorbed fusion protein with a 50 mM glycine buffer solution (pH 2.8) having a volume 4 times the volume of the column containing 150 mM NaCl. Elute.
  • the pH of the eluate containing this fusion protein is adjusted to pH 7.0 by adding 1 M Tris buffer (pH 8.0).
  • the solution thus obtained is stored as a refined product of the fusion protein at 4 ° C or frozen.
  • hNAGLU mutant that can be administered as enzyme replacement therapy for the treatment of patients with mucopolysaccharidosis type IIIB, and is more as a recombinant protein than wild-type hNAGLU. It is possible to provide hNAGLU mutants for efficient production.
  • SEQ ID NO: 1 Nucleotide sequence of wild-type hNAGLU
  • SEQ ID NO: 2 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding wild-type hNAGLU
  • synthetic sequence SEQ ID NO: 3: Amino acid sequence of hNAGLU variant No. 1
  • SEQ ID NO: 4 hNAGLU variant No. 1.
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 7 hNAGLU variant number 16 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 8 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 16
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of hNAGLU variant No. 3
  • SEQ ID NO: 10 DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 3
  • SEQ ID NO: 12 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 4
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 13 Amino acid sequence of hNAGLU variant No.
  • SEQ ID NO: 14 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 17
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 15 Nucleotide sequence of hNAGLU variant No. 5
  • SEQ ID NO: 16 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 5.
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 17 Nucleotide sequence of hNAGLU variant No. 6
  • SEQ ID NO: 18 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 6
  • Nucleotide sequence SEQ ID NO: 19 Amino acid sequence of hNAGLU variant No. 7
  • SEQ ID NO: 28 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 9, synthetic sequence SEQ ID NO: 29: hNAGLU mutation
  • Nucleotide sequence of body number 10 SEQ ID NO: 30: Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant No. 10, Nucleotide sequence SEQ ID NO: 31: hNAGLU mutation Amino acid sequence of body number 11
  • SEQ ID NO: 32 Nucleotide sequence of DNA fragment encoding hNAGLU variant number 11, synthetic sequence SEQ ID NO: 33: Amino acid sequence of hNAGLU variant number 12
  • SEQ ID NO: 34 encodes hNAGLU variant number 12.
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 41 Nucleotide sequence containing the gene encoding hNAGLU
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 42 MluI addition 5'primer
  • Synthetic sequence SEQ ID NO: 43 His tag-NotI addition 3'primer

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Abstract

本発明は，ヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ（hNAGLU）の変異体に関し，詳しくは，hNAGLUのアミノ酸配列に変異を加えることにより，hNAGLUをコードする遺伝子を導入した宿主細胞におけるhNAGLUの発現量を，野生型hNAGLUをコードする遺伝子を導入した場合と比較して高めることのできるhNAGLU変異体に関する。かかるhNAGLU変異体は，例えば配列番号３，配列番号５，配列番号９，配列番号１１，配列番号１５，又は配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するもの，若しくはこれらのアミノ酸配列に変異を加えたアミノ酸配列を有するものである。

Description

α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼの変異体
　本発明は，ヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ（hNAGLU）の変異体に関し，詳しくは，hNAGLUのアミノ酸配列に変異を加えることにより，hNAGLUをコードする遺伝子を導入した宿主細胞におけるhNAGLUの発現量を，野生型hNAGLUをコードする遺伝子を導入した場合と比較して高めることのできる，新規なhNAGLU変異体に関する。
　リソソーム病の一種であるムコ多糖症IIIＢ型（ＭＰＳ－IIIＢ）は，サンフィリポ症候群Ｂ型としても知られ，リソソーム内においてグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の一種であるヘパラン硫酸（ＨＳ）の分解に必要となる酵素α-N-アセチルグルコサミニダーゼ（NAGLU）の遺伝子異常に伴う，酵素活性低下又は欠損により発症する遺伝病である。重症例の場合，脳を含めた様々な臓器へのＨＳの蓄積により認知機能低下，行動障害などの深刻な神経障害や組織障害を２歳から６歳頃に発現し，多動等の行動上の問題及び精神発達遅滞が認められる。そして中枢神経変性症状の急速な進行に伴う重度の精神遅滞，及び運動疾患が認められ，７～８歳までに言語能力は消失する。１０歳代になると，睡眠障害，肝脾腫，痙攣発作が見られ，運動不能で寝たきりとなり，多くは２０歳代頃に呼吸器感染症等で死亡する。
　サンフィリポ症候群Ｂ型患者において不足もしくは欠損している酵素を補充するために，酵素補充療法が行われている。酵素α-N-アセチルグルコサミニダーゼ（NAGLU）は，ヘパラン硫酸の非還元末端α-N-アセチルグルコサミン残基を加水分解する反応を触媒する作用を持ち，患者に投与されることで患者体内のリソソームにおいて蓄積したＨＳを分解することができる。
　野生型ヒトNAGLU（hNAGLU）をコードする遺伝子は，１９９５年において単離されている（特許文献１）。酵素補充療法に用いられるhNAGLUは，これをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターで形質転換させた細胞を用いて生産される，組換えhNAGLUである。
特表２０００－５００９７２号公報
　本発明の目的は，hNAGLUのアミノ酸配列に変異を加えることにより，hNAGLUをコードする遺伝子を導入した宿主細胞におけるhNAGLUの発現量を，野生型hNAGLUをコードする遺伝子を導入した場合に比べて高めることのできる，新規なhNAGLU変異体を提供することである。
　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，本明細書において詳述する，hNAGLUのアミノ酸配列を改変することにより得られるhNAGLU変異体をコードする遺伝子を導入した宿主細胞が，野生型hNAGLUをコードする遺伝子を導入した宿主細胞に比較してより多くのhNAGLUを発現することを見出し，本発明を完成した。すなわち，本発明は以下を含むものである。
　１．下記の（１）～（７）からなる群から選択されるヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ（hNAGLU）の変異体：
　（１）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中36位のリシンがグルタミン酸に，かつ37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換された配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（２）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（３）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに置換された配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（４）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中228位のグルタミン酸がリシンに置換された配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（５）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中320位のトレオニンがプロリンに，かつ321位のグルタミン酸がアスパラギン酸に，それぞれ置換された配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（６）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中505位のセリンがアラニンに，かつ506位のイソロイシンがバリンに，それぞれ置換された配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するもの；及び
　（７）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中526位のセリンがアスパラギンに，かつ528位のアラニンがトレオニンに，それぞれ置換された配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するもの。
２．配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の36位のグルタミン酸及び37位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１’－ａ）～（１’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１’－ｃ）上記１’－ａの置換と１’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１’－ｅ）上記１’－ａの置換と１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１’－ｆ）上記１’－ｂの欠失と１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１’－ｇ）上記１’－ａの置換と，１’－ｂの欠失と及び１’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（１’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
３．配列番号５で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体（１）に，該アミノ酸配列の45位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（２’－ａ）～（２’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（２’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（２’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（２’－ｃ）上記２’－ａの置換と２’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（２’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（２’－ｅ）上記２’－ａの置換と２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（２’－ｆ）上記２’－ｂの欠失と２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（２’－ｇ）上記２’－ａの置換と，２’－ｂの欠失と及び２’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（２’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
４．配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（３’－ａ）～（３’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（３’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（３’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（３’－ｃ）上記３’－ａの置換と３’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（３’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（３’－ｅ）上記３’－ａの置換と３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（３’－ｆ）上記３’－ｂの欠失と３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（３’－ｇ）上記３’－ａの置換と，３’－ｂの欠失と及び３’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（３’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
５．配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の228位のリジンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（４’－ａ）～（４’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（４’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（４’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（４’－ｃ）上記４’－ａの置換と４’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（４’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（４’－ｅ）上記４’－ａの置換と４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（４’－ｆ）上記４’－ｂの欠失と４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（４’－ｇ）上記４’－ａの置換と，４’－ｂの欠失と及び４’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（４’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
６．配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の320位のプロリン及び321位のアスパラギン酸を保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（５’－ａ）～（５’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（５’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（５’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（５’－ｃ）上記５’－ａの置換と５’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（５’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（５’－ｅ）上記５’－ａの置換と５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（５’－ｆ）上記５’－ｂの欠失と５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（５’－ｇ）上記５’－ａの置換と，５’－ｂの欠失と及び５’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（５’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
７．配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の505位のアラニン及び506位のバリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（６’－ａ）～（６’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（６’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（６’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（６’－ｃ）上記６’－ａの置換と６’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（６’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（６’－ｅ）上記６’－ａの置換と６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（６’－ｆ）上記６’－ｂの欠失と６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（６’－ｇ）上記６’－ａの置換と，６’－ｂの欠失と及び６’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（６’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
８．配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有する上記１のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の526位のアスパラギン及び528位のトレオニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（７’－ａ）～（７’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（７’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（７’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（７’－ｃ）上記７’－ａの置換と７’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（７’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（７’－ｅ）上記７’－ａの置換と７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（７’－ｆ）上記７’－ｂの欠失と７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（７’－ｇ）上記７’－ａの置換と，７’－ｂの欠失と及び７’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
　（７’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
９．以下の（８）～（１５）からなる群から選択されるものである上記４のhNAGLU変異体：
　（８）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，36位のリシンがグルタミン酸に，37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換された配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（９）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（１０）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，320位のトレオニンがプロリンに，321位のグルタミン酸がアスパラギン酸に，それぞれ置換された配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（１１）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，36位のリシンがグルタミン酸に，37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（１２）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，54位のバリンがイソロイシンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換された配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（１３）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，54位のバリンがイソロイシンに置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有するもの；
　（１４）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，620位のアルギニンがリシンに置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有するもの；及び
　（１５）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニンを保存しつつ，54位のバリンがイソロイシンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有するもの。
１０．配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニン，36位のグルタミン酸，及び37位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（８’－ａ）～（８’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（８’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（８’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（８’－ｃ）上記８’－ａの置換と８’－ｂと欠失を組み合わせたもの；
