WO2022191158A1

WO2022191158A1 - 抗体－リソソーム酵素融合蛋白質の製造方法

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Publication number: WO2022191158A1
Application number: PCT/JP2022/009851
Authority: WO
Inventors: 真司柿本; 剛福井; 勇吉秦野; 彩夏小谷; 拓也三浦; 俊史石黒
Original assignee: Ｊｃｒファーマ株式会社
Priority date: 2021-03-09
Filing date: 2022-03-08
Publication date: 2022-09-15
Also published as: JP2022138142A; CN116917493A; EP4299756A1; CA3212813A1; AU2022234150A1; US20240158436A1; TW202246326A; MX2023010523A; AU2022234150A9; KR20230154043A; BR112023018268A2

Abstract

抗体をリソソーム酵素と融合させた融合蛋白質の製造方法が開示されている。当該方法は，抗体とヒトリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質の製造方法であって，（ａ）該融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して該融合蛋白質を培養液中に分泌させ，（ｂ）該培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収し，（ｃ）該培養上清から，該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて，該融合蛋白質を精製することを含んでなるものである。

Description

抗体－リソソーム酵素融合蛋白質の製造方法

　本発明は，抗体をリソソーム酵素と融合させた融合蛋白質の製造方法に関し，例えば，該融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することにより得られる組換え融合蛋白質を，医薬として利用できる純度にまで精製する方法に関する。

　現在，組換え蛋白質を有効成分として含有してなる多くの医薬が市販されている。このような組換え蛋白質は，目的の蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した宿主細胞を培養することにより，培養上清中に得られたものである。培養上清中に得られた組換え蛋白質は，そのままでは夾雑物を含むので医薬として使用できない。医薬として使用するためには，培養上清中に含まれる組換え蛋白質を精製する必要がある。

　哺乳動物細胞を宿主細胞として用い，この宿主細胞を培養して培養上清中に得られた組換え蛋白質を，医薬として使用できるレベルにまで精製する方法が報告されている。例えば，赤芽球前駆細胞に働いて赤血球へと分化させ赤血球の産生を促進する糖蛋白質であるヒトエリスロポエチン（ｈＥＰＯ）を，宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ，これを培養上清から色素アフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている（特許文献１）。また例えば，卵巣でのエストロゲンの生産及び分泌を促進する活性を有する性腺刺激ホルモンの一種であるヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）を，宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ，これを培養上清から陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている（特許文献２）。また例えば，ヘパラン硫酸やデルマタン硫酸のようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子内に存在する硫酸エステル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素の一種であるヒトイズロン酸－２－スルファターゼ（ｈＩ２Ｓ）を，宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ，これを培養上清から陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている（特許文献３）。また例えば，糖脂質及び糖蛋白質の末端α－ガラクトシル結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素の一種であるヒトα－ガラクトシダーゼＡ（hα-Gal A）を，宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ，これを培養上清から陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている（特許文献４，特許文献５）。更に例えば，ＤＮＡを塩基配列非特異的に分解する活性を有するヒトＤＮａｓｅＩを，宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ，これを培養上清から陰イオン交換カラムクロマトグラフィー及び色素リガンドアフィニティーカラムクロマトグラフィーを含む各種クロマトグラフィーを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている（特許文献６）。更に例えば，ヒトイズロン酸－２－スルファターゼと結合させた抗ｈＴｆＲ抗体を，宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いて組換え蛋白質として発現させ，これを培養上清からプロテインＡアフィニティーカラムクロマトグラフィー，ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて医薬に使用できるまで精製する方法が報告されている（特許文献７）。

　このように，医薬として使用できる組換え蛋白質を取得するために，それぞれの組換え蛋白質について，独自の精製方法が開発されている。

特表２０１０－５１１３７８号公報特開２００９－２７３４２７号公報特表２０１４－５０８５０６号公報国際公開第２０１４／０１７０８８号国際公開第２０１６／１１７３４１号国際公開第２０１６／０６７９４４号国際公開第２０１８／０３８２４３号

　本発明の目的は，抗体とリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質を，組換え蛋白質として発現させて，これを医薬として市場に流通させることが可能な純度にまで精製する方法を提供することである。

　上記目的に向けた研究において，本発明者らは，鋭意検討を重ねた結果，抗トランスフェリン受容体抗体とヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）とを融合させた融合蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を無血清培地中で培養することにより，培養液中に得られる融合蛋白質を，該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーの組み合わせにより精製することによって，高い純度で効率よく精製することができることを見出した。本発明は，これらの知見に基づき更に検討を加えて完成させたものである。すなわち，本発明は以下を提供する。
１．抗体とヒトリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質の製造方法であって，
（ａ）該融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して該融合蛋白質を培養液中に分泌させるステップと，
（ｂ）上記ステップ（ａ）で得られた培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収するステップと，
（ｃ）上記ステップ（ｂ）で得られた培養上清から，該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて，該融合蛋白質を精製するステップと，
を含んでなるものである，製造方法。
２．該ステップ（ｃ）において，該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを，この順で用いてなるものである，上記１の製造方法。
３．該抗体に親和性を有する物質が，該抗体の重鎖のＣＨ_１領域に親和性を有するものである，上記１又は２の製造方法。
４．該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陰イオン交換体が，強陰イオン交換体である，上記１乃至３のいずれかの製造方法。
５．該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陽イオン交換体が，弱陽イオン交換体である，上記１乃至４のいずれかの製造方法。
６．該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体である，上記１乃至５のいずれかの製造方法。
７．該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が，ヒト化抗体である，上記１乃至５のいずれかの製造方法。
８．該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原とするものである，上記１乃至７のいずれかの製造方法。
９．血管内皮細胞の表面に存在する該分子が，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ－Ｆ，有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ－８，モノカルボン酸トランスポーター，及びＦｃ受容体からなる群から選択されるものである，上記８の製造方法。
１０．該血管内皮細胞が脳血管内皮細胞である，上記８の製造方法。
１１．該脳血管内皮細胞の表面に存在する分子が，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ－Ｆ，有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ－８，及びモノカルボン酸トランスポーターからなる群から選択されるものである，上記１０の製造方法。
１２．該血管内皮細胞が，ヒトの血管内皮細胞である，上記８乃至１１のいずれかの製造方法。
１３．該抗体が，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって，
　該抗体が重鎖の可変領域において，ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
　該抗体が軽鎖の可変領域において，ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１乃至１２のいずれかの製造方法。
１４．該抗体が，重鎖のフレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３の製造方法。
１５．該抗体における該重鎖の可変領域が，配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１４の製造方法。
１６．該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３又は１４の製造方法。
１７．該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３又は１４の製造方法。
１８．該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列に対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３又は１４の製造方法。
１９．該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列に対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３又は１４の製造方法。
２０．該抗体における軽鎖の可変領域が，配列番号２０のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３乃至１９のいずれかの製造方法。
２１．該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３乃至１９のいずれかの製造方法。
２２．該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３乃至１９のいずれかの製造方法。
２３．該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列に対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３乃至１９のいずれかの製造方法。
２４．該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列に対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記１３乃至１９のいずれかの製造方法。
２５．該抗体の該重鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含むものである，上記１５の製造方法。
２６．該抗体の該軽鎖が，配列番号２２のアミノ酸配列を含むものである，上記２０又は２５の製造方法。
２７．該抗体がＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）である，上記１乃至２６のいずれかの製造方法。
２８．該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，該抗体の軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合しているものである，上記１乃至２７のいずれかの製造方法。
２９．該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，該軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して，結合しているものである，上記２８の製造方法。
３０．該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，該重鎖のＣ末端側又はＮ末端側においてリンカーを介して結合しているものである，上記２８の製造方法。
３１．該リンカー配列が，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，上記２９又は３０の製造方法。
３２．該リンカーが，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１のアミノ酸配列，配列番号２のアミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が１～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，上記３１の製造方法。
３３．該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼである，上記１乃至３２のいずれかの製造方法。
３４．該融合蛋白質における該抗体がＦａｂであり，
　該抗体の軽鎖が，配列番号２２のアミノ酸配列からなり，且つ
　該抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，配列番号４のアミノ酸配列からなるリンカーを介して，該ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合し，それにより該融合蛋白質が配列番号２７のアミノ酸配列を形成しているものである，上記３３の製造方法。
３５．該融合蛋白質における該抗体がＦａｂであり，
　該抗体の軽鎖が，配列番号２２のアミノ酸配列からなり，且つ
　該抗体の重鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列からなり，そのＣ末端側で，配列番号４のアミノ酸配列からなるリンカーを介して，配列番号６のアミノ酸配列からなるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合するものである，上記３３の製造方法。
３６．該ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼが，配列番号６又は７のアミノ酸配列を含んでなるものである，上記３３の製造方法。

　本発明によれば，中枢神経障害を伴うリソソーム病の治療剤として臨床的に用いることのできる純度にまで精製された，抗トランスフェリン受容体抗体とリソソーム酵素との融合蛋白質を提供することができる。特に，中枢神経障害を伴うハーラー症候群の治療剤として臨床的に用いることのできる純度にまで精製された，抗トランスフェリン受容体抗体とヒトＩＤＵＡとの融合蛋白質を提供することができる。

実施例４で得られたヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡ精製品のSE-HPLCのチャートを示す図。縦軸は215 nmでの吸光度，横軸は保持時間（分）を示す。(A)はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡの単量体に由来するピーク，(B)及び(C)はヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡの重合体に由来するピークをそれぞれ示す。

　本発明は，抗トランスフェリン受容体抗体（抗ＴｆＲ抗体）とヒトリソソーム酵素とを結合させた蛋白質の製造方法に関するものである。ここで，リソソーム酵素と結合させる抗体は，抗原に特異的に結合する性質を有するものである限り，抗体の動物種等に特に制限はないが，特にヒト抗体又はヒト化抗体である。例えば，抗体は，ヒト以外の哺乳動物の抗体であってもよく，またヒト抗体とヒト以外の他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体であってもよい。

　ヒト抗体は，その全体がヒト由来の遺伝子にコードされる抗体のことをいう。但し，遺伝子の発現効率を上昇させる等の目的で，元のヒトの遺伝子に変異を加えた遺伝子にコードされる抗体も，ヒト抗体である。また，ヒト抗体をコードする２つ以上の遺伝子を組み合わせて，ある一つのヒト抗体の一部を，他のヒト抗体の一部に置き換えた抗体も，ヒト抗体である。ヒト抗体は，免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。免疫グロブリン軽鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。免疫グロブリン重鎖の３箇所のＣＤＲは，Ｎ末端側にあるものから順にＣＤＲ１，ＣＤＲ２及びＣＤＲ３という。ある一つのヒト抗体のＣＤＲを，その他のヒト抗体のＣＤＲに置き換えることにより，ヒト抗体の抗原特異性，親和性等を改変した抗体も，ヒト抗体である。

