JP2007536933A - 抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2004年5月10日付で提出された、米国仮特許出願第60/569,892号の優先権を主張し、当該仮出願は参考によって完全に本明細書中に引用される。
非常に攻撃的なT細胞は、しばしば、望ましくない免疫反応を引き起こし、これにより、様々な疾患、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶反応、アレルギー疾患、及びT細胞誘発癌を引き起こす。したがって、攻撃的なT細胞の制御はこのような疾患を治療するのに重要である。これらの細胞の活性は、免疫抑制によってまたは免疫寛容の誘導によって封じられうる。別の解決方法としては、アポプトシスの誘導があり、これは、非常に攻撃的なT細胞などの、望ましくない細胞を除去するのに係わりがあると考えられている。例えば、Kabelitz et al.(1993) Immunol Today 14,338−340;およびRaff(1992) Nature 356,397−399を参照。
本発明は、活性化T細胞のP−セレクチン糖タンパク質リガンド−1(PSGL−1)に結合するとアポプトシスを誘導する抗体およびその誘導体に関する。
本発明は、少なくとも一部は、活性化T細胞のPSGL−1に抗体またはその誘導体を結合させることによって、活性化T細胞のアポプトシスを誘導でき、さらに活性化T細胞を枯渇させることができるという予想できない発見に基づくものである。上記抗体及びその誘導体は、過剰のもしくは望ましくないT細胞が仲介する免疫応答またはT細胞の増殖に関連する症状を治療するのに有用である。
抗PSGL−1抗体の生成
標準的な技術を用いて、ヒトPSGL−1(hCD162)に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を得た。より詳細には、マウスを、PHA−活性化ヒトT細胞の膜画分で免疫処置し、剖検して、ハイブリドーマ細胞系を得た。得られたハイブリドーマ細胞系の上清を、安定してhCD162を発現するCHO細胞への結合性についてスクリーニングした。hCD162を発現するCHO細胞に結合するが親のCHO細胞には結合しない抗体を生産する細胞系を同定し、サブクローニングし、さらに下記のようにして分析した。
ヒトCD162でのマウス15A7、43B6、及び9179の結合エピトープのマッピングを行なうために、ヒトCD162の様々な領域を包含する一連の融合タンパク質を発現させ、精製した。融合タンパク質とこれらのモノクローナル抗体との相互作用を、サンドイッチ酵素免疫吸着測定法(ELISA)によって試験した。
抗CD162抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のクローニング
抗体15A7、43B6、及び9F9の軽鎖及び重鎖可変領域(VL及びVH)をコード化するcDNAを、アンカーPCR法(anchored PCR method)によって増幅した。3’プライマーはC領域とハイブリッド形成し、5’プライマーはターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いてcDNAに結合したGテールとハイブリッド形成した。PCRフラグメントをpCRIIベクター(Invitrogen)にクローニングした。各鎖について幾つかの独立したクローンの配列を決定し、比較した。大部分の独立したクローンに代表される配列を選択した。次に、翻訳アミノ酸配列を分析し、所定の配列が具体的なマウス軽鎖または重鎖V領域の特性を有し、特定のサブタイプに属することを確認した。さらに、翻訳アミノ酸配列を各サブタイプの共通配列と比較することによって、相補性決定領域(CDR)を同定した。使用される各プライマーの名前及び配列を上記表2及び3に列挙する。15A7、43B6、及び9F9の軽鎖及び重鎖V領域の推定アミノ酸配列(配列番号:19〜24)を要約して示す。
キメラ抗体を発現させるためのベクターを得るために、15A7、43B6、及び9F9のVL及びVH領域をコード化するcDNAを、5’シグナルペプチド配列及び3’スプライスドナーシグナルを含むようにプライマーを用いてPCRによって増幅した。上記プライマーはまた、PCR産物の両末端にXbaI部位が導入されており、さらにこれをXbaI酵素で切断し、XbaIで消化したpVk、pVg1、pVg2、またはpVg4ベクターにライゲートした。より詳細には、15A7、43B6、及び9F9のVL領域cDNAを、プラスミドpVkにサブクローニングした。このプラスミドは、CMVプラスミド、及びヒト軽鎖定常領域をコード化した配列を含んでいた。15A7、43B6及び9F9のVH領域cDNAを、プラスミドpVg1、pVg2、またはpVg4にサブクローニングした。上記3つのプラスミドは、それぞれ、CMVプロモーターを有していた。これらはまた、それぞれ、IgG1、IgG2、及びIgG4のヒト重鎖定常領域を含んでいた。