　（８’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（８’－ｅ）上記８’－ａの置換と８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（８’－ｆ）上記８’－ｂの欠失と８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（８’－ｇ）上記８’－ａの置換と，８’－ｂの欠失と及び８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（８’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１１．配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，及び45位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（９’－ａ）～（９’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（９’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（９’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（９’－ｃ）上記９’－ａの置換と９’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（９’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（９’－ｅ）上記９’－ａの置換と９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（９’－ｆ）上記９’－ｂの欠失と９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（９’－ｇ）上記９’－ａの置換と，９’－ｂの欠失と及び９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（９’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１２．配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニン，320位のプロリン，及び321位のアスパラギン酸を保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１０’－ａ）～（１０’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１０’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１０’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１０’－ｃ）上記１０’－ａの置換と１０’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１０’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１０’－ｅ）上記１０’－ａの置換と１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１０’－ｆ）上記１０’－ｂの欠失と１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１０’－ｇ）上記１０’－ａの置換と，１０’－ｂの欠失と及び１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１０’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１３．配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，36位のグルタミン酸，37位のセリン，及び45位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１１’－ａ）～（１１’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１１’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１１’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１１’－ｃ）上記１１’－ａの置換と１１’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１１’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１１’－ｅ）上記１１’－ａの置換と１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１１’－ｆ）上記１１’－ｂの欠失と１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１１’－ｇ）上記１１’－ａの置換と，１１’－ｂの欠失と及び１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１１’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１４．配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の209位のアルギニン，54位のイソロイシン，及び620位のリシンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１２’－ａ）～（１２’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１２’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１２’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１２’－ｃ）上記１２’－ａの置換と１２’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１２’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１２’－ｅ）上記１２’－ａの置換と１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１２’－ｆ）上記１２’－ｂの欠失と１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１２’－ｇ）上記１２’－ａの置換と，１２’－ｂの欠失と及び１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１２’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１５．配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，55位のイソロイシン，及び45位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１３’－ａ）～（１３’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１３’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１３’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１３’－ｃ）上記１３’－ａの置換と１３’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１３’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１３’－ｅ）上記１３’－ａの置換と１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１３’－ｆ）上記１３’－ｂの欠失と１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１３’－ｇ）上記１３’－ａの置換と，１３’－ｂの欠失と及び１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１３’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１６．配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，621位のリシン，及び45位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１４’－ａ）～（１４’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１４’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１４’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１４’－ｃ）上記１４’－ａの置換と１４’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１４’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１４’－ｅ）上記１４’－ａの置換と１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１４’－ｆ）上記１４’－ｂの欠失と１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１４’－ｇ）上記１４’－ａの置換と，１４’－ｂの欠失と及び１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１４’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１７．配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有する上記９に記載のhNAGLU変異体に，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，55位のイソロイシン，621位のリシン，及び45位のセリンを保存しつつ，変異が加えられたhNAGLU変異体であって，以下の（１５’－ａ）～（１５’－ｈ）からなる群から選択されるもの：
　（１５’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換されたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１５’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失されたものであり，欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１５’－ｃ）上記１５’－ａの置換と１５’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１５’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１５’－ｅ）上記１５’－ａの置換と１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１５’－ｆ）上記１５’－ｂの欠失と１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１５’－ｇ）上記１５’－ａの置換と，１５’－ｂの欠失と及び１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１５’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
１８．上記１～１７の何れかのhNAGLU変異体をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
１９．上記１８のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
２０．上記１９の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
２１．上記２０の哺乳動物細胞を無血清培地で培養するステップを含む，hNAGLU変異体の製造方法。
２２．上記１～１７の何れかに記載のhNAGLU変異体と，抗体との融合蛋白質であって，該抗体が脳血管内皮細胞上の受容体と結合することにより，該融合蛋白質が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することのできるものである，融合蛋白質。
２３．該脳血管内皮細胞上の受容体が，インスリン受容体，トランスフェリン受容体，レプチン受容体，リポタンパク質受容体，及びＩＧＦ受容体からなる群から選択されるものである，上記２２に記載の融合蛋白質。
２４．該脳血管内皮細胞上の受容体が，トランスフェリン受容体である，上記２２に記載の融合蛋白質。
２５．該抗体が，Ｆａｂ抗体，Ｆ（ａｂ’）２抗体，Ｆ（ａｂ’）抗体，単一ドメイン抗体，一本鎖抗体，又はＦｃ抗体の何れかである，上記２２～２４の何れかに記載の融合蛋白質。
２６．該hNAGLU変異体が，該抗体の軽鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れかに結合しているものである，上記２２～２５の何れか一項に記載の融合蛋白質。
２７．該hNAGLU変異体が，該抗体の重鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れかに結合しているものである，上記２２～２５の何れか一項に記載の融合蛋白質。
２８．該hNAGLU変異体が，該抗体の軽鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れか，又は重鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れかに，リンカー配列を介して結合しているものである，上記２２～２７の何れか一項に記載の融合蛋白質。
２９．該リンカー配列が，１～５０個のアミノ酸残基からなるものである，上記２８に記載の融合蛋白質。
３０．該リンカー配列が，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Ser-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，配列番号５のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が１～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるものである，上記２９に記載の融合蛋白質。
３１．上記２２～３０の何れかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
３２．上記３１に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
３３．上記３２に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
３４．上記３３に記載の哺乳動物細胞を無血清培地で培養するステップを含む，hNAGLU変異体と抗体との融合蛋白質の製造方法。
　本発明によれば，ムコ多糖症IIIＢ型の患者の治療のため，酵素補充療法として投与されることの可能なhNAGLUを，遺伝子組換え技術を用いて効率よく製造することができる。
一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認実験の結果を示す図（実施例６）。棒グラフの縦軸は蛍光強度を示す。(ａ)は野生型hNAGLU又はhNAGLU変異体に相当するバンドのSDS-pageにおけるパターンを，（ｂ）は野生型hNAGLU又はhNAGLU変異体に相当するバンドのウエスタンブロッティングにおけるパターンを，それぞれ示す。(1)はK36E/P37S hNAGLU変異体，(2)はL44_G45insS hNAGLU変異体，(3)はR129Q hNAGLU変異体，(4)はQ209R hNAGLU変異体，(5)はE228K hNAGLU変異体，(6)はT240V hNAGLU変異体，(7)はT320P/E321D hNAGLU変異体，(8)はS505A/I506V hNAGLU変異体，(9)はS526N/A528T hNAGLU変異体，(10)はD613Q hNAGLU変異体，(11)はH204K hNAGLU変異体，及び(12)は野生型hNAGLU，の発現量のデータをそれぞれ示す。 バルク細胞によるhNAGLU変異体発現量の確認実験の結果を示す図（実施例１０）。棒グラフの縦軸は，それぞれのhNAGLU変異体について，1×106個の細胞が発現したhNAGLUの酵素活性量（nmol/h/106細胞）を示す。(1)はK36E/P37S hNAGLU変異体，(2)はL44_G45insS hNAGLU変異体，(3)はR129Q hNAGLU変異体，(4)はQ209R hNAGLU変異体，(5)はE228K hNAGLU変異体，(6)はT240V hNAGLU変異体，(7)はT320P/E321D hNAGLU変異体，(8)はS505A/I506V hNAGLU変異体，(9)はS526N/A528T hNAGLU変異体，(10)はD613Q hNAGLU変異体，(11)はH204K hNAGLU変異体，及び(12)は野生型hNAGLU，の発現量のデータをそれぞれ示す。(1)～(4)のそれぞれについて測定は4回繰り返し実施し，図にはそれぞれの測定値が示されている。 一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認実験の結果を示す図（実施例１６）。棒グラフの縦軸は蛍光強度を示す。(ａ)は野生型hNAGLU又はhNAGLU変異体に相当するバンドのSDS-pageにおけるパターンを，（ｂ）野生型hNAGLU又はhNAGLU変異体に相当するバンドのウエスタンブロッティングにおけるパターンを，それぞれ示す。(1)は野生型hNAGLU，(2)はQ209R hNAGLU変異体，(3)はK36E/P37S/Q209R hNAGLU変異体，(4)はL44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，(5)はQ209R/T320P/E321D hNAGLU変異体，(6)はK36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，の発現量のデータをそれぞれ示す。 一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認実験の結果を示す図（実施例１６）。棒グラフの縦軸は蛍光強度を示す。(ａ)は野生型hNAGLU又はhNAGLU変異体に相当するバンドのSDS-pageにおけるパターンを示す。(1)は野生型hNAGLU，(2)はQ209R hNAGLU変異体，(3)はL44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，(4)はV54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体，(5)はL44_G45insS/V54I/Q209R hNAGLU変異体，(6)はL44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU変異体，(7)はL44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体，(8)は陰性コントロールの発現量のデータをそれぞれ示す。
　本明細書において，単に「ヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ」又は「hNAGLU」というときは，配列番号１で示される７２０個のアミノ酸残基からなる通常の野生型のhNAGLUに加え，ヘパラン硫酸を分解することのできる酵素活性を有する等の通常の野生型hNAGLUとしての機能を有するものである限り，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，置換，欠失，及び／又は付加（本明細書において，アミノ酸残基の「付加」は，配列の末端又は内部に残基を追加することを意味する。）されたものに相当するhNAGLUの変異体も特に区別することなく包含する。野生型のhNAGLUは，例えば，配列番号２で示される塩基配列を有する遺伝子にコードされる。アミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合，置換するアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個である。アミノ酸残基を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個である。また，アミノ酸残基を欠失させる場合，N末端のアミノ酸残基を欠失させてもよく，その場合の欠失させるアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個である。また，これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせてもよい。
配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，アミノ酸残基を付加する場合，アミノ酸残基はhNAGLUのアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加される。このとき付加されるアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個である。また，アミノ酸残基の付加と置換を組み合わせてもよく，アミノ酸残基の付加と欠失を組み合わせてもよく，アミノ酸残基の付加，置換及び欠失を組み合わせてもよい。通常の野生型のhNAGLUは７４３個のアミノ酸残基からなる前駆体として生合成され，配列番号６７で示されるN末端から２３個のアミノ酸残基からなるリーダーペプチドが取り除かれてhNAGLUとなる。hNAGLUのＮ末端側にアミノ酸が付加される場合，当該アミノ酸はリーダーペプチドに由来するものであってもよい。その場合にN末端に付加されるアミノ酸は，アミノ酸が１個の場合はGlyであり，アミノ酸が２個の場合はAla- Glyであり，アミノ酸が２個の場合はAla-Ala- Glyである。
　これらアミノ酸の置換及び欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したhNAGLUの変異体としては，以下に示す（ｉ）～（ｉｖ）があるがこれらに限られるものではない：
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～１０個のアミノ酸残基の欠失と，０～１０個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～１０個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの；
（ｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～５個のアミノ酸残基の欠失と，０～５個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～５個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの；
（ｉｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～３個のアミノ酸残基の欠失と，０～３個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～３個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの；
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～２個のアミノ酸残基の欠失と，０～２個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～２個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの。
　上記の野生型又は変異型のhNAGLUであって，これを構成するアミノ酸が糖鎖により修飾されたものもhNAGLUである。また，上記の野生型又は変異型のhNAGLUであって，これを構成するアミノ酸がリン酸により修飾されたものもhNAGLUである。また，糖鎖及びリン酸以外のものにより修飾されたものもhNAGLUである。また，上記の野生型又は変異型のhNAGLUであって，これを構成するアミノ酸の側鎖が，置換反応等により変換したものもhNAGLUである。かかる変換としては，システイン残基のホルミルグリシンへの変換があるが，これに限られるものではない。
　つまり，糖鎖により修飾されたhNAGLUは，当該修飾される前のアミノ酸配列を有するhNAGLUに含まれるものとする。また，リン酸により修飾されたhNAGLUは，リン酸により修飾される前の元のアミノ酸配列を有するhNAGLUに含まれるものとする。また，糖鎖及びリン酸以外のものにより修飾されたものも，当該修飾される前の元のアミノ酸配列を有するhNAGLUに含まれるものとする。また，hNAGLUを構成するアミノ酸の側鎖が，置換反応等により変換したものも，当該変換される前の元のアミノ酸配列を有するhNAGLUに含まれるものとする。かかる変換としては，システイン残基のホルミルグリシンへの変換があるが，これに限られるものではない。
　本発明において，「ヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ変異体」（hNAGLU変異体）の語は，通常の野生型hNAGLUのアミノ酸配列（配列番号１で示されるアミノ酸配列）に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，置換，欠失，及び／又は付加（本明細書において，アミノ酸残基の「付加」は，配列の末端又は内部に残基を追加することを意味する。）されたものであり，且つ，ヘパラン硫酸を分解することのできる酵素活性を有する等の通常の野生型hNAGLUとしての機能を有するものである。本発明において好ましいhNAGLU変異体は，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，１個又は複数個のアミノ酸残基が，他のアミノ酸残基へ置換され，欠失し，或いは付加されたアミノ酸配列であるものを含む。当該アミノ酸配列中のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換する場合，置換するアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又２個である。アミノ酸残基を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又２個である。また，hNAGLU変異体は，これらアミノ酸残基の置換と欠失を組み合わせたものであってもよい。