　本発明において，元のヒト抗体の遺伝子を改変することにより，元の抗体のアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えた抗体も，ヒト抗体という。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個であり，より好ましくは１～１０個であり，更に好ましくは１～５個であり，更により好ましくは１～３個である。元の抗体のアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～２０個であり，より好ましくは１～１０個であり，更に好ましくは１～５個であり，更により好ましくは１～３個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。アミノ酸を付加させる場合，元の抗体のアミノ酸配列中又はＮ末端側若しくはＣ末端側に，好ましくは１～２０個，より好ましくは１～１０個，更に好ましくは１～５個，更により好ましくは１～３個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えた抗体も，ヒト抗体である。変異を加えた抗体のアミノ酸配列は，元の抗体のアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を示し，より好ましくは８５％以上の同一性を示し，更に好ましくは９０％以上の同一性を示し，更により好ましくは９５％以上の同一性を示し，なおも更に好ましくは９８％以上の同一性を示すものである。つまり，本発明において「ヒト由来の遺伝子」というときは，ヒト由来の元の遺伝子に加えて，ヒト由来の元の遺伝子に改変を加えることにより得られる遺伝子も含まれる。

　本発明において，「ヒト化抗体」の語は，可変領域の一部（例えば，特にＣＤＲの全部又は一部）のアミノ酸配列がヒト以外の哺乳動物由来であり，それ以外の領域がヒト由来である抗体のことをいう。例えば，ヒト化抗体として，ヒト抗体を構成する免疫グロブリン軽鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）と免疫グロブリン重鎖の３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ）を，他の哺乳動物のＣＤＲによって置き換えることにより作製された抗体が挙げられる。ヒト抗体の適切な位置に移植されるＣＤＲの由来となる他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウス及びラットであり，例えばマウスである。

　本発明において，抗体がヒト抗体又はヒト化抗体である場合につき，以下詳述する。ヒト抗体及びヒト化抗体の軽鎖には，λ鎖とκ鎖がある。抗体を構成する軽鎖は，λ鎖とκ鎖のいずれであってもよい。また，ヒト抗体及びヒト化抗体の重鎖には，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡ，ＩｇＤ及びＩｇＥに対応している。抗体を構成する重鎖は，γ鎖，μ鎖，α鎖，σ鎖及びε鎖のいずれであってもよいが，好ましくはγ鎖である。更に，抗体の重鎖のγ鎖には，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖があり，それぞれ，ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３及びＩｇＧ４に対応している。抗体を構成する重鎖がγ鎖である場合，そのγ鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体であり，且つＩｇＧである場合，その抗体の軽鎖はλ鎖とκ鎖のいずれでもあってもよく，その抗体の重鎖は，γ１鎖，γ２鎖，γ３鎖及びγ４鎖のいずれであってもよいが，好ましくは，γ１鎖又はγ４鎖である。例えば，好ましい抗体の一つの態様として，軽鎖がκ鎖であり重鎖がγ１鎖であるもの，軽鎖がλ鎖であり重鎖がγ１鎖であるものが挙げられる。

　本発明において，「キメラ抗体」の語は，２つ以上の異なる種に由来する，２つ以上の異なる抗体の断片が連結されてなる抗体のことをいう。

　ヒト抗体と他の哺乳動物の抗体とのキメラ抗体とは，ヒト抗体の一部がヒト以外の哺乳動物の抗体の一部によって置き換えられた抗体である。抗体は，以下に説明するＦｃ領域，Ｆａｂ領域及びヒンジ部とからなる。このようなキメラ抗体の具体例として，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域が他の哺乳動物の抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれかに由来する。逆に，Ｆｃ領域が他の哺乳動物に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又は他の哺乳動物の抗体のいずれに由来してもよい。

　また，抗体は，可変領域と定常領域とからなるということもできる。キメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）が他の哺乳動物の抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）が他の哺乳動物の抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）がヒト抗体に由来するものも挙げられる。ここで，他の哺乳動物の生物種は，ヒト以外の哺乳動物である限り特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，ウマ，又はヒト以外の霊長類であり，より好ましくはマウスである。

　ヒト抗体とマウス抗体のキメラ抗体は，特に，「ヒト／マウスキメラ抗体」という。ヒト／マウスキメラ抗体には，Ｆｃ領域がヒト抗体に由来する一方でＦａｂ領域がマウス抗体に由来するキメラ抗体や，逆に，Ｆｃ領域がマウス抗体に由来する一方でＦａｂ領域がヒト抗体に由来するキメラ抗体が挙げられる。ヒンジ部は，ヒト抗体又はマウス抗体のいずれかに由来する。ヒト／マウスキメラ抗体の他の具体例として，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）がヒト抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）がマウス抗体に由来するもの，逆に，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ）と軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ）がマウス抗体に由来する一方で，重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）及び軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）がヒト抗体に由来するものが挙げられる。

　抗体は，本来，２本の免疫グロブリン軽鎖と２本の免疫グロブリン重鎖の計４本のポリペプチド鎖からなる基本構造を有する。但し，本発明において，「抗体」というときは，この基本構造を有するものに加え，
（１）１本の免疫グロブリン軽鎖と１本の免疫グロブリン重鎖の計２本のポリペプチド鎖からなるものや，以下に詳述するように，
（２）免疫グロブリン軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体，及び
（３）免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖を結合させてなるものである一本鎖抗体も含まれる。また，
（４）本来の意味での抗体の基本構造からＦｃ領域が欠失したものであるＦａｂ領域からなるもの及びＦａｂ領域とヒンジ部の全部若しくは一部とからなるもの（Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）_２を含む）も，本発明における「抗体」に含まれる。

　ここでＦａｂとは，可変領域とＣ_Ｌ領域（軽鎖の定常領域）を含む１本の軽鎖と，可変領域とＣ_Ｈ１領域（重鎖の定常領域の部分１）を含む１本の重鎖が，それぞれに存在するシステイン残基同士でジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆａｂにおいて，重鎖は，可変領域とＣ_Ｈ１領域（重鎖の定常領域の部分１）に加えて，更にヒンジ部の一部を含んでもよいが，この場合のヒンジ部は，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠くものである。Ｆａｂにおいて，軽鎖と重鎖とは，軽鎖の定常領域（Ｃ_Ｌ領域）に存在するシステイン残基と，重鎖の定常領域（Ｃ_Ｈ１領域）又はヒンジ部に存在するシステイン残基との間で形成されるジスルフィド結合により結合する。Ｆａｂを形成する重鎖のことをＦａｂ重鎖という。Ｆａｂは，ヒンジ部に存在して抗体の重鎖どうしを結合するシステイン残基を欠いているので，１本の軽鎖と１本の重鎖とからなる。Ｆａｂを構成する軽鎖は，可変領域とＣ_Ｌ領域を含む。Ｆａｂを構成する重鎖は，可変領域とＣ_Ｈ１領域からなるものであってもよく，可変領域，Ｃ_Ｈ１領域に加えてヒンジ部の一部を含むものであってもよい。但しこの場合，ヒンジ部で２本の重鎖の間でジスルフィド結合が形成されないように，ヒンジ部は重鎖間を結合するシステイン残基を含まないように選択される。Ｆ（ａｂ’）においては，その重鎖は可変領域とＣ_Ｈ１領域に加えて，重鎖どうしを結合するシステイン残基を含むヒンジ部の全部又は一部を含む。Ｆ（ａｂ’）_２は２つのＦ（ａｂ’）が互いのヒンジ部に存在するシステイン残基どうしでジスルフィド結合により結合した分子のことをいう。Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）_２を形成する重鎖のことをＦａｂ’重鎖という。また，複数の抗体が直接又はリンカーを介して結合してなる二量体，三量体等の重合体も，抗体である。更に，これらに限らず，免疫グロブリン分子の一部を含み，且つ，抗原に特異的に結合する性質を有するものは何れも，本発明でいう「抗体」に含まれる。即ち，本発明において免疫グロブリン軽鎖というときは，免疫グロブリン軽鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。また，免疫グロブリン重鎖というときは，免疫グロブリン重鎖に由来し，その可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有するものが含まれる。従って，可変領域の全て又は一部のアミノ酸配列を有する限り，例えば，Ｆｃ領域が欠失したものも，免疫グロブリン重鎖である。

　また，ここでＦｃ又はＦｃ領域とは，抗体分子中の，Ｃ_Ｈ２領域（重鎖の定常領域の部分２），及びＣＨ３領域（重鎖の定常領域の部分３）からなる断片を含む領域のことをいう。

　更には，本発明において，「抗体」というときは，
　（５）上記（４）で示したＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）又はＦ（ａｂ’）_２を構成する軽鎖と重鎖を，リンカー配列を介して結合させて，それぞれ一本鎖抗体としたｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）_２も含まれる。ここで，ｓｃＦａｂ，ｓｃＦ（ａｂ’），及びｓｃＦ（ａｂ’）_２にあっては，軽鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖を結合させてなるものでもよく，また，重鎖のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖を結合させてなるものでもよい。更には，軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域をリンカー配列を介して結合させて一本鎖抗体としたｓｃＦｖも，本発明における抗体に含まれる。ｓｃＦｖにあっては，軽鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に重鎖の可変領域を結合させてなるものでもよく，また，重鎖の可変領域のＣ末端側にリンカー配列を，そして更にそのＣ末端側に軽鎖の可変領域を結合させてなるものでもよい。

　更には，本明細書でいう「抗体」には，完全長抗体，上記（１）～（５）に示されるものに加えて，上記（４）及び（５）を含むより広い概念である，完全長抗体の一部が欠損したものである抗原結合性断片（抗体フラグメント）のいずれの形態も含まれる。

　「抗原結合性断片」の語は，抗原との特異的結合活性の少なくとも一部を保持している抗体の断片のことをいう。結合性断片の例としては，例えば上記（４）及び（５）に示されるものに加えて，Ｆａｂ，Ｆａｂ’，Ｆ（ａｂ’）_２，可変領域（Ｆｖ），重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）とを適当なリンカーで連結させた一本鎖抗体（ｓｃＦｖ），重鎖の可変領域（Ｖ_Ｈ）と軽鎖の可変領域（Ｖ_Ｌ）を含むポリペプチドの二量体であるダイアボディ，ｓｃＦｖの重鎖（Ｈ鎖）に定常領域の一部（Ｃ_Ｈ３）が結合したものの二量体であるミニボディ，その他の低分子化抗体等を包含する。但し，抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また，これらの結合性断片には，抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず，遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。

　本発明において，「一本鎖抗体」というときは，免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質をいう。また，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列のＣ末端側にリンカー配列が結合し，更にそのＣ末端側に免疫グロブリン軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列が結合してなり，特定の抗原に特異的に結合することのできる蛋白質も，本発明における「一本鎖抗体」である。例えば，上記（２）及び（３）に示されるものは一本鎖抗体に含まれる。免疫グロブリン重鎖のＣ末端側にリンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖が結合した一本鎖抗体にあっては，通常，免疫グロブリン重鎖は，Ｆｃ領域が欠失している。免疫グロブリン軽鎖の可変領域は，抗体の抗原特異性に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有している。同様に，免疫グロブリン重鎖の可変領域も，ＣＤＲを３つ有している。これらのＣＤＲは，抗体の抗原特異性を決定する主たる領域である。従って，一本鎖抗体には，免疫グロブリン重鎖の３つのＣＤＲが全てと，免疫グロブリン軽鎖の３つのＣＤＲの全てとが含まれることが好ましい。但し，抗体の抗原特異的な親和性が維持される限り，ＣＤＲの１個又は複数個を欠失させた一本鎖抗体とすることもできる。

