TWI402274B - 抗psgl-1之抗體 - Google Patents

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TWI402274B
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Description

抗PSGL-1之抗體
本發明係關於多種藉著與一已活化T細胞上之P型選擇素醣蛋白配位體-1(P-Selectin Glycoprotein Ligand-1，PSGL-1)結合，而誘導細胞凋亡作用(apoptosis)的抗體及其衍生物。
過度侵略性的T細胞經常導致不想要的免疫反應，進而造成諸如自體免疫、移植排斥、過敏與衍生自T細胞之癌症等各種疾病。因此，治療上述疾病的關鍵在於控制該些侵略性T細胞。可藉著免疫抑制或誘導免疫耐受力來控制該些細胞的活性。另一種控制侵略性T細胞活性的方法則是誘導細胞走向細胞凋亡。細胞凋亡被認為涉及包括移除過度侵略性T細胞等不想要之細胞的過程(可參考如Kabelitz et al.(1993)Immunol Today 14,338-340以及Raff(1992)Nature 356,397-399等文獻)。
本發明係關於能藉著與一已活化T細胞上之P型選擇素醣蛋白配位體-1結合，而誘導細胞凋亡的多種抗體及其衍生物。
本發明一樣態之特徵在於一種具有三段序列的免疫球蛋白鏈，該三段序列係(i)分別包含RSSQSIVHNDGNTYFE、 KVSNRFS與FQGSYVPLT(序列編號：1-3)；(ii)分別包含SFGMH、YINGGSSTIFYANAVKG與YASYGGGAMDY(序列編號：4-6)；(iii)分別包含RASSTVNSTYLH、GSSNLAS與QQYSGYPLT(序列編號：7-9)；(iv)分別包含AYYIH、VNPNTGGTSYNPKFKG與SGSPYYRYDD(序列編號：10-12)；(v)分別包含RSSQSIVNSNGNTYLE、KVSNRFS與FQGSHVPWT(序列編號：13-15)；或(vi)分別包含TNAMNWVRQAPGKGLE、TYYADSVKD與GSSYWYFDV(序列編號：16-18)。
上述六組序列對應於諸如下述15A7、43B6與9F9小鼠抗體等可與P型選擇素醣蛋白配位體-1結合之抗體的三個輕鏈或重鏈互補性決定區(CDRs)。下列序列(序列編號：19-26)係上述三株抗體之輕鏈變異區(variable(V)region)與重鏈變異區，且序列中標示底線與網底的部分為互補性決定區。
序列編號：19(小鼠15A7輕鏈變異區)：
序列編號：20(小鼠15A7重鏈變異區)：
序列編號：21(小鼠43B6輕鏈變異區)：
序列編號：22(小鼠43B6重鏈變異區)：
序列編號：23(小鼠9F9輕鏈變異區)：
序列編號：24(小鼠9F9重鏈變異區)：
若一抗體與抗原結合的專一性取決於該抗體之輕鏈與重鏈上的互補性決定區，則上述互補性決定區便可用來產生可保留住該抗體之結合專一性的抗體衍生物。示範之抗體衍生物包括嵌合抗體(chimeric antibodies)、擬人化抗體(humanized antibodies)及其功能均等物。下列顯示15A7擬人化抗體之輕鏈變異區(序列編號：25)與重鏈變異區(序列編號：26)，該輕鏈與重鏈變異區分別包含序列編號1-3與序列編號4-6之序列。
序列編號：25(擬人化15A7輕鏈變異區)：
序列編號：26(擬人化15A7重鏈變異區)：
本發明之特徵亦在於一種序列上編碼有上述免疫球蛋白鏈的已分離核酸。「抗體(antibody)」或「免疫球蛋白鏈(immunoglobulin chain)」一詞係指一已分離聚胜肽，即，從其他自然結合之蛋白質、脂質及核酸中實質分離出來的一聚胜肽。純化出來的產物中，該聚胜肽之乾重純度至少達到50%、70%或95%。「已分離核酸(isolated nucleic acid)」係指一種核酸，其結構與任意天然核酸或天然基因體核酸斷片不同。因此，該用詞涵蓋諸如：(a)一種序列上具有一天然基因體DNA分子之部分斷片的核酸，但並非夾在原天然有機生物體基因體內該天然基因體DNA分子之部分序列兩端的兩個編碼序列中間；(b)一種整合至一載體或一原核或真核生物之基因體DNA中的核酸，使得所產生之分子不同於任何天然載體或天然基因體DNA；(c)一種諸如一cDNA、一基因體斷片、一利用聚合酶鏈鎖反應所得之斷片或一限制酶剪切斷片(restriction fragment)之類的分離分子；以及(d)一重組核苷酸序列，其係一混合基因的一部分，即是，序列上編碼著一融合蛋白的基因。本發明之核酸能用來表現一本發明之聚胜肽。為達上述目的，可將該核酸可操作性地連接至一適當的調控序列(regulatory sequence)，以產生一表現載體。
一「載體(vector)」係指一種能運送與之相連接的其他核酸，並能自行複製或整合至一宿主DNA中的核酸分子。所示範之載體包括一質體(plasmid)、黏接質體(cosmid)與病毒載體(viral vector)。本發明之載體包括其型態適合於 一宿主細胞中表現一核酸序列的核酸分子。較佳者，該載體包含一個或多個可操作性地連接至欲表現之核酸序列上的調控序列(regulatory sequences)。示範之調控序列包括啟動子(promoter)、促進子(enhancer)及諸如多聚腺嘌呤訊息(polyadenylation signal)等其他表現控制區。調控序列亦包括該些能引導一核苷酸序列進行組成性表現(constitutive expression)的序列，例如組織特異性調控序列(tissue-specific regulatory sequences)或誘導性序列(inducible sequences)。可根據所選擇之欲轉型(transform)的宿主細胞及欲達到的表現量來設計該些表現載體。可將一表現載體送入一宿主細胞中以製造一本發明之聚胜肽。本發明亦包括一種包含上述核酸的宿主細胞。一「宿主細胞(host cell)」係指含有一外源編碼序列(exogenous coding sequence)或外源之非編碼序列(non-coding sequence)的細胞。可利用諸如磷酸鈣轉染法(calcium phosphate transfection)、DEAE-葡萄聚醣介導轉染法(DEAE-Dextran mediated transfection)或電穿孔法(electroporation)將一外源序列送入細胞中。適當的宿主細胞包括諸如大腸桿菌(E.coli)、括草桿菌(Bacillus subtilis)與沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)等細菌細胞、諸如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)與裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)等酵母細胞、諸如菸草(Nicotiana tabacum)與棉花(Gossypium hirsutum)等植物細胞、與諸如大鼠融合瘤細胞株(murine hybridoma cells)、 CHO細胞株與3T3纖維母細胞株(3T3 fibroblasts)。