　配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，アミノ酸残基を付加する場合，アミノ酸残基はhNAGLUのアミノ酸配列中に又は当該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加される。このとき付加されるアミノ酸残基の個数は，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個である。また，アミノ酸残基の付加と置換を組み合わせてもよく，アミノ酸残基の付加と欠失を組み合わせてもよく，アミノ酸残基の付加，置換及び欠失を組み合わせてもよい。即ち，hNAGLU変異体は，配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，アミノ酸の置換及び欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したものである。
　これらアミノ酸の置換及び欠失，及び付加の３種類の変異のうち，少なくとも２種類の変異を組み合わせて導入したhNAGLUの変異体としては，以下に示す（ｉ）～（ｉｖ）があるがこれらに限られるものではない：
（ｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～１０個のアミノ酸残基の欠失と，０～１０個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～１０個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの（但し野生型のhNAGLUは除く）；
（ｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～５個のアミノ酸残基の欠失と，０～５個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～５個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの（但し野生型のhNAGLUは除く）；
（ｉｉｉ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～３個のアミノ酸残基の欠失と，０～３個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～３個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの（但し野生型のhNAGLUは除く）；
（ｉｖ）配列番号１で示されるアミノ酸配列に対し，０～２個のアミノ酸残基の欠失と，０～２個のアミノ酸残基の他のアミノ酸残基への置換と，更に０～２個のアミノ酸残基の付加とを行ってなるアミノ酸配列を有するもの（但し野生型のhNAGLUは除く）。
　種々のhNAGLU変異体における通常の野生型hNAGLUと比較したときの各変異の位置及びその形式（欠失，置換，及び付加）は，両hNAGLUのアミノ酸配列のアラインメントにより，容易に確認することができる。
　hNAGLU変異体のアミノ酸配列は，配列番号１で示される通常の野生型hNAGLUのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，８５％以上の同一性を示し，９０％以上の同一性を示し，又は，９５％以上の同一性を示し，例えば，９８％以上，又は９９％の同一性を示すものである。
　野生型hNAGLUのアミノ酸配列とhNAGLU変異体のアミノ酸配列との同一性は，周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば，そのようなアルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol .Biol. 215. 403-10, (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
　野生型hNAGLU又はhNAGLU変異体のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸への置換は
，例えば，アミノ酸のそれらの側鎖および化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。このようなアミノ酸ファミリー内での置換は，元の蛋白質の機能に大きな変化をもたらさない（即ち，保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。かかるアミノ酸ファミリーとしては，例えば以下の（１）～（１２）で示されるものがある：
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，及びトリプトファン，
（４）水酸基を有するアミノ酸（ヒドロキシアミノ酸）であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸（極性アミノ酸）であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン，
（１２）分岐鎖を有するアミノ酸であるバリン，ロイシン，及びイソロイシン。
　本発明の一実施形態において，高発現型hNAGLU変異体というときは，組換え蛋白質として宿主細胞で発現させたときに，同一条件で野生型のhNAGLUを組換え蛋白質として宿主細胞で発現させたときと比較して，少なくとも１．１倍以上，１．５倍以上，２倍以上，４倍以上，５倍以上，又は６倍以上，例えば，１．５～４倍，２～５倍，２～８倍等の発現量が得られることを特徴とするhNAGLU変異体である。ここで同一条件下とは，発現ベクター，宿主細胞，培養条件等が同一であることをいう。
　かかる高発現型hNAGLU変異体の好ましい実施形態として，以下の（１）～（７）が挙げられる：
（１）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中36位のリシンがグルタミン酸に，かつ37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換された配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するもの，
（２）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するもの，
（３）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに置換された配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するもの，
（４）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中228位のグルタミン酸がリシンに置換された配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有するもの，
（５）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中320位のトレオニンがプロリンに，かつ321位のグルタミン酸がアスパラギン酸に，それぞれ置換された配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するもの，
（６）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中505位のセリンがアラニンに，かつ506位のイソロイシンがバリンに，それぞれ置換された配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するもの，
（７）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中526位のセリンがアスパラギンに，かつ528位のアラニンがトレオニンに，それぞれ置換された配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するもの。
　更に，かかる高発現型hNAGLU変異体の好ましい実施形態として，以下の（１’）～（７’）が挙げられる。
（１’）配列番号３で示されるアミノ酸配列の36位のグルタミン酸及び37位のセリンに変異を加えることなく：
　（１’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１’－ｃ）上記１’－ａの置換と１’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１’－ｅ）上記１’－ａの置換と１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１’－ｆ）上記１’－ｂの欠失と１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１’－ｇ）上記１’－ａの置換と，１’－ｂの欠失と及び１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（２’）配列番号５で示されるアミノ酸配列の45位のセリンに変異を加えることなく：
　（２’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（２’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（２’－ｃ）上記２’－ａの置換と２’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（２’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（２’－ｅ）上記２’－ａの置換と２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（２’－ｆ）上記２’－ｂの欠失と２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（２’－ｇ）上記２’－ａの置換と，２’－ｂの欠失と及び２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（２’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（３’）配列番号９で示されるアミノ酸配列の209位のアルギニンに変異を加えることなく：
　（３’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（３’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（３’－ｃ）上記３’－ａの置換と３’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（３’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（３’－ｅ）上記３’－ａの置換と３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（３’－ｆ）上記３’－ｂの欠失と３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（３’－ｇ）上記３’－ａの置換と，３’－ｂの欠失と及び３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（３’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（４’）配列番号１１で示されるアミノ酸配列の228位のリシンに変異を加えることなく：
　（４’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（４’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（４’－ｃ）上記４’－ａの置換と４’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（４’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（４’－ｅ）上記４’－ａの置換と４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（４’－ｆ）上記４’－ｂの欠失と４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（４’－ｇ）上記４’－ａの置換と，４’－ｂの欠失と及び４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（４’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（５’）配列番号１５で示されるアミノ酸配列の320位のプロリン及び321位のアスパラギン酸に変異を加えることなく：
　（５’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（５’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（５’－ｃ）上記５’－ａの置換と５’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（５’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（５’－ｅ）上記５’－ａの置換と５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（５’－ｆ）上記５’－ｂの欠失と５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（５’－ｇ）上記５’－ａの置換と，５’－ｂの欠失と及び５’－ｄの付加を組み合わせたもの；。
　（５’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（６’）配列番号１７で示されるアミノ酸配列の505位のアラニン及び506位のバリンに変異を加えることなく：
　（６’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（６’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（６’－ｃ）上記６’－ａの置換と６’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（６’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（６’－ｅ）上記６’－ａの置換と６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（６’－ｆ）上記６’－ｂの欠失と６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（６’－ｇ）上記６’－ａの置換と，６’－ｂの欠失と及び６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（６’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（７’）配列番号１９で示されるアミノ酸配列の526位のアスパラギン及び528位のトレオニンに変異を加えることなく：
　（７’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（７’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（７’－ｃ）上記７’－ａの置換と７’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（７’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（７’－ｅ）上記７’－ａの置換と７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（７’－ｆ）上記７’－ｂの欠失と７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（７’－ｇ）上記７’－ａの置換と，７’－ｂの欠失と及び７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（７’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　上記（１）の配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに置換された配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する高発現型hNAGLU変異体に，更に変異を導入した高発現型hNAGLU変異体の具体的な実施形態として，以下の（８）～（１５）が挙げられる：
（８）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，36位のリシンがグルタミン酸に，37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換された配列番号２５で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（９）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（１０）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，320位のトレオニンがプロリンに，321位のグルタミン酸がアスパラギン酸に，それぞれ置換された配列番号２９で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（１１）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，36位のリシンがグルタミン酸に，37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３１で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（１２）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，54位のバリンがイソロイシンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換された配列番号３３で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（１３）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，54位のバリンがイソロイシンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３５で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（１４）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３７で示されるアミノ酸配列を有するもの，
　（１５）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに，54位のバリンがイソロイシンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３９で示されるアミノ酸配列を有するもの。
　更に，かかる高発現型hNAGLU変異体の好ましい実施形態として，以下の（８’）～（１５’）が挙げられる。
　（８’）配列番号２５で示されるアミノ酸配列の209位のアルギニン，36位のグルタミン酸，及び37位のセリンに変異を加えることなく：
　（８’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（８’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（８’－ｃ）上記８’－ａの置換と８’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（８’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（８’－ｅ）上記８’－ａの置換と８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（８’－ｆ）上記８’－ｂの欠失と８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（８’－ｇ）上記８’－ａの置換と，８’－ｂの欠失と及び８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（８’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（９’）配列番号２７で示されるアミノ酸配列の210位のアルギニン，及び45位のセリンに変異を加えることなく：
　（９’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（９’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（９’－ｃ）上記９’－ａの置換と９’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（９’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（９’－ｅ）上記９’－ａの置換と９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（９’－ｆ）上記９’－ｂの欠失と９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（９’－ｇ）上記９’－ａの置換と，９’－ｂの欠失と及び９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（９’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（１０’）配列番号２９で示されるアミノ酸配列の209位のアルギニン，320位のプロリン，及び321位のアスパラギン酸に変異を加えることなく：
　（１０’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１０’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１０’－ｃ）上記１０’－ａの置換と１０’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１０’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１０’－ｅ）上記１０’－ａの置換と１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１０’－ｆ）上記１０’－ｂの欠失と１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１０’－ｇ）上記１０’－ａの置換と，１０’－ｂの欠失と及び１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１０’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（１１’）配列番号３１で示されるアミノ酸配列の210位のアルギニン，36位のグルタミン酸，37位のセリン，及び45位のセリンに変異を加えることなく：，
　（１１’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１１’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１１’－ｃ）上記１１’－ａの置換と１１’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１１’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１１’－ｅ）上記１１’－ａの置換と１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１１’－ｆ）上記１１’－ｂの欠失と１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１１’－ｇ）上記１１’－ａの置換と，１１’－ｂの欠失と及び１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１１’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（１２’）配列番号３３で示されるアミノ酸配列の209位のアルギニン，54位のイソロイシン，及び620位のリシンに変異を加えることなく：
　（１２’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１２’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１２’－ｃ）上記１２’－ａの置換と１２’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１２’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１２’－ｅ）上記１２’－ａの置換と１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１２’－ｆ）上記１２’－ｂの欠失と１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１２’－ｇ）上記１２’－ａの置換と，１２’－ｂの欠失と及び１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１２’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（１３’）配列番号３５で示されるアミノ酸配列の210位のアルギニン，55位のイソロイシン，及び45位のセリンに変異を加えることなく：