　一本鎖抗体において，免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の間に配置されるリンカー配列は，好ましくは２～５０個，より好ましくは８～５０個，更に好ましくは１０～３０個，更により好ましくは１２～１８個又は１５～２５個，例えば１５個若しくは２５個のアミノ酸残基から構成されるペプチド鎖である。そのようなリンカー配列は，これにより両鎖が連結されてなる抗ｈＴｆＲ抗体がｈＴｆＲに対する親和性を保持する限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンのみ又はグリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号３），又はこれらのアミノ酸配列が２～１０回，あるいは２～５回繰り返された配列を有するものである。例えば，免疫グロブリン重鎖の可変領域の全領域からなるアミノ酸配列のＣ末端側に，リンカー配列を介して免疫グロブリン軽鎖の可変領域を結合させてＳｃＦＶとする場合，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１）の３個が連続したものに相当する計１５個のアミノ酸からなるリンカー配列（配列番号４）が好適に用いられる。

　本発明において，抗体が特異的に認識する抗原としては，例えば，血管内皮細胞の表面に存在する分子（表面抗原）である。かかる表面抗原としては，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ－Ｆ等の有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ－８等のモノカルボン酸トランスポーター，Ｆｃ受容体が挙げられるが，これらに限定されるものではない。抗原は，好ましくはヒト血管内皮細胞の表面に存在するこれら分子（表面抗原）である。

　上記の表面抗原の中でも，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ－Ｆ等の有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ－８等のモノカルボン酸トランスポーターは，血液脳関門（Blood Brain Barrier）を形成する脳毛細血管内皮細胞（脳血管内皮細胞）の表面に存在するものである。これら抗原を認識できる抗体は，抗原を介して脳毛細血管内皮細胞に結合できる。そして脳毛細血管内皮細胞に結合した抗体は，血液脳関門を通過して中枢神経系に到達することができる。従って，目的の蛋白質を，このような抗体と結合させることにより，中枢神経系にまで到達させることができる。目的の蛋白質としては，中枢神経系で薬効を発揮すべき機能を有する蛋白質が挙げられる。例えば，中枢神経障害を伴うリソソーム病患者において欠損しているか又は機能不全であるリソソーム酵素が，目的の蛋白質として挙げられる。かかるリソソーム酵素は，そのままでは中枢神経系に到達することができず，患者の中枢神経障害に対して薬効を示すことがないが，これらの抗体と結合させることにより血液脳関門を通過できるようになるので，リソソーム病患者において見られる中枢神経障害を改善することができる。

　本発明において，「ヒトトランスフェリン受容体」又は「ｈＴｆＲ」の語は，配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する膜蛋白質をいう。本発明の抗ｈＴｆＲ抗体は，その一実施態様において，配列番号５で示されるアミノ酸配列中Ｎ末端側から８９番目のシステイン残基からＣ末端のフェニルアラニンまでの部分（ｈＴｆＲの細胞外領域）に対して特異的に結合するものであるが，これに限定されない。

　抗体の作製方法をｈＴｆＲに対する抗体を例にとって以下に説明する。ｈＴｆＲに対する抗体の作製方法としては，ｈＴｆＲ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを導入した細胞を用いて，組換えヒトトランスフェリン受容体（ｒｈＴｆＲ）を作製し，このｒｈＴｆＲを用いてマウス等の動物を用いて免疫して得る方法が一般的である。免疫後の動物からｈＴｆＲに対する抗体産生細胞を取り出し，これとミエローマ細胞とを癒合させることにより，ｈＴｆＲに対する抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞を作製することができる。

　また，マウス等の動物より得た免疫系細胞を体外免疫法によりｒｈＴｆＲで免疫することによってもｈＴｆＲに対する抗体を産生する細胞を取得できる。体外免疫法により免疫する場合，その免疫系細胞が由来する動物種に特に限定はないが，好ましくは，マウス，ラット，ウサギ，モルモット，イヌ，ネコ，ウマ及びヒトを含む霊長類であり，より好ましくは，マウス，ラット及びヒトであり，更に好ましくはマウス及びヒトである。マウスの免疫系細胞としては，例えば，マウスの脾臓から調製した脾細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞としては，ヒトの末梢血，骨髄，脾臓等から調製した細胞を用いることができる。ヒトの免疫系細胞を体外免疫法により免疫した場合，ｈＴｆＲに対するヒト抗体を得ることができる。

　本発明において，抗体と結合させるべきヒトリソソーム酵素に特に限定はないが，α－Ｌ－イズロニダーゼ，イズロン酸－２－スルファターゼ，グルコセレブロシダーゼ，β－ガラクトシダーゼ，ＧＭ２活性化蛋白質，β－ヘキソサミニダーゼＡ，β－ヘキソサミニダーゼＢ，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼ，α－マンノシダーゼ，β－マンノシダーゼ，ガラクトシルセラミダーゼ，サポシンＣ，アリールスルファターゼＡ，α－Ｌ－フコシダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ，酸性スフィンゴミエリナーゼ，α－ガラクトシダーゼＡ，β－グルクロニダーゼ，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ，Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼ，酸性セラミダーゼ，アミロ－１，６－グルコシダーゼ，シアリダーゼ，アスパルチルグルコサミニダーゼ，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１），トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１），ヒアルロニダーゼ－１，ＣＬＮ１，ＣＬＮ２，ＣＬＮ３，ＣＬＮ６，及びＣＬＮ８等のリソソーム酵素，が挙げられる。

　抗体が血管内皮細胞の表面に存在する分子（表面抗原）を特異的に認識するものである場合，抗体と結合させたヒトリソソーム酵素はそれぞれ，α－Ｌ－イズロニダーゼはハーラー症候群，ハーラー・シャイエ症候群，及びシャイエ症候群における中枢神経障害治療剤として，イズロン酸－２－スルファターゼはハンター症候群における中枢神経障害治療剤として，グルコセレブロシダーゼはゴーシェ病における中枢神経障害治療剤として，βガラクトシダーゼはＧＭ１－ガングリオシドーシス１～３型における中枢神経障害治療剤として，ＧＭ２活性化蛋白質はＧＭ２－ガングリオシドーシスＡＢ異型における中枢神経障害治療剤として，β－ヘキソサミニダーゼＡはサンドホフ病及びティサックス病における中枢神経障害治療剤として，β－ヘキソサミニダーゼＢはサンドホフ病における中枢神経障害治療剤として，Ｎ－アセチルグルコサミン－１－フォスフォトランスフェラーゼはＩ－細胞病における中枢神経障害治療剤として，α－マンノシダーゼはα－マンノシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，β－マンノシダーゼはβ－マンノシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，ガラクトシルセラミダーゼはクラッベ病における中枢神経障害治療剤として，サポシンＣはゴーシェ病様蓄積症における中枢神経障害治療剤として，アリールスルファターゼＡは異染性白質変性症（異染性白質ジストロフィー）における中枢神経障害治療剤として，α－Ｌ－フコシダーゼはフコシドーシスにおける中枢神経障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼはアスパルチルグルコサミン尿症における中枢神経障害治療剤として，α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼはシンドラー病及び川崎病における中枢神経障害治療剤として，酸性スフィンゴミエリナーゼはニーマン・ピック病における中枢神経障害治療剤として，α－ガラクトシダーゼＡはファブリー病における中枢神経障害治療剤として，β－グルクロニダーゼはスライ症候群における中枢神経障害治療剤として，ヘパランＮ－スルファターゼ，α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ，アセチルＣｏＡα－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ及びＮ－アセチルグルコサミン－６－硫酸スルファターゼはサンフィリッポ症候群における中枢神経障害治療剤として，酸性セラミダーゼはファーバー病における中枢神経障害治療剤として，アミロ－１，６－グルコシダーゼはコリ病（フォーブス・コリ病）における中枢神経障害治療剤として，シアリダーゼはシアリダーゼ欠損症における中枢神経障害治療剤として，アスパルチルグルコサミニダーゼはアスパルチルグルコサミン尿症における中枢神経障害治療剤として，パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ－１（ＰＰＴ－１）は，神経セロイドリポフスチン症又はＳａｎｔａｖｕｏｒｉ－Ｈａｌｔｉａ病における中枢神経障害治療剤として，トリペプチジルペプチダーゼ－１（ＴＰＰ－１）は，神経セロイドリポフスチン症又はＪａｎｓｋｙ－Ｂｉｅｌｓｃｈｏｗｓｋｙ病における中枢神経障害治療剤として，ヒアルロニダーゼ－１はヒアルロニダーゼ欠損症における中枢神経障害治療剤として，ＣＬＮ１，ＣＬＮ２，ＣＬＮ３，ＣＬＮ６，及びＣＬＮ８はバッテン病における中枢神経障害治療剤として使用できる。

　抗体が血管内皮細胞の表面に存在する分子（表面抗原）を特異的に認識するものである場合に，抗体と結合させるべきリソソーム酵素として好適なものとして，ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）を挙げることができる。ｈＩＤＵＡは，ヘパラン硫酸やデルマタン硫酸のようなグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）分子内に存在するイズロン酸結合を加水分解する活性を有するライソソーム酵素の一種である。ムコ多糖症Ｉ型はこの酵素をコードする遺伝子の変異による遺伝子疾患である。ムコ多糖症Ｉ型はハーラー症候群，ハーラー・シャイエ症候群，及びシャイエ症候群に分類され，ハーラー症候群は重症型，ハーラー・シャイエ症候群は中間型，シャイエ症候群は軽症型である。これらの患者では，ヘパラン硫酸，デルマタン硫酸が組織内に蓄積する結果，角膜混濁，精神発達遅滞等の諸症状を示す。但し，軽症型の場合は精神発達遅延は観察されないこともある。当該抗体とｈＩＤＵＡとの融合蛋白質は，ＢＢＢを通過することにより脳組織内に蓄積したＧＡＧを分解することができるので，精神発達遅滞を示すハーラー症候群の患者に投与することにより，中枢神経障害治療剤として使用することができる。

　本発明において，「ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ」又は「ｈＩＤＵＡ」の語は，特に野生型のｈＩＤＵＡと同一のアミノ酸配列を有するｈＩＤＵＡのことをいう。野生型のｈＩＤＵＡは，配列番号６で示される６２８個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を有する。配列番号７で示される６２６個のアミノ酸から構成されるアミノ酸配列を有するｈＩＤＵＡのバリアントもｈＩＤＵＡである。但し，これらに限らず，ＩＤＵＡ活性を有するものである限り，野生型のｈＩＤＵＡのアミノ酸配列に置換，欠失，付加等の変異を加えたものもｈＩＤＵＡに含まれる。ｈＩＤＵＡのアミノ酸配列のアミノ酸を他のアミノ酸へ置換させる場合，置換させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。ｈＩＤＵＡのアミノ酸配列中のアミノ酸を欠失させる場合，欠失させるアミノ酸の個数は，好ましくは１～１０個であり，より好ましくは１～５個であり，更に好ましくは１～３個であり，更により好ましくは１～２個である。また，これらアミノ酸の置換と欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。ｈＩＤＵＡにアミノ酸を付加させる場合，ｈＩＤＵＡのアミノ酸配列中又はＮ末端側若しくはＣ末端側に，好ましくは１～１０個，より好ましくは１～５個，更に好ましくは１～３個，更により好ましくは１～２個のアミノ酸が付加される。これらアミノ酸の付加，置換及び欠失を組み合わせた変異を加えることもできる。変異を加えたｈＩＤＵＡのアミノ酸配列は，元のｈＩＤＵＡのアミノ酸配列と，好ましくは８０％以上の同一性を有し，より好ましくは８５％以上の同一性を示し，更に好ましくは９０％以上の同一性を示し，更により好ましくは９５％以上の同一性を示し，更により好ましくは９９％以上の同一性を示す。