可於允許表現出上述核酸序列上所編碼之聚胜肽的條件下，將一宿主細胞培養於培養液中，並從該培養液中分離出所表現的聚胜肽，以製造本發明之免疫球蛋白鏈。或可使用諸如T7啟動子調控序列與T7聚合酶，以對本發明之核酸進行活體外轉錄及轉譯作用。
本發明範圍涵蓋一種抗體。該抗體係由一第一免疫球蛋白鏈與一第二免疫球蛋白鏈所構成，該第一與第二免疫球蛋白鏈分別包含上述15A7、43B6或9F9小鼠抗體之輕鏈互補性決定區(CDRs)與重鏈互補性決定區。較佳者，此抗體係由15A7抗體之輕鏈與重鏈所構成。
本發明範圍亦涵蓋其他抗體，包括：(1)在不干擾P型選擇素醣蛋白配位體-1與P型選擇素間之結合作用之情況下，能專一性結合至P型選擇素醣蛋白配位體-1的抗體；以及(ii)可藉著專一性結合至一已活化T細胞上之P型選擇素醣蛋白配位體-1，而誘導該T細胞死亡的抗體。在一實施例中，此抗體可專一性地結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1。
本發明範圍更涵蓋該些可專一性結合至成熟的人類P型選擇素醣蛋白配位體-1之第115-126個胺基酸殘基的抗體。較佳者係該抗體可專一性結合至第117-123個胺基酸殘基。特別是，該抗體能專一性結合至第119-121個胺基酸殘基，第119-121個胺基酸殘基為存在於所有經測試之抗原決定區或抗原表位(epitope)中的保留序列(consensus sequence)。若將這三個胺基酸殘基中的其中一個或多個殘基進行突變，確實會使該些抗體失去其結合能力。在一實施例中，此抗體可藉著與一已活化T細胞上的P型選擇素醣蛋白配位體-1結合，而誘導該已活化T細胞死亡。
在一實施例中，方才提及之兩抗體中的其中一者係由分別含有序列編號1-3與序列編號4-6的輕鏈與重鏈所形成，例如，該輕鏈與重鏈分別包含序列編號19與20或序列編號25與26之序列。
本發明又一態樣之特徵在於一種誘導一已活化T細胞之死亡的方法。該方法包括使上述三種抗體之其中一者與一已活化T細胞接觸，而該抗體與該已活化T細胞的結合作用會誘導細胞死亡。
本發明之特徵亦在於一種調控一個體體內之T細胞介導免疫反應的方法。該方法包括：(1)鑑定出已罹患或極可能罹患一過度T細胞介導免疫反應相關疾病的個體，以及(2)對該個體施用一有效劑量之上述三種抗體中的其中一者。「過度T細胞介導免疫反應(excessive T cell-mediated immune response)」係指一種因已活化T細胞過量所造成的反應。「過量(excessive level)」係指一個體體內：(1)已活化T細胞量高於正常量；以及(2)雖然已活化T細胞量並未高於正常數量，但卻高於想要的數量。上述疾病包括發炎疾病、自體免疫疾病、過敏疾病或T細胞癌症，以及一個體已接受或欲接受同種異體或異種異體移植所發生的諸多症狀。
本發明之一或多個實施例係詳述於下。根據下列詳述內容將可輕易明白本發明之其他特徵、目的及優點。
本發明係基於或至少部分基於該已活化T細胞經誘導後可走向細胞凋亡途徑並，以及可藉著抗體或其衍生物與該已活化細胞上之P型選擇素醣蛋白配位體-1的結合來耗盡該已活化T細胞之數量等不可預期之發現所作成。該些抗體及其衍生物可能用來治療與過度或不想要之T細胞介導免疫反應或T細胞增殖有關之疾病。
因此，本發明之特徵在於多種序列上包含抗-P型選擇素醣蛋白配位體-1抗體之免疫球蛋白輕鏈與重鏈互補性決定區之聚胜肽，以及包含該些序列上編碼有上述聚胜肽的核酸。上述免疫球蛋白鏈與核酸可能用來製造上述抗體及其衍生物。
可藉著諸如合成聚胜肽或一重組聚胜肽來獲得本發明之一免疫球蛋白鏈。亦可將序列上編碼有上一重組聚胜肽之核酸與另一個序列上編碼有其融合夥伴(fusion partner)的核酸相連接已製備出一重組聚胜肽，該融合夥伴係如麩胱甘肽轉移酶(麩胱甘肽轉移酶，GST)、6組織胺酸表位幟(6x-His epitope tag)、M13基因3蛋白(M13 Gene 3 protein)或一免疫球蛋白重鏈恆定區(immunoglobulin heavy chain constant region)。
可將所產生的融合核酸送入一細胞中以表現蛋白。隨 後可藉著習知方法自宿主細胞中分離出該融合蛋白。並可更進一步處理該些融合蛋白，例如可利用酵素剪切方法來移除該融合部分，而得到所需要的重組聚胜肽。
或可藉著活化一序列上編碼著一免疫球蛋白鏈之核酸的內生性表現作用，而得以從一適當宿主細胞中獲得該一免疫球蛋白鏈。
可在不破壞本發明免疫球蛋白鏈形成一對P型選擇素醣蛋白配位體-1具有結合能力之抗體的前提下，對本發明隻免疫球蛋白鏈之胺基酸組成進行改變。例如，此種變異體(variant)可包含一個或多個同類胺基酸置換。「同類胺基酸置換(conservative amino acid substitution)」係指原胺基酸殘基被一個具有類似支鏈(side chain)的胺基酸殘基所取代。習知領域中，係已定義出各個具有類似支鏈之胺基酸殘基家族。該些家族包括：諸如離胺酸、魚精胺酸、組織胺酸等具有鹼性支鏈的胺基酸；諸如天門冬胺酸、麩胺酸等具有酸性支鏈的胺基酸；諸如甘胺酸、天門冬醯酸、麩胺酸醯胺、絲胺酸、息寧胺酸、酪胺酸、半胱胺酸等具有不帶電荷之極性支鏈的胺基酸；諸如胺基丙酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸等具有非極性支鏈的胺基酸；諸如息寧胺酸、纈胺酸、異白胺酸等具有β-分枝支鏈的胺基酸；以及諸如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組織胺酸等具有芳香性支鏈的胺基酸。因此，較佳係使用同一支鏈家族中的其他胺基酸殘基來取代一聚胜肽中預定改變的非必須胺基酸殘基。或可藉著諸 如飽和突變法(saturation mutagenesis)，而在整個或部分之本發明聚胜肽中隨機產生突變，並根據所產生之突變種形成可與P型選擇素醣蛋白配位體-1結合之抗體的能力來篩選該些突變種，以鑑定出諸如以下實施例中所述的變異種。因此，舉例來說，「包含序列編號19之免疫球蛋白鏈(an immunoglobulin chain containing SEQ ID NO：19)」一詞係涵蓋該些包含序列編號19之變異種的免疫球蛋白鏈。
