KR101256400B1 - 항체 - Google Patents

항체 Download PDF

Info

Publication number
KR101256400B1
KR101256400B1 KR1020067024896A KR20067024896A KR101256400B1 KR 101256400 B1 KR101256400 B1 KR 101256400B1 KR 1020067024896 A KR1020067024896 A KR 1020067024896A KR 20067024896 A KR20067024896 A KR 20067024896A KR 101256400 B1 KR101256400 B1 KR 101256400B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
ser
seq
gly
cell
Prior art date
Application number
KR1020067024896A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070020048A (ko
Inventor
롱-화 린
충 난 창
페이-지운 첸
치-첸 황
Original Assignee
압제노믹스 코오페라티에프 유.에이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=35394680&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101256400(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 압제노믹스 코오페라티에프 유.에이. filed Critical 압제노믹스 코오페라티에프 유.에이.
Publication of KR20070020048A publication Critical patent/KR20070020048A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101256400B1 publication Critical patent/KR101256400B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/462—Igs containing a variable region (Fv) from one specie and a constant region (Fc) from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명의 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1에 결합하는 항체의 경쇄 또는 중쇄 상보성 결정 부위를 가지는 면역글로불린 체인 또는 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 면역글로불린 체인을 코딩하는 핵산, 상기 핵산 서열을 가지는 벡터 및 숙주 세포, 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 방법 및 개체에서 T 세포 매개성 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다.
P-셀렉틴 당단백질 리간드-1, 활성화된 T 세포, 세포자살