　なお本発明において，元の蛋白質（抗体を含む）のアミノ酸配列と変異を加えた蛋白質のアミノ酸配列との同一性は，周知の同一性計算アルゴリズムを用いて容易に算出することができる。例えば，そのようなアルゴリズムとして，BLAST(Altschul SF. J Mol .Biol. 215. 403-10， (1990))，Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988))，Smith及びWatermanの局所同一性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等がある。

　また，元の蛋白質（抗体を含む）のアミノ酸配列中のアミノ酸の他のアミノ酸への置換は，例えば，アミノ酸のそれらの側鎖及び化学的性質で関連性のあるアミノ酸ファミリー内で起こるものである。かかるアミノ酸ファミリーとしては，以下のものがある：
（１）酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグルタミン酸，
（２）塩基性アミノ酸であるヒスチジン，リシン，及びアルギニン，
（３）芳香族アミン酸であるフェニルアラニン，チロシン，トリプトファン，
（４）ヒドロキシアミノ酸であるセリンとトレオニン，
（５）疎水性アミノ酸であるメチオニン，アラニン，バリン，ロイシン，及びイソロイシン，
（６）中性の親水性アミノ酸であるシステイン，セリン，トレオニン，アスパラギン，及びグルタミン，
（７）ペプチド鎖の配向に影響するアミノ酸であるグリシンとプロリン，
（８）アミド型アミノ酸であるアスパラギンとグルタミン，
（９）脂肪族アミノ酸である，アラニン，ロイシン，イソロイシン，及びバリン，
（１０）側鎖の小さいアミノ酸であるアラニン，グリシン，セリン，及びトレオニン，
（１１）側鎖の特に小さいアミノ酸であるアラニンとグリシン，
（１２）分岐鎖を有するアミノ酸であるバリン，ロイシン，及びイソロイシン。

　本発明において，ｈＩＤＵＡがＩＤＵＡ活性を有するというときは，ｈＩＤＵＡを抗体と融合させて融合蛋白質としたときに，天然型のｈＩＤＵＡが本来有する活性に対して，３％以上の活性を有していることをいう。但し，その活性は，天然型のｈＩＤＵＡが本来有する活性に対して，１０％以上であることが好ましく，２０％以上であることがより好ましく，５０％以上であることが更に好ましく，８０％以上であることが更により好ましい。抗体と融合させたｈＩＤＵＡが変異を加えたものである場合も同様である。抗体は，例えば抗ｈＴｆＲ抗体である。

　本発明において「融合蛋白質」というときは，抗体とヒトリソソーム酵素とを，非ペプチドリンカー若しくはペプチドリンカーを介して，又は直接に結合させた物質のことをいう。抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させる方法は，以下に詳述する。

　抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させる方法としては，非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーを介して結合させる方法がある。非ペプチドリンカーとしては，ポリエチレングリコール，ポリプロピレングリコール，エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体，ポリオキシエチル化ポリオール，ポリビニルアルコール，多糖類，デキストラン，ポリビニルエーテル，生分解性高分子，脂質重合体，キチン類，及びヒアルロン酸，又はこれらの誘導体，若しくはこれらを組み合わせたものを用いることができる。ペプチドリンカーは，ペプチド結合した１～５０個のアミノ酸から構成されるペプチド鎖若しくはその誘導体であって，そのＮ末端とＣ末端が，それぞれ抗体又はヒトリソソーム酵素のいずれかと共有結合を形成することにより，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させるものである。

　非ペプチドリンカーとしてビオチン－ストレプトアビジンを用いる場合，抗体がビオチンを結合させたものであり，ヒトリソソーム酵素がストレプトアビジンを結合させたものであり，このビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させてもよく，逆に，抗体がストレプトアビジンを結合させたものであり，ヒトリソソーム酵素がビオチンを結合させたものであり，このビオチンとストレプトアビジンとの結合を介して，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させてもよい。

　非ペプチドリンカーとしてＰＥＧを用いて本発明の抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させたものは，特に，抗体－ＰＥＧ－ヒトリソソーム酵素という。抗体－ＰＥＧ－ヒトリソソーム酵素は，抗体とＰＥＧとを結合させて抗体－ＰＥＧを作製し，次いで抗体－ＰＥＧとヒトリソソーム酵素とを結合させることにより製造することができる。又は，抗体－ＰＥＧ－ヒトリソソーム酵素は，ヒトリソソーム酵素とＰＥＧとを結合させてヒトリソソーム酵素－ＰＥＧを作製し，次いでヒトリソソーム酵素－ＰＥＧと抗体とを結合させることによっても製造することができる。ＰＥＧを抗体及びヒトリソソーム酵素と結合させる際には，カーボネート，カルボニルイミダゾール，カルボン酸の活性エステル，アズラクトン，環状イミドチオン，イソシアネート，イソチオシアネート，イミデート，又はアルデヒド等の官能基で修飾されたＰＥＧが用いられる。これらＰＥＧに導入された官能基が，主に抗体及びヒトリソソーム酵素分子内のアミノ基と反応することにより，ＰＥＧと抗体及びヒトリソソーム酵素が共有結合する。このとき用いられるＰＥＧの分子量及び形状に特に限定はないが，その平均分子量（ＭＷ）は，好ましくはＭＷ＝３００～６００００であり，より好ましくはＭＷ＝５００～２００００である。例えば，平均分子量が約３００，約５００，約１０００，約２０００，約４０００，約１００００，約２００００等であるＰＥＧは，非ペプチドリンカーとして好適に使用することができる。

　例えば，抗体－ＰＥＧは，抗体とアルデヒド基を官能基として有するポリエチレングリコール（ＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤ）とを，該抗体に対するＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤのモル比が１１，１２．５，１５，１１０，１２０等になるように混合し，これにＮａＣＮＢＨ_３等の還元剤を添加して反応させることにより得られる。次いで，抗体－ＰＥＧを，ＮａＣＮＢＨ_３等の還元剤の存在下で，ヒトリソソーム酵素と反応させることにより，抗体－ＰＥＧ－ヒトリソソーム酵素が得られる。逆に，先にヒトリソソーム酵素とＡＬＤ－ＰＥＧ－ＡＬＤとを結合させてヒトリソソーム酵素－ＰＥＧを作製し，次いでヒトリソソーム酵素－ＰＥＧと抗体を結合させることによっても，抗体－ＰＥＧ－ヒトリソソーム酵素を得ることができる。

　抗体とヒトリソソーム酵素とは，抗体の重鎖又は軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，リンカー配列を介して又は直接に，それぞれヒトリソソーム酵素のＮ末端又はＣ末端をペプチド結合により結合させることもできる。このように抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させてなる融合蛋白質は，抗体の重鎖又は軽鎖をコードするｃＤＮＡの３’末端側又は５’末端側に，直接又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を挟んで，ヒトリソソーム酵素をコードするｃＤＮＡがインフレームで配置されたＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入した哺乳動物細胞を培養することにより，得ることができる。この哺乳動物細胞には，ヒトリソソーム酵素をコードするＤＮＡ断片を重鎖と結合させる場合にあっては，抗体の軽鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入され，また，ヒトリソソーム酵素をコードするＤＮＡ断片を軽鎖と結合させる場合にあっては，抗体の重鎖をコードするｃＤＮＡ断片を組み込んだ哺乳動物細胞用の発現ベクターも，同じホスト細胞に導入される。抗体が一本鎖抗体である場合，抗体とヒトリソソーム酵素とを結合させた融合蛋白質は，ヒトリソソーム酵素をコードするｃＤＮＡの５’末端側又は３’末端側に，直接，又はリンカー配列をコードするＤＮＡ断片を挟んで，１本鎖抗体をコードするｃＤＮＡを連結したＤＮＡ断片を，哺乳動物細胞，酵母等の真核生物用の発現ベクターに組み込み，この発現ベクターを導入したこれらの細胞中で発現させることにより，得ることができる。

　抗体の軽鎖のＣ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の軽鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗体の軽鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

　抗体の重鎖のＣ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の重鎖のＣ末端側に結合したものである。ここで抗体の重鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

　抗体の軽鎖のＮ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の軽鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗体の軽鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

　抗体の重鎖のＮ末端側にヒトリソソーム酵素を結合させたタイプの融合蛋白質は，抗体が，軽鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列と，重鎖の可変領域の全て又は一部を含むアミノ酸配列とを含むものであり，ヒトリソソーム酵素が，この抗体の重鎖のＮ末端側に結合したものである。ここで抗体の重鎖とヒトリソソーム酵素とは，直接結合してもよく，リンカーを介して結合してもよい。

　このとき抗体とヒトリソソーム酵素との間にリンカー配列を配置する場合，その配列は，好ましくは１～５０個，より好ましくは１～１７個，更に好ましくは１～１０個，更により好ましくは１～５個のアミノ酸から構成されるものであるが，抗体に結合させるべきヒトリソソーム酵素によって，リンカー配列を構成するアミノ酸の個数は，１個，２個，３個，１～１７個，１～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個等と適宜調整できる。そのようなリンカー配列は，これにより連結された抗体がｈＴｆＲとの親和性を保持し，且つ当該リンカー配列により連結されたヒトリソソーム酵素が，生理的条件下で当該蛋白質の生理活性を発揮できる限り，そのアミノ酸配列に限定はないが，好ましくは，グリシンとセリンから構成されるものであり，例えば，グリシン又はセリンのいずれか１個のアミノ酸からなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１），アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号２），アミノ酸配列Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（配列番号３），又はこれらのアミノ酸配列が１～１０個，あるいは２～５個連続してなる１～５０個のアミノ酸からなる配列，２～１７個，２～１０個，１０～４０個，２０～３４個，２３～３１個，２５～２９個のアミノ酸からなる配列等を有するものである。例えば，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｓｅｒからなるもの，アミノ酸配列Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ（配列番号１）が３個連続してなる１５個のアミノ酸からなる配列（配列番号４）を有するものはリンカー配列として好適に用いることができる。抗体が１本鎖抗体であっても同様である。

　なお，本発明において，１つのペプチド鎖に複数のリンカー配列が含まれる場合，便宜上，各リンカー配列はＮ末端側から順に，第１のリンカー配列，第２のリンカー配列というように命名する。