上述免疫球蛋白鏈與變異體(variants)可用來製造本發明之抗體或其衍生物。「抗體(antibody)」包括完整分子以及諸如Fab、F(ab')2、Fv、scFv(單鏈抗體，single chain antibody)與dAb(domain antibody；Ward,et.al.(1989)Nature,341,544)等分子斷片。一抗體之衍生物係指具有本發明之一聚胜肽變異體的一蛋白或一蛋白複合體。可如下述實施例所敘述般，藉著在一適當宿主細胞中共同表現(co-expressing)含有相對應之輕鏈與重鏈互補性決定區的聚胜肽，以製造出本發明之抗體或其衍生物。或可利用製造單株抗體或多株抗體及其斷片等習知方法來製造本發明之抗體或其衍生物(可參考文獻如Harlow and Lane,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。
可將P型選擇素醣蛋白配位體-1或其抗原斷片與諸如透孔螺血氰蛋白(KLH)等載體蛋白(carrier protein)結合，並與一佐劑混合後注射至一宿主動物體內，以製造本發明之抗體。隨後可利用親和管注層析法來純化該動物體內產 生的抗體。常用之宿主動物包括兔子、小鼠、天竺鼠與大鼠。可根據宿主的種類來使用能提高免疫反應的各式佐劑，其包括弗氏佐劑(Freund’s adjuvant，包括完全佐劑與不完全佐劑)、諸如氫氧化鋁等礦物膠、諸如溶血卵磷酯(lysolecithin)、普羅尼多元醇(pluronic polyols)、陰離子多聚物(polyanions)、胜肽(peptides)、油乳化物(oil emulsions)、透孔螺血氰蛋白(keyhle limpet hemocyanin)及二硝基酚(dinitrophenol)等界面活性劑。用於人類的佐劑包括卡介苗(BCG，bacille Calmette-Guerin)與短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。
多株抗體(多種異株抗體分子)會出現於經免疫處理後之動物的血清中。而單株抗體(針對一特定抗原所產生的同株抗體)則可利用標準融合瘤技術來製備之(例如，Kohler et al.,1975,Nature 256,495；Kohler et al.,1976,Eur J Immunol 6,511；Kohler et al.,1976,Eur J Immunol 6,292；以及Hammerling et al.,1981,Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elservier,N.Y.)。特別是，亦可以任何能製備抗體分子之技術來製備上述單株抗體，例如Kohler等人於Nature期刊第256期第495頁與美國專利案4,376,110號中所敘述之連續細胞株培養方法、人類B細胞融合瘤技術(Kosbor er al.,1983,Immunol Today 4：72；Cole et al.,1983,Proc Natl Acad Sci USA 80：2026)以及EBV-融合瘤技術(Cole et al.,1983, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。上述抗體可以是各種類的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD與任一種亞型抗體。用來製造本發明之單株抗體的融合瘤可以體內或體外方式培養之。且由於體內培養方式可製造出較高力價(titer)的單株抗體，故對於抗體之製造來說是極為有用的一種方法。
此外，還可利用該些用來製造「嵌合抗體(chimeric antibodies)」的技術來製造抗體(參考Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger et al.(1984)Nature 312,604；and Takeda et al.(1984)Nature 314,452)。一嵌合抗體係指一分子中具有不同部分，該些部分係來自於不同動物種類，例如一分子中具有來自於大鼠單株抗體的變異區以及人類免疫球蛋白恆定區。或可利用上述用來製造單鏈抗體之技術(美國專利案4,946,778與4,704,692號)來製造一單鏈Fv抗體噬菌體庫。單鏈抗體係將透過一胺基酸橋鏈連接該Fv區域之重鏈與輕鏈斷片所形成。此外，可利用習知技術來產生抗體斷片。例如，此類斷片包括經過胃蛋白酶分解抗體分子後所產生之F(ab')2斷片，以及還原F(ab')2斷片之雙硫鍵後所產生的Fab斷片，但不僅限於此。還可利用下方範例中所敘述之習知方法將抗體擬人化。例如，可大量地將具有想要之結合專一性的單株抗體進行擬人化(Scotgene,Scotland；and Oxford Molecular,Palo Alto,Calif.)。諸如該些表現於基 因轉植動物體內的完全擬人化抗體亦為本發明所涵蓋(參考文獻如Green et al.(1994)Nature Genetics 7,13；and U.S.Patent Nos.5,545,806 and 5,569,825)。
本發明範圍亦涵蓋一種藉著諸如於體外使已活化T細胞與一本發明之抗體接觸，以及提供有需要之個體一有效劑量之該抗體等方式，來誘導已活化T細胞之死亡的方法。欲接受治療之個體可能為該些患有或極可能罹患一過度或不想要之T細胞介導免疫反應相關疾病者，例如受到自體免疫疾病、移植排斥、過敏疾病或T細胞衍生癌症所困擾的病人。此方法可單獨施行或與其他藥物或治療合併施行。
「治療(treating)」一詞係定義為提供一個體一組合物，以達到治癒、舒緩、減輕、醫治、預防或緩和一疾病、一疾病之症狀、一疾病之次要病症或罹患該疾病之傾向的目的。「有效劑量(effective amount)」係指能在接受治療之個體體內產生諸如上述想要之醫學結果的一組合物劑量。
欲治療之疾病範例包括糖尿病、關節炎(包括類風濕性關節炎、幼年型類風濕性關節炎、退化性關節炎與乾癬性關節炎)、多發性硬化症、脊髓炎、重症肌無力、全身紅斑性狼瘡、自體免疫性甲狀腺炎、皮膚炎(包括異位性皮膚炎與濕疹性皮膚炎)、乾癬、修格蘭氏症(Sjöhren’s Syndrome)、克隆氏症(Crohn’s disease)、口腔潰瘍、結膜炎、角膜結膜炎、第一型糖尿病、發炎性腸道疾病、潰瘍 性結腸炎、氣喘、過敏性氣喘、皮膚性紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥物疹、痲瘋逆行反應、痲瘋結節性紅斑、自體免疫性葡萄膜炎、過敏性脊髓炎、急性壞死出血腦炎、原發性雙邊漸進式感知聽力喪失、再生不良性貧血、純粹性紅血球貧血、原發性血小板減少、多發性軟骨炎、偉格納氏肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、慢性活動性肝炎、史提夫-強生氏症(Stevens-Johnson syndrome)、原發性熱帶口瘡、扁平苔癬、格雷氏症(Geave’s disease)、類肉瘤病、原發性膽汁性肝硬化、後部葡萄膜炎、間質性肺纖維化、移植物對抗宿主疾病、諸如骨髓移植、肝臟移植或任何器官或組織等移植手術(包括使用同源組織或異源組織進行移植)、諸如異位性過敏等過敏症、愛滋病與諸如白血病或淋巴瘤等T細胞癌症。