　（１３’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１３’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１３’－ｃ）上記１３’－ａの置換と１３’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１３’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１３’－ｅ）上記１３’－ａの置換と１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１３’－ｆ）上記１３’－ｂの欠失と１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１３’－ｇ）上記１３’－ａの置換と，１３’－ｂの欠失と及び１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１３’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（１４’）配列番号３７で示されるアミノ酸配列の210位のアルギニン，621位のリシン，及び45位のセリンに変異を加えることなく：
　（１４’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１４’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１４’－ｃ）上記１４’－ａの置換と１４’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１４’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１４’－ｅ）上記１４’－ａの置換と１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１４’－ｆ）上記１４’－ｂの欠失と１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１４’－ｇ）上記１４’－ａの置換と，１４’－ｂの欠失と及び１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１４’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　（１５’）配列番号３９で示されるアミノ酸配列の210位のアルギニン，55位のイソロイシン，621位のリシン，及び45位のセリンに変異を加えることなく：
　（１５’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換させたものであり，置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１５’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基を欠失させたものであり，欠失させたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１５’－ｃ）上記１５’－ａの置換と１５’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
　（１５’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
　（１５’－ｅ）上記１５’－ａの置換と１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１５’－ｆ）上記１５’－ｂの欠失と１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１５’－ｇ）上記１５’－ａの置換と，１５’－ｂの欠失と及び１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
　（１５’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
　本発明の一実施形態におけるhNAGLU変異体は，組換え蛋白質として宿主細胞で発現させたときに，同一条件下で野生型のhNAGLUを組換え蛋白質として宿主細胞で発現させたときと比較して，発現量が多いことを特徴とするものである。本明細書において，このタイプのhNAGLU変異体を，高発現型hNAGLU変異体という。高発現型hNAGLU変異体は，組換え蛋白質として製造したときに，野生型のhNAGLUと比較して生産効率を上昇させることができるので，生産コストを低減することができる。なお，ここで同一条件下とは，発現ベクター，宿主細胞，培養条件等が同一であることをいう。
　組換え蛋白質として宿主細胞で発現させたときに，野生型のhNAGLUと比較して発現量が上昇するhNAGLU変異体をコードする遺伝子は，例えば，以下の手法で取得できる。変異を導入したhNAGLUと野生型のhNAGLUをコードする遺伝子をそれぞれ同一の種類の発現ベクターに組込み，これを用いて同一の種類の宿主細胞を形質転換させて，それぞれの発現ベクターが導入された細胞を取得する。次いで，これらの細胞を同一条件下で培養し，培養上清に得られるhNAGLUを定量する。野生型のhNAGLUをコードする遺伝子が導入された細胞の定量値と比較して，大きい定量値を示した細胞に導入された遺伝子が，目的の高発現型hNAGLU変異体をコードする遺伝子として特定される。なお，ここでの定量値として，hNAGLUの蛋白質としての定量値の他に，hNAGLUの酵素活性値を用いることもできる。例えば，定量値として，培養上清に含まれるhNAGLUの酵素活性の総量を用いることもできる。
　野生型のhNAGLUへの変異の導入は，野生型のhNAGLUをコードする遺伝子にランダムに変異を導入する手法を用いて行うことができる。例えば，野生型のhNAGLUをコードする遺伝子をベクターに組込み，これを用いて形質転換させた宿主細胞に変異源（放射線，変異原性物質等）を作用させることにより，野生型のhNAGLUをコードする遺伝子に変異を導入することができる。
　野生型のhNAGLUへの変異の導入は，野生型のhNAGLUをコードする遺伝子の予め定めた箇所に変異を導入する手法を用いて行うこともできる。例えば，予め定めた箇所に変異を有する遺伝子を化学合成することにより，かかる遺伝子変異を導入することができる。
　高発現型hNAGLU変異体は，当該変異体をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを用いて形質転換させた宿主細胞を培養することにより，組換え蛋白質として製造することができる。
　このとき用いられる宿主細胞は，そのような発現ベクターを導入することにより高発現型hNAGLU変異体を発現させることができるものである限り特に制限はなく，哺乳動物細胞，酵母，植物細胞，昆虫細胞等の真核生物細胞，大腸菌，枯草菌等の原核細胞の何れであってもよいが，哺乳動物細胞が特に好適である。
　哺乳動物細胞を宿主細胞として使用する場合，該哺乳動物細胞の種類について特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。またこのとき高発現型hNAGLU変異体をコードするＤＮＡ断片を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入したとき該遺伝子の発現をもたらすものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。
　目的の蛋白質をコードする遺伝子の下流側に内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ：internal ribosome entry site）を介して，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素（ＧＳ）を配置した発現ベクターが知られている（国際特許公報ＷＯ２０１２／０６３７９９，ＷＯ２０１３／１６１９５８）。これら文献に記載された発現ベクターは，高発現型hNAGLU変異体の製造に特に好適に使用することができる。
　例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，第１の遺伝子発現制御部位，並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，上記第１の遺伝子発現制御部位の又はこれとは別の第２の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる発現ベクターは，高発現型hNAGLU変異体の製造に好適に使用できる。この発現ベクターにおいて，第１の遺伝子発現制御部位又は第２の遺伝子発現制御部位としては，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１αプロモーター（ｈＥＦ－１αプロモーター），ヒトユビキチンＣプロモーターが好適に用いられるが，ｈＥＦ－１αプロモーターが特に好適である。
　また，内部リボソーム結合部位としては，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルスからなる群より選択されるウイルスのゲノム，又はヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択される遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものが好適に用いられるが，マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が特に好適である。マウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を用いる場合，野生型のもの以外に，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものも好適に使用できる。また，この発現ベクターにおいて，好適に用いられる薬剤耐性遺伝子は，好ましくはピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子であり，より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である。
　また，例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子－１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，高発現型hNAGLU変異体の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１３／１６１９５８に記載された発現ベクターが挙げられる。
　また，例えば，目的の蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ヒト伸長因子－１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，高発現型hNAGLU変異体の製造に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１２／０６３７９９に記載されたpE-mIRES-GS-puro及びＷＯ２０１３／１６１９５８に記載されたpE-mIRES-GS-mNeoが挙げられる。
　野生型のマウス脳心筋炎ウイルスゲノムの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位の３’末端には，３つの開始コドン（ATG）が存在している。上記のpE-mIRES-GS-puro及びpE-mIRES-GS-mNeoは，開始コドンのうちの一部が破壊されたIRESを有する発現ベクターである。
　hNAGLU変異体（高発現型hNAGLU変異体を含む）は，これをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することにより，細胞中又は培地中に発現させることができる。哺乳動物細胞が宿主細胞である場合のhNAGLU変異体の発現方法について，以下に詳述する。
　哺乳動物細胞の培養のための培地としては，哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば，特に限定なく用いることができるが，好ましくは無血清培地が用いられる。本発明において，組換え蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地としては，例えば，アミノ酸を３～７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１～５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３～１０ｇ／Ｌ，無機塩を０．１～１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１～０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１～５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１～１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１～１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１～２０μｇ／Ｌ，インシュリンを０．１～２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１～１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１～１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０～５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
　組換え蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地として，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ－グルタミン，Ｄ－グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地，ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社，旧ライフテクノロジーズ社），ＩＳ　ｃｈｏ－ＶＴＭ 培地（Irvine Scientific社），ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３０２培地又はＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３２５－ＰＦ培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用することもできる。
　高発現型hNAGLU変異体は，これをコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を上記の無血清培地で培養して組換え蛋白質として発現させたときに，同一条件で野生型のhNAGLUを組換え蛋白質として発現させたときと比較して，少なくとも１．１倍以上，１．５倍以上，２倍以上，４倍以上，５倍以上，又は６倍以上，例えば，１．５～４倍，２～５倍，２～８倍等の発現量が得られることを特徴とする。このとき用いられる哺乳動物細胞は，ＣＨＯ細胞，ＮＳ／０細胞等であるが，特にＣＨＯ細胞である。
　hNAGLU変異体をコードする宿主細胞を培養することにより，細胞内又は培地中に発現した組換えhNAGLU変異体は，カラムクロマトグラフィー等の方法により不純物から分離し，精製することができる。精製されたhNAGLU変異体は，医薬として使用することができる。特に，hNAGLU変異体は，サンフィリポ症候群Ｂ型として知られるムコ多糖症IIIＢ型（ＭＰＳ－IIIＢ）を対象疾患とする医薬として使用することができる。
　hNAGLU変異体を有効成分として含有してなる医薬は，注射剤として静脈内，筋肉内，腹腔内，皮下又は脳室内に投与することができる。それらの注射剤は，凍結乾燥製剤又は水性液剤として供給することができる。水性液剤とする場合，バイアルに充填した形態としてもよく，注射器に予め充填したものであるプレフィルド型の製剤として供給することもできる。凍結乾燥製剤の場合，使用前に水性媒質に溶解し復元して使用する。
　本発明の一実施形態におけるhNAGLU変異体は，抗体との結合とすることができる。例えば，本発明の一実施形態におけるhNAGLU変異体は，脳血管内皮細胞上の受容体と特異的に結合することのできる抗体との結合体とすることができる。脳血管内皮細胞上の受容体と特異的に結合することのできる抗体との結合体とすることにより，hNAGLU変異体をして血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させ，中枢神経系（ＣＮＳ）において機能を発揮させるようにすることができる。そのような脳血管内皮細胞上の受容体としては，例えば，インスリン受容体，トランスフェリン受容体，レプチン受容体，リポタンパク質受容体，及びＩＧＦ受容体等が挙げられるが，これらに限られない。また，当該受容体は好ましくはヒト由来の受容体である。
　本発明において，「抗体」の語は，主としてヒト抗体，マウス抗体，ヒト化抗体，ラクダ科動物（アルパカを含む）由来の抗体，ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体，及びマウス抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体のことをいうが，特定の抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，これらに限定されるものではなく，また，抗体の動物種にも特に制限はない。
　本発明において，「ヒト抗体」の語は，その蛋白質全体がヒト由来の遺伝子にコードされている抗体をいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に，元のアミノ酸配列に変化を与えることなく変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。また，ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，あるヒト抗体の一部を他のヒト抗体の一部に置き換えて作製した抗体も，「ヒト抗体」である。ヒト抗体は，軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。重鎖の３箇所のＣＤＲも，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。あるヒト抗体のＣＤＲを，その他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより，ヒト抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，ヒト抗体に含まれる。
　本発明において，元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，「ヒト抗体」に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，より好ましくは９０％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９５％以上の同一性を示し，更により好ましくは９８％以上の同一性を示す。ヒト抗体に上記の変異を加える場合，当該変異は抗体の可変領域に加えることができる。抗体の可変領域に上記の変異を加える場合，当該変異は可変領域のＣＤＲとフレームワーク領域の何れに加えてもよいが，特にフレームワーク領域に加えられる。即ち，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，これに改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。
　本発明において，「ヒト化抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲに置き換えることによって作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，更に好ましくはマウスである。また，元のヒト化抗体のアミノ酸配列に上記のヒト抗体に加えることのできる変異と同様の変異を加えた抗体も，「ヒト化抗体」に含まれる。
　本発明において，「キメラ抗体」の語は，２つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。
　ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は，以下に説明するＦｃ領域，Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。
　また，抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（ＣＨ）と軽鎖の定常領域（ＣＬ）が他の哺乳動物の抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，例えばマウスである。
　本発明の一実施形態における抗体は，２本の免疫グロブリン軽鎖（又は単に「軽鎖」）と２本の免疫グロブリン重鎖（又は単に「重鎖」）の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
　（１）１本の軽鎖と１本の重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなるもの，
　（２）本来の意味での抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２を含む），
　（３）軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，
　（４）重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，
　（５）本来の意味での抗体の基本構造からＦａｂ領域が欠失したものであるＦｃ領域からなるものであって，且つ当該Ｆｃ領域のアミノ酸配列が特定の抗原に特異的に結合する性質を有するように改変されたもの（Ｆｃ抗体），
　（６）後述する単一ドメイン抗体も，本発明における「抗体」に含まれる。
　本発明の一実施形態における抗体は，ラクダ科動物（アルパカを含む）由来の抗体である。ラクダ科動物の抗体には，ジスルフィド結合により連結された２本の重鎖からなるものがある。この２本の重鎖からなる抗体を重鎖抗体という。ＶＨＨは，重鎖抗体を構成する重鎖の可変領域を含む１本の重鎖からなる抗体，又は重鎖抗体を構成する定常領域（ＣＨ）を欠く１本の重鎖からなる抗体である。ＶＨＨも本発明の実施形態における抗体の一つである。その他，ジスルフィド結合により連結された２本の軽鎖からなる抗体も本発明の実施形態における抗体の一つである。この２本の軽鎖からなる抗体を軽鎖抗体という。ラクダ科動物由来の抗体（ＶＨＨを含む）をヒトに投与したときの抗原性を低減させるために，ラクダ科動物の抗体のアミノ酸配列に変異を加えたものも，本発明の一実施形態における抗体である。ラクダ科動物の抗体のアミノ酸に変異を加える場合，本明細書に記載の抗体に加えることのできる変異と同様の変異を加えることができる。
　本発明の一実施形態における抗体は，サメ由来の抗体である。サメの抗体は，ジスルフィド結合により連結された２本の重鎖からなる。この２本の重鎖からなる抗体を重鎖抗体という。ＶＮＡＲは，重鎖抗体を構成する重鎖の可変領域を含む１本の重鎖からなる抗体，又は重鎖抗体を構成する定常領域（ＣＨ）を欠く１本の重鎖からなる抗体である。ＶＮＡＲも本発明の実施形態における抗体の一つである。サメ由来の抗体（ＶＮＡＲを含む）をヒトに投与したときの抗原性を低減させるために，サメの抗体のアミノ酸配列に変異を加えたものも，本発明の一実施形態における抗体である。サメの抗体のアミノ酸に変異を加える場合，本明細書に記載の抗体に加えることのできる変異と同様の変異加えることができる。サメの抗体をヒト化したものも本発明の実施形態における抗体の一つである。
　２本の軽鎖と２本の重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する抗体は，軽鎖の可変領域（ＶＬ）に３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と重鎖の可変領域（ＶＨ）に３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。重鎖の３箇所のＣＤＲも，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。ただし，これらＣＤＲの一部又は全部が不完全であるか，または存在しないものであっても，特定の抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，抗体に含まれる。軽鎖及び重鎖の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）のＣＤＲ以外の領域は，フレームワーク領域（ＦＲ）という。ＦＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＦＲ１，ＦＲ２，ＦＲ３及びＦＲ４という。通常，ＣＤＲとＦＲはＮ末端側から順に，ＦＲ１，ＣＤＲ１，ＦＲ２，ＣＤＲ２，ＦＲ３，ＣＤＲ３，ＦＲ４の順で存在する。
　本発明の一実施形態において，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，抗体に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，より好ましくは８５％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９０％以上，９５％以上，又は９８％以上の同一性を示す。
　本発明の一実施形態において，元の抗体の可変領域のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，抗体に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，より好ましくは８５％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９０％以上，９５％以上，又は９８％以上の同一性を示す。抗体の可変領域に変異を加える場合，当該変異は可変領域のＣＤＲとフレームワーク領域の何れに加えてもよいが，特にフレームワーク領域に加えられる。