　抗体が抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の好ましい一実施形態として，
　軽鎖の可変領域において：
　（ａ）ＣＤＲ１が配列番号８又は９で示されるアミノ酸配列を含んでなり，
　（ｂ）ＣＤＲ２が配列番号１０又は１１で示されるアミノ酸配列を含んでなり，且つ
　（ｃ）ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含んでなるものであり；
　重鎖の可変領域において：
　（ｄ）ＣＤＲ１が配列番号１３又は１４で示されるアミノ酸配列を含んでなり，
　（ｅ）ＣＤＲ２が配列番号１５又は１６で示されるアミノ酸配列を含んでなり，且つ
　（ｆ）ＣＤＲ３が配列番号１７又は１８で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである，抗体が例示できる。ここで抗体は好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。

　上記の（ａ）～（ｆ）に示される各ＣＤＲのアミノ酸配列の組み合わせは，何れの組み合わせであってもよく，例えば，表１で示されるものが挙げられる。

　抗体が抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の更なる好ましい一実施形態として，
　（ｘ）軽鎖の可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するものであり，重鎖の可変領域が配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含んでなるものである，抗体が例示できる。ここで抗体は好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。
　ここで，配列番号２０で示される軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１として配列番号８及び配列番号９で示されるアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２として配列番号１０及び配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３として配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含む。また，配列番号２１で示される重鎖の可変領域のアミノ酸配列は，ＣＤＲ１として配列番号１３及び配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ２として配列番号１５及び配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含み，ＣＤＲ３として配列番号１７及び配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含む。更に，重鎖フレームワーク領域３として配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む。

　但し，抗体がヒト化抗体であり且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の好ましい実施形態は，上記の（ｘ）に限られるものではない。例えば，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものであり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。

　更には，軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するものであり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するものである抗体，
　軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものであり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである抗体，及び
　軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するものであり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。

　軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と同一性を有するものであり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列と同一性を有するものである抗体として，
　（ｘ－ａ）軽鎖の可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号２１で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｘ－ｂ）軽鎖の可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号２１で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｘ－ｃ）軽鎖の可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｘ－ｄ）軽鎖の可変領域が配列番号２０で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域が，配列番号２１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
が挙げられる。

　更に，抗体が且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の好ましい実施形態として，
　上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであるもの，
　上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであるもの，及び
　上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであるものも，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。ここで抗体は好ましくはヒト抗体又はヒト化抗体である。

　抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が，上記の（ｘ）における軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｘ）における重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである抗体として，
　（ｘ－ｅ）
　軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，且つＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｘ－ｆ）
　軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，且つＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｘ－ｇ）
　軽鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，且つＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖の可変領域のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
が挙げられる。

　上記の（ｘ－ａ）～（ｘ－ｇ）において，各ＣＤＲのアミノ酸配列の組み合わせは，何れの組み合わせであってもよく，例えば，表２で示されるものが挙げられる。下記の（ｙ－ａ）～（ｙ－ｇ）においても同様である。

　本発明において，抗体がヒト化抗体であり且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であるＦａｂである場合の，好ましい一実施形態として，
　（ｙ）軽鎖が配列番号２２で示されるアミノ酸配列を含むものであり，重鎖が配列番号２３で示されるアミノ酸配列を含んでなるものであるＦａｂである抗体が例示できる。ここで，軽鎖は可変領域として配列番号２０で示されるアミノ酸配列を含み，重鎖は可変領域として配列番号２１で示されるアミノ酸配列を含む。本発明において，Ｆａｂを構成する重鎖のことをＦａｂ重鎖という。すなわち，配列番号２３で示されるアミノ酸配列からなる重鎖はＦａｂ重鎖である。

　抗体がヒト化抗体であり且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体である場合の，抗体の好ましい実施形態は，上記の（ｙ）に限られるものではない。例えば，軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものであり，重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。

　更には，軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するものであり，重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列と８５％以上の同一性を有するものである抗体，
　軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものであり，重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するものである抗体，及び
　軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するものであり，重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列と９５％以上の同一性を有するものである抗体も，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。

　軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列と同一性を有するものであり，重鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列と同一性を有するものである抗体として，
　（ｙ－ａ）軽鎖が配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖が配列番号２３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｙ－ｂ）軽鎖が配列番号２２で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖が配列番号２３で示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｙ－ｃ）軽鎖が配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖が配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｙ－ｄ）軽鎖が配列番号２２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖が配列番号２３で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，が挙げられる。

　更に，抗体がヒト化抗体であり且つ抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であるＦａｂである場合の，抗体の好ましい実施形態として，抗体のアミノ酸配列が，
　上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したもの，
　上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したもの，及び，
　上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであるものも，ｈＴｆＲに対して親和性を有する限り，本発明において用いることができる。

　軽鎖のアミノ酸配列が，上記の（ｙ）における軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，上記の（ｙ）における重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものである抗体として，
　（ｙ－ｅ）
　軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，且つＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～５個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｙ－ｆ）
　軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，且つＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１～３個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
　（ｙ－ｇ）
　軽鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，且つＣＤＲ１として配列番号８又は９のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１０又は１１のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１２のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなり，重鎖のアミノ酸配列において，これを構成するアミノ酸配列中１又は２個のアミノ酸が置換，欠失又は付加したものであり，かつＣＤＲ１として配列番号１３又は１４のアミノ酸配列を，ＣＤＲ２として配列番号１５又は１６のアミノ酸配列を，及びＣＤＲ３として配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を，それぞれ含んでなるもの，
が挙げられる。

　抗体がヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であり，ヒトリソソーム酵素がヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）である場合の，融合蛋白質の好ましい形態として，以下のものが挙げられる。すなわち，
　配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖と，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖のＣ末端側に，配列番号６で示されるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼが，配列番号４で示されるリンカー配列を介して結合したものとからなる，融合蛋白質。

　また，抗体がヒト化抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であり，ヒトリソソーム酵素がヒトα－Ｌ－イズロニダーゼ（ｈＩＤＵＡ）である場合の，融合蛋白質の好ましい形態として，以下のものが挙げられる。すなわち，
　該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，
　該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖が，そのＣ末端側で，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，配列番号６で示されるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合しており，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質。

　本発明において，抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質は，例えば，当該融合蛋白質をコードする遺伝子が発現又は強発現することによって，当該融合蛋白質を産生するように人為的な操作を加えた，哺乳動物細胞を培養することにより産生させることができる。このとき融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞内で強発現させる該遺伝子は，該遺伝子が組み込まれた発現ベクターで形質転換させることにより該哺乳動物細胞に導入するのが一般的である。また，このとき用いられる哺乳動物細胞について特に限定はないが，ヒト，マウス，チャイニーズハムスター由来の細胞が好ましく，特にチャイニーズハムスター卵巣細胞由来のＣＨＯ細胞が好ましい。本発明において，融合蛋白質というときは，特に，このような融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を培養したときに，培地中に分泌される組換え融合蛋白質のことをいう。

　抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質は，抗体とヒトリソソーム酵素とをそれぞれ産生させた後，これらを非ペプチドリンカー又はペプチドリンカーで結合させることによっても製造することができる。このとき，抗体とヒトリソソーム酵素とは，これらをコードする遺伝子が発現又は強発現することによって，これらを産生するように人為的な操作を加えた，哺乳動物細胞を培養することにより組換え蛋白質として産生させることができる。

　融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子を組み込んで発現させるために用いる発現ベクターは，哺乳動物細胞内に導入させたときに，該遺伝子を発現させるものであれば特に限定なく用いることができる。発現ベクターに組み込まれた該遺伝子は，哺乳動物細胞内で遺伝子の転写の頻度を調節することができるＤＮＡ配列（遺伝子発現制御部位）の下流に配置される。本発明において用いることのできる遺伝子発現制御部位としては，例えば，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１α）プロモーター，ヒトユビキチンＣプロモーター等が挙げられる。

　このような発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた所望の蛋白質を発現するようになるが，その発現量は個々の細胞により異なり一様ではない。従って，組換え蛋白質を効率よく生産するためには，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞から，所望の蛋白質の発現レベルが高い細胞を選択するステップが必要となる。この選択ステップを行うために，発現ベクターには選択マーカーとして働く遺伝子が組み込まれている。

　選択マーカーとして最も一般的なものはピューロマイシン，ネオマイシン等の薬剤を分解する酵素（薬剤耐性マーカー）である。哺乳動物細胞は一定濃度以上の上記薬剤の存在下で死滅する。しかし，発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，発現ベクターに組み込まれた薬剤耐性マーカーにより上記薬剤を分解し，これを無毒化又は弱毒化することができるので，上記薬剤存在下でも生存可能となる。選択マーカーとして薬剤耐性マーカーが組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入し，その薬剤耐性マーカーに対応する薬剤を含有する選択培地中で，その薬剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度の薬剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，薬剤耐性マーカーとともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた所望の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加するので，結果として所望の蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。

　また，選択マーカーとして，グルタミン合成酵素（ＧＳ）を用いることもできる。グルタミン合成酵素は，グルタミン酸とアンモニアからグルタミンを合成する酵素である。哺乳動物細胞を，グルタミン合成酵素の阻害剤，例えばメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）を含有し，且つグルタミンを含有しない選択培地中で培養すると，細胞は死滅する。しかし，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素が組み込まれた発現ベクターを哺乳動物細胞に導入すると，該細胞では，グルタミン合成酵素の発現レベルが上昇するようになるので，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能となる。このとき，ＭＳＸの濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＭＳＸ存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，グルタミン合成酵素とともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた所望の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加するので，結果として所望の蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。

　また，選択マーカーとして，ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いることもできる。ＤＨＦＲを選択マーカーとして用いる場合，発現ベクターを導入した哺乳動物細胞は，メトトレキセート，アミノプテリン等のＤＨＦＲ阻害剤を含有する選択培地中で培養される。ＤＨＦＲ阻害剤の濃度を徐々に上昇させながら培養を続けると，より高濃度のＤＨＦＲ阻害剤存在下でも増殖可能な細胞が得られる。このようにして選択された細胞では，ＤＨＦＲとともに，一般に，発現ベクターに組み込まれた所望の蛋白質をコードする遺伝子の発現量も増加するので，結果として所望の蛋白質の発現レベルの高い細胞が選択される。

　所望の蛋白質をコードする遺伝子の下流側に内部リボソーム結合部位（IRES: internal ribosome entry site）を介して，選択マーカーとしてグルタミン合成酵素（ＧＳ）を配置させた発現ベクターが知られている（国際特許公報ＷＯ２０１２／０６３７９９，ＷＯ２０１３／１６１９５８）。これら文献に記載された発現ベクターは，本発明の製造方法に特に好適に使用することができる。

　例えば，蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，遺伝子発現制御部位，並びに，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流に内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ，該遺伝子発現制御部位の又は該遺伝子発現制御部位とは別の遺伝子発現制御部位の下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を更に含んでなる，発現ベクターは，本発明の製造方法に好適に使用できる。この発現ベクターにおいて，遺伝子発現制御部位又は別の遺伝子発現制御部位としては，サイトメガロウイルス由来のプロモーター，ＳＶ４０初期プロモーター，ヒト伸長因子－１アルファプロモーター（ｈＥＦ－１αプロモーター），ヒトユビキチンＣプロモーターが好適に用いられるが，ｈＥＦ－１αプロモーターが特に好適である。