在一活體內方法中，可對該個體施用一治療組合物，例如含有本發明一抗體之組合物。通常該抗體係懸浮於諸如生理食鹽水等藥學可接受載劑中，並藉由口服、靜脈滴注或經皮下、肌肉內、椎管內、腹腔內、直腸內、陰道內、鼻腔內、胃內、氣管內或肺內注射或植入等方式用藥。
所需劑量需視選擇之用藥途徑、配方性質、個體病況之性質、個體之身材大小、體重、表面積、年齡與性別、服用之其他藥物以及主治醫生之判斷等因素來決定。適當的劑量範圍約介於0.01-100.0毫克/公斤(mg/kg)之間。需可根據使用之組合物的種類與各種用藥途徑之效率的不同 來預測所需劑量之變化。例如，口服用藥之劑量可能高於靜脈滴注之劑量。可根據此領域中所熟悉用來最適化劑量之標準實驗常規來調整該些劑量範圍。將該組合物囊裝於諸如聚合物微粒子或植入性裝置等適當遞送媒介中，特別是對於口服用藥而言，可提高遞送藥物的效率。
本發明範圍亦涵蓋一種藥學組合物，其包含一藥學可接受載劑與一有效劑量之本發明抗體。該藥學組合物可用來治療上述疾病。該藥學可接受載劑包括一溶劑、一分散介質、一包覆膜、一抗細菌或抗真菌劑以及一等滲透壓與吸收延緩劑。
可藉著傳統方法將本發明之藥學組合物配製成適用於各種用藥途徑的劑型。例如該藥學組合物可製成用於口服的一膠囊、一軟膠囊或一錠劑。膠囊中可含有諸如明膠或纖維素等任一種藥學可接受物質。並可藉著壓製該組合物與一固態載劑及一潤滑劑之混合物等傳統程序，而將該組合物製備成錠劑。示範之固態載劑包括澱粉與榶類膨潤土。該組合物亦可製成含有諸如乳糖、甘露醇、一傳統填充劑與一打錠劑等結合劑(binder)的硬殼錠或膠囊以供用藥。可經由非腸胃途徑來使用該藥學組合物。示範之非腸胃劑型包括含活性藥劑之水溶液、等滲透壓食鹽水或5%葡萄糖溶液，亦或其他習知的藥學上可接受輔劑。習知技藝者所熟知的環糊精或其他可溶性藥劑亦可作為遞送治療藥物的藥學輔劑。
本發明組合物的效用可藉由諸如下述範例等體內或體 外方法來加以評估。簡單而言，可偵測該組合物於體內誘導已活化T細胞之死亡的能力。對於體內研究來說，可將該組合物注射至諸如小鼠等動物體內，而達到其治療效果。並根據該實驗結果來決定適當之劑量範圍與用藥途徑。
下述特定實施例僅作示範之用，並不能限制本揭露內容在各方面上的其他用途。無須更多的其他描述，所屬領域之習知技藝者可根據此處之敘述內容而將本發明作最大範圍之應用。文中引用之公開文獻均於此處全文納入參考。
第1實施例：小鼠單株抗體15A7、43B6與9F9
產生抗-PSGL-1抗體
可使用標準技術來產生能專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1(hCD162)的小鼠單株抗體。更進一步說明係使用經PHA活化之人類T細胞的細胞膜組成物使小鼠產生免疫反應，並犧牲該小鼠以製備融合瘤細胞株(hybridoma cell lines)。根據所產生之融合瘤細胞的培養上清液是否可與穩定表現hCD162之CHO細胞株結合來篩選該些融合瘤細胞株。鑑定及選殖出該些製造出能與表現hCD162之CHO細胞結合，但無法與母代CHO細胞株結合之抗體的融合瘤細胞株，並根據下述方法來分析之。
所鑑定出的細胞株為m152-15A7、m166-43B6與m128-9F9。且該些細胞株所產生出的免疫球蛋白G1抗體分別為15A7、43B6與9F9抗體。免疫墨點分析結果顯示出，此三種抗體可從已活化T細胞之溶胞液中抓取出一蛋白分 子，且該蛋白分子可被抗-hCD162抗體(kpl-1，PharMingen,San Diego,CA)所辨識。
接著，測試方才所述之三種抗體誘導已活化T細胞之凋亡的能力。將含有上述三株融合瘤細胞株所分泌出之抗體的培養上清液分別與未活化人類T細胞抗體(第0天)或於體外活化之人類T細胞(第7天)作用6小時。隨後以膜聯蛋白V(annexin V)對該些細胞進行染色，並以流式細胞儀(FACS)分析之。流式細胞儀將會攔阻該些呈現CD3陽性的細胞，以計算體外活化人類T細胞或是處於休止狀態的人類T細胞。而凋亡的細胞將呈現膜聯蛋白V染色陽性反應。表一係整理所有掃描細胞中的T細胞凋亡百分比。
這些結果係顯示15A7、43B6與9F9小鼠抗體為：(1)對hCD162具有專一性，以及；(2)可結合至人類已活化T細胞上並誘導該已活化T細胞之凋亡，但卻無法誘導處於休止期之人類T細胞走向細胞凋亡。
亦對經PHA活化之人類週邊血液單核細胞(PBMC)進行細胞凋亡分析試驗。實驗結果發現，該些抗體僅能誘導已活化T細胞之凋亡，卻無法誘導休止期之T細胞、B細胞或中性球的凋亡。
目前已知諸如抗CD3抗體等T細胞耗盡抗體(T cell-depleting antibodies)能誘導一些可溶性因子的產生。力用此類抗體進行治療通常會產生有害的細胞激素症狀(deleterious cytokine syndrom)。因此，將剛分離出來的新鮮人類週邊血液單核細胞與15A7抗體共同培養24、48或72小時，以測試抗-P型選擇素醣蛋白配位體-1抗體是否也會造成與細胞激素有關的副作用。於反應後，偵測該培養上清液中的細胞激素含量。在正控制組中，經過PHA活化之週邊血液單核細胞中產生相當數量的介白素-2、腫瘤壞死因子(TNF-α)與干擾素(IFN-γ)，而在經過15A7抗體處理的細胞中則無法偵測到上述細胞激素。此實驗結果支持該抗-P型選擇素醣蛋白配位體-1抗體在誘導細胞凋亡與係標活化的情況中，均不會對於休止期的週邊血液細胞造成影響或影響極小。
由於上述抗體可在不對休止期之T細胞或其他免疫細胞造成不良影響的情況下，選擇性地誘導已活化T細胞之凋亡，因此，提供一個體上述抗體，將不會如同抗-CD3抗體或免疫抑制作用般造成淋巴球數目低落或免疫缺乏症狀。
抗-CD-162抗體之抗原決定區的定位(epitope mapping)
為了定位出15A7、43B6與9F9小鼠抗體對於人類CD162的抗原結合決定區(binding epitopes)，遂表現並純化出一系列含有人類CD162之不同區域的融合蛋白。並利 用三明治式酵素免疫分析法(Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)來測定該些融合蛋白與上述單株抗體之間的交互作用。
簡單地說，係在一大腸桿菌中表現出含有人類CD162之不同區域的斷片與人類免疫球蛋白G1重鏈恆定區的融合蛋白。利用分別具有一BglII與一BamHI限制酶位置的引子及聚合酶鏈鎖反應來放大序列上編碼有該人類免疫球蛋白G1重鏈恆定區的cDNA。以BglII與BamHI限制酶來剪切該PCR產物，並將之次選殖至經相同限制酶處理過的pET-32a載體中(Novagen)。隨後，利用分別於5’端上具有一NdeI以及於3’端上具有BglII限制酶位置的引子及聚合酶鏈鎖反應來放大序列上編碼有人類CD162之不同區域的cDNA。利用相對應的限制酶來剪切所得之PCR產物，並將該PCR產物以正確的譯碼讀框方式(in frame)黏接至pET-32a載體中編碼有該人類免疫球蛋白G1恆定區的序列上。上述架構質體中所使用的引子列於表二中，以及該些引子之序列係列示於表三中。