Description

항체{ANTIBODIES}
본 출원은 2004년 5월 10일자 미국 가출원 제 60/569,892호를 우선권으로 주장하며, 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
과도하게 공격적인 T 세포는 종종 원하지 않는 면역 반응을 발생시키며, 이후 여러가지 질환, 예컨대 자가면역 질환, 이식 거부 반응, 알레르기성 질환 및 T 세포 유래 암을 초래한다. 따라서, 공격적인 T 세포의 조절은 이러한 질환을 치료하는데 중요한다. 이들 세포의 활성은 면역억제 또는 면역학적 허용에 의해 억제될 수 있다. 세포자살 유발은 대안적인 해결책으로, 과도하게 공격적인 T 세포를 포함한 불필요한 세포를 제거하는데 관여하는 것으로 여겨지고 있다. 예로, Kabelitz et al. (1993) Immunol Today 14, 338-340 및 Raff (1992) Nature 356, 397-399를 참조한다.
발명의 개시
본 발명은 활성화된 T 세포상의 P-셀렉틴 당단백질 리간드-1(P-Selectin Glycoprotein Ligand-1, PSGL-1)에 결합하여 세포자살을 유도하는 항체 및 그 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 일 측면은 (i) 각각 RSSQSIVHNDGNTYFE, KVSNRFS 및 FQGSHVPLT(서열번호 1-3); (ii) 각각 SFGMH, YINGGSSTIFYANAVKG 및 YASYGGGAMDY(서열번호 4-6); (iii) 각각 RASSTVNSTYLH, GSSNLAS 및 QQYSGYPLT(서열번호 7-9); (iv) 각각 AYYIH, VNPNTGGTSYNPKFKG 및 SGSPYYRYDD(서열번호 10-12); (v) 각각 RSSQSIVNSNGNTYLE, KVSNRFS 및 FQGSHVPWT(서열번호 13-15); 또는 (vi) 각각 TNAMNWVRQAPGKGLE, TYYADSVKD 및 GGSYWYFDV(서열번호 16-18)를 포함하는 3종의 서열을 가지는 면역글로불린 체인에 관한 것이다.
전술한 6세트의 서열들 각각은 하기 실시예에 개시된 3종의 마우스 항체 15A7, 43B6, 및 9F9와 같이 PSGL-1에 결합하는 항체의 3가지 경쇄 또는 중쇄 상보성 결정 부위(complementarity determining regions; CDR)에 해당된다. 이들 3가지 항체들의 경쇄 및 중쇄 가변(V) 부위는 하기에 나타낸다(서열번호 19-26, CDR은 밑줄 및 강조 표시됨):
서열번호 19(마우스 15A7 경쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00001
서열번호 20(마우스 15A7 중쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00002
서열번호 21(마우스 43B6 경쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00003
서열번호 22 (마우스 43B6 중쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00004
서열번호 23 (마우스 9F9 경쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00005
서열번호 24 (마우스 9F9 중쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00006
항체의 항원 결합 특이성은 그것의 중쇄 및 중쇄 CDR에 의해 결정되므로, 전술한 CDR들을 사용하여 항원 결합 특이성을 유지하고 있는 항체 유도체를 제조할 수 있다. 항체 유도체의 예로는 키메라 항체, 인간화 항체 및 이들의 기능 동등체들이 있다. 인간화 15A7 항체의 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6을 각각 포함하는 경쇄 V 부위 (서열번호 25)와 중쇄 V 부위 (서열번호 26)는 하기에 나타낸다.
서열번호 25 (인간화 15A7 경쇄 V 부위):
Figure 112006087218264-pct00007
서열번호 26 (인간화 15A7 중쇄 V 부위):
Figure 112008064201353-pct00008
또한, 본 발명은 전술한 면역글로불린 체인들중 하나를 코딩하는 서열을 가지는 분리된 핵산을 특징으로 한다. 용어 "항체" 또는 "면역글로불린 체인"은 분리된 폴리펩티드, 즉, 자연적으로 조합된 다른 단백질, 지질 및 핵산으로부터 실질적으로 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 정제된 조제물의 적어도 50 건조 중량% 이상, 70 건조 중량% 이상 또는 95 건조 중량%로 구성될 수 있다. "분리된 핵산"은 자연적으로 형성되는 핵산 또는 자연적으로 형성되는 게놈 핵산의 임의 절편과 구조가 동일하지 않은 핵산을 의미한다. 따라서, 상기 용어는, 예컨대, (a) 자연적으로 형성되는 게놈 DNA 분자의 부분 서열을 가지나, 천연적으로 형성되는 유기체의 게놈에서 상기 부분 분자의 측면에 위치한 코딩 서열들 사이에 위치하지 않는 DNA; (b) 수득되는 분자가 자연적으로 형성되는 벡터 또는 게놈 DNA과 동일하지 않게 원핵 또는 진핵 생물의 게놈 DNA나 벡터로 조합된 핵산; (c) cDNA, 게놈 절편, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 절편 또는 제한효소 절편과 같은 분리된 분자; 및 (d) 혼성 유전자의 부분인 재조합 핵산 서열, 즉 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 본 발명의 핵산을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 발현시킬 수 있다. 이를 위해, 핵산 서열을 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결시켜 발현 벡터를 제조할 수 있다.
벡터는 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있으며, 또한 자가 복제 또는 숙주 DNA로 병합할 수 있는, 핵산 분자를 의미한다. 그 예로는, 플라스미드, 코스미드, 및 바이러스 벡터가 있다. 본 발명의 벡터는 숙주 세포에서 핵산 발현에 적합한 형태의 핵산을 포함한다. 바람직하기로는, 상기 벡터는 발현되는 핵산 서열에 작동가능하도록 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열의 예로는 프로모터, 인핸서 및 그외 발현 조절 인자(예, 폴리아데닐레이션 신호)가 있다. 또한, 조절 서열은 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현(constitutive expression)을 도출하는 서열 뿐만 아니라 조직 특이적 조절 및/또는 유발성 서열을 포함한다. 이러한 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선정 및 원하는 발현 수준을 포함한 고려사항을 토대로 이루어진다. 발현 벡터는 숙주 세포로 도입되어 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 또한, 본 발명은 전술한 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다. 숙주 세포는 외인성 코딩 서열 또는 비코딩 서열을 포함하는 세포를 의미한다. 외인성 서열은 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염 또는 전기충격에 의해 세포내로 도입될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 세균성 세포(예, E. coli, Bacillus subtilis, 및 Salmonella typhimurium), 효모 세포(예, Saccharomyces cerevisiae 및 Schizosaccharomyces pombe), 식물 세포(예, Nicotiana tabacum 및 Gossypium hirsutum), 및 포유류 세포(예, murine hybridoma cells, CHO cells, 및 3T3 fibroblasts)가 있다. .
본 발명의 면역글로불린을 생산하기 위해, 전술한 핵산으로 코딩된 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하고, 배양물로부터 폴리펩티드를 분리할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 핵산은 예컨대 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
본 발명의 범위내에 항체가 포함된다. 이는, 전술한 마우스 15A7, 43B6, 또는 9F9 항체의 각각 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR을 포함하는 제1 면역글로불린 체인 및 제2 면역글로불린 체인으로 형성되어 있다. 바람직하기로는, 상기 항체는 15A7의 경쇄 및 중쇄로 형성되어 있다.
또한, (i) P-셀렉틴 당단백질 리간드 1과 P-셀렉틴간의 결합을 간섭하지 않고 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 특이적으로 결합하며, (ii) 활성화된 T 세포상의 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 결합하여 상기 T 세포의 사멸을 유도하는 다른 항체를 포함한다. 일 예로, 상기 항체는 인간 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 특이적으로 결합한다.
또한, 본 발명의 범위는 성숙형 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 아미노산 잔기 115-126에 특이적으로 결합하는 또다른 항체를 포함한다. 바람직하기로는, 상기 항체는 아미노산 잔기 117-123에 특이적으로 결합한다. 더 바람직하기로는, 상기 항체는 테스트한 에피토프들 중에서 보존적 서열, 아미노산 잔기 119-121에 특이적으로 결합한다. 실제, 이들 3가지 아미노산 잔기들중 하나 이상에 돌연변이가 있으면 항체 결합은 없어진다. 일 예로, 상기 항체는 활성화된 T 세포상의 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 결합하여, 활성화된 T 세포의 사멸을 유도한다.
일예에서, 바로 위에서 언급한 두가지 항체들중 하나는 각각 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6 (예, 서열번호 19 및 20, 또는 서열번호 25 및 26)를 포함하는 경쇄 및 중쇄로 형성되어 있다.
본 발명의 다른 측면은 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 활성화된 T 세포를 전술한 3가지 항체들 중 하나와 접촉시키는 단계를 포함하며, 활성화된 T 세포에 상기 항체가 결합하면 세포 사멸이 유도된다.
또한, 본 발명은 개체에서 T 세포 매개성 면역 반응을 조절하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (1) 과도한 T 세포 매개성 면역 반응과 관련된 증상을 가지고 있거나 또는 가질 위험이 있는 개체를 확인하는 단계; 및 (2) 전술한 3가지 항체들중 한가지를 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함한다. "과도한 T 세포 매개성 면역 반응"은 과도한 수준으로 활성화된 T 세포에 의해 초래된 반응을 의미한다. 과도한 수준은 (1) 정상 수준보다 높은 수준, 및 (2) 정상 수준보다 높진 않지만 개체에서 적합한 수준 보단 높은 수준을 의미한다. 상기 증상의 예로는 염증성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환 또는 T 세포암 뿐만 아니라 동종 또는 이종 이식을 받은 또는 받을 예정인 개체의 상태를 의미한다.
본 발명의 한가지 이상의 구체적인 예를 하기에 기재한다. 본 발명의 그외 구성, 목적 및 효과는 상세한 설명에서 명확해질 것이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 활성화된 세포상의 PSGL-1에 대한 항체 또는 그 유도체의 결합에 의해 활성화된 T 세포가 세포자살로 진행되도록 유도되고 고갈되는 예상하지 못했던 발견을 토대로 한다. 상기 항체 및 유도체는 과도하거나 또는 원하지 않은 T 세포 매개성 면역 반응 또는 T 세포 증식과 관련있는 증상의 치료에 유용하다.
따라서, 본 발명은 항-PSGL-1의 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 CDR을 포함하는 폴리펩티드 뿐만 아니라 이를 코딩하는 핵산에 관한 것이다. 상기 면역글로불린 체인들과 핵산은 둘다 전술한 항체 및 유사체를 제조하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 면역글로불린은 합성 폴리펩티드 또는 재조합 폴리펩티드로서 수득할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 제조하기 위해, 이를 코딩하는 핵산을 융합 파트너, 예컨대 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 6x-His 에피토프 텍, M13 유전자 3 단백질 또는 면역글로불린 중쇄 불변부를 코딩하는 다른 핵산에 연결시킬 수 있다. 제조된 융합 핵산은 단백질 발현용 세포에 도입될 수 있다. 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 융합 단백질을 분리할 수 있다. 분리된 융합 단백질은 예컨대 효소 절단에 의해 추가적으로 처리하여 융합 파트너를 제거함으로써, 원하는 재조합 폴리펩티드를 수득할 수 있다. 대안적으로 상기 체인을 코딩하는 핵산의 내인성 발현 활성화에 의해 적합한 숙주 세포로부터 면역글로불린 체인을 수득할 수 있다.
본 발명의 면역글로불린 체인의 아미노산 조성은 PSGL-1에 결합할 수 있는 항체 형성 능력을 파괴하지 않고도 변경할 수 있다. 예를 들어, 그러한 변이체는 하나 이상의 보존적 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. "보존적 아미노산의 치환"은 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기로 아미노산 잔기가 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 공지되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예, 아스파라트산, 글루탐산), 비전하성 극성 측쇄를 가진 아미노산(예, 글리신, 아스파라진, 글루타민, 세린, 트레온닌, 타이로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄(예, 트레오닌, 발린, 이소루신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예, 타이로신, 페닐알라닌, 트립토팝, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 폴리펩티드에서 예상되는 비필수 아미노산 잔기를 바람직하기로는 동일한 측쇄 패밀리의 다른 아미노산으로 치환한다. 대안적으로, 돌연변이를 본 발명의 폴리펩티드 전체 또는 일부에 포화 돌연변이 유발(saturation mutagenesis)에 의해 무작위적으로 도입할 수 있으며, 제조된 돌연변이는 하기 개시된 바와 같이 본 발명의 변이체들을 동정하기 위해 PSGL-1에 결합할 수 있는 항체를 형성하는 능력에 대해 스크리닝할 수 있다. 따라서, 예로서, 용어 "서열번호 19를 포함하는 면역글로불린 체인"은 서열번호 19의 변이체를 포함하는 면역글로불린 체인을 포괄한다.
전술한 면역글로불린 체인 및 변이체를 사용하여 본 발명의 항체 또는 그의 유도체를 제조할 수 있다. "항체"는 무손상 분자 뿐만 아니라 Fab, F(ab')2, Fv, scFv(단쇄 항체) 및 dAb(도메인 항체; Ward, et. al. (1989) Nature, 341, 544)와 같은 그것의 단편을 포함한다. 항체 유도체는 본 발명의 폴리펩티드 변이체를 가지는 단백질 또는 단백질 복합체를 의미한다. 본 발명의 항체 또는 유도체는 하기 실시예에 기재된 바와 같이 적합한 숙주 세포에서 해당 경쇄 및 중쇄 CDR 함유 폴리펩티드를 공동 발현함으로써 제조할 수 있다. 대안적으로, 이는 단일항체 및 다클론 항체 및 단편 제조 분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있다. 예로, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York를 참조한다.
본 발명의 항체를 제조하기 위해, PSGL-1 또는 항원성 단편을 KLH와 같은 캐리어 단백질과 커플링시켜, 보강체와 혼합한 다음 숙주 동물에 주입할 수 있다. 동물에서 생산된 항체는 펩티드 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다. 일반적으로 사용되는 숙주 동물로는 토끼, 마우스, 기니아 피그 및 랫이 있다. 면역학적 반응을 증가시키기 위해 사용할 수 있는 여러가지 보강체는 숙조 종들에 따라 다르며, 프레운드의 보강제(완전 및 불완전), 알루미늄 하이드록사이드와 같은 미네랄 겔, 리소레시친과 같은 계면활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온(polyanion), 펩티드, 오엘 에멀젼, KLH(keyhole limpet hemocyanin) 및 디니트로페놀이 있다. 유용한 인간 보강체로는 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 있다.
이질적인 항체 분자 집단인 다클론 항체들은 면역화된 개체의 혈청내에 존재한다. 특정 항원에 대해 동질적인 항체 집단인 단일클론 항체는 표준적인 하이브리도마 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 예로, Kohler et al. (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 292; 및 Hammerling et al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y를 참조한다. 특히, 단일클론 항체는 미국 특허 제 4,376,110호에 제시된 바와 같은, 연속 배양 세포주에 의한 항체 분자의 생산 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al., Immunology Today 4: 72(1983); Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026(1983)), 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96(1983))에 의하여 수득할 수 있다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 클래스 및 그의 서브클래스(subclass)의 항체일 수 있다. 본 발명의 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다. 생체내에서 높은 역가의 단일클론 항체를 생산하는 능력은 특히 유용한 생산 방법이다.
또한, "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기법들을 사용할 수 있다. 예로, Morrison et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda et al. (1984) Nature 3 14:452을 참조한다. 키메라 항체는 뮤라인 단일클론 항체에서 유래된 가변부 및 인간 면역글로불린의 불변부를 가지는 것과 같이, 각각의 부분들이 상이한 동물 종으로부터 유래된 하나의 분자이다. 대안적으로, 단쇄 항체의 생산에 대한 기법(미국 특허 제 4,946,778 및 4,704,692호)을 적절하게 수정하여 단쇄 Fv 항체의 파지 라이브러리를 제작할 수 있다. 단쇄 항체는 아미노산 브릿지를 통해 Fv 부위의 중쇄와 경쇄 단편을 연결시킴으로써 형성된다. 더욱이, 항체 단편은 공지된 기법으로 제조가능하다. 예를 들면, 이러한 단편은 비제한적으로, 항체 분자의 펩신 절단에 의해 제조할 수 있는 F(ab')2 단편과 F(ab')2 단편의 이황화 결합을 환원시킴으로써 제조할 수 있는 Fab 단편이 있다. 항체는 하기 실시예 또는 당업계에 공지된 방법으로 인간화할 수 있다. 예를 들어, 원하는 결합 특이성을 가지는 단일클론 항체를 상업적으로 인간화시킬 수 있다(Scotgene, Scotland; and Oxford Molecular, Palo Alto, Calif.). 또한, 형질전환 동물에서 발현되는 것과 같은 완전한 인간 항체도 본 발명의 특징이다(예, Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13; 및 미국 특허 제 5,545,806호와 제 5,569,825호 참조).