　また，内部リボソーム結合部位としては，ピコルナウイルス科のウイルス，口蹄疫ウイルス，Ａ型肝炎ウイルス，Ｃ型肝炎ウイルス，コロナウイルス，ウシ腸内ウイルス，サイラーのネズミ脳脊髄炎ウイルス，コクサッキーＢ型ウイルス，ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質遺伝子，ショウジョウバエアンテナペディア遺伝子，ショウジョウバエウルトラビトラックス遺伝子からなる群から選択されるウイルス又は遺伝子の５’非翻訳領域に由来するものが好適に用いられるが，マウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位が特に好適である。マウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位を用いる場合，野生型のもの以外に，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものも好適に使用できる。また，この発現ベクターにおいて，好適に用いられる薬剤耐性遺伝子は，好ましくはピューロマイシン又はネオマイシン耐性遺伝子であり，より好ましくはピューロマイシン耐性遺伝子である。

　また，例えば，蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ｈＥＦ－１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流にジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，本発明の製造方法に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１３／１６１９５８に記載された発現ベクターが挙げられる。

　また，例えば，蛋白質を発現させるための発現ベクターであって，ｈＥＦ－１αプロモーター，その下流に該蛋白質をコードする遺伝子，更に下流にマウス脳心筋炎ウイルスの５’非翻訳領域に由来する内部リボソーム結合部位，及び更に下流にグルタミン合成酵素をコードする遺伝子を含み，且つ別の遺伝子発現制御部位及びその下流に薬剤耐性遺伝子を更に含む発現ベクターであって，該内部リボソーム結合部位が，野生型の内部リボソーム結合部位に含まれる複数の開始コドンのうちの一部が破壊されたものである発現ベクターは，本発明の製造方法に好適に使用できる。このような発現ベクターとして，ＷＯ２０１２／０６３７９９に記載されたpE-mIRES-GS-puro及びＷＯ２０１３／１６１９５８に記載されたpE-mIRES-GS-mNeoが挙げられる。

　本発明において，融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素をコードする遺伝子が組み込まれた発現ベクターが導入された哺乳動物細胞は，融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素の発現レベルの高い細胞を選択するために，選択培地中で選択培養される。

　選択培養において，ＤＨＦＲを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＤＨＦＲ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＤＨＦＲ阻害剤がメトトレキセートの場合，好ましくは０．２５～５μＭであり，より好ましくは０．５～１．５μＭであり，更に好ましくは約１．０μＭである。

　ＧＳを選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧＳ阻害剤の濃度を段階的に上昇させる。その最大濃度は，ＧＳ阻害剤がＭＳＸの場合，好ましくは１００～１０００μＭであり，より好ましくは２００～５００μＭであり，更に好ましくは約３００μＭである。またこのとき，一般的にグルタミンを含有しない培地が選択培地として用いられる。

　ピューロマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるピューロマイシンの最大濃度は，好ましくは３～３０μｇ／ｍＬであり，より好ましくは５～２０μｇ／ｍＬであり，更に好ましくは約１０μｇ／ｍＬである。

　ネオマイシンを分解する酵素を選択マーカーとして使用する場合，選択培地に含まれるＧ４１８の最大濃度は，好ましくは０．１ｍｇ～２ｍｇ／ｍＬであり，より好ましくは０．５～１．５ｍｇ／ｍＬであり，更に好ましくは約１ｍｇ／ｍＬである。

　また，哺乳動物細胞の培養のための培地としては，選択培養で用いる培地，後述する融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素を産生させるために用いる培地（組換え蛋白質産生用培地）ともに，哺乳動物細胞を培養して増殖させることのできるものであれば，特に限定なく用いることができるが，好ましくは無血清培地が用いられる。

　選択培養により選択された融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素の発現レベルの高い細胞は，これらの産生細胞として，これらの生産に用いられる。融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素の生産は，これらの産生細胞を組換え蛋白質産生用培地中で培養することにより行われる。この培養を生産培養という。

　本発明において，組換え蛋白質産生用培地として用いられる無血清培地としては，例えば，アミノ酸を３～７００ｍｇ／Ｌ，ビタミン類を０．００１～５０ｍｇ／Ｌ，単糖類を０．３～１０ｇ／Ｌ，無機塩を０．１～１００００ｍｇ／Ｌ，微量元素を０．００１～０．１ｍｇ／Ｌ，ヌクレオシドを０．１～５０ｍｇ／Ｌ，脂肪酸を０．００１～１０ｍｇ／Ｌ，ビオチンを０．０１～１ｍｇ／Ｌ，ヒドロコルチゾンを０．１～２０μｇ／Ｌ，インシュリンを０．１～２０ｍｇ／Ｌ，ビタミンＢ１２を０．１～１０ｍｇ／Ｌ，プトレッシンを０．０１～１ｍｇ／Ｌ，ピルビン酸ナトリウムを１０～５００ｍｇ／Ｌ，及び水溶性鉄化合物を含有する培地が好適に用いられる。所望により，チミジン，ヒポキサンチン，慣用のｐＨ指示薬及び抗生物質を培地に添加してもよい。

　また組換え蛋白質産生用培地として用いられる無血清培地として，DMEM/F12培地（DMEMとF12の混合培地）を基本培地として用いてもよく，これら各培地は当業者に周知である。更にまた，無血清培地として，炭酸水素ナトリウム，Ｌ－グルタミン，Ｄ－グルコース，インスリン，ナトリウムセレナイト，ジアミノブタン，ヒドロコルチゾン，硫酸鉄(II)，アスパラギン，アスパラギン酸，セリン及びポリビニルアルコールを含むものである，DMEM(HG)HAM改良型(R5)培地を使用してもよい。更には市販の無血清培地，例えば，CD OptiCHO^TM培地，CHO-S-SFM II培地又はCD CHO培地（Thermo Fisher Scientific社），EX-CELL^TM302培地又はEX-CELL^TM325-PF培地（SAFC Biosciences社）等を基本培地として使用することもできる。例えば，１６μｍｏｌ／Ｌチミジン，１００μｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン，及び４ｍｍｏｌ／ＬＬ－アラニル－Ｌ－グルタミンを含む無血清培地であるEX-CELL^TM Advanced CHO Fed-batch培地（SAFC Biosciences社）は，融合蛋白質産生細胞の培養に好適に用いることができる。また例えば，１６μｍｏｌ／Ｌチミジン，１００μｍｏｌ／Ｌヒポキサンチン，及び１０ｍｇ／Ｌインスリンを含む無血清培地であるCD OptiCHO^TM培地（Thermo Fisher Scientific社）も，融合蛋白質産生細胞の培養に好適に用いることができる。

　融合蛋白質，抗体又はヒトリソソーム酵素の産生細胞の生産培養は，これら産生細胞の組換え蛋白質産生用培地中における密度を，好ましくは０．２Ｘ１０^５～５Ｘ１０^５個／ｍＬ，より好ましくは１Ｘ１０^５～４Ｘ１０^５個／ｍＬ，更に好ましくは約３Ｘ１０^５個／ｍＬに調整して開始される。

　生産培養は，細胞の生存率（％）を経時的に観察しながら行い，生産培養期間中の細胞の生存率が，好ましくは８０％以上，より好ましくは８５％以上に維持されるようにして行われる。

　また，生産培養期間中，培養温度は，好ましくは３３．５～３７．５℃に維持され，生産培地中の溶存酸素飽和度は，好ましくは２８～３２％，より好ましくは約３０％に維持される。ここで，溶存酸素飽和度とは，酸素の飽和溶解量を１００％としたときの，同条件下での酸素の溶解量のことをいう。

　また，生産培養期間中，生産培地はインペラ（羽根車）で撹拌される。このときのインペラの回転速度は，好ましくは５０～１００回転／分であり，より好ましくは６０～１１０回転／分，例えば９０回転／分，１００回転／分，１１０回転／分等に調整されるが，インペラの形状等によりその回転速度は適宜変更される。

　生産培養における好適な培養条件の初期条件として，例えば，生産培養の開始時における産生細胞の組換え蛋白質産生用培地中における密度が３Ｘ１０^５個／ｍＬであり，生産培養期間中の培養温度が３４～３７℃であり，生産培地中の溶存酸素飽和度が３０％であり，且つ培地が約１００回転／分の速度で回転するインペラで撹拌されるものが挙げられる。

　生産培養の終了後に培地を回収し，回収した培地を遠心分離することにより又は膜ろ過することにより，細胞等を除去して培養上清を得ることができる。この培養上清中に含まれる目的の融合蛋白質は，各種クロマトグラフィーを用いた工程により精製される。精製プロセスは，室温又は低温環境で行うことができるが，好ましくは低温環境で行われ，特に１～１０℃の温度で行われることが好ましい。

　以下，培養上清中に含まれる抗体とヒトリソソーム酵素との融合蛋白質の精製方法の一実施形態について詳述する。この実施形態は，特に抗体がＦａｂであるヒトＩｇＧ抗体であり，ヒトリソソーム酵素がｈＩＤＵＡである融合蛋白質であるときに特に好適に使用できる。例えば，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖が，そのＣ末端側で，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，配列番号６で示されるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合しており，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するものである，融合蛋白質の精製方法として好適である。

　精製工程の第一ステップは，抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーである。このとき用いられる抗体に親和性を有する物質に特に限定はないが，好ましくは，Ｆａｂに親和性を有する物質であり，特にＦａｂの重鎖のＣＨ_１領域に親和性を有する物質である。当該領域に対する抗体は，抗体に親和性を有する物質として用いることができる。ＦａｂがヒトＩｇＧ抗体である場合，抗ヒトＩｇＧ－ＣＨ_１抗体が好適に用いられる。抗体に親和性を有する物質が抗体である場合，固定相は，担体に抗体が結合したものである。ここで担体に特に限定はないが，例えばアガロースである。培養上清を負荷することにより，培養上清中に含まれる融合蛋白質をカラムに結合させ，カラムを洗浄した後に，融合蛋白質をカラムから溶出させる。こうして夾雑物の多くを除去することができる。

　培養上清は，容量が大きいことから，精製工程に供される前に濃縮することが好ましいが，濃縮操作は必須ではない。精製工程の第一ステップにおいて，培養上清又はその濃縮液には，これをカラムに負荷する前に，アルギニンが添加される。このときアルギニンは，溶液中の濃度が好ましくは０．１Ｍ～１．０Ｍとなるように，より好ましくは０．２５Ｍ～１．０Ｍとなるように，更に好ましくは０．３Ｍ～１．０Ｍとなるように，更により好ましくは０．３～０．５Ｍとなるように，例えば０．４Ｍとなるように添加される。また，固定相は，培養上清を負荷する前に，予めアルギニンを含む緩衝液で平衡化される。このとき用いられる緩衝液のアルギニン濃度は，好ましくは０．１Ｍ～１．０Ｍであり，より好ましくは０．２Ｍ～０．８Ｍであり，更に好ましくは０．２Ｍ～０．６Ｍであり，更により好ましくは０．３～０．５Ｍであり，例えば０．４Ｍである。また，このとき用いられる緩衝液に特に限定はないが，好ましくはＭＥＳ緩衝液であり，そのｐＨは好ましくは６．０～７．０であり，より好ましくは約６．５である。