將上述構築之表現質體轉型至BL21大腸桿菌株(DE3)中。待於菌液中加入濃度為2mM之IPTG並培養6小時後，收取該些轉型後的細胞並重新懸浮於磷酸鹽緩衝溶液中。待利用超音波振破該些細胞並經14000g的轉速離心10分鐘後，收集所得的上清液用以純化該些融合蛋白。更進一步說明，首先係使該上清液與G蛋白珠粒或A蛋白珠粒於4℃下一同反應3小時。隨後以3000g之轉速將該些珠粒離心出來，並以第一清洗緩衝液與第二清洗緩衝液清洗該些珠粒各5次，其中該第一清洗緩衝液含有0.05% Triton X-100、50mM Tris-HCl(pH 8.5)、400 mM氯化鈉、1mM氯化鈣與1mg/ml卵蛋白素(OVA)，該第二清洗緩衝液含有0.05% Triton X-100、50 mM Tris-HCl(pH 8.5)與150 mM之氯化鈉。隨後，以含有0.1M之甘胺酸-鹽酸且pH2.7之洗出緩衝液(elution buffer)來洗出結合在珠粒上的蛋白，並以1M的Tris-HCl(pH8.6)來中和該些洗出的蛋白液。利用Bio-Rad蛋白分析試劑(Bio-Rad Laboratories,Cat.No.500-0006)來定量所有經純化後的融合蛋白，並利用十二烷基磺酸鈉-聚丙醯胺凝膠電泳法來確認之。
進行三明治式酵素免疫分析法，以研究該hCD162斷片分別與15A7、9F9與43B6抗體之間的交互作用。係在96微滴定孔盤的每一孔中塗覆以濃度為2微克/毫升之50微升的山羊抗人類免疫球蛋白抗體(goat anti-human IgG，Southern Biotechnology,Cat.No.2040-01)，並於4℃下作 用一個晚上。之後，在每孔中加入50微升之含有0.25%牛血清蛋白之磷酸鹽緩衝溶液，於37℃下作用1小時，以阻隔(blocking)該孔盤。隨後，於阻隔後的孔盤中加入濃度為2微克/毫升之含有人類CD162之不同斷片的融合蛋白，並於室溫下作用2小時。反應完畢後，係以含0.05%之Tween 20的磷酸鹽緩衝溶液(PBST)清洗該些孔盤4次，再於孔盤中加入濃度為2微克/毫升之待測抗體，於室溫下反應1.5小時。反應完後，以上述之PBST清洗該些孔盤4次。隨後，並於該些孔盤的每一孔中加入50微升且分別稀釋成1至3000倍之標記有鹼性磷酸酶的山羊抗小鼠免疫球蛋白，並將該些孔盤置於37℃下反應1小時(goat anti-mouse IgG conjugated with alkaline phosphotase，Southern Biotechnology,Cat.No.1031-04)。最後，於該些孔盤的每一孔中加入50微升之鹼性磷酸酶受質溶液以進行酵素反應，並以405 nm之波長來偵測其吸光度(absorbance)，其中該鹼性磷酸酶受質溶液係將1錠鹼性磷酸酶受質溶解於5毫升之含有0.012M碳酸鈉(Na2CO3)、0.16M碳酸氫鈉(NaHCO3)與1mM氯化鎂(MgCl2，pH8.6)的受質緩衝液中而得。
43B6與9F9抗體均能與所有包含人類CD162之第50至60個胺基酸殘基之融合蛋白交互作用的結果，顯示出43B6與9F9抗體之抗原決定區係位在第50-60個胺基酸殘基之間。不同9F9與43B6抗體，15A7抗體僅能與含有第42-319個胺基酸殘基之融合蛋白結合，但卻無法與含有第42-119 個胺基酸殘基的融合蛋白結合，故，此結果表示15A7抗體之抗原決定區係位在第119-319個胺基酸殘基之間。接著，再將15A7抗體之抗原決定區的位置限縮至第115-126個胺基酸殘基之間。若將位於第120個胺基酸位置之麩胺酸(Glu)取代成魚精胺酸(Arg)，則會降低15A7抗體與該融合蛋白之間的交互作用，此結果係表示該15A7抗體在人類CD162上的主要接觸區域係位在或鄰近第120個胺基酸位置，並且該麩胺酸殘基對於15A7抗體與該融合蛋白之間的交互作用來說是必要的。
亦可在哺乳動物細胞中表現涵蓋各種人類CD162區域的融合蛋白，並測試該些融合蛋白與15A7抗體之間的交互作用。涵蓋該些區域的斷片會與人類免疫球蛋白G1重鏈恆定區共同形成一融合蛋白而表現於哺乳動物細胞中。首先，將序列上編碼有人類免疫球蛋白G1重鏈恆定區(human immunoglobulin gamma 1 heavy chain constant region)的cDNA插入一pcDNA3載體(Invitrogen)中。其次，利用引子與聚合酶鏈鎖反應來放大序列上編碼著hCD162之變異區的cDNA，並分別在該cDNA的5’端序列上引入一個BamHI限制酶位置以及3’端上引入一個XhoI限制酶位置。利用相對應的限制酶剪切所得的PCR產物，並選殖至上述含有人類免疫球蛋白G1重鏈恆定區的pcDNA3載體中。各引子之名稱與序列係顯示於上方表二與表三中。
利用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen,Cat.No.11668-027)及參考其操作指引手冊以將方才所述之哺乳動 物表現載體短暫性轉染至COS-7細胞株中。將該轉染後細胞培養於含超低免疫球蛋白含量之培養液中(Invitrogen,Cat.No.16250-078)。之後，可利用上述相同方法來純化出所表現之蛋白，並以三明治式酵素免疫分析法來測定該些蛋白。
該酵素免疫分析結果顯示出僅該些含有第94-148胺基酸殘基的融合蛋白能與15A7發生交互作用。此結果與認為15A7抗體之抗原決定區位於第115至126胺基酸殘基之間的假設相符。
由於三種抗體均能與利用細菌所表現出的融合蛋白結合，故上述所有結果均顯示該9F9、43B6與15A7抗體之抗原決定區係取決於蛋白(protein-dependent)，而非取決於醣基修飾作用(carbohydrate modification)。且該些結果亦顯示雖然15A7、9F9與43B6抗體在結合專一性與誘導已活化T細胞走向凋亡之功能上具有相似性質，然此三種抗體係各自作用在人類CD162的不同區域上，並在其行為表現上有所差異。
第2實施例：嵌合抗體15A7、43B6與9F9
抗-CD162抗體之輕鏈與重鏈的選殖
利用錨定式聚合酶鏈鎖反應(anchored PCR method)來放大序列上編碼有15A7、43B6與9F9抗體之輕鏈及重鏈變異區的cDNA。該3端引子會雜合至C端區域，而5端引子則會與利用末端去氧轉移酶(terminal deoxytransferase)而連 接至cDNA上的G尾端進行雜合。將該PCR斷片選殖至一pCRII載體(Invitrogen)中。隨後對每一鏈的數種獨立選殖株進行定序與序列比較。並挑選出該些獨立選殖株中作為主要出現序列的序列。隨後分析該轉譯出的胺基酸序列，以確認所選擇的序列能展現出典型小鼠輕鏈或重鏈變異區的性質，並將之歸屬於一特定亞型。隨後藉著比較該轉譯出的胺基酸序列與每一亞型的保留序列，以鑑定出該些互補性決定。各引子之名稱與序列係顯示於上方表二與表三中。並於發明內容章節中顯示出15A7、43B6與9F9抗體之輕鏈與重鏈變異區的演譯後胺基酸序列(deduced amino acid sequences)(SEQ ID NOs：19-24)。