또한, 본 발명은 예로, 본 발명의 항체를 활성화된 T 세포와 시험관내에서 접촉시키고, 유효량의 항체를 필요로 하는 개체에게 투여함으로써, 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 방법을 포함한다. 치료되는 개체는 과도하거나 또는 원하지 않는 T 세포 매개성 면역 반응과 관련된 증상을 가지고 있거나 또는 가질 위험성이 있는 것으로 확인할 수 있으며, 예컨대, 자가면역 질환, 이식 거부 반응, 알레르기성 질환 또는 T 세포 유래 암 환자이다. 상기 방법은 단독으로 또는 다른 약물이나 요법과 병용 수행할 수 있다.
용어 "치료"는 장애, 장애의 증상, 질환으로 이차적으로 발생되는 장애 또는 병에 걸리기 쉬운 소인을 치유, 경감, 완화, 개선, 예방 또는 향상시킬 목적으로 개체에게 조성물을 투여하는 것으로 정의된다. "유효량"은 처리된 개체에서 의학적으로 바람직한 결과를 형성시킬 수 있는 조성물의 함량이다.
치료되는 질환의 예로는, 당뇨병, 관절염(류마토스 관절염, 아동 류머티스성 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis) 및 건선성 관절염(psoriatic arthritis) 포함), 다발성 경화증, 뇌척수염(encephalomyelitis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 전신 낭창성 홍반(systemic lupus erythematosis), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis), 피부염(아토피성 피부염 및 습진성 피부염), 건선, 조그렌 증후군(Sjogren's Syndrome), 크론 증후군(Crohn's disease), 아프타 궤양(aphthous ulcer), 홍채염, 결막염, 각막 결막염, 1형 당뇨병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 천식, 알레르기성 천식, 피부 낭창성 홍반(cutaneous lupus erythematosus), 경피증, 질염, 직장염, 약물 발진(drug eruptions), 나병 전도 반응(leprosy reversal reactions), 나병 결절 홍반(erythema nodosum leprosum), 자가면역성 포도막염(autoimmune uveitis), 알레르기성 뇌척수염, 급성 괴사 출혈성 척수염(acute necrotizing hemorrhagic encephalopathy), 특발성의 진행성 양측 감각신경 난청(idiopathic bilateral progressive sensorineural hearing loss), 재생불량성 빈혈, 순수 적혈구 세포성 빈혈(pure red cell anemia), 특발성 저혈소판증(idiopathic thrombocytopenia), 다발연골염(polychondritis), 베게너의 육아종증(Wegener's granulomaltosis), 만성 활성 간염(chronic active hepatitis), 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 특발성 스프루(idiopathic sprue), 편평 태선(lichen planus), 그레이브씨병(Graves' disease), 사르코이드증, 초기 담즙 경화(primary biliary cirrhosis), 후부 포도막염(uveitis posterior), 간질성 폐섬유증(interstitial lung fibrosis), 이식편-대-숙주 질환, 골수 이식, 간 이식, 또는 임의의 기관 또는 조직의 이식과 같은 이식의 사례(동형 또는 이형 조직을 이용한 이식 포함), 아토피성 알레르기와 같은 알레르기, AIDS, 및 백혈병 및/또는 림프종과 같은 T-세포 종양이 포함된다.
생체내 방법으로, 치료 조성물(예, 본 발명의 항체를 함유하는 조성물)을 개체에 투여한다. 일반적으로, 항체는 약학적으로 허용가능한 담체(예, 생리식염수)에 현탁하여 경구 투여, 정맥내 주입, 또는 피하, 근육내, 척수강내(intrathecal), 복막내, 직장내, 질내, 비내, 위내, 기도내, 또는 폐내 주사 또는 삽입된다.
필요 투여량은 투여 경로의 선정, 제형의 성질, 개체의 질환 특성, 개체의 신장, 체중, 표면적, 나이 및 성별, 그외 투여중인 약물 및 주치의의 판단에 따라 결정된다. 적정 투여량은 0.01-100.0 mg/kg의 범위이다. 이용가능한 조성물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 상이한 효율성의 측면에서 요구되는 투여량에 있어서의 다양한 변화가 예상된다. 예컨대, 경구 투여는 정맥내 주사에 의한 투여에 비해 더 많은 투여량이 필요할 것으로 예측된다. 이러한 투여량의 변동은 당업계에 잘 이해되고 있는 최적화를 위한 표준 공식 경로를 사용하여 조정할 수 있다. 적절한 전달 비히클(예컨대, 폴리머 미세입자 또는 삽입가능 기구)내 조성물의 캡슐화는 특히 경구 전달시 전달 효율성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 담체 및 유효량의 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 약학적 조성물은 전술한 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 용매, 분산 매질, 코팅제, 항세균제, 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적인 방법을 사용하여 상이한 투여 경로를 위한 제형으로 제형화될 수 있다. 예컨대, 경구 투여용 캡슐, 겔 실(gel seal), 또는 정제로 제형화될 수 있다. 캡슐은 젤라틴 또는 셀룰로오스와 같은 약학적으로 허용되는 임의의 표준 물질을 함유할 수 있다. 정제는 조성 혼합물을 고체 담체 및 윤활제와 함께 압축함으로써 전형적인 절차에 따라 제형화할 수 있다. 고체 담체의 예는 전분 및 슈가 벤토나이트를 포함한다. 조성물은 또한 락토오스 또는 만니톨과 같은 바인더, 통상적인 충전제 및 정제화제를 함유하는 캡슐 또는 경피 정제(hard shell tablet)의 형태로 투여할 수 있다. 약학적 조성물은 비경구 경로로 투여할 수 있다. 비경구 제형의 예는 수용액, 등장 염수 또는 5% 글루코오스 활성 제제, 또는 기타 공지의 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 시클로덱스트린 또는 당업계에 알려진 가용화제를 치료제 전달을 위한 약학적 부형제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 효능은 시험관내 및 생체내에서 평가할 수 있다. 예로, 하기 실시예들을 참조한다. 간략하게 설명하면, 상기 조성물은 시험관내에서 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 능력에 대해 조사할 수 있다. 생체내 연구에서, 조성물을 동물(예, 마우스 모델)에 주입한 후, 그것의 치료 효과를 분석할 수 있다. 그 결과를 토대로, 적정 투여량 범위와 투여 경로를 결정할 수 있다.
하기 구체적인 실시예들은 예시로서 개시된 것으로, 어떠한 방식으로도 한정하는 것으로 아니다. 추가의 노력없이도, 당업자는 본 발명에 기재된 바를 토대로 본 발명을 최대한 이용할 수 있을 것이다. 본 발명에 원용된 참조문헌들은 그 전체로서 본 발명에 포함된다.
실시예 1: 마우스 단일클론 항체 15A7, 43B6 및 9F9
항- PSGL -1 항체의 제조
표준 기법을 이용하여 인간 PSGL-1(hCD162)에 특이적으로 결합하는 마우스 단일클론 항체를 제조하였다. 보다 구체적으로는, 마우스를 PHA-활성화된 인간 T 세포의 막 분획으로 면역화한 다음 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 죽였다. 수득한 하이브리도마 세포주의 상층액으로부터 안정적으로 hCD162을 발현하는 CHO 세포주에 대한 결합성을 스크리닝하였다. hCD162-발현 CHO 세포에 결합하나 모 CHO 세포에는 결합하지 않는 항체를 생산하는 세포주를 확인하여, 서브클로닝한 다음 하기와 같이 추가적으로 분석하였다.
동정된 세포주는 ml52-15A7, ml66-43B6, 및 ml28-9F9이다. 이들은 각각 IgGl 항체 15A7, 43B6, 및 9F9를 생산한다. 면역블롯 분석으로, 이들 3가지 항체들이 항-hCD162 항체(kpl-1, PharMingen, San Diego, CA)에 의해 검출되는 단백질을 활성화된 T 세포의 용해물로부터 잡는다는 것이 확인되었다.
상기 3종의 항체는 활성화된 T 세포의 세포자살을 유도하는 능력에 대해 평가하였다. 3종의 하브리도마 세포주에 의해 분비된 단일클론 항체를 포함하는 배양 상층액을 각각 미활성화된 인간 T 세포(0일) 또는 시험관내에서 활성화된 인간 T 세포(7일)중 어느 하나와 6시간동안 반응시켰다. 이후, 세포를 아넥신 V로 염색하고 FACS 분석을 수행하였다. CD3-양성 세포는 시험관내에서 활성화된 인간 T 세포 또는 휴지기(resting) 인간 T 세포중 어느 하나를 계수하는데 사용하였다. 세포자살적 세포는 아넥신 V 염색에 양성이었다. 표 1은 스캐닝한 T세포 전체에서 세포자살성 T 세포의 퍼센트를 나타낸 것이다.
표 1. 세포자살성 T 세포의 퍼센트
무처리 항-myc m128-9F9 무처리 항-myc m152-15A7 m166-43B6
0일 4.17 6.67 5.82 18.18 15.52 5.23 6.57
7일 12.63 13.36 28.71 24.18 23.08 51.66 49.44
이러한 결과는 마우스 15A7, 43B6, 및 9F9 항체들이 (1) hCD162에 특이적이며, (2) 활성화된 T 세포에 결합하여 휴지기 인간 T 세포가 아닌 활성화된 T 세포에 세포자살을 유도할 수 있음을 나타낸다.
또한, 세포자살 분석은 PHA-활성화된 인간 말초혈관 단핵구 세포(PHA-activated human peripheral blood mononuclear cells (PBMC))에 대해 수행하였다. 항체는 활성화된 T 세포에서만 세포자살을 유도하며, 휴지기 T 세포, B 세포 또는 호중구에서는 세포자살을 유도하지 않는 것으로 발견하였다.
항-CD3과 같은 T 세포 고갈성 항체들은 가용성 인자의 생산을 유도할 수 있 는 것으로 알려져 있다. 이러한 항체들을 이용한 치료법은 해로운 사이토카인 증후군을 일반적으로 초래한다. 항-PSGL-1 항체 역시 사이토카인 관련 부작용을 초래하는지 여부를 시험하기 위해, 신선하게 분리한 인간 PBMC를 15A7과 함께, 24, 48 또는 72시간 배양하였다. 이후, 상층액내의 사이토카인의 수준을 측정하였다. 상당량의 IL-2, TNF-α, 및 IFN-γ가 PHA-활성화된 PBMC(양성 대조군)에서 생성되었으나, 15A7-처리된 세포에서는 이들 사이토카인은 검출되지 않았다. 이러한 결과는 항-PSGL-1은 휴지기 말초 혈관 세포에 대해 세포자살 유도 및 세포 활성화 두가지 측면에서 효과가 없거나 또는 거의 없음을 뒷받침한다.
전술한 항체들은 휴지기 T 세포 또는 다른 면역 세포에 부작용을 야기하지 않으면서 활성화된 T 세포에만 선택적으로 세포자살을 유도하므로, 이를 개체에게 투여하더라도 항-CD3 또는 면역억제제와 유사한 림프구 감소증 또는 광범위의 면역결핍증을 초래하진 않을 것이다.
항- CD162 항체의 에피토프 맵핑( mapping )
인간 CD162에 대한 마우스 15A7, 43B6 및 9F9의 결합성 에피토프를 맵핑하기 위해, 인간 CD162의 다양한 부위를 포괄하는 일련의 융합 단백질을 발현시켜 정제하였다. 융합 단백질과 이들 단일클론 항체들간의 상호작용은 샌드위치 효소 연계 면역흡착법(ELISA)로 시험하였다.
간략하게 보면, 인간 CD162의 여러가지 부위를 포괄하는 단편들을 인간 면역글로불린 감마1 중쇄 불변부와 함께 융합 단백질로서 E. coli에서 발현시켰다. 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변부를 코딩하는 cDNA를 BglII 및 BamHI 사이트를 가지는 프라이머로 PCR로 증폭시켰다. PCR 산물은 BglII 및 BamHI로 절단하여 동일 효소로 절단한 pET-32a 벡터(Novagen)에 서브클로닝하였다. 이후, hCD162의 여러가지 부위를 코딩하는 cDNA를 5'말단에 NdeI 부위를 가지고 3' 말단에 BglII 부위를 가지는 프라이머로 PCR하여 증폭시켰다. 이 PCR 산물은 해당 효소로 절단하고, pET-32a 벡터내 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 부위를 코딩하는 서열내(in frame)에 융합시켰다. 각 구축시 사용한 프라이머는 표 2에 나열하였고, 프라이머 서열은 표 3에 나열하였다.
표 2. 각 실험에 사용된 프라이머 명
증폭 코딩 서열 정방향 프라이머 역방향 프라이머
E. coli에서 발현된 hCD162 단편
42-119
42-80
61-99
81-119
42-70
42-60
50-80
50-70
42-319
115-126
115-126EtoR
AB1001
AB1001
AB1003
Ab1004
AB1001
AB1001
AB1002
AB1002
AB1001
AB1022
AB1024
AB1005
AB1008
AB1009
AB1005
AB1007
AB1006
AB1008
Ab1007
Ab1010
AB1023
AB1025
cDNA V 부위
경쇄
중쇄
AB1058
AB1058
AB1059
AB1060
포유류에서 발현된 hCD162 단편
1-119
1-319
110-319
94-148
119-222
174-269
214-317
AB1011
AB1011
AB1058
AB1020
AB1018
AB1016
AB1014
AB1013
AB1012
AB1059
AB1021
AB1019
AB1017
AB1015
키메라 체인
15A7 경쇄
15A7 중쇄
9F9 경쇄
9F9 중쇄
43B6 경쇄
43B6 중쇄
AB1030
AB1032
AB1026
AB1028
AB1034
AB1036
AB1031
AB1033
AB1027
AB1029
AB1035
AB1037
인간화 체인
15A7 경쇄
15A7 경쇄 제 1쌍
15A7 경쇄 제 2쌍
15A7 경쇄 제 3쌍
15A7 경쇄 제 4쌍
15A7 중쇄
15A7 중쇄 제 1쌍
15A7 중쇄 제 2쌍
15A7 중쇄 제 3쌍
15A7 중쇄 제 4쌍
AB1048
AD1049
AB1051
AB1053
AB1055
AB1038
AB1039
AB1041
AB1043
AB1045
AB1057
AB1050
AB1052
AB1054
Ab1056
AB1047
AB1040
AB1042
AB1044
AB1046
표 3. 프라이머 서열
명칭 서열
AB1001 cccgggacCATATGcaggccaccgaatatgagtacc
AB1002 tatgagCATATGgattatgatttcctgccagaaacgg
AB1003 aaacggagCATATGgaaatgctgaggaacagcactgacacc
AB1004 aacccctCATATGaccactgtggagcctgctgcaaggcg
AB1005 gtggtcAGATCTtccatagctgctgaatccgtggacagg
AB1006 GTTCCTCAGATCTTCTGGAGGCTCCGTTTCTGGCAGG
AB1007 AGGCCCAAGATCTGGAGTGGTGTCAGTGCTGTTCCTC
AB1008 ggctccAGATCTgtagactcaggggttccaggccc
AB1009 gtggtcAGATCTgtgactgcccctcctgcatccaggcc
AB1010 GCCAGCAGATCTTGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGGG
AB1011 cgcggatccatgcctctgcaactcctcctgttgc
AB1012 GCCAGCCTCGAGCTTCACAGAGATGTGGTCTGGGG
AB1013 GGTCTGctcgagCATAGCTGCTGAATCCGTGGACAGGTTC
AB1058 agacaggccaccgaagggaacctgtccacg
AB1059 cgtggacaggttcccttcggtggcctgtct
AB1014 ccgctcgagcgccaagattaggatggc
AB1015 cgggatccactcaaaccacagccatgg
AB1016 ccgctcgagtggtagtaggttccatgg
AB1017 cgggatcaactcaacccacaggcctg
AB1018 ctgtgcctcgagggctgtggtttgagtg
AB1019 cgggatccatggagatacagaccactcaac
AB1020 cgggatccgatgcaggaggggcagtcac
AB1021 ggccgtcactcgagttgtctgtgcctc
AB1022 TatgGATTCAGCAGCTATGGAGATACAGACCACTCAACCAgcA
AB1023 GATCTgcTGGTTGAGTGGTCTGTATCTCCATAGCTGCTGAATCCA
AB1024 TatgGATTCAGCAGCTATGCGGATACAGACCACTCAACCAgcA
AB1025 GATCTgcTGGTTGAGTGGTCTGTATCCGCATAGCTGCTGAATCCA
AB1026 CTAGTCTAGATGACCCAAACTCCACTCTCCC
AB1027 CTAGTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTAGCATCAGCCCGTTTGATTTCC
AB1028 TAACATtctagATGCTGTTGGGGCTGAAGTGGG
AB1029 GGATAGTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGG
AB1030 CTAGTCTAGATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGG
AB1031 CTAGTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTTTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCC
AB1032 CTAGTCTAGATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTTCC
AB1033 CTAGTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGttcc
AB1034 CTAGTCTAGATGGATTTTCTGGTGCAGATTTTCAGC
AB1035 CTAGTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTAGCATCAGCCCGTTTCAGCTCC
AB1036 CTAGTCTAGATGGAATGGAGCTGGGTCTTTCTC
AB1037 CTAGTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCAGCTTCCAGTGGATAGACTGATGG
AB1038 TCTATCTAGATGAACTTCGGGTCCAGCTTGATTTTCCTTGTCCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTG
AB1039 CCTTGTTTTAAAAGGTGTCCAGTGTGAAGTGCAACTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGG
AB1040 CTGAAAGTGAATCCAGAGGCTGCACAGGAGAGTCTCAAGCTTCCTCCAGGCTGCACTAAGCCTCC
AB1041 GCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTTTGGAATGCACTGGGTTCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGACTCGAG
AB1042 GCATAGAAGATGGTACTACTGCCACCATTAATGTATGCGACCCACTCGAGTCCCTTCCCTGGAGCC
AB1043 GTAGTACCATCTTCTATGCAAACGCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCC
AB1044 CCTCAGCCCTCAGAGAATTCATTTGCAGGTACAGGGTGTTCTTGGCATTATCTCTGGAGATGG
AB1045 GAATTCTCTGAGGGCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGATATGCTAGTTACGGAGG
AB1046 CTGTGACCAGGGTGCCTTGGCCCCAATAGTCCATAGCACCCCCTCCGTAACTAGCATATC
AB1047 ACCCTCTAGAGGTTGTGAGGACTCACCTGAGGAGACTGTGACCAGGGTGCCTTGGCC
AB1048 TCTATCTAGATGGAGACAGACACAATCCTGCTATGGGTGCTGCTGCTCTGGGTTCCAGGC
AB1049 GCTGCTCTGGGTTCCAGGCTCCACTGGTGACATTCAGATGACCCAATCTCCGAGCTCTTTG
AB1050 GATCTGCAGGTGATAGTGACCCTATCCCCTACAGACGCAGACAAAGAGCTCGGAGATTGG
AB1051 CACTATCACCTGCAGATCTAGTCAGAGCATTGTACATAATGATGGAAACACCTATTTTGAATG
AB1052 GATGAGAAGCTTGGGTGCCTTTCCTGGTTTCTGTTGGTACCATTCAAAATAGGTGTTTC
AB1053 GCACCCAAGCTTCTCATCTATAAAGTTTCCAATCGATTTTCTGGTGTCCCATCCAGGTTTAGTGGC
AB1054 GCAGAGAAGAGATGGTGAGGGTGAAGTGTGTCCCAGACCCACTGCCACTAAACCTGGATGG
AB1055 CTCACCATCTCTTCTCTGCAGCCGGAGGATTTCGCAACCTATTACTGTTTTCAAG
AB1056 CCTTGGTGCCTTGACCGAACGTGAGAGGAACATATGAACCTTGAAAACAGTAATAGG
AB1057 ACCCTCTAGAATTAGGAAAGTGCACTTACGTTTGATTTCCACCTTGGTGCCTTGACCG
AB1058 TATATCTAGAATTCCCCCCCCCCCCCCCCC
AB1059 TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC
AB1060 TATAGAGCTCAAGCTTCCAGTGGATAGAC(C/A/T)GATGGGG(C/G)TGT(C/T)GTTTTGGC
전술한 발현 구조체들을 E. coli BL21(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 세포는 IPTG(2 mM)로 유도한 후 6시간 지난 후 수득하고, PBS에 현탁하였다. 세포를 초음파처리하고, 14,00O g에서 10분간 회전시킨 다음, 수득된 상층액을 융합 단백질 정제를 위해 모았다. 보다 구체적으로, 상층액은 먼저 단백질 G 또는 단백질 A 비드와 4 ℃에서 3시간동안 반응시켰다. 이후 비드는 3,000g로 회전 침전시킨 다음 세척 완충액 I(0.05% Triton X-100, 5O mM Tris-HCl, pH 8.5, 400 mM NaCl, 1 mM CaCl2 및 l mg/㎖ OVA) 및 세척 완충액 II(0.05% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 및 150 mM of NaCl)로 각각 5회씩 세정하였다. 결합된 단백질은 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.7가 함유된 용출 완충액으로 용출시킨 다음 1 M Tris-HCl, pH 8.6로 중화시켰다. 정제한 모든 융합 단백질은 Bio-Rad 단백질 분석(Bio-Rad Laboratories, Cat. No. 500-0006)으로 정량하고, SDS-PAGE로 검증하였다.
hCD162 단편과 각각의 15A7, 9F9, 및 43B6 사이의 상호작용을 연구하기 위해 샌드위치 ELISA를 실시하였다. 96웰 마이크로타이터 플레이트를 염소 항-인간 IgG(Southern Biotechnology, Cat. No. 2040-01) 항체(2 ㎍/㎖, 50 ㎕/well)로 4 ℃에서 하룻밤동안 코팅하였다. 이후 37 ℃에서 1시간동안 PBS(150 ㎕/well) 중의 0.25% BSA를 넣어 플레이트를 블록킹하였다. 블록킹한 플레이트는 이후 실온에서 2시간동안 여러가지 인간 CD162(2 ㎍/㎖) 단편을 포함하는 융합 단백질과 반응시켰다. 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS(PBST)로 4번 세정한 다음, 테스트 항체(2 ㎍/㎖)와 실온에서 1.5시간동안 반응시켰다. 반응 후, 플레이트는 PBST로 4번 세정하였다. 알카리 포스파타제(Southern Biotechnology, Cat. No. 1031-04)가 접합된 1 : 3000으로 희석한 염소 항-마우스 IgG 50 ㎕을 각 웰에 첨가하고, 플레이트는 37 ℃에서 1시간동안 두었다. 여기에 알카리 포스파타제 기질 용액(0.012 M Na2CO3, 0.16 M NaHCO3 및 1 mM MgCl2, pH 8.6를 포함하는 기질 완충액 5 ㎖에 용해시킨 알카리 포스파타제 기질 정제 1개) 50 ㎕을 첨가하여 효소 반응을 실시하였고, 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 43B6와 9F9는 성숙형 인간 CD162의 50 - 60번 잔기를 포함하는 모든 융합 단백질과 상호작용할 수 있는 것으로 확인되었으며, 이는 43B6 및 9F9의 에피토프가 잔기 50-60 사이에 위치되어 있음을 의미한다. 9F9와 43B6과는 달리, 15A7은 잔기 42-319를 포괄하는 융합 단백질에만 결합하고, 42-119를 포괄하는 융합 단백질에는 결합하지 않았는데, 이는 15A7 에피토프는 잔기 119-319 사이에 위치되어 있음을 의미한다. 15A7 에피토프의 위치는 이후 잔기 115-126으로 축소되 었다. 120번 아미노산을 변이(Glu -> Arg)시키면 15A7과 융합 단백질간의 상호작용이 없어졌는데, 이는 인간 CD162상에 15A7 도메인이 일차적으로 접촉하는 위치는 120번이거나 인접한 곳이며, 잔기 Glu가 상기 상호작용에 필수적임을 나타낸다.
여러가지 인간 CD162 부위들을 포괄하는 융합 단백질들을 또한 포유류 세포에서 발현시켜, 15A7과의 상호작용을 시험하였다. 이들 부위를 포괄하는 단편들은 인간 면역글로불린 감마1 중쇄 불변부와 융합 단백질로서 포유류 세포에서 발현시켰다. 먼저, 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변부를 코딩하는 cDNA를 pcDNA3 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다. 이후, hCD162의 여러가지 부위를 코딩하는 cDNA들을 5'말단에 BamHI 부위를 가지고 3' 말단에 XhoI 부위를 가지는 프라이머로 PCR하여 증폭시켰다. 이 PCR 산물은 해당 효소로 절단하고, 인간 면역글로불린 감마 1 중쇄 불변부를 포함하는 pcDNA3 벡터에 서브클로닝하였다. 각 프라이머의 명칭 및 서열은 표 2 및 표 3에 나타나 있다.
상기 포유류 발현 벡터는 제조사의 안내서에 따라 리포펙타민2000(Invitrogen, Cat. No. 11668-027)을 사용하여 COS-7 세포로 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포는 울트라 low-Ig 배지(Invitrogen, Cat. No. 16250-078)에서 배양하였다. 발현된 단백질들을 정제하고, 전술한 방법으로 샌드위치 ELISA을 수행하였다.
ELISA 결과는 잔기 94-148을 포함하는 융합 단백질만 15A7과 상호작용할 수 있음을 보인다. 이들 결과는 15A7 에피토프가 잔기 115-126 사이에 위치되어있다는 생각과 일치된다.
전술한 모든 결과들은, 3종의 항체 모두 세균에서 발현시킨 융합 단백질에 결합하므로, 9F9, 43B6 및 15A7 에피토프들이 탄수화물 수정에 의존적이지 않고 단백질에 의존적임을 나타낸다. 또한, 15A7, 9F9, 및 43B6은 활성화된 T 세포에서 세포자살을 유도하는 기능 및 결합 특이성 측면에서 유사한 특성을 보이지만, 이들은 인간 CD1162의 여러가지 도메인들을 통해 작용하며, 다르게 작용한다는 것을 의미한다.
실시예 2: 키메라 항체 15A7, 43B6 및 9F9
항- CD162 항체의 경쇄 및 중쇄 가변부의 클로닝
항체 15A7, 43B6 및 9F9의 경쇄 및 중쇄 가변부(VL 및 VH)를 코딩하는 cDNA를 앵커 PCR(anchored PCR) 방법으로 증폭시켰다. 말단 데옥시트랜스퍼라제를 이용하여 cDNA에 C 부위와 혼성화하는 3' 프라이머 및 G 테일에 혼성화하는 5' 프라이머를 붙였다. PCR 단편들은 pCRII 벡터(Invitrogen)에 클로닝하였다. 각 체인에 대한 수개의 독립 클론들의 서열을 분석 및 비교하였다. 각각의 클론들 대부분에서 나타나는 서열을 선별하였다. 번역된 아미노산 서열을 이후 분석하여, 선별한 서열이 전형적인 마우스 경쇄 또는 중쇄 V 부위의 특징들을 가지며 특정 서브타입에 속한다는 것을 확인하였다. 번역된 아미노산 서열을 각 서브타입의 보존적인 서열과 비교하여 CDR을 결정하였다. 사용한 각 프라이머의 명칭 및 서열은 상기 표 2 및 3에 나타나 있다. 15A7, 43B6 및 9F9의 중쇄 및 경쇄 V 부위에 대한 유추 아미노산 서열(서열번호 19-24)은 개요에 나타낸다.
키메라 항체
키메라 항체를 발현하는 벡터를 제조하기 위해, 15A7, 43B6, 및 9F9의 VL 및 VH를 코딩하는 cDNA를 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시켜 5' 시그널 펩티드 서열과 3' 스플라이스 도너 시그널을 포함시켰다. 또한, 프라이머로 PCR 산물의 양 말단에 XbaI 부위를 도입하여, 이후 XbaI 효소로 전달한 다음 XbaI으로 절단한 pVk, pVgl, pVg2, 또는 pVg4 벡터에 연결시켰다. 보다 구체적으로는, 15A7, 43B6 및 9F9의 VL 부위 cDNA를 플라스미드 pVk에 서브클로닝하였다. 이 플라스미드는 CMV 프로모터와 인간 경쇄 불변부를 코딩하는 서열을 포함한다. 15A7, 43B6 및 9F9의 VH 부위는 플라스미드 pVgl, pVg2, 또는 pVg4에 서브클로닝하였다. 3개의 플라스미드 각각은 CMV 프로모터를 가지고 있다. 또한, 이들 각각은 IgGl, IgG2, 및 IgG4의 인간 중쇄 불분부를 포함한다.
전술한 경쇄 코딩 플라스미드 각각을 중쇄 코딩 플라스미드와 함께 COS-7 세포에 공동으로 형질감염하였다. 형질감염된 세포의 상층액을 수집하였다. 상층액중의 키메라 항체는 인간 CD162에 결합하는 능력과 활성화된 T 세포의 세포 자살을 유도하는 능력에 대해 분석하였다.
그 결과, 15A7, 43B6 및 9F9로부터 제조한 키메라 항체 모두 인간 CD162를 안정적으로 발현하는 Sp2/0 형질전환체에 결합하였으나, Sp2/0 모세포에는 결합하지 않았는데, 이는 이들에 CD162 결합 특이성이 남아 있음을 시사한다. 더욱이, 키메라 항체는 7일동안 활성화된 T 세포에 세포자살을 유발하였는데, 이는 상기 항 체에 마우스측의 기능도 역시 유지되어 있음을 의미한다.
인간화 항체
마우스 15A7의 CDR을 인간 프래임워크상에 이식함으로써 인간화 항체를 제조하였다. 결합 친화성 및 특이성을 유지시키기 위해선, 인간 프래임워크상에 CDR을 이식시켰을때 V 부위의 구조를 유지시키는 것이 필수적이다. 적절한 프래임워크 도너를 선별하기 위해 마우스 15A7 경쇄 및 중쇄 V 부위의 아미노산 서열들을 인간화된 50개의 마우스 항체들의 부위와 비교하였다.
마우스 항체, mDREG-55는 마우스 15A7 V 부위가 경쇄 및 중쇄 모두에서 서열 상동성이 높은 것으로 확인되었다. 하기에 상기 mDREG-55 항체에 대한 마우스 15A7의 서열 정렬을 나타낸다(CDR 강조):
경쇄 정렬:
mDREG-55 DIVLTQSPASLSVSLGERASISCKASQSVDY-DGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLES
DI++TQ+P SL VSLG++ASISC++SQS+ + DG++Y WY QKPGQ PKLLIY SN S
m15A7 DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHNDGNTYFEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFS
mDREG-55 GIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIK
G+P RFSGSGSGT FTLNI VE ED YYC Q + P TF GGTKLE+K
m15A7 GVPDRFSGSGSGTHFTLNISRVEAEDLGIYYCFQGSYVPLTFGAGTKLELK
중쇄 정렬:
MDREG-55 EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSTYAMSWVRQTPEKRLEWVASISTGGST-YYPDSVKG
+V+LVESGGGLV+PGGS KLSCAASGFTFS++ M WVRQ PEK LEWVA I+ G ST +Y ++VKG
m15A7 DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKG
MDREG-55 RFTISRDNARNILYLQMSSLRSEDTAMYYCAR--DY-DGYFDYWGQGTTLTVSS
RFTISRDN +N L+LQM+ LRSEDTA+YYC R Y G DYWGQGT++TVSS
m15A7 RFTISRDNPKNTLFLQMTILRSEDTAIYYCGRYASYGGGAMDYWGQGTSVTVSS
마우스 DREG-55는 L-셀렉틴에 대한 단일클론 IgGl 항체이다. 마우스 15A7 VL 및 VH 부위의 서열은 마우스 DREG55의 해당 부위와 각각 64.3%(프래임워크는 73.8%) 및 70%(프래임워크는 81.6%)의 상동성을 나타내었다. 인간화 DREG-55(HuDREG-55)를 인간 항체 Gal유래 VL 및 VH 부위의 프래임워크 서열을 이용하여 구축하였다. 따라서, 마우스 15A7을 인간화하기 위해 인간 Gal 중쇄 및 경쇄의 프래임워크 서열을 사용하여 마우스 15A7의 반대 부분을 치환하였다.
인간화된 15A7 경쇄 및 중쇄 가변부를 각각 합성 올리고뉴클레오티드 4쌍(길이 ~ 80bp)에 의해 조합하였다. 각 올리고뉴클레오티드 쌍은 약 20개 뉴클레오티드가 중첩된다. 시그널 펩티드를 포함하는 인간화된 가변부의 단백질 서열을 코딩하도록, 뉴클레오티드 서열을 선택 및 합성하였다. 유전자의 조합 및 증폭은 4단 계로 수행하였다: (1) 4쌍의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링하고, 4번의 각각의 반응으로 클레나우 단편으로 연장시키고; (2) 수득한 4개의 dsDNA 단편들을 쌍으로 혼합하여 변성 및 다시 어닐링하고, 2번의 별도의 반응으로 연장시키고; (3) 수득한 2개의 dsDNA 단편을 혼합, 변성, 다시 어닐링 및 연장하여 최종 전장 dsDNA를 제조하고; 및 (4) 제조된 DNA는 프라이머로 PCR하여, 양 말단에 XbaI 부위를 도입하였다. PCR 단편은 이후 XbaI으로 전달하여 XbaI으로 절단된 pVk 및 pVg4 벡터에 삽입하였다. 이후, CDR과 프래임워크가 상호작용하는 위치가 중요한 것으로 여겨지는 위치에서, Gal 잔기를 다시 마우스 15A7(즉, I62V 및 D74H)의 것으로 변경하였다. 하기에 mDREG-55에 대한 마우스 15A7 및 인간화 15A7(Hu15A7)을 정렬하여 나타내며, V62와 H74는 밑줄로 표시한다.
경쇄 정렬:
hDREG-55 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVDY-DGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLES
mouse 15A7 DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHNDGNTYFEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFS
Hu15A7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSIVHNDGNTYFEWYQQKPGKAPKLLIYKVSNRFS
hDREG-55 GIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEIK
m15A7 GVPDRFSGSGSGTHFTLNISRVEAEDLGIYYCFQGSYVPLTFGAGTKLELK
Hu15A7 GVPSRFSGSGSGTHFTLTISSLQPEDFATYYCFQGSYVPLTFGQGTKVEIK
중쇄 정렬:
hDREG-55 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVASISTGGST-YYPDSVKG
m15A7 DVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKG
Hu15A7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPGKGLEWVAYINGGSSTIFYANAVKG
hDREG-55 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR--DY-DGYFDYWGQGTLVTVSS
m15A7 RFTISRDNPKNTLFLQMTILRSEDTAIYYCGRYASYGGGAMDYWGQGTSVTVSS
Hu15A7 RFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYASYGGGAMDYWGQGTLVTVSS
따라서, 수득된 플라스미드는 인간화 15A7 중쇄 및 경쇄를 코딩한다. 이들 플라스미드는 COS-7 세포에 공동 형질감염시켰다. 배양한 세포로부터 상층액(exhausted supernatant)을 수집하였다. 상층액내 인간화 15A7은 hCD162를 안정적으로 발현하는 CHO 형질전환체에 결합하여 7일간 활성화된 T 세포에 세포자살을 유도하는 능력에 대해 조사하였다. 그 결과, 상기 능력이 유지되어 것으로 나타났다.
키메라 및 인간화 항체의 제조
인간화 및 키메라 항체를 생산하는 세포를 제조하였다. 보다 구체적으로는, Sp2/0 세포(Sp2/0-Agl4; ATCC CRL 1581)에 적정 플라스미드를 제조사의 지침서에 따라 360 V 및 25 μF 전기 용량으로 유전자 펄서 장치(Gene Pulser apparatus, Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 안정적으로 형질감염시켰다. 형질감염 전에, 플라스미드에 BamHI 효소를 처리하여 선형화하였다. 모든 형질감염은 PBS중에 107 세포 및 플라스미드 DNA 20 ㎍을 사용하여 수행하였다. 각 형질감염에서 세포는 96웰 조직 배양 플레이트 2개에 접종하였다. 48시간 후, 선별 배지(DMEM l0% FBS/하이폭산틴/티미딘 배지 보충제) 및 l ㎍/㎖의 미코페놀산을 가하였다. 항체 생산 세포를 스크리닝하고 배양 상층액내 항체의 존재를 ELISA로 테스트하여 분리하였다.
분리된 세포는 혈청 결핍성 또는 low-Ig 배지에서 배양하고, 배양 상층액을 수집하였다. 이후 스타필로코코스 단백질 A-세파로스 CL-4B 컬럼을 통과시켜 항체를 정제하였다. 각각 세척 완충액 I(0.05% Triton X-100, 5O mM Tris-HCl, pH 8.5, 400 mM NaCl, 1 mM CaCl2 및 1 mg/㎖ OVA) 및 세척 완충액 II(0.05% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl, pH 8.5 및 150 mM of NaCl)로 5번씩 세정한 후, 0.1 M 글리신-HCl, pH 2.7를 포함하는 용출 완충액을 사용하여 결합한 항체를 용출시킨 다음 1 M Tris-HCl, pH 8.6로 중화하였다.
친화성 측정
전술한 마우스, 키메라 및 인간화 15A7 항체의 결합 친화성을 경쟁적 결합으로 측정하였다.
EZ-Link Sulfo-NHS-비오틴 시스템(Pierce Biotechnology, Cat. No. 21217)을 사용하여 마우스 15A7를 바이오틴화하였다. 즉, 마우스 15A7 0.5 mg(3.3 x 10-6 nmoles)을 PBS 187 ㎕에 용해하고, Sulfo-NHS-비오틴 6.8 x l0-5 nmole과 혼합하였다. 이후, 혼합물은 2시간동안 얼음위에 둔 후, PBS에 대해 4 ℃에서 하룻밤동안 투석하여, 결합되지 않은 비오틴을 제거하였다. 비오틴으로 표지된 마우스 15A7는 사용하기 전까지 4 ℃에서 보관하였다.
인간 CD162를 안정적으로 발현하는 Sp2/0 형질감염체를 인간 CD162 항원의 공급원으로서 사용하였다. 비오틴으로 표지된 마우스 15A7는 추적원(tracer)으로 사용하였다. 경쟁자 항체(마우스, 키메라 또는 인간화 15A7)의 양을 증가시켜 비오틴으로 표지된 마우스 15A7 35 ng과 혼합하여, 1 x 105 CD162 발현 Sp2/0 세포와 함께 4 ℃에서 1.5시간동안 일정한 교반 조건으로 배양하였다. 세정 후, 이차항체, 스트렙타비딘-PE(Becton Dickinson Immunocytometry System Inc. Cat. No. 349023)을 혼합물에 첨가하였다. 4 ℃에서 45분간 배양한 후, 세포를 다시 세정하고, 1% FBS가 첨가된 PBS 300 ㎕에 재현탁한 후 FACS 분석을 수행하였다.