マウス15A7を用いて、ヒトのフレームワークにCDRをグラフトすることによってヒト化抗体を作製した。結合親和性及び特異性を保持するために、CDRをヒトのフレームワークにグラフトする際にV領域の構造を保存することが重要である。適当なフレームワークドナーを選択するために、マウス15A7軽鎖及び重鎖V領域のアミノ酸配列を、予めヒト化された50個のマウス抗体のアミノ酸配列と比較した。
ヒト化及びキメラ抗体を産生する細胞を得た。より詳細には、Sp2/0細胞(Sp2/0−Agl4;ATCC CRL 1581)を、製造社の指示に従って、360V及び25μFのキャパシタンスでGene Pulser装置(Gene Pulser apparatus)(Bio-Rad Laboratories)を用いたエレクトロポレーションによって適当なプラスミドを安定してトランスフェクトした。トランスフェクション前に、プラスミドを、BamHI酵素で消化することによって線状にした。すべてのトランスフェクションは、PBS中で107細胞及び20μgの各プラスミドDNAを用いて行なった。各トランスフェクションから得られた細胞を96ウェル組織培養プレートに播種した。48時間後、選択培地(DMEM 10% FBS/ヒポキサンチン/チミジン媒体補足)及び1μg/mlミコフェノール酸を適用した。抗体を産生する細胞を、ELISAによって培養上清中の抗体の存在を調べることによってスクリーニング、単離した。
上記マウス、キメラ、及びヒト化15A7抗体の結合親和性を、競合的結合によって測定した。
競合分析を行なって、上記3種のマウス抗体、PSGL−1、及びP−セレクチンのうちの相互作用を研究した。
マウスPSGL−1に対するモノクローナル抗体である、TAB4を、実施例1に記載した方法と同様にして調製した。これは、インビトロでT細胞のアポプトシスを誘導し、インビボでT細胞を枯渇した。マウスPSGL−1とマウスP−セレクチンとの結合を妨げるか否かを決定するために、競合分析を実施例2に記載した方法と同様にして行なった。TAB4は、20μg/mlという高濃度でもマウスPSGL−1へのマウスP−セレクチンの結合を阻害しないことが分かった。
ヒトPSGL−1に対するモノクローナル抗体 4B7、5C4、12E7、14B3、17E5、及び18D12の特徴をさらに明らかにした。活性化T細胞に結合すると、これらはすべて、活性化T細胞の死を誘導した。PSGL−1とP−セレクチンとの相互作用を遮断するか否かを決定するために、競合分析を実施例2に記載した方法と同様にして行なった。これらの抗体は、最も高い試験濃度(5μg/ml)でも、ヒトPSGL−1へのヒトP−セレクチンの結合に阻害作用を、示したとしても、ほとんど示さないことが分かった。
本明細書に開示された態様はすべて、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示された各態様は、同じ、等価の、または同様の目的を果たす別の態様に置換されてもよい。ゆえに、特記しない限り、開示された各態様は包括的な等価のあるいは同様の態様群の一例に過ぎない。
Claims (40)
- それぞれ、配列番号:1〜3、配列番号:4〜6、配列番号:7〜9、配列番号:10〜12、配列番号:13〜15、または配列番号:16〜18を有する免疫グロブリン鎖。
- 前記免疫グロブリン鎖は、配列番号:1〜3または配列番号:4〜6を有する、請求項1に記載の免疫グロブリン鎖。
- 前記免疫グロブリン鎖は、配列番号:19、20、21、22、23、24、25、または26を有する、請求項1に記載の免疫グロブリン鎖。
- 免疫グロブリン鎖は、配列番号:25または26を有する、請求項3に記載の免疫グロブリン鎖。
- 請求項1に記載の第一の免疫グロブリン鎖および請求項1に記載の第二の免疫グロブリン鎖を有し、軽鎖である、前記第一の鎖、および重鎖である、前記第二の鎖は、それぞれ、配列番号:1〜3及び配列番号:4〜6;配列番号:7〜9及び配列番号:10〜12;または配列番号:13〜15及び配列番号:16〜18を含む、抗体。
- 前記軽鎖および重鎖は、それぞれ、配列番号:1〜3および配列番号:4〜6を含む、請求項5に記載の抗体。
- 前記軽鎖および重鎖は、それぞれ、配列番号:19及び20、21及び22、23及び24、または25及び26を含む、請求項5に記載の抗体。
- 前記軽鎖および重鎖は、それぞれ、配列番号:25及び26を含む、請求項7に記載の抗体。
- 活性化T細胞のP−セレクチン糖タンパク質リガンド1に結合すると、活性化T細胞の死を誘導する、P−セレクチン糖タンパク質リガンド1とP−セレクチンとの結合を妨げることなくP−セレクチン糖タンパク質リガンド1に特異的に結合する抗体。