嵌合抗體
可利用包含5端訊息胜肽序列(5’signal peptide sequence)與3端剪切提供訊號(3’splice donor signal)的引子與聚合酶鏈鎖反應來放大序列上編碼有15A7、43B6與9F9抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的cDNA，以便製造用來表現嵌合抗體的載體。該些引子亦將XbaI限制酶位置引進上述PCR產物的兩末端上，隨後以XbaI限制酶剪切該些PCR產物，並將剪切後的PCR產物黏接(ligate)至經XbaI處理過的pVk、pVg1、pVg2或pVg4載體中。並特別將15A7、43B6與9F9小鼠抗體之輕鏈變異區的cDNA次選殖至pVk質體中。該pVk質體含有一CMV啟動子與一段序列上編碼著人類輕鏈恆定區的序列。將15A7、43B6與9F9小鼠抗體之 重鏈變異區的cDNA次選殖至pVg1、pVg2或pVg4質體中。上述三種質體均包含一CMV啟動子，並分別包含一人類免疫球蛋白IgG1、IgG2與IgG4之重鏈恆定區。
將上述每一個序列上編碼有輕鏈的質體與一序列上編碼有一重鏈的質體共轉染至COS-7細胞株中。並收集轉染後細胞的培養上清液。隨後分析該上清液中之嵌合抗體對人類CD162的結合力，以及分析該嵌合抗體誘導已活化T細胞走向細胞凋亡的能力。
實驗結果發現，所有從15A7、43B6與9F9抗體所製備出的嵌合抗體均能結合至穩定表現人類CD162的Sp2/0轉染細胞株上，但卻無法與母代Sp2/0細胞(parental Sp2/0 cells)結合，此結果表示該些嵌合抗體包留了對人類CD162的結合專一性。此外，實驗結果亦發現該些嵌合抗體可誘導已活化7天的T細胞走向細胞凋亡，此表示該些嵌合抗體中的小鼠抗體部分保留了誘導已活化T細胞之死亡的功能。
擬人化抗體
可藉著將15A7小鼠抗體之互補性決定區移植至一人類架構中而製造出擬人化抗體。當將小鼠抗體之互補性決定區移植至一人類架構中時，需保留該小鼠抗體之變異區(V regions)的構形，以保留其對抗原的結合親和性與專一性。將15A7小鼠抗體之輕鏈與重鏈變異區的序列與50種已擬人化之小鼠抗體的輕鏈及重鏈變異區序列作比較，以便 選擇適當的架構提供者(framework donor)。
已知mDREG-55小鼠抗體之輕鏈與重鏈與15A7小鼠抗體變異區具有極高的序列相似性。下方係15A7小鼠抗體與mDREG-55抗體之序列排比，其中互補性決定區(CDRs)特別以反白顯示。
輕鏈排比：
重鏈排比：
小鼠DEREG-55抗體係一可辨識L-選擇素(L-selectin)之單株免疫球蛋白G1抗體。15A7小鼠抗體之輕鏈變異區(VL)與重鏈變異區(VH)與小鼠DREG-55抗體之輕鏈與重鏈 變異區的序列相似性分別為64.3%(架構(framework)僅：73.8%)與70%(架構僅：81.6%)。目前已由Ga1人類抗體之輕鏈變異區與重鏈變異區的架構序列來建構出DREG-55擬人化抗體(HuDREG-55)。因此，使用Ga1人類抗體之輕鏈與重鏈的架構序列來取代15A7小鼠抗體的相對應部分，以將15A7小鼠抗體擬人化。擬人化的15A7輕鏈變異區與重鏈變異區各由四對長度約80個鹼基之人工合成寡聚核苷酸所組合而成。每一對寡聚核苷酸之序列上約有20個核苷酸相互重疊。核苷酸序列係經選擇與合成，以使其序列上編碼有包含單一胜肽之擬人化變異區的蛋白質序列。該些基因的組合與放大程序依循四步驟：(1)將四對互補的寡聚核苷酸分別於四個反應中進行黏合(anneal)，並以Klenow斷片(Klenow fragment)來增長該些寡聚核苷酸；(2)將所得的4條雙股DNA斷片以兩兩一對的方式混合後，分別於兩個反應中進行變性(denatured)、再黏合(reannealed)與增長反應(extending)；(3)再將所得的兩條雙股DNA斷片混合並進行變性、再黏合與增長反應，以創造出最終全長雙股DNA；以及(4)利用引子及聚合酶鏈鎖反應(PCR)來放大上述產生的DNA，並在該DNA序列的兩末端處引進一個XbaI限制酶位置。隨後，利用XbaI限制酶來剪切該PCR斷片，並將剪切後的PCR斷片分別插入已經XbaI處理過的pVk與pVg4載體(vector)中。之後，將Ga1抗體中認為重要的序列架構及會與互補性決定區(CDR)進行交互作用之位置上的胺基酸殘基換成15A7小鼠抗體中同樣位置上的氨基酸殘基(即， I62V與D74H)。下方係15A7小鼠抗體輕鏈與重鏈、擬人化15A7抗體(Hu15A7)輕鏈與重鏈以及HuDREG-55抗體之輕鏈與重鏈的序列排比，其中V62與H74兩胺基酸殘基標示有底線。
輕鏈排比：
重鏈排比：
所得質體的序列中編碼有擬人化15A7重鏈與輕鏈。隨後將這些質體共轉染至COS-7細胞株中，並收集經該些培養細胞耗用過的培養上清液。隨後測定上清液中之擬人化15A7抗體對能表現hCD162之CHO細胞穩定轉染株的結合 能力，以及測定該擬人化15A7抗體誘導已活化7天之T細胞走向細胞凋亡的能力。實驗結果顯示該擬人化15A7抗體保有上述該些能力。
製備嵌合抗體與擬人化抗體
可利用細胞來產生的擬人化抗體與嵌合抗體。特別是可依照製造商之操作指示，以Gene Pulser裝置提供360伏特(V)與25μF電容量來執行電穿孔法，而將適當的質體穩定轉染(stable transfected)至Sp2/0細胞中(Sp2/0-Ag14；ATCC CRL 1581)。進行轉染之前，先以BamHI限制酶將該質體線性化(linearized)。所有轉染反應均以20微克的質體DNA來轉染懸浮於磷酸鹽緩衝溶液中數目約107個的細胞。將每一轉染反應的細胞塗佈於兩個96孔組織培養盤中。待48小時後，加入選擇性培養液(selective medium，係補充10%小牛血清、次黃嘌呤、胸腺嘧啶之DMEM培養液)以及1微克/毫升之黴酚酸(mycophenolic acid)。之後，藉著酵素免疫分析法測定該培養上清液中是否存在抗體，而得以篩選並分離出能製造抗體的細胞。
將已分離的細胞培養在不含血清或低免疫球蛋白含量的培養液中，並收集該些細胞的培養上清液。使所收集的培養上清液通過一葡萄球菌蛋白A-瓊酯醣凝膠CL-4B管柱(staphylococcal protein A-Sepharose CL-4B)以純化該些抗體。隨後以第一清洗緩衝液(0.05% triton X-100、50 mM Tris-HCl(pH8.4)、400mM氯化鈉、1mM氯化鈣及1毫克/ 毫升之卵蛋白素)與第二清洗緩衝液(0.05% Triton X-100、50 mM Tris-HCl(pH 8.5)及150 mM氯化鈉)清洗該管柱各5次後，最後以含有0.1M之甘胺酸(pH2.7)的洗出緩衝液將結合在管柱中的抗體洗出，並以1M之Tris-HCl(pH8.6)來中和洗出的抗體。
親和性測定試驗