그 결과, 마우스 15A7의 최대 경쟁 농도 1/2은 3.72 ㎍/㎖이었으나, 키메라 및 인간화 15A7의 농도는 각각 약 5.71 ㎍/㎖ 및 4.51 ㎍/㎖이었다. 이러한 결과는 마우스, 키메라 및 인간화 15A7의 친화성이 비교됨을 의미한다. 즉, 마우스 15A7의 결합 친화성(Ka)은 4.03 x 107 M-1이지만, 키메라 및 인간화 15A7의 결합 친화성은 각각 2.62 x 107 M-1 및 3.33 x 107 M-1이었다.
경쟁적 분석
경쟁적 분석을 수행하여, 전술한 3종의 마우스 항체들, PSGL-1 및 P-셀렉틴들간의 상호작용을 연구하였다.
P-셀렉틴은 마우스 백혈구상의 PSGL-1에 대한 주된 고친화성 리간드이다. 상기 3종의 항체들이 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴의 결합을 방지하는지를 조사하기 위 해, 활성화된 T 세포에 대한 정재된 인간 P-셀렉틴의 결합성을 상기 3종의 항체의 존재하에 측정하였다. P-셀렉틴과 PSGL-1의 상호작용을 차단하는 것으로 알려진 KPL-1을 양성 대조군으로 사용하였다.
인간 PBMC를 2일간 1% PHA로 활성화시키고, 3일간 IL-2 함유 배지에 두었다. 이후, 세포를 적정화된 9F9, 15A7, 43B6, KPL-1(PSGL-1 길항제) 또는 대조군 항체(9E10)와 함께 30분간 둔 다음, 재조합 인간 P-셀렉틴(1.25 ㎍/㎖)을 첨가하였다. 활성화된 T 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합은 FACS상에서 분석한 항-P-셀렉틴으로 측정하였다.
기존 보고들과 일치되게, KPL-1은 활성화된 T 세포에 대한 P-셀랙틴의 결합을 저농도(0.31 ㎍/㎖)에서 거의 완전히 저해하였다. 43B6은 활성화된 T 세포에 대한 P-셀렉틴의 결합을 KPL-1에서와 같이 효과적으로 차단하였지만, 동일한 효과를 이루기 위해서는 9F9가 보다 높은 농도로 필요하였다. 실제, 결합을 50%로 방지하는데 0.08 ㎍/㎖ KPL 또는 43B6이 필요하였다. 이와는 반대로, 9F9는 5 ㎍/㎖이 필요하였다. 더욱이, 15A7은 20 ㎍/㎖의 농도에서도 P-셀렉틴의 결합 저해 효과를 나타내지 않았으며, 놀랍게도 이는 PSGL-1에 대한 P-셀렉틴의 결합을 증강시켰다. 이러한 결과는, 15A7와 P-셀렉틴이 활성화된 T 세포의 다른 PSGL-1 모티프에 결합함을 시사한다.
15A7이 PSGL-1에 대해 P-셀렉틴과 경쟁하지 않는다는 사실은, 15A7의 생체내 투여시 P-셀렉틴-의존적 백혈구 보충을 간섭함으로써 선천성 면역에 작용할 것으로 추측되지 않음을 나타낸다.
PSGL-1은 혈소판에서 낮은 수준으로 발현되는 것으로 보고되고 있다. 혈소판에 대한 15A7 항체의 효과를 조사하였다. 그 결과, 항체는 인간 혈소판의 응집을 증강 또는 저해하지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 3: 마우스 PSGL -1에 대한 햄스터 단일클론 항체 TAB4
마우스 PSGL-1에 대한 단일클론 항체, TAB4를 실시예 1과 유사한 방법으로 제조하였다. 이는 시험관내에서 T 세포의 세포자살을 유도하였고, 생체내에서 T 세포를 고갈시켰다. 이것이 마우스 PSGL-1과 마우스 P-셀렉틴의 결합을 방해하는지를 확인하기 위해, 실시예 2의 방법과 유사한 방법으로 경쟁적 분석을 수행하였다. 그 결과, TAB4는 20 ㎍/㎖과 같이 높은 농도에서도 마우스 PSGL-1에 대한 마우스 P-셀렉틴의 결합을 저해하지 못하였다.
실시예 4: 마우스 단일클론 항체들 4B7, 5 C4 , 12 E7 , 14B3, 17 E5 , 및 18 D12
인간 PSGL-1에 대한 추가적인 단일클론 항체들 4B7, 5C4, 12E7, 14B3, 17E5, 및 18Dl2를 특정화하였다. 활성화된 T 세포에 결합하여, 이들은 활성화된 T 세포의 사멸을 모두 유도하였다. 이들이 PSGL-1과 P-셀렉틴간의 상호작용을 차단하는지를 확인하기 위해, 실시예 2의 방법으로 경쟁적 분석을 수행하였다. 그 결과, 테스트한 최고 농도에서도 인간 PSGL-1에 대한 인간 P-셀렉틴의 결합에 대해 어떠한 저해 효과도 거의 가지지 않았다.
그외 구현예들
본 명세서에 개시된 모든 구성은 모든 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 구성은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적으로 위한 대체 구성으로 치 환될 수 있다. 따라서, 별도로 언급되지 않는 한, 개시된 각 구성은 일반적인 동등하거나 유사한 구성 시리드의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 필수적인 특징을 용이하게 이해할 것이며, 본 발명이 사상 및 범위로부터 이탈되지 않으면서 다양한 사용 및 조건에 이를 적응시키기 위해 본 발명의 여러가지 변화 및 수정을 가할 수 있다. 따라서, 다른 구현예들 역시 본 발명의 범위에 속한다.
SEQUENCE LISTING <110> AbGenomics Corporation <120> ANTIBODIES <130> A0871.70002WO00 <140> PCT/US2005/016357 <141> 2005-05-10 <150> US 60/569,892 <151> 2004-05-10 <160> 100 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu 1 5 10 15 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Ser Phe Gly Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Arg Ala Ser Ser Thr Val Asn Ser Thr Tyr Leu His 1 5 10 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Gly Ser Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gln Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Ala Tyr Tyr Ile His 1 5 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Pro Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp 1 5 10 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 16 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Thr Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 1 5 10 15 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp 1 5 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 <210> 19 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr 85 90 95 Leu Asn Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Leu Lys 130 <210> 20 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala 65 70 75 80 Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110 Tyr Tyr Cys Gly Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 21 <211> 130 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Met Asp Phe Leu Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ala Met Ser Arg Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Ser Thr Val Asn Ser Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly 50 55 60 Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu 115 120 125 Leu Lys 130 <210> 22 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 Thr Ala Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Arg Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 Pro Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 23 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys 130 <210> 24 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly 1 5 10 15 Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Thr Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Thr 85 90 95 Gln Ser Met Ile Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 Gly Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 115 120 125 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 25 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(393) <400> 27 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat att ttg atg acc caa act cca ctg tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tca ata tct tgc aga tct agt cag agc att 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 gta cat aat gat gga aac acc tat ttt gaa tgg tac ctg cag aaa cca 192 Val His Asn Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aaa ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aat cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca cat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr 85 90 95 ctc aac atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga att tat tac tgc 336 Leu Asn Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttt caa ggt tca tat gtt cct ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg 384 Phe Gln Gly Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gag ctg aaa 393 Glu Leu Lys 130 <210> 28 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(417) <400> 28 atg gac tcc agg ctc aat tta gtt ttc ctt gtc ctt att tta aaa ggt 48 Met Asp Ser Arg Leu Asn Leu Val Phe Leu Val Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gat gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag 96 Val Gln Cys Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 cct gga ggg tcc cgg aaa ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc act ttc 144 Pro Gly Gly Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agc ttt gga atg cac tgg gtt cgt cag gct cca gag aag ggg ctg 192 Ser Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtc gca tac att aat ggt ggc agt agt acc atc ttc tat gca 240 Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala 65 70 75 80 aac gca gtg aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aat ccc aag aat 288 Asn Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn 85 90 95 acc ctg ttc ctg caa atg acc att cta agg tct gag gac acg gcc att 336 Thr Leu Phe Leu Gln Met Thr Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile 100 105 110 tat tac tgt gga agg tat gct agt tac gga ggg ggt gct atg gac tat 384 Tyr Tyr Cys Gly Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr 115 120 125 tgg ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 417 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 29 <211> 390 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(390) <400> 29 atg gat ttt ctg gtg cag att ttc agc ttc ttg cta atc agt gcc tca 48 Met Asp Phe Leu Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 gtt gca atg tcc aga gga gaa aat gtg ctc acc cag tct cca gca atc 96 Val Ala Met Ser Arg Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile 20 25 30 atg tct gca tct cca ggg gaa aag gtc acc atg acc tgc agg gcc agc 144 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 tca act gta aat tcc act tac ttg cac tgg ttc cag cag aag tca ggt 192 Ser Thr Val Asn Ser Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly 50 55 60 gcc tcc ccc aaa ctc tgg att tat ggc tca tcc aac ttg gct tct gga 240 Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc 288 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 85 90 95 aca atc agc agt gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cag 336 Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 cag tac agt ggt tac cca ctc acg ttc ggt gct ggg acc acg ctg gag 384 Gln Tyr Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Thr Leu Glu 115 120 125 ctg aaa 390 Leu Lys 130 <210> 30 <211> 414 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(414) <400> 30 atg gaa tgg agc tgg gtc ttt ctc ttc ctc ctg tca gtc act aca ggt 48 Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Leu Leu Ser Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 gtc cac tct gag gtc cag ctg cag cag tct gga cct gac ctg gtg aag 96 Val His Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys 20 25 30 cct ggg gct tta gtg aag ata tcc tgc aag gct tct ggt tac tca ttc 144 Pro Gly Ala Leu Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45 act gcc tac tac att cac tgg gtg aag cag agc cat gga aag agc ctt 192 Thr Ala Tyr Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu 50 55 60 gag tgg att gga cgt gtt aat cct aat act ggt ggt act agc tac aac 240 Glu Trp Ile Gly Arg Val Asn Pro Asn Thr Gly Gly Thr Ser Tyr Asn 65 70 75 80 ccg aag ttc aag ggc aag gcc ata tta aat gta gat aag tca tcc agc 288 Pro Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Asn Val Asp Lys Ser Ser Ser 85 90 95 aca gcc tac atg gag ctc cgc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga tcg gga tcc ccc tac tat agg tac gac gac tgg 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Ser Pro Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Trp 115 120 125 ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 414 Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 31 <211> 393 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(393) <400> 31 atg aag ttg cct gtt agg ctg ttg gtg ctg atg ttc tgg att cct gct 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala 1 5 10 15 tcc agc agt gat gtt ttg atg acc caa act cca ctc tcc ctg cct gtc 96 Ser Ser Ser Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val 20 25 30 agt ctt gga gat caa gcc tcc atc tct tgc aga tct agt cag agc att 144 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile 35 40 45 gta aat agt aat gga aac acc tat tta gaa tgg tac ctg cag aaa cca 192 Val Asn Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 50 55 60 ggc cag tct cca aag ctc ctg atc tac aaa gtt tcc aac cga ttt tct 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 65 70 75 80 ggg gtc cca gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggg aca gat ttc aca 288 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctc aag atc agc aga gtg gag gct gag gat ctg gga gtt tat tac tgc 336 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys 100 105 110 ttt caa ggt tca cat gtt ccg tgg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg 384 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 gaa atc aaa 393 Glu Ile Lys 130 <210> 32 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)...