　本発明の一実施形態において，元の抗体の可変領域のフレームワーク領域にアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，抗体に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，より好ましくは８５％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９０％以上，９５％以上，又は９８％以上の同一性を示す。
　本発明の一実施形態において，元の抗体の可変領域のＣＤＲ領域にアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，抗体に含まれる。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸で置換する場合，置換するアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１又は２個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～５個，より好ましくは１～３個，更に好ましくは１又は２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。アミノ酸を付加する場合，元の抗体のアミノ酸配列中若しくはＮ末端又はＣ末端に，好ましくは１～５個，よりに好ましくは１～３個，更に好ましくは１又は２個のアミノ酸を付加する。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えたものも，抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，より好ましくは８５％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９０％以上，９５％以上，又は９８％以上の同一性を示す。
　元の抗体のアミノ酸配列と変異を加えた抗体のアミノ酸配列との同一性は，周知の相同性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば，そのようなアルゴリズムとして，ＢＬＡＳＴ(Altschul SF. J Mol .Biol. 215. 403-10, (1990))，Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。
　本発明の一実施形態において，Ｆａｂとは，可変領域とＣＬ領域（軽鎖の定常領域）を含む１本の軽鎖と，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む１本の重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて，重鎖は，可変領域とＣＨ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（ＣＬ領域）に存在するシステイン残基と，重鎖の定常領域（ＣＨ１領域）又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂを形成する重鎖のことをＦａｂ重鎖という。Ｆａｂは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いているので，１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆａｂを構成する軽鎖は，可変領域とＣＬ領域を含む。Ｆａｂを構成する重鎖は，可変領域とＣＨ１領域からなるものであってもよく，可変領域，ＣＨ１領域に加えてヒンジ部の一部を含むものであってもよい。但しこの場合，ヒンジ部で２本の重鎖の間でジスルフィド結合が形成されないように，ヒンジ部は重鎖間を結合するシステイン残基を含まないように選択される。Ｆ（ａｂ’）においては，その重鎖は可変領域とＣＨ１領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部又は一部を含む。Ｆ（ａｂ’）２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基どうしでジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を形成する重鎖のことをＦａｂ’重鎖という。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合してなるニ量体，三量体等の重合体も，抗体である。更に，これらに限らず，抗体分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において軽鎖というときは，軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，重鎖というときは，重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Ｆｃ領域が欠失したものも，重鎖である。
　また，ここでＦｃ又はＦｃ領域とは，抗体分子中の，ＣＨ２領域（重鎖の定常領域の部分２），及びＣＨ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。
　更には，本発明の一実施形態における抗体は，
　（７）上記（２）で示したＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）２を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２も含まれる。ここで，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）２にあっては，軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては，軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。
　更には，本明細書でいう「抗体」には，完全長抗体，上記（１）～（７）に示されるものに加えて，（１）～（７）を含むより広い概念である，完全長抗体の一部が欠損したものである抗原結合性断片（抗体フラグメント）のいずれの形態も含まれる。抗原結合性断片には，重鎖抗体，軽鎖抗体，ＶＨＨ，ＶＮＡＲ，及びこれらの一部が欠損したものも含まれる。
　「抗原結合性断片」の語は，抗原との特異的結合活性の少なくとも一部を保持している抗体の断片のことをいう。結合性断片の例としては，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２，可変領域（Ｆｖ），重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とを適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ），重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むポリペプチドの二量体であるダイアボディ，ｓｃＦｖの重鎖（Ｈ鎖）に定常領域の一部（ＣＨ３）が結合したものの二量体であるミニボディ，その他の低分子化抗体等を包含する。但し，抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。
　本発明の一実施形態において，「一本鎖抗体」というときは，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。また，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，重鎖は，Ｆｃ領域が欠失している。軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に，重鎖の可変領域も，ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，重鎖の３つのＣＤＲが全てと，軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。
　一本鎖抗体において，抗体の軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２～５０個，より好ましくは８～５０個，更に好ましくは１０～３０個，更により好ましくは１２～１８個又は１５～２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号３），アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号４），アミノ酸配列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号５），又はこれらのアミノ酸配列が２～１０回，あるいは２～５回繰り返された配列を含むものである。例えば，重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側に，リンカー配列を介して軽鎖の可変領域を結合させる場合，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号３）の３個が連続したものに相当する計１５個のアミノ酸を含むリンカー配列が好適である。
　本発明の一実施形態において，単一ドメイン抗体とは，単一の可変領域で抗原に特異的に結合する性質を有する抗体のことをいう。単一ドメイン抗体には，可変領域が重鎖の可変領域のみからなる抗体（重鎖単一ドメイン抗体），可変領域が軽鎖の可変領域のみからなる抗体（軽鎖単一ドメイン抗体）が含まれる。ＶＨＨ，ＶＮＡＲは単一ドメイン抗体の一種である。
　本発明の一実施形態において，「ヒトトランスフェリン受容体」の語は，配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有する膜蛋白質をいう。本発明の抗体は，その一実施態様において，配列番号５７で示されるアミノ酸配列中Ｎ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（トランスフェリン受容体の細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。
　所望の蛋白質に対する抗体の作製方法としては，当該蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を用いて，組換え蛋白質を作製し，この組換え蛋白質を用いてマウス等の動物を免疫して得る方法が一般的である。免疫後の動物から組換え蛋白質に対する抗体産生細胞を取り出し，これとミエローマ細胞とを融合させることにより，組換え蛋白質に対する抗体の産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。
　また，マウス等の動物より得た免疫系細胞を体外免疫法により所望の蛋白質で免疫することによっても，当該蛋白質に対する抗体を産生する細胞を取得できる。体外免疫法を用いる場合，その免疫系細胞が由来する動物種に特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウマ，及びヒトを含む霊長類であり，より好ましくは，マウス，ラット及びヒトであり，更に好ましくはマウス及びヒトである。マウスの免疫系細胞としては，例えば，マウスの脾臓から調製した脾細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞としては，ヒトの末梢血，骨髄，脾臓等から調製した細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞を体外免疫法により免疫した場合，組換え蛋白質に対するヒト抗体を得ることができる。
　体外免疫法により免疫系細胞を免疫した後，細胞をミエローマ細胞と融合させることにより，抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。また，免疫後の細胞からｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応により免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅し，これらを用いて人工的に抗体遺伝子を再構築することもできる。
　上記方法により得られたままのハイブリドーマ細胞には，目的外の蛋白質を抗原として認識する抗体を産生する細胞も含まれる。また，所望の蛋白質に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞の全てが，当該蛋白質に対して高親和性を有する等の所望の特性を示す抗体を産生するとも限らない。
　同様に，人工的に再構築した抗体遺伝子には，目的外の蛋白質を抗原として認識する抗体をコードする遺伝子も含まれる。また，所望の蛋白質に対する抗体をコードする遺伝子の全てが，当該蛋白質に対して高親和性を有する等の所望の特性を示す抗体をコードするものとも限らない。
　従って，上記で得られたままのハイブリドーマ細胞から，所望の特性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択するステップが必要となる。また，人工的に再構築した抗体遺伝子にあっては，当該抗体遺伝子から，所望の特性を有する抗体をコードする遺伝子を選択するステップが必要となる。例えば，所望の蛋白質に対して高親和性を示す抗体（高親和性抗体）を産生するハイブリドーマ細胞，又は高親和性抗体をコードする遺伝子を選択する方法として，以下に詳述する方法が有効である。
　例えば，所望の蛋白質に対して高親和性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選択する場合，当該蛋白質をプレートに添加してこれに保持させた後，ハイブリドーマ細胞の培養上清を添加し，次いで当該蛋白質と結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，プレートに添加したハイブリドーマ細胞の培養上清に含まれる抗体の当該蛋白質に対する親和性が高いほど，プレートに保持される抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応するハイブリドーマ細胞を，当該蛋白質に対して相対的に高い親和性を有する抗体を産生する細胞株として選択することができる。この様にして選択された細胞株から，ｍＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成し，このｃＤＮＡを鋳型として，当該蛋白質に対する抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することもできる。
　上記の人工的に再構築した抗体遺伝子から，高親和性を有する目的の蛋白質に対する抗体をコードする遺伝子を選択する場合は，一旦，人工的に再構築した抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み，この発現ベクターをホスト細胞に導入する。このとき，ホスト細胞として用いる細胞としては，人工的に再構築した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入することにより抗体遺伝子を発現させることのできる細胞であれば原核細胞，真核細胞を問わず特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター等の哺乳動物由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞，又はマウス骨髄腫に由来するＮＳ／０細胞が好ましい。また，抗体遺伝子をコードする遺伝子を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入させたときに，該遺伝子を発現させるものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。
　このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた上述の人工的に再構築した抗体を発現するようになる。このようにして得た，人工的に再構築した抗体を発現する細胞から，所望の蛋白質に対する抗体に対して高親和性を有する抗体を産生する細胞を選択する場合，当該蛋白質をプレートに添加してこれに保持させた後，当該蛋白質に細胞の培養上清を接触させ，次いで，当該蛋白質と結合していない抗体をプレートから除去し，プレートに保持された抗体の量を測定する方法が用いられる。この方法によれば，細胞の培養上清に含まれる抗体の当該蛋白質に対する親和性が高いほど，プレートに保持された抗体の量が多くなる。従って，プレートに保持された抗体の量を測定し，より多くの抗体が保持されたプレートに対応する細胞を，当該蛋白質に対して相対的に高い親和性を有する抗体を産生する細胞株として選択することができ，ひいては，当該蛋白質に対して高親和性を有する抗体をコードする遺伝子を選択できる。このようにして選択された細胞株から，当該蛋白質に対する抗体をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片を，ＰＣＲ法を用いて増幅することにより，高親和性抗体をコードする遺伝子を単離することもできる。
　本発明におけるhNAGLU変異体と，抗体との結合体を製造する方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１～５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれhNAGLU変異体は抗体のいずれかと共有結合を形成することにより，hNAGLU変異体と抗体とを結合させるものである。
　抗体とhNAGLU変異体とは，抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，それぞれhNAGLU変異体のＮ末端又はＣ末端をペプチド結合により結合させることもできる。このように抗体とhNAGLU変異体とを結合させてなる結合体は，抗体の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を挟んで，hNAGLU変異体をコードするｃＤＮＡがインフレームで配置されたＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより，融合蛋白質として得ることができる。この哺乳動物細胞には，hNAGLU変異体をコードするＤＮＡ断片を重鎖と結合させる場合にあっては，抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入されることができ，また，hNAGLU変異体をコードするＤＮＡ断片を軽鎖と結合させる場合にあっては，抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入されることができる。抗体が一本鎖抗体である場合，抗体とhNAGLU変異体とを結合させた融合蛋白質は，hNAGLU変異体をコードするｃＤＮＡの５’末端側又は３’末端側に，直接，又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を挟んで，一本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を，（哺乳動物細胞，酵母等の真核生物又は大腸菌等の原核生物細胞用の）発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入したこれらの細胞中で発現させることにより，得ることができる。抗体とhNAGLU変異体の融合蛋白質は，上記手法により組換え蛋白質として製造することができる。
　発現ベクターを導入した哺乳動物細胞の培養のための培地としては，哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば，特に限定なく用いることができるが，好ましくは無血清培地が用いられる。本発明において，組換え蛋白質生産用培地として用いられる無血清培地としては，例えば，アミノ酸を３～７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１～５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３～１０ｇ／Ｌ，無機塩を０．１～１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１～０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１～５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１～１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１～１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１～２０μｇ／Ｌ，インシュリンを０．１～２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１～１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１～１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０～５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質等を培地に添加してもよい。
　抗体とhNAGLU変異体の融合蛋白質の生産用培地として用いられる無血清培地として，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＤＭＥＭとＦ１２の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ－グルタミン，Ｄ－グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄（ＩＩ），アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，ＤＭＥＭ（ＨＧ）ＨＡＭ改良型（Ｒ５）培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，ＣＤ ＯｐｔｉＣＨＯＴＭ培地，ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ ＩＩ培地又はＣＤ ＣＨＯ培地（Thermo Fisher Scientific社，旧ライフテクノロジーズ社），ＩＳ　ｃｈｏ－ＶＴＭ 培地（Irvine Scientific社），ＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３０２培地又はＥＸ－ＣＥＬＬＴＭ３２５－ＰＦ培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用することもできる。
　抗体とhNAGLU変異体の融合蛋白質の好ましい実施形態として，以下の（１）～（７）が挙げられる。すなわち：
　（１）抗体の重鎖のC末端に直接又はリンカーを介してhNAGLU変異体が結合した結合体と，抗体の軽鎖とを含むもの；
　（２）抗体の重鎖のN末端に直接又はリンカーを介してhNAGLU変異体が結合した結合体と，抗体の軽鎖とを含むもの；
　（３）抗体の軽鎖のC末端に直接又はリンカーを介してhNAGLU変異体が結合した結合体と，抗体の重鎖とを含むもの；
　（４）抗体の軽い鎖のN末端に直接又はリンカーを介してhNAGLU変異体が結合した結合体と，抗体の重鎖とを含むもの。
　抗体とhNAGLU変異体とを，リンカー配列を介して結合させる場合，抗体とhNAGLU変異体との間に配置されるリンカー配列は，好ましくは１～６０個又は１～５０個，より好ましくは１～１７個，更に好ましくは１～１０個，更により好ましくは１～５個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖であるが，リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，１個，２個，３個，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，２７個等と適宜調整できる。そのようなリンカー配列は，これにより連結された抗体が脳血管内皮細胞上の受容体との親和性を保持し，且つ当該リンカー配列により連結されたhNAGLU変異体が，生理的条件下で当該hNAGLU変異体の生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものである。例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Ser-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５８），アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５９），アミノ酸配列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号６０），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，あるいは２～５個連続してなる配列を含むものが挙げられる。１～５０個のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個，又は２７個のアミノ酸からなる配列等を有するものである。例えば，アミノ酸配列Gly-Serを含むものはリンカー配列として好適に用いることができる。また，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒに続いてアミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５８）が５個連続してなる計２７個のアミノ酸配列を含むものはリンカー配列として好適に用いることができる。更には，アミノ酸配列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号５８）が５個連続してなる計２５個のアミノ酸配列を含むものもリンカー配列として好適に用いることができる。
　なお，本発明において，１つのペプチド鎖に複数のリンカー配列が含まれる場合，便宜上，各リンカー配列はＮ末端側から順に，第１のリンカー配列，第２のリンカー配列というように命名する。
　本発明のhNAGLU変異体と結合させるべき抗体の具体的な例として，以下の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（抗ｈＴｆＲ抗体）が挙げられる。すなわち，