可藉著競爭性結合試驗來偵測上述15A7小鼠抗體、15A7嵌合抗體與擬人化15A7抗體的結合親和性。
以EZ-Link Sulfo-NHS-生物素試劑組(Sulfo-NHS-Biotin system，Pierce Biotechnology,Cat.No.21217)將15A7小鼠抗體生物素化(biotinynated)。係將0.5毫克，即，3.3 x 10-6毫微莫耳(nmole)之15A7小鼠抗體溶於187微升的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，並混入6.8x10-5毫微莫耳之Sulfo-NHS-生物素。隨後，將該混合物置於冰上反應2小時後，於4℃下，以磷酸鹽緩衝液透析該混合物一個晚上，以移除未反應的生物素。並將所獲得之經生物素標記的15A7小鼠抗體保存於4℃之環境中，備用。
使用穩定表現人類CD162蛋白的Sp2/0轉染細胞株作為人類CD162抗原之來源。並以上述生物素標記15A7小鼠抗體作為追蹤劑(tracer)。
使提升用量之競爭性抗體(15A7之小鼠、嵌合或擬人化抗體)與35毫微克之生物素標記15A7小鼠抗體混合後，使之與1x105個Sp2/0-CD162表現細胞(CD162-expressing Sp2/0 cells)於4℃且穩定搖晃該反應之條件下，作用1.5個小時。待清洗該反應後，於混合物中加入鏈黴卵白素-PE(Streptavidin-PE，Becton Dickinson Immunocytometry System Inc.Cat.No.349023)。使混合物於4℃下反應45分鐘後，再次清洗該些細胞，並將清洗後的細胞重新懸浮於300微升且含有1%小牛血清的磷酸鹽緩衝溶液中，並對該些細胞進行流式細胞分析。
實驗結果發現，15A7小鼠抗體之1/2最大競爭濃度(half-maximum competing concentration)為3.72微克/毫升，而15A7嵌合抗體與擬人化15A7抗體則分別約為5.71微克/毫升與4.51微克/毫升。此結果表示15A7之小鼠抗體、嵌合抗體與擬人化抗體的親和性相當。也就是15A7小鼠抗體之結合親和力(Ka值)為4.03 x 107 M-1，而15A7嵌合抗體與擬人化15A7抗體之Ka值則分別為2.62 x 107 M-1與3.33 x 107 M-1。
競爭性分析試驗
執行競爭性分析試驗以探討上述三種小鼠抗體與P型選擇素醣蛋白配位體-1及P型選擇素之間的交互作用。
在多數的白血球中，P型選擇素醣蛋白配位體-1的主要高親和性配位體為P型選擇素。為了探討上述三種抗體是否能阻止P型選擇素與P型選擇素醣蛋白配位體-1結合，故於存在有上述三種抗體的條件下，測定已純化之人類P型選擇素對已活化T細胞的結合作用。並使用已知能阻斷P 型選擇與P型選擇素醣蛋白配位體-1間之交互作用的KPL-1來作用正對照組(positive control)。
以1%的PHA活化人類週邊血液單核細胞(PBMC)兩天後，將該些細胞培養於含介白素-2(IL-2)之培養液中3天。使該些細胞與已測定抗體力價(titrated)之9F9抗體、15A7抗體、43B6抗體、KPL-1(一種P型選擇素醣蛋白配位體-1結抗劑)或一控制組抗體(9E10)作用30分鐘，隨後於各反應中加入重組人類P型選擇素(1.25微克/毫升)。接著利用抗-P型選擇素-FITC抗體與流式細胞分析儀(FACS)來偵測P型選擇對已活化T細胞的結合作用。
與過去文獻報導一致的是，使用低濃度(0.31微克/毫升)的KPL-1便可幾乎完全阻止P型選擇素結合至已活化T細胞上。43B6抗體阻止P型選擇素結合至已活化T細胞上的效果如同KPL-1般良好，而9F9抗體則須以較高的抗體濃度方能達到相同的效果。0.08微克/毫升之KPL-1或43B6抗體便可確實阻斷50%的結合作用。而9F9抗體則需5微克/毫升方能達到相同效果。此外，即使將15A7抗體的使用濃度提升到20微克/毫升也無法抑制P型選擇素的結合作用。同時令人驚訝的是，15A7抗體反而增進了P型選擇素與P型選擇素醣蛋白配位體-1之間的結合作用。此結果表示，15A7抗體與P型選擇素在已活化T細胞之P型選擇素醣蛋白配位體-1上的結合位置不同。
15A7抗體無法與P型選擇素競爭P型選擇素醣蛋白配位體-1的事實，說明了對一活體使用15A7抗體可能無法藉 著干擾白血球之P型選擇素依賴性募集作用(P-selectin-dependent recruitment of leukocytes)而影響天生的免疫作用。
已有文獻報導過P型選擇素醣蛋白配位體-1在血小板上的表現量不高。故，進一步測定15A7抗體對血小板的作用效果。實驗結果發現，該抗體無法增高或抑制人類血小板的凝集作用。
第3實施例：抗小鼠PSGL-1之天竺鼠單株抗體TAB4
依據類似於第1實施例中所敘述之方法來製備抗-小鼠P型選擇素醣蛋白配位體-1單株抗體TAB4。TAB4單株抗體可於活體外試驗中誘導T細胞凋亡，並可在活體內耗盡T細胞數目。並依據第2實施例中所敘述之方法來執行競爭性分析試驗，以測定TAB4單株抗體是否能干擾小鼠P型選擇素與小鼠P型選擇素醣蛋白配位體-1之間的結合作用。實驗結果發現，即使在20微克/毫升之高抗體濃度下，TAB4單株抗體無法抑制小鼠P型選擇素與小鼠P型選擇素醣蛋白配位體-1之間的結合作用。
第4實施例：小鼠單株抗體4B7、5C4、12E7、14B3、17E5與18D12
除上述抗體外，更鑑定出其他能辨識人類P型選擇素醣蛋白配位體-1的單株抗體：4B7、5C4、12E7、14B3、17E5與18D12。這些抗體均能藉著與一已活化T細胞結合，而誘 導該已活化T細胞之死亡。依照第2實施例中所述之方法來進行競爭性分析試驗，以測定這些抗體是否能阻斷P型選擇素醣蛋白配位體-1與P型選擇素之間的交互作用。實驗結果發現，即便使用最高濃度之該些抗體(5微克/毫升)來進行競爭性分析，該些抗體對於人類P型選擇素與P型選擇素醣蛋白配位體-1之間的結合作用僅有些微的抑制效果。
其他實施例
本說明書中所揭露之所有特徵可採各種結合方式加以組合。亦可使用能達到相同、相等或相似目的之其他特徵來替代本說明書中所揭露的每個特徵。因此，除非另作說明，否則所揭露之每一特徵僅為一系列均等物或類似特徵的示範範例。
該領域之習知技藝者可根據上述內容而輕易地實施本發明之必要特徵，並在不偏離本發明精神下，當可對本發明作各種修飾與變化以配合不同用途與條件。故，其他實施例亦為本發明範圍所涵蓋。
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Claims (35)