　融合蛋白質を結合させた固定相を洗浄した後，融合蛋白質を，塩を含まない酸性の緩衝液で溶出させて，融合蛋白質を含有する画分を回収する。このときに用いられる緩衝液は，好ましくはグリシン緩衝液又は酢酸緩衝液であり，そのｐＨは好ましくは３．２～３．８であり，より好ましくは３．５である。回収した融合蛋白質を含有する溶液のｐＨは，速やかに中性付近となるように調整される。

　精製工程の第二ステップは陰イオン交換カラムクロマトグラフィーである。このとき用いられる陰イオン交換体に特に限定はないが，好ましくは強陰イオン交換体であり，特に静電相互作用，疎水性相互作用及び水素結合形成に基づく選択性を持つ陰イオン交換体である。マルチモーダル陰イオン交換体は，本発明において好適に使用することができ，例えば，官能基としてＮ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミン基を有する強陰イオン交換体は特に好適に用いることができる。Capto adhere（GE Healthcare社）は，Ｎ－ベンジル－Ｎ－メチルエタノールアミン基を有するマルチモーダル強陰イオン交換体の一つである。

　陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに供される前に，精製工程の第一ステップで回収した溶液には，ｐＨが中性付近に調整されるように，緩衝液が添加される。このとき用いられる緩衝液に特に限定はないが，例えばＭＥＳ緩衝液である。また，このときｐＨは，好ましくは５．５～６．５，より好ましくは５．７～６．３，例えば６．０に調整される。また，固定相は，予め緩衝液で平衡化される。このとき用いられる緩衝液に特に限定はないが，好ましくはＭＥＳ緩衝液であり，そのｐＨは好ましくは５．５～６．５であり，例えば６．０である。

　上記でｐＨを調整した精製工程の第一ステップにおけるカラムクロマトグラフィー回収画分を，上記で予め平衡化した陰イオン交換カラムに負荷し，融合蛋白質を含む非吸着画分を回収した後，緩衝液でカラムを洗浄する。このとき得られる洗浄液も非吸着画分として回収する。カラムの洗浄に用いられる緩衝液は，好ましくはＭＥＳ緩衝液であり，そのｐＨは好ましくは５.５～６．５であり，例えば６．０である。

　精製工程の第三ステップは陽イオン交換クロマトグラフィーである。陽イオン交換クロマトグラフィーにおいてどの陽イオン交換樹脂を用いるかについて特段の限定はないが，弱陽イオン交換体が好ましく，より好ましいのは，疎水性相互作用及び水素結合形成の双方に基づく選択性を持つ弱陽イオン交換体である。例えば，Capto MMC（GE Healthcare社）等のような，フェニル基，アミド結合及びカルボキシル基を備え疎水性相互作用及び水素結合形成の双方に基づく選択性を持つ弱陽イオン交換体を使用することができる。

　陽イオン交換クロマトグラフィーにおいて，カラムは，予め緩衝液で平衡化される。このときに用いられる緩衝液は，好ましくはＭＥＳ緩衝液であり，そのｐＨは好ましくは６．０～７．０であり，より好ましくは約６．５である。

　精製工程の第二ステップで回収された融合蛋白質含有画分及び洗浄液を，陽イオン交換カラムに負荷し，融合蛋白質を結合させたカラムを洗浄した後，融合蛋白質を溶出させる。溶出は，塩の濃度を高めた緩衝液によって行うことができる。このときに用いられる緩衝液は，好ましくはＭＥＳ緩衝液であり，そのｐＨは好ましくは６．０～７．０であり，より好ましくは約６．５である。緩衝液中に加える塩は，塩化ナトリウムが好ましく，塩の濃度は，好ましくは０．５～１．５Ｍの範囲，より好ましくは０．８～１．２Ｍの範囲，更に好ましくは約１Ｍである。

　第三ステップで得られた溶出液の融合蛋白質含有画分のｐＨは，好ましくは５．５～６．１，より好ましくは約５．８に調整される。

　精製工程の第四ステップは，サイズ排除カラムクロマトグラフィーである。このステップは，エンドトトキシン等の低分子の不純物，融合蛋白質の多量体，分解物等を除去するためのものであり，これにより，実質的に純粋な融合蛋白質が得られる。

　加えて，抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーをこの順で含んでなる上述の精製方法に，更に１つ又は２つ以上のカラムクロマトグラフィーを導入してもよい。そのような追加のカラムクロマトグラフィーは，例えば，リン酸基に対する親和性を有する固相を用いたカラムクロマトグラフィー，抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィー，疎水性カラムクロマトグラフィー，陰イオン交換カラムクロマトグラフィー，陽イオン交換カラムクロマトグラフィー，及び色素親和性カラムクロマトグラフィーである。好適には，ブルートリアジン色素をリガンドとする色素親和性カラムクロマトグラフィーが，精製工程の第一ステップの前に，又は精製工程の第一ステップと第二ステップの間に導入される。

　融合蛋白質の精製工程において，培養上清から持ち込まれるおそれのあるウイルスを不活化する工程を追加させることもできる。このウイルス不活化工程は，精製工程の第一ステップの前に実施してもよく，精製工程の各ステップの間に実施してもよく，精製工程の終了後に実施してもよいが，例えば，精製工程の第一ステップの前に，又は精製工程の第一ステップと第二ステップの間に実施される。

　ウイルス不活化工程は，融合蛋白質を含む溶液に非イオン性界面活性剤を添加し，20～60℃で2～6時間，撹拌することにより行われる。このとき用いられる非イオン性界面活性剤の好適なものとして，ポリソルベート20，80，及びトリｎ－ブチルリン酸，又はこれらの混合物を挙げることができる。

　ウイルス不活化工程は，ウイルス除去膜を用いて行うこともできる。孔径が35 nm，20 nmのウイルス除去膜に，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡを含む溶液を通過させることにより，溶液中に含まれるウイルスを除くことができる。

　本発明の製造方法を用いて得られる融合蛋白質の精製品は，そのまま医薬として用いることのできる純度のものである。特に融合蛋白質が，ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖が，配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するものであり，該ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のＦａｂ重鎖が，そのＣ末端側で，配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して，配列番号６で示されるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合しており，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するものである場合（ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡ），そのまま医薬として用いることのできる純度の精製品が得られる。

　本発明の製造方法を用いて得られる融合蛋白質，特にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡの精製品に含まれる宿主細胞由来蛋白質（HCP）の濃度は，100 ppm未満であり，例えば，60 ppm未満，40 ppm未満であり，例えば1～50 ppm，1～40 ppmである。

　本発明の製造方法を用いて得られる融合蛋白質，特にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡの精製品に含まれる，融合蛋白質全体に占める重合体の比率は，0.5%未満であり，例えば，0.2%未満，0.1%未満，0.05%未満等であり，例えば，0.01～0.1%，0.001～0.1%である。

　本発明の製造方法を用いて得られる融合蛋白質，特にヒト化抗ｈＴｆＲ抗体－ｈＩＤＵＡの精製品は，医薬として供給する場合，適当な賦形剤を含む水性液剤又は凍結乾燥製剤として供給することができる。水性液剤とする場合，バイアルに充填した形態としてもよく，注射器に予め充填したものであるプレフィルド型の製剤として供給することもできる。凍結乾燥製剤の場合，使用前に水性媒質に溶解して使用する。

　以下，実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが，本発明が実施例に限定されることは意図しない。

〔実施例１〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質発現用ベクターの構築
　ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質発現用ベクターは，抗体部分として配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖と，配列番号２３で示されるアミノ酸配列を有する重鎖のFab領域とをコードする遺伝子を用いて構築した。

〔pE-neoベクター及びpE-hygrベクターの構築〕
　pEF/myc/nucベクター（インビトロジェン社）を，KpnIとNcoIで消化し，EF-1プロモーター及びその第一イントロンを含む領域を切り出し，これをT4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。別に，pCI-neo（インビトロジェン社）を，BglII及びEcoRIで消化して，CMVのエンハンサー／プロモーター及びイントロンを含む領域を切除した後に，T4 DNA ポリメラーゼで平滑末端化処理した。これに，上記のEF-1αプロモーター及びその第一イントロンを含む領域（平滑末端化処理後のもの）を挿入して，pE-neoベクターを構築した。pE-neoベクターを，SfiI及びBstXIで消化し，ネオマイシン耐性遺伝子を含む約1 kbpの領域を切除した。pcDNA3.1/Hygro(+)（インビトロジェン社）を鋳型にしてプライマーHyg-Sfi5'（配列番号１３）及びプライマーHyg-BstX3'（配列番号１４）を用いて，ＰＣＲ反応によりハイグロマイシン遺伝子を増幅した。増幅したハイグロマイシン遺伝子を，SfiI及びBstXIで消化し，上記のpE-neoベクターに挿入して，pE-hygrベクターを構築した。なお，pE-neoベクター及びpE-hygrベクターの構築は，特許文献（特第6279466号）を参考にして行った。

〔pE-IRES-GS-puroの構築〕
　発現ベクターpPGKIH（Miyahara M. et.al.， J. Biol. Chem. 275，613-618(2000) ）を制限酵素（XhoI及びBamHI）で消化し，マウス脳心筋炎ウイルス（EMCV）に由来する内部リボソーム結合部位（IRES），ハイグロマイシン耐性遺伝子(Hyg^r遺伝子)及びマウスホスホグリセリン酸キナーゼ(mPGK)のポリアデニル化領域(mPGKpA)を含むDNA断片を切り出した。このDNA断片をpBluescript SK(-) （Stratagene社）のXhoI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpBSK（IRES-Hygr-mPGKpA）とした。

　pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA)を鋳型とし，プライマーIRES5'（配列番号２９）及びプライマーIRES3'（配列番号３０）を用いて，PCRによりEMCVのIRESの一部を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（XhoI及びHindIII）で消化し，pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA) のXhoI及びHindIIIサイト間に挿入し，これをpBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA) とした。pBSK（NotI-IRES-Hygr-mPGKpA）を制限酵素（NotI及びBamHI）で消化し，pE-hygrベクターのNotI及びBamHIサイト間に挿入し，これをプラスミドpE-IRES-Hygrとした。

　発現ベクターpPGKIHをEcoRIで消化し，mPGKのプロモーター領域（mPGKp）を含む塩基配列よりなるDNA断片を切り出した。このDNA断片をpBluescript SK(-)（Stratagene社）のEcoRIサイトに挿入し，これをmPGK promoter/pBS(-)とした。mPGK promoter/pBS(-)を鋳型とし，プライマーmPGKP5'（配列番号３１）及びプライマーmPGKP3'（配列番号３２）を用いて，PCRによりmPGKのプロモーター領域（mPGKp）を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（BglII及びEcoRI）で消化し，pCI-neo（Promega社）のBglII及びEcoRIサイト間に挿入し，これをpPGK-neoとした。pE-IRES-Hygrを制限酵素（NotI及びBamHI）で消化してDNA断片（IRES-Hygr）を切り出し，pPGK-neoのNotI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpPGK-IRES-Hygrとした。