　（１）抗ｈＴｆＲ抗体であって，該抗体の軽鎖が，配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなり，重鎖が，配列番号６２のアミノ酸配列を含んでなる抗体，及び
　（２）抗ｈＴｆＲ抗体であって，かつＦａｂ抗体であって，該抗体の軽鎖が，配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなり，重鎖が，配列番号６３のアミノ酸配列を含んでなる抗体，
　である。ただし，これらに限られず，上記アミノ酸配列に対しては適宜，置換，欠失，付加等の変異を加えることができる。なお，上記（１）及び（２）の抗ｈＴｆＲ抗体はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体である。
　上記の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１又は２個である。軽鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１又は２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。
　上記の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の軽鎖のアミノ酸配列にアミノ酸を付加する場合，軽鎖のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１又は２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた軽鎖のアミノ酸配列は，元の軽鎖のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を有し，より好ましくは９０％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９５％以上の同一性を示す。
　上記の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１又は２個である。重鎖のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１又は２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。
　上記の抗ヒトトランスフェリン受容体抗体の重鎖のアミノ酸配列にアミノ酸を付加する場合，重鎖のアミノ酸配列中若しくはＮ末端側又はＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１又は２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えた重鎖のアミノ酸配列は，元の重鎖のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を有し，より好ましくは９０％以上の同一性を示し，更に好ましくは，９５％以上の同一性を示す。
　本発明のhNAGLU変異体は，脳血管内皮細胞上の受容体に対する抗体と結合させることにより，血液脳関門を通過させて脳内で機能を発揮させることができるので，NAGLUの欠損を原因とする中枢神経系の疾患状態の治療のための血中投与用薬剤の製造のために使用することができる。また，抗体と結合させたhNAGLU変異体は，NAGLUの欠損を原因とする中枢神経系の疾患状態の治療上有効量を，該当する患者に血中投与（点滴静注等の静脈注射を含む）することを含む，治療方法において使用することができる。血中投与された抗体と結合させたhNAGLU変異体は，脳内に到達する他，NAGLUを発現する他の臓器・器官にも到達することができる。また，当該薬剤は，当該疾患状態の発症を予防するために用いることもできる。
　本発明のhNAGLU変異体は，脳血管内皮細胞上の受容体に対する抗体と結合させることにより，血中に投与して中枢神経系（ＣＮＳ）において薬効を発揮させるべき薬剤として使用することができる。かかる薬剤は，一般に点滴静脈注射等による静脈注射，皮下注射，筋肉注射により患者に投与されるが，投与経路には特に限定はない。
　本発明の一実施形態におけるhNAGLU変異体は，抗体に限らず，その他の蛋白質との結合体とすることもできる。その他の蛋白質に特に限定はないが，当該蛋白質は，例えばヒト由来の蛋白質である。hNAGLU変異体と当該その他の蛋白質の結合体は，上述のhNAGLU変異体と抗体との結合体を製造する方法により得ることができる。また，hNAGLU変異体と当該その他の蛋白質の融合蛋白質は，上述の抗体との融合蛋白質を製造する方法により組換え蛋白質として得ることができる。本発明の一実施形態には，hNAGLU変異体とその他の蛋白質との融合蛋白質をコードする遺伝子，当該遺伝子を組み込んだ発現ベクター，及び当該発現ベクターを導入した宿主細胞が含まれる。
　本発明の一実施形態におけるhNAGLU変異体は，抗hTfR抗体に限らず，ヒトhTfRに結合することのできる物質との結合体とすることもできる。当該物質に特に限定はないが，当該蛋白質は，例えば，ヒトトランスフェリンである。ヒトトランスフェリンは野生型のものに限らず，hTfRとの親和性を有する限り，その部分断片，変異体であってもよい。このような結合体は，血液脳関門を通過して脳内で機能を発揮することができる。hNAGLU変異体とヒトトランスフェリンの融合蛋白質は，上述の抗体との融合蛋白質を製造する方法により組換え蛋白質として得ることができる。本発明の一実施形態には，hNAGLU変異体とヒトトランスフェリンとの融合蛋白質をコードする遺伝子，当該遺伝子を組み込んだ発現ベクター，及び当該発現ベクターを導入した宿主細胞が含まれる。
　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。
〔実施例１〕hNAGLU変異体の発現ベクターの構築
　野生型hNAGLU遺伝子を含む配列番号４１で示される塩基配列を有するDNA断片を合成した。これを鋳型として，フォワードプライマーとして配列番号４２で示される塩基配列を有するMluI付加5’プライマーを，リバースプライマーとして表１で示すプライマーを用いて，表１に示すNo. 1～7及び11のPCRを行った。表１に各リバースプライマーの塩基配列に対応する配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　次いで，配列番号４１で示される塩基配列を有するDNA断片を鋳型として，フォワードプライマーとして表１に示すNo. 1～7及び11のPCRで得られたPCR産物を，リバースプライマーとして配列番号４３で示される塩基配列を有するHisタグ-NotI付加3’プライマーを用いてPCRを行い，表２に示すhNAGLU変異体をコードする遺伝子を含むPCR産物を得た。表２に各hNAGLU変異体のアミノ酸配列に対応する配列番号，それらをコードする塩基配列に対応する配列番号，及び各hNAGLU変異体の番号（変異体番号）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　野生型hNAGLU遺伝子を含む配列番号４１で示される塩基配列を有するDNA断片を鋳型として，フォワードプライマーとして表３に示すプライマー，リバースプライマーとして配列番号４３で示される塩基配列を有するHisタグ-NotI付加3’プライマーを用いて表３に示すNo. 8～10のPCRを行った。表３に各フォワードプライマーの塩基配列に対応する配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　次いで，配列番号４１で示される塩基配列を有するDNA断片を鋳型として，フォワードプライマーとして配列番号４２で示される塩基配列を有するMluI付加5’プライマーを，リバースプライマーとして表３に示すNo. 8～10のPCRで得られたPCR産物を用いてPCRを行い，表４に示すhNAGLU変異体をコードする遺伝子を含むPCR産物を得た。表４に各hNAGLU変異体のアミノ酸配列に対応する配列番号，それらをコードする塩基配列に対応する配列番号，及び各hNAGLU変異体の番号（変異体番号）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　次いで，No. 1～11のPCRで得られたPCR産物，及び野生型hNAGLUをコードする配列番号４１で示される塩基配列を有するDNA断片を，MluI及びNotI（タカラバイオ社）で制限酵素処理し，アガロースゲル電気泳動にて分離した。EtBr染色を行った後，UV照射下で目的のDNA断片を含むバンドを切り出し，QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてゲルからDNAを抽出した。同様に，pCI-neoベクター（プロメガ社），pEI-puroベクターもMluI及びNotIで制限酵素処理し，ゲル抽出，精製を行った。制限酵素で処理した各ベクターに，制限酵素で処理した各PCR産物をそれぞれ混合し，Ligation Mix（タカラバイオ社）を用いて16℃で30～60分間ライゲーション反応を行った。野生型hNAGLU遺伝子を含む配列番号４１で示される塩基配列を含むDNA断片についても，同様にライゲーション反応を行った。
　なお，pEI-puroベクターは以下の手順で作製した。pEF/myc/nucベクター（インビトロジェン社）を，制限酵素（KpnI及びNcoI）で消化し，EF-1aプロモーター及びその第一イントロンを含むDNA断片を切り出し，このDNA断片をT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。別に，pCI-neo（インビトロジェン社）を，制限酵素（BglII及びEcoRI）で消化して，CMVのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1aプロモーター及びその第一イントロンを含む領域（平滑末端化処理後のもの）を挿入した。これをpE-neoベクターを名付けた。pCAGIpuroベクター（Miyahara M. et.al., J. Biol. Chem. 275, 613-618 (2000) ）を，制限酵素（NotI及びBamHI）で消化し，マウス脳心筋炎ウイルス（EMCV）に由来する内部リボソーム結合部位（IRES），ピューロマイシン耐性遺伝子（Puror）及びウシ成長ホルモン（bGH）に由来するポリアデニル化シグナル（polyA）を含むDNA断片を切り出した。別に，pE-neoベクターを，制限酵素（NotI及びBamHI）で消化して，ネオマイシン耐性遺伝子（Neor）を含む約2 kbpの領域を切除した。これに，上記のIRES，PuroR及びbGH由来のpolyAを含むDNA断片を挿入した。これをpEI-puroベクターと名付けた。
　次いで，各ライゲーション反応液を用いて大腸菌（ECOSTM X Competent E. coli DH5 α，ニッポンジーン社）をそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体が目的のプラスミドDNAを保持しているか確認するため，シングルコロニーをLB液体培地（LB Broth，Sigma-Aldrich社）で一晩培養し，FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社）を用いてプラスミドDNAを少量精製した。精製したプラスミドDNAをMluI及びNotIで制限酵素処理し，アガロースゲル電気泳動にて分離することで，目的のインサートDNAが挿入されていることを確認した。また，各hNAGLU遺伝子に目的の改変が導入されていることを，サンガーシーケンス解析により確認した。目的のhNAGLU変異体又は野生型hNAGLUが組込まれていることを確認した各プラスミドを常法により精製した。
〔実施例２〕hNAGLU変異体の一過性発現
　hNAGLU変異体の一過性発現は，実施例１で得た精製したpCI-neoベクターに各hNAGLU変異体をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて行った。コントロールとしてpCI-neoベクターに野生型NAGLUをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いた。
　ExpiCHO Expression System（Thermo Fisher Scientific社）のHigh titerプロトコールに従い，hNAGLU変異体をコードする遺伝子を組み込んだプラスミド，及び野生型hNAGLUをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて，ExpiCHO細胞を形質転換させた。形質転換後，細胞を８日間培養し，各hNAGLU変異体及び野生型hNAGLUを培養上清中に発現させた。培養後，培養液を遠心分離して培養上清を回収した。
〔実施例３〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（SDS page電気泳動）
　実施例２で得られた培養上清10 μLを，8 μLの2×Sample Buffer（バイオラッド社）及び2 μLの2-Mercaptoethanolと混合し，100℃で3分間保温することで還元条件下で熱変性させた。熱変性後の試料を，0.1% SDSを含む50 mM Tris緩衝液/380 mM グリシン緩衝液(pH8.3)内に設置した5-20%ポリアクリルアミドゲルのウェルに5 μLずつ付し，25 mA定電流にて電気泳動した。電気泳動後のゲルをOriole Fluorescent Gel Stain（バイオラッド社）に浸し，室温で90分間振とうした。ゲルを純水で洗浄した後，ルミノイメージアナライザー（Amersham Imager 600RGB，サイティバ社）で蛋白質のバンドを検出した。
〔実施例４〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（ウエスタンブロッティング法）
　実施例３に記載した方法と同様に電気泳動を行い，ニトロセルロース膜と電気泳動後のゲルを，20%メタノールを含む25 mM Tris緩衝液/192 mM グリシン緩衝液に浸したブロッティングペーパーで挟み，ブロッティング装置で1.0 A，25 Vで10分間通電することで，蛋白質をニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を5%スキムミルクを含むPBSTに浸して1時間振とうした後，0.4 μg/mLに希釈したMouse anti-His tag mAb（医学生物学研究所）溶液に浸して1時間振とうした。PBSTで膜を洗浄後，0.4 μg/mLに希釈したAnti-mouse IgG (H+L), HRP Conjugate（プロメガ社）溶液に浸して30分間振とうし，再度PBSTで洗浄した。膜の転写面にHRP検出試薬（バイオラッド社）を滴下して5分間反応させ，各hNAGLU変異体及び野生型hNAGLUに相当するバンドをルミノイメージアナライザーで検出した。
〔実施例５〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（酵素活性測定）
　試料溶液として，実施例２で得られた培養上清を0.1% BSAを含む100 mM クエン酸緩衝液(pH4.2)で10倍希釈したものを調製した。標準溶液として，4-MU（4-Methylumbelliferone，シグマアルドリッチ社）を0.1% BSAを含む100 mM クエン酸緩衝液(pH4.2)で400～35.12 μMに段階希釈したものを調製した。基質溶液として，NAGLUの人工基質である4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminide（シグマアルドリッチ社）を0.1% BSAを含む100 mM クエン酸緩衝液(pH4.2)で1 mmol/Lに希釈したものを調製した。マイクロプレートに試料溶液又は標準溶液を各ウェルに25 μLずつ添加し，更に基質溶液を25 μL/well添加してプレートシェイカーで撹拌し混合した。プレートを37℃で1時間保温した後，200 mmol/L グリシン-NaOH緩衝液(pH10.7)を各ウェルに150 μLずつ添加して反応を停止させた。蛍光プレートリーダー（Gemini XPS，モレキュラーデバイス社）で遊離した4-MU（4-Methylumbelliferone）の蛍光強度を測定した（励起波長355 nm，蛍光波長460 nm）。標準溶液の測定結果に基づき検量線を作成し，これに各試料溶液の測定値を内挿して，酵素活性量を求めた。
〔実施例６〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（結果）
　図１に，実施例２～４で測定した一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の測定結果を示す。表５は，図１において棒グラフで示される酵素活性測定結果に基づく各hNAGLU変異体の発現量を，野生型の発現量を１としたときの相対値として示したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　K36E/P37S hNAGLU変異体，L44_G45insS hNAGLU変異体，Q209R hNAGLU変異体，E228K hNAGLU変異体，T320P/E321 D hNAGLU変異体，S505A/I506V hNAGLU変異体，S526N/A528 T hNAGLU変異体の7種の変異体（変異体番号１～７）は，野生型と比較して高い一過性発現を示した。特に，Q209R hNAGLU変異体（変異体番号３）は野生型hNAGLUと比較して4.4倍の発現量を示した。一方，R129Q hNAGLU変異体（変異体番号１６），S526N/A528T hNAGLU変異体（変異体番号１７），D613Q hNAGLU変異体（変異体番号１８），及びH204K hNAGLU変異体（変異体番号１９）は，野生型と比較して低い一過性発現を示した。
　また，酵素活性量と，図１（ａ）に示されるSDS page電気泳動上で確認されるhNAGLU変異体の発現量には正の相関が認められた。更に，酵素活性量と，図１ (ｂ)に示されるウエスタンブロッティング法で確認されるhNAGLU変異体の発現量にも正の相関が認められた。
〔実施例７〕hNAGLU変異体発現バルク細胞の作製
　遺伝子導入装置（スーパーエレクトロポレーターNEPA21，ネッパジーン社）を用いて，CHO-K1細胞の無血清馴化株に，実施例１で得られた各hNAGLU変異体又は野生型hNAGLUをコードする遺伝子を組み込んだ発現プラスミドをそれぞれ導入し，10 μg/mL Puromycin（Thermo Fisher Scientific社）を含むCD OptiCHO培地（Thermo Fisher Scientific社）にて選択培養を行った。3～4日おきに培地交換を繰り返しながら順次培養液量を拡大し，培養中の細胞の生存率が90%を超えた時点で細胞を回収し，これをhNAGLU変異体発現バルク細胞及び野生型hNAGLU発現バルク細胞とした。
〔実施例８〕hNAGLU変異体発現バルク細胞の培養
　10 μg/mL Puromycinを含むCD OptiCHO培地に，実施例７で得られた各hNAGLU変異体発現バルク細胞及び野生型hNAGLU発現バルク細胞を，それぞれ2×105 cells/mLの細胞密度で播種し，37°C，5% CO2存在下で静置培養した。培養開始から9日後，培養上清を遠心分離して培養上清を回収した。
〔実施例９〕バルク細胞によるhNAGLU変異体発現量の確認（酵素活性測定）
　試料溶液として，実施例８で得られた培養上清を0.1% BSAを含むクエン酸緩衝液(pH4.2)で10倍希釈したものを調製した。基質溶液として，hNAGLUの人工基質である4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminideをクエン酸緩衝液(pH4.2)で1 mmol/Lに希釈したものを調製した。マイクロプレートに試料溶液又は標準溶液を各ウェルに25 μLずつ添加し，更に基質溶液を25 μL/well添加してプレートシェイカーで撹拌し混合した。プレートを37℃で1時間保温した後，200 mmol/L グリシン-NaOH緩衝液(pH10.7)を各ウェルに150 μLずつl添加して反応を停止させた。蛍光プレートリーダーで遊離した4-MU（4-Methylumbelliferone）の蛍光強度を測定した（励起波長355 nm，蛍光波長460 nm）。標準溶液の測定結果に基づき検量線を作成し，これに各試料溶液の測定値を内挿して，酵素活性量を求めた。酵素活性量は，各々のhNAGLU変異体について，培養中に1×106個の細胞から発現したhNAGLUの酵素活性量（nmol/h/1×106個細胞）として求めた。
〔実施例１０〕バルク細胞によるhNAGLU変異体発現量の確認（結果）
　図２に，実施例９で測定したバルク細胞によるhNAGLU変異体発現量の測定結果を示す。表６は，図２において棒グラフで示される酵素活性測定結果に基づく各hNAGLU変異体の発現量を，野生型の発現量を１としたときの相対値として示したものである。なお，バルク細胞の培養は４回繰り返し，それぞれについて酵素活性測定を実施した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　一過性発現の場合と同様に，バルク細胞においてもK36E/P37S hNAGLU変異体，L44_G45insS hNAGLU変異体，Q209R hNAGLU変異体，E228K hNAGLU変異体，T320P/E321D hNAGLU変異体，S505A/I506V hNAGLU変異体，S526N/A528T hNAGLU変異体の7種の変異体（変異体番号１～７）は，野生型と比較して発現量が多かった。特に，Q209R hNAGLU変異体（変異体番号３）は野生型hNAGLUと比較して2.2倍の発現量を示した。また，一過性発現の場合と同様に，R129Q hNAGLU変異体（変異体番号１６），S526N/A528T hNAGLU変異体（変異体番号１７），D613Q hNAGLU変異体（変異体番号１８），及びH204K hNAGLU変異体（変異体番号１９）は，野生型と比較して発現量が少なかった。
〔実施例１１〕Q209R hNAGLU変異体への変異導入及び発現ベクターの構築
　実施例１～１０の実験結果により，hNAGLU変異体の中で，Q209R hNAGLU変異体が最も高い発現量を示すことがわかった。そこで，更なる高発現hNAGLU変異体を得るために，Q209R hNAGLU変異体に更に変異を導入した。実施例１で得られたQ209R hNAGLU変異体をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを鋳型として，フォワードプライマーとして配列番号４２で示される塩基配列を有するMluI付加5’プライマーを，リバースプライマーとして表７に示すプライマーを用いて，表７に示すNo. 12～15のPCRを行った。表７に各リバースプライマーの塩基配列に対応する配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　また，実施例１で得られたQ209R hNAGLU変異体をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを鋳型として，フォワードプライマーとして表８で示すプライマー，リバースプライマーとして配列番号４３で示される塩基配列を有するHisタグ-NotI付加3’プライマーを用いて表８に示すNo. 16のPCRを行った。表８にフォワードプライマーの塩基配列に対応する配列番号を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　次いで，実施例１で得られたQ209R hNAGLU変異体をコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを鋳型として，表９に示すフォワードプライマーとリバースプライマーとを用いて，表９に示すNo. 17～26のPCRを行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記のNo. 17～19，21，及び23～26のPCRにより，Q209R hNAGLU変異体に，更に1～3個の変異を導入した表１０に示すhNAGLU変異体をコードするDNA断片を増幅した。表１０に各hNAGLU変異体のアミノ酸配列に対応する配列番号，それらをコードする塩基配列に対応する配列番号，及び各hNAGLU変異体の番号（変異体番号）を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　次いで，No. 17～19，21，及び23～26のPCRで得られた各PCR産物を，MluI及びNotI（タカラバイオ社）で制限酵素処理し，アガロースゲル電気泳動にて分離した。EtBr染色を行った後，UV照射下で目的のDNA断片を含むバンドを切り出し，QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAGEN社）を用いてゲルからDNAを抽出した。同様に，pCI-neoベクター（プロメガ社），pEI-puroベクターもMluI及びNotIで制限酵素処理し，ゲル抽出，精製を行った。制限酵素で処理した各ベクターに，制限酵素で処理した各PCR産物をそれぞれ混合し，Ligation Mix（タカラバイオ社）を用いて16℃で30～60分間ライゲーション反応を行った。
　次いで，各ライゲーション反応液を用いて大腸菌（ECOSTM X Competent E. coli DH5 α，ニッポンジーン社）をそれぞれ形質転換した。得られた形質転換体が目的のプラスミドDNAを保持しているか確認するため，シングルコロニーをLB液体培地（LB Broth，Sigma-Aldrich社）で一晩培養し，FastGene Plasmid Mini Kit（日本ジェネティクス社）を用いてプラスミドDNAを少量精製した。精製したプラスミドDNAをMluI及びNotIで制限酵素処理し，アガロースゲル電気泳動にて分離することで，目的のインサートDNAが挿入されていることを確認した。また，各hNAGLU遺伝子に目的の改変が導入されていることを，サンガーシーケンス解析により確認した。目的のhNAGLU変異体が組込まれていることを確認した各プラスミドを常法により精製した。
〔実施例１２〕hNAGLU変異体の一過性発現
　hNAGLU変異体の一過性発現は，実施例１１で精製したpCI-neoベクターにhNAGLU変異体を組み込んだプラスミドを用いて行った。コントロールとしてpCI-neoベクターに野生型hNAGLUを組み込んだプラスミドを用いた。
　ExpiCHO Expression System（Thermo Fisher Scientific社）のHigh titerプロトコールに従い，hNAGLU変異体をコードする遺伝子を組み込んだプラスミド，及び野生型hNAGLUをコードする遺伝子を組み込んだプラスミドを用いて，ExpiCHO細胞を形質転換させた。形質転換後，細胞を８日間培養し，各hNAGLU変異体及び野生型hNAGLUを培養上清中に発現させた。培養後，培養液を遠心分離して培養上清を回収した。また，陰性コントロールとして，形質転換をしていない細胞の培養上清を同様にして回収した。