(417) <400> 32 atg ctg ttg ggg ctg aag tgg gtt ttc ttt gtt gtt ttt tat caa ggt 48 Met Leu Leu Gly Leu Lys Trp Val Phe Phe Val Val Phe Tyr Gln Gly 1 5 10 15 gtg cat tgt gag gtg cag ctt gtt gag act ggt gga gga ttg gtg cag 96 Val His Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 cct aaa ggg tca ttg aaa ctc tca tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc 144 Pro Lys Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 aat acc aat gcc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggt ttg 192 Asn Thr Asn Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gaa tgg gtt gct cgc ata aga agt aaa agt aat aat tat gca aca tat 240 Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr 65 70 75 80 tat gcc gat tca gtg aaa gac agg ttc acc atc tcc aga gat gat aca 288 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Thr 85 90 95 caa agc atg atc tat ctg caa atg aac aac ttg aaa act gag gac aca 336 Gln Ser Met Ile Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 ggc atg tat tac tgt gtg aga ggg gga agc tac tgg tac ttc gat gtc 384 Gly Met Tyr Tyr Cys Val Arg Gly Gly Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val 115 120 125 tgg ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 417 Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 33 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 33 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 34 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 34 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Asn 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Asn Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 35 <211> 116 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 35 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 36 <211> 120 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 36 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Asn Gly Gly Ser Ser Thr Ile Phe Tyr Ala Asn Ala Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Arg Tyr Ala Ser Tyr Gly Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 37 <211> 111 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 38 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 39 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 cccgggacca tatgcaggcc accgaatatg agtacc 36 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 tatgagcata tggattatga tttcctgcca gaaacgg 37 <210> 41 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 aaacggagca tatggaaatg ctgaggaaca gcactgacac c 41 <210> 42 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 42 aacccctcat atgaccactg tggagcctgc tgcaaggcg 39 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 43 gtggtcagat cttccatagc tgctgaatcc gtggacagg 39 <210> 44 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 44 gttcctcaga tcttctggag gctccgtttc tggcagg 37 <210> 45 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 45 aggcccaaga tctggagtgg tgtcagtgct gttcctc 37 <210> 46 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 46 ggctccagat ctgtagactc aggggttcca ggccc 35 <210> 47 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 47 gtggtcagat ctgtgactgc ccctcctgca tccaggcc 38 <210> 48 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 gccagcagat cttgcttcac agagatgtgg tctgggg 37 <210> 49 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 cgcggatcca tgcctctgca actcctcctg ttgc 34 <210> 50 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 gccagcctcg agcttcacag agatgtggtc tgggg 35 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ggtctgctcg agcatagctg ctgaatccgt ggacaggttc 40 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 52 agacaggcca ccgaagggaa cctgtccacg 30 <210> 53 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 53 cgtggacagg ttcccttcgg tggcctgtct 30 <210> 54 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 54 ccgctcgagc gccaagatta ggatggc 27 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 55 cgggatccac tcaaaccaca gccatgg 27 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 56 ccgctcgagt ggtagtaggt tccatgg 27 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 57 cgggatcaac tcaacccaca ggcctg 26 <210> 58 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 58 ctgtgcctcg agggctgtgg tttgagtg 28 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 59 cgggatccat ggagatacag accactcaac 30 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 60 cgggatccga tgcaggaggg gcagtcac 28 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 61 ggccgtcact cgagttgtct gtgcctc 27 <210> 62 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 tatggattca gcagctatgg agatacagac cactcaacca gca 43 <210> 63 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 63 gatctgctgg ttgagtggtc tgtatctcca tagctgctga atcca 45 <210> 64 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 64 tatggattca gcagctatgc ggatacagac cactcaacca gca 43 <210> 65 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 65 gatctgctgg ttgagtggtc tgtatccgca tagctgctga atcca 45 <210> 66 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 66 ctagtctaga tgacccaaac tccactctcc c 31 <210> 67 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 67 ctagtctaga attaggaaag tgcacttagc atcagcccgt ttgatttcc 49 <210> 68 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 68 taacattcta gatgctgttg gggctgaagt ggg 33 <210> 69 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 69 ggatagtcta gaggttgtga ggactcacct gaggagacgg tgaccgtgg 49 <210> 70 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 70 ctagtctaga tggagacaga cacactcctg ttatggg 37 <210> 71 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 71 ctagtctaga attaggaaag tgcacttttt ccagcttggt cccccctcc 49 <210> 72 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 72 ctagtctaga tggactccag gctcaattta gttttcc 37 <210> 73 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 73 ctagtctaga ggttgtgagg actcacctga ggagacggtg actgaggttc c 51 <210> 74 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 74 ctagtctaga tggattttct ggtgcagatt ttcagc 36 <210> 75 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 75 ctagtctaga attaggaaag tgcacttagc atcagcccgt ttcagctcc 49 <210> 76 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 76 ctagtctaga tggaatggag ctgggtcttt ctc 33 <210> 77 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 77 ctagtctaga ggttgtgagg actcaccagc ttccagtgga tagactgatg g 51 <210> 78 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 78 tctatctaga tgaacttcgg gtccagcttg attttccttg tccttgtttt aaaaggtgtc 60 cagtg 65 <210> 79 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 79 ccttgtttta aaaggtgtcc agtgtgaagt gcaactggtg gagtctgggg gaggcttagt 60 gcagcctgg 69 <210> 80 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 80 ctgaaagtga atccagaggc tgcacaggag agtctcaagc ttcctccagg ctgcactaag 60 cctcc 65 <210> 81 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 81 gcctctggat tcactttcag tagctttgga atgcactggg ttcgccaggc tccagggaag 60 ggactcgag 69 <210> 82 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 82 gcatagaaga tggtactact gccaccatta atgtatgcga cccactcgag tcccttccct 60 ggagcc 66 <210> 83 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 83 gtagtaccat cttctatgca aacgcagtga agggccgatt caccatctcc agagataatg 60 cc 62 <210> 84 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 84 cctcagccct cagagaattc atttgcaggt acagggtgtt cttggcatta tctctggaga 60 tgg 63 <210> 85 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 85 gaattctctg agggctgagg acacggccgt gtattactgt gcaagatatg ctagttacgg 60 agg 63 <210> 86 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 86 ctgtgaccag ggtgccttgg ccccaatagt ccatagcacc ccctccgtaa ctagcatatc 60 <210> 87 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 87 accctctaga ggttgtgagg actcacctga ggagactgtg accagggtgc cttggcc 57 <210> 88 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 88 tctatctaga tggagacaga cacaatcctg ctatgggtgc tgctgctctg ggttccaggc 60 <210> 89 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 89 gctgctctgg gttccaggct ccactggtga cattcagatg acccaatctc cgagctcttt 60 g 61 <210> 90 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 90 gatctgcagg tgatagtgac cctatcccct acagacgcag acaaagagct cggagattgg 60 <210> 91 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 91 cactatcacc tgcagatcta gtcagagcat tgtacataat gatggaaaca cctattttga 60 atg 63 <210> 92 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 92 gatgagaagc ttgggtgcct ttcctggttt ctgttggtac cattcaaaat aggtgtttc 59 <210> 93 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 93 gcacccaagc ttctcatcta taaagtttcc aatcgatttt ctggtgtccc atccaggttt 60 agtggc 66 <210> 94 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 94 gcagagaaga gatggtgagg gtgaagtgtg tcccagaccc actgccacta aacctggatg 60 g 61 <210> 95 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 95 ctcaccatct cttctctgca gccggaggat ttcgcaacct attactgttt tcaag 55 <210> 96 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 96 ccttggtgcc ttgaccgaac gtgagaggaa catatgaacc ttgaaaacag taatagg 57 <210> 97 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 97 accctctaga attaggaaag tgcacttacg tttgatttcc accttggtgc cttgaccg 58 <210> 98 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 98 tatatctaga attccccccc cccccccccc 30 <210> 99 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 99 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46 <210> 100 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> 30 <223> n = c, a or t <220> <221> misc_feature <222> 38 <223> n = c or g <220> <221> misc_feature <222> 42 <223> n = c or t <400> 100 tatagagctc aagcttccag tggatagacn gatggggntg tngttttggc 50