  1. 一種抗體，其包含一第一免疫球蛋白鏈以及一第二免疫球蛋白鏈，其中該第一鏈係一輕鏈，該第二鏈係一重鏈，且該第一鏈與該第二鏈分別含有：序列編號1-3及序列編號4-6之序列，其中該抗體能專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1(PSGL-1)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗體，其中該抗體包含序列編號19之輕鏈變異區與序列編號20的重鏈變異區，或該抗體包含序列編號25之輕鏈變異區與序列編號26的重鏈變異區。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之抗體，其中該抗體包含序列編號25之輕鏈變異區與序列編號26的重鏈變異區。
  4. 一種可專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1但不干擾P型選擇素與P型選擇素醣蛋白配位體-1間之結合作用的抗體，其中當該抗體與一已活化T細胞上之P型選擇素醣蛋白配位體-1結合，該抗體會誘導該已活化T細胞之死亡。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之抗體，其中該抗體包括一輕鏈與一重鏈，且該輕鏈與該重鏈分別含有序列編號1-3及序列編號4-6之序列。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之抗體，其中該抗體包含序列編號19之輕鏈變異區與序列編號20的重鏈變異區，或該抗體包含序列編號25之輕鏈變異區與序列編號26的重鏈變異區。
  7. 一種可專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1之第115-126個胺基酸殘基的抗體。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之抗體，其中該抗體可專一性結合至第117-123個胺基酸殘基。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之抗體，其中該抗體可專一性結合至第119-121個胺基酸殘基。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之抗體，其中該抗體包括一輕鏈與一重鏈，且該輕鏈與該重鏈分別含有序列編號1-3及序列編號4-6之序列。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之抗體，其中當該抗體與一已活化T細胞上之P型選擇素醣蛋白配位體-1結合，該抗體會誘導該已活化T細胞之死亡。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之抗體，其中該輕鏈與該 重鏈分別含有序列編號1-3及序列編號4-6之序列。
  13. 一種使用申請專利範圍第1至12項中任一項所述之一抗體來製備可誘導已活化T細胞死亡之藥物的用途。
  14. 一種使用申請專利範圍第1至12項中任一項所述之一抗體來製備可調控一個體體內一T細胞介導免疫反應之藥物的用途，該個體罹患或極可能罹患一T細胞介導過度免疫反應相關症狀。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中該症狀係一發炎疾病、一自體免疫疾病、一過敏性疾病或一T細胞癌症。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之用途，其中該個體已接受或預期會接受一同種異體移植或異種異體移植。
  17. 一種已分離核酸，其包含一序列，該序列編碼一多胜肽，該多胜肽包含序列編號1-3或序列編號4-6之序列，其中由該核酸所編碼之一抗體能專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1(PSGL-1)。
  18. 一種已分離核酸，其包含一序列，該序列編碼一多胜肽，該多胜肽包含序列編號19、20、25或26之序列， 其中由該核酸所編碼之一抗體能專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1(PSGL-1)。
  19. 一種包含如申請專利範圍第17項所述之已分離核酸的載體。
  20. 一種包含如申請專利範圍第18項所述之已分離核酸的載體。
  21. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第17項所述之一已分離核酸。
  22. 如申請專利範圍第21項所述之宿主細胞，其中該細胞係一細菌細胞、一酵母菌細胞、一植物細胞、一昆蟲細胞或一哺乳動物細胞。
  23. 如申請專利範圍第22項所述之宿主細胞，其中該哺乳動物細胞係一融合瘤細胞。
  24. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第18項所述之一已分離核酸。
  25. 如申請專利範圍第24項所述之宿主細胞，其中該細胞係一細菌細胞、一酵母菌細胞、一植物細胞、一昆蟲細 胞或一哺乳動物細胞。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之宿主細胞，其中該哺乳動物細胞係一融合瘤細胞。
  27. 一種已分離核酸，其編碼一多胜肽，該多胜肽包含序列編號1、2、3、4、5或6之序列，其中由該核酸所編碼之一抗體能專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1(PSGL-1)。
  28. 一種載體，其包含如申請專利範圍第27項所述之一已分離核酸。
  29. 一種宿主細胞，其包含如申請專利範圍第27項所述之一已分離核酸。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之宿主細胞，其中該細胞係一細菌細胞、一酵母菌細胞、一植物細胞、一昆蟲細胞或一哺乳動物細胞。
  31. 如申請專利範圍第30項所述之宿主細胞，其中該哺乳動物細胞係一融合瘤細胞。
  32. 一種專一性結合至人類P型選擇素醣蛋白配位體-1之 抗體，其中該抗體包含：(i)一輕鏈包含序列編號19之一變異區，該變異區連結至一人類κ輕鏈恆定區，以及一重鏈包含序列編號20之一變異區；或(ii)一輕鏈包含序列編號25之一變異區，該變異區連結至一人類κ輕鏈恆定區，以及一重鏈包含序列編號26之一變異區。
  33. 如申請專利範圍第32項所述之抗體，其中該抗體包含人類IgG1、IgG2或IgG4之一重鏈恆定區。
  34. 如申請專利範圍第33項所述之抗體，其中該抗體包含：(i)一輕鏈包含序列編號25之一變異區，該變異區連結至一人類κ輕鏈恆定區，以及(ii)一重鏈包含序列編號26之一變異區，該變異區連結至一人類IgG4重鏈恆定區。
  35. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至12或32至34項中任一項所述之一抗體，及其醫藥上可接受之載劑。
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