〔実施例１３〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（SDS page電気泳動）
　実施例１２で得られた培養上清10 μLを，8 μLの2×Sample Buffer及び2 μLの2-Mercaptoethanolと混合し，100℃で3分間保温することで還元条件下で熱変性させた。熱変性後の試料を，0.1% SDSを含む50 mM Tris緩衝液/380 mM グリシン緩衝液(pH8.3)内に設置した5-20%ポリアクリルアミドゲルのウェルに5 μLずつアプライし，25 mA定電流にて電気泳動した。電気泳動後のゲルをOriole Fluorescent Gel Stain（バイオラッド社）に浸し，室温で90分間振とうした。ゲルを純水で洗浄した後，ルミノイメージアナライザーで蛋白質のバンドを検出した。
〔実施例１４〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（ウエスタンブロッティング法）
　実施例１３に記載した方法と同様に電気泳動を行い，ニトロセルロース膜と電気泳動後のゲルを，20%メタノールを含む25 mM Tris緩衝液/192 mM グリシン緩衝液に浸したブロッティングペーパーで挟み，ブロッティング装置で1.0 A，25 Vで10分間通電することで蛋白質をニトロセルロース膜に転写した。転写後のニトロセルロース膜を5%スキムミルクを含むPBSTに浸して1時間振とう後，0.4 μg/mLに希釈したMouse anti-His tag mAb溶液に浸して1時間振とうした。PBSTで膜を洗浄後，0.4 μg/mLに希釈したAnti-mouse IgG (H+L), HRP Conjugate溶液に浸して30分間振とうし，再度PBSTで洗浄した。膜の転写面にHRP検出試薬を滴下して5分間反応させ，ルミノイメージアナライザーで検出した。
〔実施例１５〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（酵素活性測定）
　試料溶液として，実施例１２で得られた培養上清を0.1% BSAを含むクエン酸緩衝液(pH4.2)で10倍希釈したものを調製した。基質溶液として，hNAGLUの人工基質である4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-glucosaminideをクエン酸緩衝液(pH4.2)で1 mmol/Lに希釈したものを調製した。マイクロプレートに試料溶液又は標準溶液を25 μL/well添加し，更に各ウェルに25 μLの基質溶液を添加してプレートシェイカーで撹拌し混合した。プレートを37℃で1時間保温した後，200 mmol/L グリシン-NaOH緩衝液（pH10.7）を150 μL/well添加して反応を停止させた。蛍光プレートリーダーで遊離した4-MU（4-Methylumbelliferone）の蛍光強度を測定した（励起波長355 nm，蛍光波長460 nm）。標準溶液の測定結果に基づき検量線を作成し，これに各試料溶液の測定値を内挿して，酵素活性量を求めた。
〔実施例１６〕一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の確認（結果）
　図３及び図４に，実施例１２～１５で測定した一過性発現によるhNAGLU変異体発現量の測定結果を示す。表１１は，図３及びず４において棒グラフで示される酵素活性測定結果に基づく各hNAGLU変異体の発現量を，野生型の発現量を１としたときの相対値として示したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　Q209R hNAGLU変異体に更に変異を加えた，K36E/P37S/Q209R hNAGLU変異体，L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，Q209R/T320P/E321D hNAGLU変異体，K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，V54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体，L44_G45insS/V54I/Q209Rh NAGLU変異体，L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU変異体，及びL44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体（変異体８～１５）は，何れもQ209R hNAGLU変異体と比較して高い一過性発現を示した。特に，V54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体は，Q209R hNAGLU変異体と比較して，約1.8倍（野生型の5.9倍）の一過性発現を示した。また，酵素活性量と，図３（ｂ）及び図４(ａ)に示されるSDS page電気泳動上で確認されるhNAGLU変異体の発現量には正の相関が認められた。更に，酵素活性量と，図４ (ｂ)に示されるウエスタンブロッティング法で確認されるhNAGLU変異体の発現量にも正の相関が認められた。
〔実施例１７〕
　以上の結果は，組換え体hNAGLUを製造する場合に，組換え体野生型hNAGLUに代えて組換え体Q209R hNAGLU変異体として製造することにより，2～5倍の生産量を得ることができることを示す。また，Q209R hNAGLU変異体に更に変異を加えて，組換え体K36E/P37S/Q209R hNAGLU変異体，組換え体L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，組換え体Q209R/T320P/E321D hNAGLU変異体，組換え体K36E/P37S/L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体，組換え体V54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体，組換え体L44_G45insS/V54I/Q209R hNAGLU変異体，組換え体L44_G45insS/Q209R/R620K hNAGLU変異体，及び組換え体L44_G45insS/V54I/Q209R/R620K hNAGLU変異体として製造することにより，更に組換え体hNAGLUの生産量を増加させることができることを示す。
〔実施例１８〕抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（抗ｈＴｆＲ抗体）とhNAGLU変異体の融合蛋白質の発現用細胞の構築
　抗ヒトトランスフェリン受容体抗体（抗ｈＴｆＲ抗体）とhNAGLU変異体の融合蛋白質は，以下に詳述する方法により製造することができる。
　発現ベクターであるpE-neoベクターとpE-hygrベクターを特許文献（WO2018/124121）に記載された方法により構築する。pE-neoベクターとpE-hygrベクターをそれぞれMluIとNotIにより消化する。
配列番号６３のアミノ酸配列を含んでなる抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖のC末端に，配列番号３で示されるアミノ酸配列が３個連続してなる計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体（変異体番号９）が結合する配列番号６４で示される蛋白質をコードするＤＮＡ断片を合成する。このＤＮＡ断片の5’側には，5’端から順にMluI配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にはNotI配列を配置する。このＤＮＡ断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-neo(HC-mhNAGLU)を構築する。
　また，L44_G45insS/Q209R hNAGLU変異体（変異体番号９）のC末端に，配列番号３で示されるアミノ酸配列が３個連続してなる計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列を介して，配列番号６３のアミノ酸配列を含んでなる抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖が結合する配列番号６５で示される蛋白質をコードするＤＮＡ断片を合成する。このＤＮＡ断片の5’側には，5’端から順にMluI配列と，分泌シグナルとして機能するリーダーペプチドをコードする配列とを，３’側にはNotI配列を配置する。このＤＮＡ断片をMluIとNotIで消化し，pE-neoベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-neo(mhNAGLU-HC)を構築する。
　配列番号６１のアミノ酸配列を含んでなる抗ｈＴｆＲの軽鎖をコードするＤＮＡ断片（配列番号６６）をコードするＤＮＡ断片を合成する。このDNA断片をMluIとNotIで消化し，pE-hygrベクターのMluIとNotIの間に組み込み，pE-hygr (LC)を構築する。
　ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１：American Type Culture Collectionから入手）を，下記の方法により，GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，pE-neo(HC-mhNAGLU)及びpE-neo(HC-mhNAGLU)，又はpE-neo(HC-mhNAGLU)及びpE-neo(mhNAGLU-HC)でそれぞれ形質転換する。細胞の形質転換は概ね以下の方法で行う。5Ｘ105個のＣＨＯ－Ｋ１細胞をCD OptiCHOＴＭ培地（ライフテクノロジー社）を添加した3.5 cm培養ディッシュに播種し，37℃，5% CO2の条件下で一晩培養する。培地をOpti-MEMＴＭ I培地（ライフテクノロジー社）に交換し，細胞を5Ｘ106 細胞/mLの密度となるように懸濁する。細胞懸濁液100 μLを採取し，これにOpti-MEMＴＭ Ｉ培地で100 μg/mLに希釈したpE-neo(HC-mhNAGLU)及びpE-neo(HC-mhNAGLU)プラスミドＤＮＡ溶液を5 μLずつ添加する。GenePulser（Bio-Rad社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にプラスミドを導入する。細胞を，37℃，5% CO2の条件下で一晩培養し，次いで0.5 mg/mLのハイグロマイシン及び0.8 mg/mLのＧ４１８を添加したCD OptiCHOＴＭ培地で選択培養する。
　次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が播種されるように，９６ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約10日間培養する。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，培養上清中のヒト化抗体含量をＥＬＩＳＡ法にて調べ，ヒト化抗体高発現細胞株を選択する。
　このときのＥＬＩＳＡ法は概ね以下の方法で実施する。９６ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，ヤギ抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体溶液を0.05M 炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）で4 μg/mLに希釈したしたものを100 μLずつ加え，室温で少なくとも１時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，PBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，Starting Block (PBS) Blocking Buffer（Thermo Fisher Scientific社）を各ウェルに200 μLずつ加えてプレートを室温で30分静置する。各ウェルをPBS-Tで3回洗浄した後，PBSに0.5% BSA及び0.05% Tween20を添加したもの（PBS-BT）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒトＩｇＧ標準品を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置する。プレートをPBS-Tで3回洗浄した後，PBS-BTで希釈したHRP標識抗ヒトＩｇＧポリクロ－ナル抗体溶液を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で少なくとも1時間静置する。PBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，リン酸－クエン酸緩衝液（pH 5.0）を含む0.4 mg/mL ｏ－フェニレンジアミンを100 μLずつ各ウェルに加え，室温で8～20分間静置する。次いで，1 mol/L 硫酸を100 μLずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，96ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルの490 nmにおける吸光度を測定する。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，高発現細胞株として融合蛋白質の製造に用いることができる。
〔実施例１９〕抗ｈＴｆＲ抗体とhNAGLU変異体の融合蛋白質の製造
　抗ｈＴｆＲ抗体とhNAGLU変異体の融合蛋白質は，以下の方法で製造することができる。実施例１８に記載の高発現細胞株を，細胞濃度が約2Ｘ105 個/mLとなるように，CD OptiCHOＴＭ培地で希釈し，1 Lの三角フラスコに200 mLの細胞懸濁液を加え，37℃で，5% CO2と95% 空気からなる湿潤環境で約70 rpmの撹拌速度で6～7日間培養する。培養上清を遠心操作により回収し，0.22 μmフィルター（Millipore社）でろ過して，培養上清を回収する。その培養上清に，カラム体積の5倍容の150 mL NaClを含む20 mM Tris緩衝液（pH 8.0）を添加し，カラム体積の3倍容の150 mM NaClを含む20 mM Tris緩衝液（pH 8.0）で予め平衡化しておいたProtein Aカラム（カラム体積：1 mL，Bio-Rad社）に負荷する。次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を供給してカラムを洗浄した後，150 mM NaClを含むカラム体積の4倍容の50 mM グリシン緩衝液（pH 2.8）で，吸着した融合蛋白質を溶出させる。この融合蛋白質を含む溶出液のpHを1 M Tris緩衝液（pH 8.0）を添加してpH 7.0に調整する。こうして得られて溶液を融合蛋白質の精製品として，4℃又は凍結して保存する。
　本発明によれば，ムコ多糖症IIIＢ型の患者の治療のため，酵素補充療法として投与されることの可能なhNAGLU変異体であって，野生型hNAGLUと比較して，組換え体蛋白質としてより効率良く生産することのhNAGLU変異体を提供することができる。
配列番号１：野生型ｈＮＡＧＬＵのアミノ酸配列
配列番号２：野生型ｈＮＡＧＬＵをコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号３：hNAGLU変異体番号１のアミノ酸配列
配列番号４：hNAGLU変異体番号１をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号５：hNAGLU変異体番号２のアミノ酸配列
配列番号６：hNAGLU変異体番号２をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号７：hNAGLU変異体番号１６のアミノ酸配列
配列番号８：hNAGLU変異体番号１６をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号９：hNAGLU変異体番号３のアミノ酸配列
配列番号１０：hNAGLU変異体番号３をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号１１：hNAGLU変異体番号４のアミノ酸配列
配列番号１２：hNAGLU変異体番号４をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号１３：hNAGLU変異体番号１７のアミノ酸配列
配列番号１４：hNAGLU変異体番号１７をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号１５：hNAGLU変異体番号５のアミノ酸配列
配列番号１６：hNAGLU変異体番号５をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号１７：hNAGLU変異体番号６のアミノ酸配列
配列番号１８：hNAGLU変異体番号６をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号１９：hNAGLU変異体番号７のアミノ酸配列
配列番号２０：hNAGLU変異体番号７をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号２１：hNAGLU変異体番号１８のアミノ酸配列
配列番号２２：hNAGLU変異体番号１８をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号２３：hNAGLU変異体番号１９のアミノ酸配列
配列番号２４：hNAGLU変異体番号１９をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号２５：hNAGLU変異体番号８のアミノ酸配列
配列番号２６：hNAGLU変異体番号８をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号２７：hNAGLU変異体番号９のアミノ酸配列
配列番号２８：hNAGLU変異体番号９をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号２９：hNAGLU変異体番号１０のアミノ酸配列
配列番号３０：hNAGLU変異体番号１０をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号３１：hNAGLU変異体番号１１のアミノ酸配列
配列番号３２：hNAGLU変異体番号１１をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号３３：hNAGLU変異体番号１２のアミノ酸配列
配列番号３４：hNAGLU変異体番号１２をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号３５：hNAGLU変異体番号１３のアミノ酸配列
配列番号３６：hNAGLU変異体番号１３をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号３７：hNAGLU変異体番号１４のアミノ酸配列
配列番号３８：hNAGLU変異体番号１４をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号３９：hNAGLU変異体番号１５のアミノ酸配列
配列番号４０：hNAGLU変異体番号１５をコードするＤＮＡ断片の塩基配列，合成配列
配列番号４１：hNAGLUをコードする遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号４２：MluI付加5’プライマー，合成配列
配列番号４３：Hisタグ-NotI付加3’プライマー，合成配列
配列番号４４：K36E/P37S変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号４５：L44_G45insS変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号４６：R129Q変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号４７：Q209R変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号４８：E228K変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号４９：T240V変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号５０：T320P/E321 D変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号５１：S505A/I506V変異導入5’ プライマー，合成配列
配列番号５２：S526N/A528 T変異導入5’ プライマー，合成配列
配列番号５３：D613Q変異導入5’ プライマー，合成配列
配列番号５４：H204K変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号５５：V54I変異導入3’ プライマー，合成配列
配列番号５６：R620K変異導入5’ プライマー，合成配列
配列番号５７：ヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸配列
配列番号５８：リンカーのアミノ酸配列の一例１
配列番号５９：リンカーのアミノ酸配列の一例２
配列番号６０：リンカーのアミノ酸配列の一例３
配列番号６１：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号６２：抗hTfR抗体の重鎖のアミノ酸配列
配列番号６３：抗hTfR抗体のFab重鎖のアミノ酸配列
配列番号６４：hNAGLU変異体番号９と抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖の融合蛋白質のアミノ酸配列１
配列番号６５：hNAGLU変異体番号９と抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖の融合蛋白質のアミノ酸配列２
配列番号６６：抗hTfR抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号６７：野生型hNAGLU前駆体のシグナルペプチドのアミノ酸配列

Claims (34)

  1. 　下記の（１）～（７）からなる群から選択されるヒトα-N-アセチルグルコサミニダーゼ（hNAGLU）の変異体：
    　（１）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中36位のリシンがグルタミン酸に，かつ37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換された配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（２）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（３）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中209位のグルタミンがアルギニンに置換された配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（４）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中228位のグルタミン酸がリシンに置換された配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（５）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中320位のトレオニンがプロリンに，かつ321位のグルタミン酸がアスパラギン酸に，それぞれ置換された配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（６）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中505位のセリンがアラニンに，かつ506位のイソロイシンがバリンに，それぞれ置換された配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むもの；及び
    　（７）配列番号１で示される野生型のhNAGLUのアミノ酸配列中526位のセリンがアスパラギンに，かつ528位のアラニンがトレオニンに，それぞれ置換された配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むもの。
  2. 　請求項１に記載の配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の36位のグルタミン酸及び37位のセリン以外において，以下の（１’－ａ）～（１’－ｈ）からなる群から選択される変異を含むhNAGLU変異体：