Claims (49)

  1. 서열번호 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15 또는 16-18을 각각 포함하는 면역글로불린 체인.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 면역글로불린 체인은 서열번호 1-3 또는 4-6을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 체인.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 면역글로불린 체인은 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 체인.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 면역글로불린 체인은 서열번호 25 또는 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역글로불린 체인.
  5. 제 1항의 제1 면역글로불린 체인 및 제1항의 제2 면역글로불린 체인을 포함하며, 경쇄인 상기 제1 체인 및 중쇄인 상기 제2 체인은 각각 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6; 서열번호 7-9 및 서열번호 10-12; 또는 서열번호 13-15 및 서열번호 16-18을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 경쇄 및 중쇄는 각각 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6 을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 경쇄 및 중쇄는 각각 서열번호 19 및 20, 21 및 22, 23 및 24 또는 25 및 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 경쇄 및 중쇄는 각각 서열번호 25 및 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  9. P-셀렉틴 당단백질 리간드 1과 P-셀렉틴간의 결합을 간섭하지 않으면서 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 특이적으로 결합하며, 활성화된 T 세포상의 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 결합하여 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 항체로서, 상기 항체는 각각 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6을 포함하는 경쇄 및 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 항체는 인간 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  11. 삭제
  12. 제 9항에 있어서, 상기 경쇄 및 중쇄는 각각 서열번호 25 및 26을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  13. 인간 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1의 아미노산 잔기 115-126에 특이적으로 결합하는 항체.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 잔기 117-123에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 항체는 아미노산 잔기 119-121에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
  16. 제 13항에 있어서, 상기 항체는 각각 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6을 포함하는 경쇄 및 중쇄를 함유하는 것을 특징으로 하는 항체.
  17. 제 13항에 있어서, 상기 항체는 활성화된 T 세포상의 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 결합하여 활성화된 T 세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 항체.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 항체는 각각 서열번호 1-3 및 서열번호 4-6을 포함하는 경쇄 및 중쇄를 함유하는 것을 특징으로 하는 항체.
  19. 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 염증성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환 또는 T 세포암 중에서 선택된 질병의 진단, 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  20. 제 9항, 제10항 및 제 12항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 염증성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환 또는 T 세포암 중에서 선택된 질병의 진단, 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  21. 제 13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 염증성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환 또는 T 세포암 중에서 선택된 질병의 진단, 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  22. 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체임을 특징으로 하는 항체.
  23. 제 9항, 제10항 및 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체임을 특징으로 하는 항체.
  24. 제 13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체임을 특징으로 하는 항체.
  25. 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체임을 특징으로 하는 항체.
  26. 제 9항, 제10항 및 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체임을 특징으로 하는 항체.
  27. 제 13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 인간화 항체임을 특징으로 하는 항체.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 1항의 면역글로불린 체인을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  32. 제 3항의 면역글로불린 체인을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  33. 제 31항의 핵산을 포함하는 벡터.
  34. 제 32항의 핵산을 포함하는 벡터.
  35. 서열번호 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 13-15 또는 16-18을 코딩하는 핵산을포함하는 숙주 세포.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 세포는 세균성 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 포유류 세포는 하이브리도마 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  38. 서열번호 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 또는 26을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 세포는 세균성 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 포유류 세포는 하이브리도마 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  41. 인간 P-셀렉틴 당단백질 리간드 1에 특이적으로 결합하는 분리된 항체로서, 상기 항체는, (i) 인간 카파 경쇄 불변부에 연결된 서열번호 19의 가변부를 포함하는 경쇄 및 서열번호 20의 가변부를 포함하는 중쇄; 또는 (ii) 인간 카파 경쇄 불변부에 연결된 서열번호 25의 가변부를 포함하는 경쇄 및 서열번호 26의 가변부를 포함하는 중쇄, 를 포함하는 항체.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 항체는 인간 IgGl, IgG2, 또는 IgG4의 중쇄 불변부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 항체는, (i) 인간 카파 경쇄 불변부에 연결된 서열번호 25의 가변부를 포함하는 경쇄, 및 (ii) 인간 IgG4의 중쇄 불변부에 연결된 서열번호 26의 가변부를 포함하는 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  44. 제 41항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는, 염증성 질환, 자가면역 질환, 알레르기성 질환 또는 T 세포암 중에서 선택된 질병의 진단, 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  45. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 핵산.
  46. 제 45항의 핵산을 포함하는 벡터.
  47. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 또는 18을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 세포는 세균성 세포, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 또는 포유류 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 포유류 세포는 하이브리도마 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
KR1020067024896A 2004-05-10 2005-05-10 항체 KR101256400B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US56989204P 2004-05-10 2004-05-10
US60/569,892 2004-05-10
PCT/US2005/016357 WO2005110475A2 (en) 2004-05-10 2005-05-10 Antibodies