- 前記抗体は、ヒトP−セレクチン糖タンパク質リガンド1に結合する、請求項9に記載の抗体。
- 前記抗体は、それぞれ、配列番号:1〜3及び配列番号:4〜6を含む軽鎖及び重鎖を含む、請求項9に記載の抗体。
- 前記軽鎖および重鎖は、それぞれ、配列番号:25及び26を含む、請求項10に記載の抗体。
- ヒトP−セレクチン糖タンパク質リガンド1の115〜126番目のアミノ酸残基に特異的に結合する抗体。
- 前記抗体は、117〜123番目のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項13に記載の抗体。
- 前記抗体は、119〜121番目のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項14に記載の抗体。
- 前記抗体は、それぞれ、配列番号:1〜3及び配列番号:4〜6を含む軽鎖及び重鎖を含む、請求項13に記載の抗体。
- 前記抗体は、活性化T細胞のP−セレクチン糖タンパク質リガンド1に結合すると、活性化T細胞の死を誘導する、請求項13に記載の抗体。
- 前記軽鎖及び重鎖は、それぞれ、配列番号:1〜3及び配列番号:4〜6を含む、請求項17に記載の抗体。
- 請求項8に記載の抗体を活性化T細胞と接触させることを有し、前記抗体の活性化T細胞への結合によって、活性化T細胞の死が誘導される、活性化T細胞の死の誘導方法。
- 請求項9に記載の抗体を活性化T細胞と接触させることを有し、前記抗体の活性化T細胞への結合によって、活性化T細胞の死が誘導される、活性化T細胞の死の誘導方法。
- 請求項13に記載の抗体を活性化T細胞と接触させることを有し、前記抗体の活性化T細胞への結合によって、活性化T細胞の死が誘導される、活性化T細胞の死の誘導方法。
- 過剰のT細胞が仲介する免疫応答に関連する症状を有するまたは前記症状を有する危険性のある患者を同定し、
前記患者に有効量の請求項8に記載の抗体を投与することを有する、
患者のT細胞が仲介する免疫応答の調節方法。 - 前記症状は、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、またはT細胞癌である、請求項22に記載の方法。
- 前記患者は、同種もしくは異種移植を受けたまたは同種もしくは異種移植を受ける予定がある、請求項23に記載の方法。
- 過剰のT細胞が仲介する免疫応答に関連する症状を有するまたは前記症状を有する危険性のある患者を同定し、
前記患者に有効量の請求項9に記載の抗体を投与することを有する、
患者のT細胞が仲介する免疫応答の調節方法。 - 前記症状は、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、またはT細胞癌である、請求項25に記載の方法。
- 前記患者は、同種もしくは異種移植を受けたまたは同種もしくは異種移植を受ける予定がある、請求項26に記載の方法。
- 過剰のT細胞が仲介する免疫応答に関連する症状を有するまたは前記症状を有する危険性のある患者を同定し、
前記患者に有効量の請求項13に記載の抗体を投与することを有する、
患者のT細胞が仲介する免疫応答の調節方法。 - 前記症状は、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、またはT細胞癌である、請求項28に記載の方法。
- 前記患者は、同種もしくは異種移植を受けたまたは同種もしくは異種移植を受ける予定がある、請求項29に記載の方法。
- 請求項1に記載の免疫グロブリン鎖をコード化する配列を有する単離された核酸。
- 請求項3に記載の免疫グロブリン鎖をコード化する配列を有する単離された核酸。
- 請求項31に記載の核酸を有するベクター。
- 請求項32に記載の核酸を有するベクター。
- 配列番号:1〜3、配列番号:4〜6、配列番号:7〜9、配列番号:10〜12、配列番号:13〜15、または配列番号:16〜18をコード化する核酸を有する宿主細胞。
- 前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項35に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ細胞である、請求項36に記載の宿主細胞。
- 配列番号:19、20、21、22、23、24、25、または26をコード化する核酸を有する宿主細胞。
- 前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項38に記載の宿主細胞。
- 前記哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ細胞である、請求項39に記載の宿主細胞。
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