    　（１’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１’－ｃ）上記１’－ａの置換と１’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１’－ｅ）上記１’－ａの置換と１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１’－ｆ）上記１’－ｂの欠失と１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１’－ｇ）上記１’－ａの置換と，１’－ｂの欠失と及び１’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    　（１’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  3. 　請求項１に記載の配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLUの変異体に対し，該アミノ酸配列の45位のセリン以外において，以下の（２’－ａ）～（２’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（２’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（２’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（２’－ｃ）上記２’－ａの置換と２’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（２’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（２’－ｅ）上記２’－ａの置換と２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（２’－ｆ）上記２’－ｂの欠失と２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（２’－ｇ）上記２’－ａの置換と，２’－ｂの欠失と及び２’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    　（２’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  4. 　請求項１に記載の配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の209位のアルギニン以外において，以下の（３’－ａ）～（３’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（３’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（３’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（３’－ｃ）上記３’－ａの置換と３’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（３’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（３’－ｅ）上記３’－ａの置換と３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（３’－ｆ）上記３’－ｂの欠失と３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（３’－ｇ）上記３’－ａの置換と，３’－ｂの欠失と及び３’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    　（３’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  5. 　請求項１に記載の配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の228位のリジン以外において，以下の（４’－ａ）～（４’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（４’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（４’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（４’－ｃ）上記４’－ａの置換と４’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（４’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（４’－ｅ）上記４’－ａの置換と４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（４’－ｆ）上記４’－ｂの欠失と４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（４’－ｇ）上記４’－ａの置換と，４’－ｂの欠失と及び４’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    　（４’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  6. 　請求項１に記載の配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の320位のプロリン及び321位のアスパラギン酸以外において，以下の（５’－ａ）～（５’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（５’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（５’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（５’－ｃ）上記５’－ａの置換と５’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（５’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（５’－ｅ）上記５’－ａの置換と５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（５’－ｆ）上記５’－ｂの欠失と５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（５’－ｇ）上記５’－ａの置換と，５’－ｂの欠失と及び５’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    （５’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  7. 　請求項１に記載の配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の505位のアラニン及び506位のバリン以外において，以下の（６’－ａ）～（６’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（６’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（６’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（６’－ｃ）上記６’－ａの置換と６’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（６’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（６’－ｅ）上記６’－ａの置換と６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（６’－ｆ）上記６’－ｂの欠失と６’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（６’－ｇ）上記６’－ａの置換と，６’－ｂの欠失と及び６’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    　（６’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  8. 　請求項１に記載の配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の526位のアスパラギン及び528位のトレオニン以外において，以下の（７’－ａ）～（７’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（７’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（７’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（７’－ｃ）上記７’－ａの置換と７’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（７’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（７’－ｅ）上記７’－ａの置換と７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（７’－ｆ）上記７’－ｂの欠失と７’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（７’－ｇ）上記７’－ａの置換と，７’－ｂの欠失と及び７’－ｄの付加を組み合わせたもの；及び
    　（７’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  9. 　請求項４に記載の配列番号９で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し， 以下の（８）～（１５）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（８）36位のリシンがグルタミン酸に，37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換された配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（９）44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（１０）320位のトレオニンがプロリンに，321位のグルタミン酸がアスパラギン酸に，それぞれ置換された配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（１１）36位のリシンがグルタミン酸に，37位のプロリンがセリンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（１２）54位のバリンがイソロイシンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換された配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（１３）54位のバリンがイソロイシンに置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含むもの；
    　（１４）620位のアルギニンがリシンに置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含むもの；及び
    　（１５）54位のバリンがイソロイシンに，620位のアルギニンがリシンに，それぞれ置換され，かつ，44位のロイシンと45位のグリシンの間にセリンが付加された配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含むもの。
  10. 　請求項９に記載の配列番号２５で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の209位のアルギニン，36位のグルタミン酸，及び37位のセリン以外において，以下の（８’－ａ）～（８’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（８’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（８’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（８’－ｃ）上記８’－ａの置換と８’－ｂと欠失を組み合わせたもの；
    　（８’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（８’－ｅ）上記８’－ａの置換と８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（８’－ｆ）上記８’－ｂの欠失と８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（８’－ｇ）上記８’－ａの置換と，８’－ｂの欠失と及び８’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（８’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  11. 　請求項９に記載の配列番号２７で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，及び45位のセリン以外において，以下の（９’－ａ）～（９’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（９’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（９’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（９’－ｃ）上記９’－ａの置換と９’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（９’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（９’－ｅ）上記９’－ａの置換と９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（９’－ｆ）上記９’－ｂの欠失と９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（９’－ｇ）上記９’－ａの置換と，９’－ｂの欠失と及び９’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（９’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  12. 　請求項９に記載の配列番号２９で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の209位のアルギニン，320位のプロリン，及び321位のアスパラギン酸以外において，以下の（１０’－ａ）～（１０’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（１０’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１０’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１０’－ｃ）上記１０’－ａの置換と１０’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１０’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１０’－ｅ）上記１０’－ａの置換と１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１０’－ｆ）上記１０’－ｂの欠失と１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１０’－ｇ）上記１０’－ａの置換と，１０’－ｂの欠失と及び１０’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１０’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  13. 　請求項９に記載の配列番号３１で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，36位のグルタミン酸，37位のセリン，及び45位のセリン以外において，以下の（１１’－ａ）～（１１’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（１１’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１１’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１１’－ｃ）上記１１’－ａの置換と１１’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１１’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１１’－ｅ）上記１１’－ａの置換と１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１１’－ｆ）上記１１’－ｂの欠失と１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１１’－ｇ）上記１１’－ａの置換と，１１’－ｂの欠失と及び１１’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１１’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  14. 　請求項９に記載の配列番号３３で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の209位のアルギニン，54位のイソロイシン，及び620位のリシン以外において，以下の（１２’－ａ）～（１２’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（１２’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１２’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１２’－ｃ）上記１２’－ａの置換と１２’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１２’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１２’－ｅ）上記１２’－ａの置換と１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１２’－ｆ）上記１２’－ｂの欠失と１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１２’－ｇ）上記１２’－ａの置換と，１２’－ｂの欠失と及び１２’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１２’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  15. 　請求項９に記載の配列番号３５で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，55位のイソロイシン，及び45位のセリン以外において，以下の（１３’－ａ）～（１３’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（１３’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１３’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１３’－ｃ）上記１３’－ａの置換と１３’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１３’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１３’－ｅ）上記１３’－ａの置換と１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１３’－ｆ）上記１３’－ｂの欠失と１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１３’－ｇ）上記１３’－ａの置換と，１３’－ｂの欠失と及び１３’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１３’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  16. 　請求項９に記載の配列番号３７で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，621位のリシン，及び45位のセリン以外において，以下の（１４’－ａ）～（１４’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（１４’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１４’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１４’－ｃ）上記１４’－ａの置換と１４’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１４’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１４’－ｅ）上記１４’－ａの置換と１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１４’－ｆ）上記１４’－ｂの欠失と１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１４’－ｇ）上記１４’－ａの置換と，１４’－ｂの欠失と及び１４’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１４’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  17. 　請求項９に記載の配列番号３９で示されるアミノ酸配列を含むhNAGLU変異体に対し，該アミノ酸配列の210位のアルギニン，55位のイソロイシン，621位のリシン，及び45位のセリン以外において，以下の（１５’－ａ）～（１５’－ｈ）からなる群から選択される変異を有するhNAGLU変異体：
    　（１５’－ａ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基で置換されたものであり，該置換されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１５’－ｂ）該アミノ酸配列を構成するアミノ酸残基が欠失されたものであり，該欠失されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１５’－ｃ）上記１５’－ａの置換と１５’－ｂの欠失を組み合わせたもの；
    　（１５’－ｄ）該アミノ酸配列中に又は該アミノ酸配列のＮ末端側若しくはＣ末端側に，１個又は複数個のアミノ酸残基が付加されたものであり，該付加されたアミノ酸残基の個数が，１～１０個であり，１～５個であり，又は１～３個であり，例えば，１個又は２個であるもの；
    　（１５’－ｅ）上記１５’－ａの置換と１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１５’－ｆ）上記１５’－ｂの欠失と１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１５’－ｇ）上記１５’－ａの置換と，１５’－ｂの欠失と及び１５’－ｄの付加を組み合わせたもの；
    　（１５’－ｈ）該アミノ酸配列と８０％以上，８５％以上，９０％以上，９５％以上の同一性，９８％以上，又は９９％の同一性を示すもの。
  18. 　請求項１～１７の何れかに記載のhNAGLU変異体をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
  19. 　請求項１８に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
  20. 　請求項１９に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
  21. 　請求項２０に記載の哺乳動物細胞を無血清培地で培養するステップを含む，hNAGLU変異体の製造方法。
  22. 　請求項１～１７の何れかに記載のhNAGLU変異体と，抗体との融合蛋白質であって，該抗体が脳血管内皮細胞上の受容体と結合することにより，該融合蛋白質が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することのできるものである，融合蛋白質。
  23. 　該脳血管内皮細胞上の受容体が，インスリン受容体，トランスフェリン受容体，レプチン受容体，リポタンパク質受容体，及びＩＧＦ受容体からなる群から選択されるものである，請求項２２に記載の融合蛋白質。
  24. 　該脳血管内皮細胞上の受容体が，トランスフェリン受容体である，請求項２２に記載の融合蛋白質。
  25. 　該抗体が，Ｆａｂ抗体，Ｆ（ａｂ’）２抗体，Ｆ（ａｂ’）抗体，単一ドメイン抗体，一本鎖抗体，又はＦｃ抗体の何れかである，請求項２２～２４の何れかに記載の融合蛋白質。
  26. 　該hNAGLU変異体が，該抗体の軽鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れかに結合しているものである，請求項２２～２５の何れか一項に記載の融合蛋白質。
  27. 　該hNAGLU変異体が，該抗体の重鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れかに結合しているものである，請求項２２～２５の何れか一項に記載の融合蛋白質。
  28. 　該hNAGLU変異体が，該抗体の軽鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れか，又は重鎖のＣ末端側若しくはＮ末端側の何れかに，リンカー配列を介して結合しているものである，請求項２２～２７の何れか一項に記載の融合蛋白質。
  29. 　該リンカー配列が，１～５０個のアミノ酸残基からなるものである，請求項２８に記載の融合蛋白質。
  30. 　該リンカー配列が，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Ser-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，配列番号５のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が１～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項２９に記載の融合蛋白質。
  31. 　請求項２２～３０の何れかに記載の融合蛋白質をコードする遺伝子を含んでなるＤＮＡ。
  32. 　請求項３１に記載のＤＮＡを含んでなる発現ベクター。
  33. 　請求項３２に記載の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞。
  34. 　請求項３３に記載の哺乳動物細胞を無血清培地で培養するステップを含む，hNAGLU変異体と抗体との融合蛋白質の製造方法。
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