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070020048A KR20070020048A (ko) 2007-02-16
KR101256400B1 true KR101256400B1 (ko) 2013-04-26

Family

ID=35394680

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067024896A KR101256400B1 (ko) 2004-05-10 2005-05-10 항체

Country Status (28)

Country Link
US (8) US7604800B2 (ko)
EP (3) EP1765396B1 (ko)
JP (4) JP5623690B2 (ko)
KR (1) KR101256400B1 (ko)
CN (2) CN103980361B (ko)
AR (1) AR048781A1 (ko)
AU (1) AU2005244072C1 (ko)
BR (1) BRPI0510567B8 (ko)
CA (3) CA2566305C (ko)
DK (1) DK1765396T3 (ko)
EC (1) ECSP067056A (ko)
EG (1) EG26781A (ko)
ES (3) ES2448468T3 (ko)
HK (1) HK1102760A1 (ko)
IL (3) IL178838A (ko)
MX (1) MXPA06012986A (ko)
MY (1) MY148646A (ko)
NO (1) NO341844B1 (ko)
NZ (3) NZ590690A (ko)
PH (1) PH12015500247A1 (ko)
PL (1) PL1765396T3 (ko)
PT (1) PT1765396E (ko)
RU (1) RU2482131C2 (ko)
SG (2) SG10201606541UA (ko)
TW (2) TWI448474B (ko)
UA (1) UA100356C2 (ko)
UY (1) UY28886A1 (ko)
WO (1) WO2005110475A2 (ko)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040116333A1 (en) * 2001-08-03 2004-06-17 Rong-Hwa Lin Modulators of P-selectin glycoprotein ligand 1
US7744888B2 (en) 2001-08-03 2010-06-29 Abgenomics Cooperatief U.A. Methods of modulating T cell or natural killer cell activity with anti-P-selectin glycoprotein ligand 1 antibodies
MY148646A (en) * 2004-05-10 2013-05-15 Abgenomics Cooperatief Ua Anti-psgl-1 antibodies
NZ551625A (en) * 2004-05-11 2011-03-31 Abgenomics Cooperatief Ua T-cell death-inducing epitopes
WO2007067984A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-14 Wyeth Neutralizing antibodies against primate psgl-1 and uses therefor
EP2351777B1 (en) * 2008-10-28 2015-10-28 Shionogi&Co., Ltd. Anti-muc1 antibody
TWI633605B (zh) * 2008-10-31 2018-08-21 半導體能源研究所股份有限公司 半導體裝置及其製造方法
GB0822011D0 (en) * 2008-12-02 2009-01-07 Queen Mary & Westfield College Treatment
EP2473531A4 (en) 2009-09-03 2013-05-01 Merck Sharp & Dohme ANTI-GITRANT ANTIBODIES
US8889132B2 (en) * 2010-06-30 2014-11-18 Mount Sinai Hospital Antibodies against human HIF-1α
ES2387156B1 (es) * 2010-12-01 2013-07-04 Universidad Autónoma de Madrid Uso de psgl-1 para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y autoinmunes
WO2012174001A1 (en) * 2011-06-13 2012-12-20 Abgenomics Cooperatief U.A. Anti-psgl-1 antibodies and uses thereof
EP2769223A1 (en) 2011-10-17 2014-08-27 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Assessment of pml risk and methods based thereon
PT2888283T (pt) 2012-08-24 2018-11-16 Univ California Anticorpos e vacinas para serem utilizados no tratamento de cancros que expressam ror1 e inibição de metástases
TWI660972B (zh) * 2012-09-10 2019-06-01 愛爾蘭商尼歐托普生物科學公司 抗ｍｃａｍ抗體及相關使用方法
EP3334453A4 (en) * 2015-08-13 2019-02-06 New York University SPECIFIC ANTIBODY MOLECULES OF THE ASP421 EPITOPE TRUNCATED FROM THE TAU PROTEIN AND THEIR USES IN THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF TAUOPATHY
BR112018013912A2 (pt) * 2016-01-08 2018-12-18 Bioalliance C.V. anticorpos tetravalentes anti-psgl-1 e usos dos mesmos
WO2017214941A1 (zh) * 2016-06-16 2017-12-21 毛侃琅 一种提升SelP基因表达水平的慢病毒载体及其应用
CN109996544A (zh) 2016-06-27 2019-07-09 加利福尼亚大学董事会 癌症治疗组合
US11306150B2 (en) 2017-01-11 2022-04-19 Bristol-Myers Squibb Company Method of identifying a P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) antagonist
CN110740749A (zh) 2017-03-14 2020-01-31 戊瑞治疗有限公司 在酸性pH下与VISTA结合的抗体
CN112740043A (zh) 2018-07-20 2021-04-30 皮埃尔法布雷医药公司 Vista受体
TW202110891A (zh) * 2019-06-04 2021-03-16 美商維西歐製藥公司 抗psgl-1組合物及其用於調節骨髓細胞發炎表型之方法及用途
MX2022009044A (es) * 2020-01-22 2022-08-11 Shanghai Senhui Medicine Co Ltd Conjugado de farmaco de derivado de eribulin, metodo de preparacion y aplicacion del mismo en medicina.
AU2022394559A1 (en) * 2021-11-17 2024-05-09 Altrubio Inc. Methods of using anti-psgl-1 antibodies in combination with jak inhibitors to treat t-cell mediated inflammatory diseases or cancers

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049252A1 (en) 2001-08-03 2003-03-13 Rong-Hwa Lin Modulators of P-selectin glycoprotein ligand 1

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5464778A (en) 1989-03-08 1995-11-07 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Glycoprotein ligand for P-selectin and methods of use thereof
US5378464A (en) * 1989-03-08 1995-01-03 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Modulation of inflammatory responses by administration of GMP-140 or antibody to GMP-140
US5690933A (en) * 1989-05-31 1997-11-25 Glaxo Wellcome Inc. Monoclonal antibodies for inducing tolerance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
KR100272077B1 (ko) 1990-08-29 2000-11-15 젠팜인터내셔날,인코포레이티드 이종 항체를 생산할 수 있는 전이유전자를 가진 인간이외의 동물
US5709859A (en) * 1991-01-24 1998-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Mixed specificity fusion proteins
US6309639B1 (en) * 1991-02-05 2001-10-30 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method for inhibiting an inflammatory response using antibodies to P-selectin glycoprotein ligand
US6124267A (en) * 1991-02-05 2000-09-26 Southpac Trust Internationals, Inc. O-glycan inhibitors of selectin mediated inflammation derived from PSGL-1
US5972625A (en) * 1991-05-06 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Assays for inhibitors of leukocyte adhesion
CA2130173A1 (en) * 1992-03-17 1993-09-30 Norman Hardman Genetically engineered antibodies
US5843707A (en) * 1992-10-23 1998-12-01 Genetics Institute, Inc. Nucleic acid encoding a novel P-selectin ligand protein
US6210671B1 (en) 1992-12-01 2001-04-03 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with L-selectin
JPH08503617A (ja) * 1992-12-01 1996-04-23 プロテイン デザイン ラブズ、インコーポレーテッド Ｌ−セレクチンに反応性のヒト化抗体
US5710123A (en) * 1992-12-18 1998-01-20 Centocor, Inc. Peptide inhibitors of selectin binding
AU694933B2 (en) * 1993-01-25 1998-08-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Chimeric L- and P-selectin by exchange of domains - uses thereof
NZ266934A (en) * 1993-05-04 1997-07-27 Cytel Corp Blocking p-selectin antibody and compositions thereof
WO1995014787A1 (en) * 1993-11-22 1995-06-01 Centocor, Inc. Peptide inhibitors of selecting binding
AU723262B2 (en) 1995-08-03 2000-08-24 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The Peptide and O-glycan inhibitors of selectin mediated inflammation
US6348581B1 (en) * 1996-10-31 2002-02-19 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-TAG-72 monoclonalantibodies
JP3248570B2 (ja) * 1997-10-09 2002-01-21 日本電気株式会社 半導体装置の製造方法
WO1999043353A2 (en) * 1998-02-26 1999-09-02 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Combination anti-selectin and immunosuppressant therapy
JP2002528513A (ja) 1998-10-30 2002-09-03 ジェネティックス・インスチチュート・インコーポレーテッド Ｐ−セレクチンリガンド（ｐｓｇｌ）アンタゴニストによる細胞毒性ｔ−細胞分化の阻害
US6696620B2 (en) 2000-05-02 2004-02-24 Epicyte Pharmaceutical, Inc. Immunoglobulin binding protein arrays in eukaryotic cells
WO2001089564A2 (en) * 2000-05-19 2001-11-29 The Center For Blood Research, Inc. Methods for diagnosing and treating hemostatic disorders by modulating p-selectin activity
CN1124928C (zh) * 2000-07-11 2003-10-22 湛江包装材料企业有限公司 光降解双向拉伸聚丙烯薄膜的制造方法
EP1325123A4 (en) * 2000-09-12 2004-07-21 Inst Genetics Llc STENOSE- OR RESEARCH INHIBITION BY P-SELECTIN ANTAGONISTS
US20040001839A1 (en) * 2000-12-29 2004-01-01 Avigdor Levanon Multimers - isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US20040002450A1 (en) * 2000-12-29 2004-01-01 Janette Lazarovits Y17 - isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
CA2433225A1 (en) 2000-12-29 2002-07-11 Bio-Technology General, Inc. Isolated molecules comprising epitopes containing sulfated moieties, antibodies to such epitopes, and uses thereof
US6884619B2 (en) * 2001-07-17 2005-04-26 Yale University Inhibition of BEHAB cleavage and primary central nervous system (CNS) tumors
US20040116333A1 (en) 2001-08-03 2004-06-17 Rong-Hwa Lin Modulators of P-selectin glycoprotein ligand 1
MY148646A (en) 2004-05-10 2013-05-15 Abgenomics Cooperatief Ua Anti-psgl-1 antibodies
NZ551625A (en) 2004-05-11 2011-03-31 Abgenomics Cooperatief Ua T-cell death-inducing epitopes
WO2012174001A1 (en) 2011-06-13 2012-12-20 Abgenomics Cooperatief U.A. Anti-psgl-1 antibodies and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049252A1 (en) 2001-08-03 2003-03-13 Rong-Hwa Lin Modulators of P-selectin glycoprotein ligand 1

Also Published As

Publication number Publication date
MXPA06012986A (es) 2007-02-12
AU2005244072B2 (en) 2012-05-31
CA2907141C (en) 2016-05-31
TWI402274B (zh) 2013-07-21
US20130101587A1 (en) 2013-04-25
WO2005110475A2 (en) 2005-11-24
BRPI0510567B1 (pt) 2018-11-13
US20050266003A1 (en) 2005-12-01
TW201313740A (zh) 2013-04-01
EP2377889A3 (en) 2012-03-28
JP5623690B2 (ja) 2014-11-12
TW200536860A (en) 2005-11-16
BRPI0510567B8 (pt) 2021-05-25
US20150183870A1 (en) 2015-07-02
DK1765396T3 (en) 2014-02-24
EP1765396A2 (en) 2007-03-28
ES2602633T3 (es) 2017-02-21
CA2907141A1 (en) 2005-11-24
AU2005244072A1 (en) 2005-11-24
EP1765396B1 (en) 2013-11-20
CN103980361B (zh) 2017-06-23
NZ590690A (en) 2012-10-26
CA2812040C (en) 2016-05-03
WO2005110475A3 (en) 2006-02-23
US8361472B2 (en) 2013-01-29
NZ551626A (en) 2010-03-26
US9631019B2 (en) 2017-04-25
CA2812040A1 (en) 2005-11-24
MY148646A (en) 2013-05-15
RU2006143686A (ru) 2008-06-20
US8287871B2 (en) 2012-10-16
CN1984680A (zh) 2007-06-20
CN103980361A (zh) 2014-08-13
IL178838A0 (en) 2007-03-08
JP2011200247A (ja) 2011-10-13
PT1765396E (pt) 2014-02-25
EP2377890A2 (en) 2011-10-19
US20110172397A1 (en) 2011-07-14
EP2377889B1 (en) 2016-07-13
US7604800B2 (en) 2009-10-20
EG26781A (en) 2014-09-07
SG10201606541UA (en) 2016-09-29
UA100356C2 (ru) 2012-12-25
PL1765396T3 (pl) 2014-07-31
BRPI0510567A (pt) 2007-11-20
KR20070020048A (ko) 2007-02-16
CN1984680B (zh) 2014-11-05
AR048781A1 (es) 2006-05-24
US20130102762A1 (en) 2013-04-25
EP2377890A3 (en) 2011-12-28
AU2005244072C1 (en) 2012-09-20
US20090191204A1 (en) 2009-07-30
JP2014223084A (ja) 2014-12-04
NO341844B1 (no) 2018-02-05
TWI448474B (zh) 2014-08-11
CA2566305C (en) 2014-10-14
ES2448468T3 (es) 2014-03-14
PH12015500247A1 (en) 2015-12-14
EP2377889A2 (en) 2011-10-19
CA2566305A1 (en) 2005-11-24
ES2598034T3 (es) 2017-01-24
US8663641B2 (en) 2014-03-04
ECSP067056A (es) 2007-01-26
HK1102760A1 (en) 2007-12-07
US8828397B2 (en) 2014-09-09
EP2377890B1 (en) 2016-08-10
US20090198044A1 (en) 2009-08-06
IL228033A0 (en) 2013-09-30
NZ578647A (en) 2012-04-27
SG187443A1 (en) 2013-02-28
UY28886A1 (es) 2005-12-30
JP2014094010A (ja) 2014-05-22
US20170190782A1 (en) 2017-07-06
EP1765396A4 (en) 2008-07-02
IL228032A0 (en) 2013-09-30
IL178838A (en) 2017-08-31
US10030075B2 (en) 2018-07-24
NO20065542L (no) 2007-01-31
RU2482131C2 (ru) 2013-05-20
JP2007536933A (ja) 2007-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101256400B1 (ko) 항체
RU2676078C2 (ru) Молекулы, связывающие il-6
AU2012201999B2 (en) Antibodies
WO2022247826A1 (zh) 靶向pd-l1和cd73的特异性结合蛋白

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160328

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180330

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190329

Year of fee payment: 7