　CHO-K1細胞からcDNAを調製し，これを鋳型とし，プライマーGS5'（配列番号３３）及びプライマーGS3'（配列番号３４）を用いて，PCRによりGS遺伝子を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（BalI及びBamHI）で消化し，pPGK-IRES-HygrのBalI及びBamHIサイト間に挿入し，これをpPGK-IRES-GS-ΔpolyAとした。

　pCAGIPuro（Miyahara M. et.al.， J. Biol. Chem. 275，613-618(2000)）を鋳型とし，プライマーpuro5'（配列番号３５）及びプライマーpuro3'（配列番号３６）を用いて，PCRによりピューロマイシン耐性遺伝子（puro^r遺伝子）を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片をpT7Blue T-Vector（Novagen社）に挿入し，これをpT7-puroとした。
pT7-puroを制限酵素（AflII及びBstXI）で消化し，発現ベクターpE-neoのAflII及びBstXIサイト間に挿入し，これをpE-puroとした。

　pE-puroを鋳型とし，プライマーSV40polyA5'（配列番号３７）及びプライマーSV40polyA3'（配列番号３８）を用いて，PCRによりSV40後期ポリアデニル化領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（NotI及びHpaI）で消化し，発現ベクターpE-puroのNotI及びHpaIサイト間に挿入し，これをpE-puro（XhoI）とした。pPGK-IRES-GS-ΔpolyAを制限酵素（NotI及びXhoI）で消化し，IRES-GS領域を含むDNA断片を切り出し，これを発現ベクターpE-puro（XhoI）のNotI及びXhoIサイト間に挿入し，これをpE-IRES-GS-puroとした。なお，pE-IRES-GS-puroの構築は，特許文献（特第6279466号）を参考にして行った。

〔pE-mIRES-GS-puro(ΔE)の構築〕
　発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型とし，プライマーmIRES-GS5'（配列番号３９）及びプライマーmIRES-GS3'（配列番号４０）を用いて，PCRにより，EMCVのIRESからGSにかけての領域を増幅させ，EMCVのIRESの5'側から2番目に位置する開始コドン（ATG）に変異を加えて破壊したDNA断片を増幅させた。発現ベクターpE-IRES-GS-puroを鋳型として，このDNA断片と上記のプライマーIRES5'を用いて，PCRによりIRESからGSにかけての上記領域を含むDNA断片を増幅させた。このDNA断片を制限酵素（NotI及びPstI）で消化し，切り出されたDNA断片を，pBluescript SK(-)（Stratagene社）のNotI及びPstIサイト間に挿入し，これをmIRES/pBlueScript SK（-）とした。

　発現ベクターpE-IRES-GS-puroを，SphIで消化し，SV40エンハンサー領域を切除した。残りのDNA断片をセルフライゲーションし，これをpE-IRES-GS-puro(ΔE)とした。mIRES/pBlueScript SK(-)をNotI及びPstIで消化し，改変型IRES（mIRES）及びGS遺伝子の一部を含む領域を切り出した。別に，pE-IRES-GS-puro(ΔE)を，NotI及びPstIで消化して，上記のmIRES及びGS遺伝子の一部を含む領域を挿入して，pE-mIRES-GS-puro(ΔE)を構築した。

〔pEM-hygr(LC3)及びpE-mIRES-GSp-Fab-IDUAの構築〕
　β-Globin MAR (Matrix Attachment Region)，CMVエンハンサー，ヒトEF-1αプロモーター，MluI及びBamHI切断サイト，インターフェロンβ Marを含むDNA断片（CMVE-EF-1αp-IFNβMAR）を人工的に合成した（配列番号４１）。このDNA断片の5’側にはHindIII配列を，3’側にはEcoRI配列を導入した。このDNA断片をHindIII及びEcoRIで消化し，pUC57ベクターのHindIII及びEcoRIサイト間に挿入し，これをJCR69 in pUC57とした。MluI及びBamHI切断サイト，IRES，ハイグロマイシン耐性遺伝子及びmPGKポリアデニレーションシグナルを含むDNA断片（IRES-HygroR-mPGKpA）を人工的に合成した（配列番号４２）。このDNA断片をJCR69 in pUC57のMluI及びBamHIサイトに挿入し，これをpEM hygroとした。

　配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体の軽鎖の全長をコードする遺伝子を含むDNA断片（配列番号２６）を人工的に合成してpUC57-Ampに挿入し，これをJCR131 in pUC57-Ampとした。このDNA断片の5’側にはMluI配列を，3’側にはNotI配列を導入した。このプラスミドDNAをMluIとNotIで消化し，発現ベクターpEM hygroのMluI-NotI間に組み込んだ。得られたベクターをヒト化抗hTfR抗体の軽鎖の発現用ベクターであるpEM-hygr(LC3)とした。

　配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するヒト化抗hTfR抗体の重鎖のFab領域のC末端側に，配列番号４で示されるリンカー配列を介して，配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するヒトIDUAが結合した，全体として配列番号２７で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む配列番号２８で示される塩基配列を有するDNA断片を人工的に合成した。このDNA断片の5’側にはMluI配列を，3’側にはNotI配列を導入した。このDNA断片をMluI及びNotIで消化し，pE-mIRES-GS-puro(ΔE)のMluIとNotIの間に組み込んだ。得られたベクターをヒト化抗hTfR抗体のFab重鎖のC末端側にhIDUAを結合させた蛋白質の発現用ベクターであるpE-mIRES-GSp-Fab-IDUAとした。

〔実施例２〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質の高発現細胞株の作製
　CHO細胞（CHO-K1：American Type Culture Collectionから入手）を，下記の方法により，NEPA21（NEPAGENE社）を用いて，実施例１で構築したpEM-hygr(LC3)とpE-mIRES-GSp-Fab-IDUAを形質転換した。

　細胞の形質転換は概ね以下の方法で行った。CHO-K1細胞を2×10⁷細胞/mLの密度となるようにCD OptiCHO^TM培地（Thermo Fisher Scientific社）及びPBSの1:1混合液で懸濁した。50 μLの細胞懸濁液を採取し，これにCD OptiCHO^TM培地及びPBSの1:1混合液で200 μg/mLに希釈したpEM-hygr(LC3)プラスミドDNA溶液を50 μL添加した。NEPA21（NEPAGENE社）を用いて，エレクトロポレーションを実施し，細胞にpEM-hygr(LC3)プラスミドDNAを導入した。37℃，5% CO₂の条件下で一晩培養した後，細胞を，0.5 mg/mLのハイグロマイシンを添加したCD OptiCHO^TM培地で選択培養した。得られた細胞に同手法によりpE-mIRES-GSp-Fab-IDUAプラスミドDNA（AhdIで消化し，リニアライズしたもの）を導入した。37℃，5% CO₂の条件下で一晩培養した後，細胞を，0.5 mg/mLのハイグロマイシン及び10 μg/mLのピューロマイシンを添加したCD OptiCHO^TM培地で選択培養した。選択培養の際，MSXの濃度を段階的に上昇させて，最終的にMSX濃度を300 μMとして，薬剤耐性を示す細胞を選択的に増殖させた。

　次いで，限界希釈法により，１ウェルあたり１個以下の細胞が増殖してくるように，96ウェルプレート上に選択培養で選択された細胞を播種し，各細胞が単クローンコロニーを形成するように約2週間培養した。単クローンコロニーが形成されたウェルの培養上清を採取し，ヒト化抗体含量をELISA法にて調べ，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質の高発現細胞株を選択した。

　このときのELISA法は概ね以下の方法で実施した。96ウェルマイクロタイタープレート（Nunc社）の各ウェルに，ニワトリ抗IDUAポリクローナル抗体溶液を0.05 M 炭酸水素塩緩衝液で5 μg/mLに希釈したものを100 μLずつ加え，室温又は4℃で少なくとも１時間静置して抗体をプレートに吸着させた。次いで，トリス緩衝生理食塩水(pH 8.0)に0.05% Tween20を添加したもの(TBS-T)で各ウェルを3回洗浄後，トリス緩衝生理食塩水(pH8.0)に1% BSAを添加したものを各ウェルに300 μLずつ加えてプレートを室温で1時間静置した。次いで，各ウェルをTBS-Tで3回洗浄した後，トリス緩衝生理食塩水(pH 8.0)に0.1% BSA及び0.05% Tween20を添加したもの（TBS-BT）で適当な濃度に希釈した培養上清又はヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質精製品を，各ウェルに100 μLずつ加え，プレートを室温で1時間静置した。次いで，プレートをTBS-Tで3回洗浄した後，TBS-BTで希釈したHRP標識抗ヒトIgGポリクロ－ナル抗体溶液を，各ウェルに50 μLずつ加え，プレートを室温で1時間静置した。TBS-Tで各ウェルを3回洗浄後，ELISA POD基質TMBキット（Nakalai Tesque社）を用いて発色させた。次いで，1 mol/L 硫酸を50 μLずつ各ウェルに加えて反応を停止させ，96ウェルプレートリーダーを用いて，各ウェルにつき450 nmでの吸光度を測定した。高い測定値を示したウェルに対応する細胞を，ヒト化抗hTfR抗体－hIDUA融合蛋白質の高発現細胞株として選択した。こうして得られたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質の高発現細胞株を，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA発現株とした。この細胞株が発現するヒト化抗ｈＴｆＲ抗体とｈＩＤＵＡとの融合蛋白質をヒト化抗hTfR抗体-hIDUA融合蛋白質（ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA）とした。

　得られたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA発現株を，10 mg/L インスリン，16 μmol/L チミジン，100 μmol/L ヒポキサンチン，500 μg/mL ハイグロマイシンB，10 μg/mLピューロマイシン，300 μmol/L MSX及び10% (v/v) DMSOを含有するCD OptiCHO^TM培地に懸濁させてからクライオチューブに分注し，種細胞として液体窒素中で保存した。

〔実施例３〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA発現株の培養
　ヒト化抗hTfR抗体-hIDUAを取得するために，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA発現株を以下の方法で培養した。実施例２で得たヒト化抗hTfR抗体-hIDUA発現株を，細胞密度が約3 X 10⁵個/mLとなるように，10 mg/L インスリン，16 μmol/L チミジン，100 μmol/L ヒポキサンチンを含有する，pH6.9に調整した約170 Lの無血清培地（CD OptiCHO^TM培地，ThermoFisher SCIENTIFIC社）に懸濁させた。この細胞懸濁液170 Lを培養槽に移した。培地をインペラ―で概ね100 rpmの速度で撹拌し，培地の溶存酸素飽和度を約30%に保持し，34～37℃の温度範囲で，約10日間細胞を培養した。培養期間中，細胞密度，細胞の生存率，培地のグルコース濃度及び乳酸濃度を監視した。培地のグルコース濃度が3.0 g/L以下となった場合には，直ちにグルコース濃度が3.5 g/Lとなるように，グルコース溶液を培地に添加した。培養期間中，フィード液（EFFICIENTFEED A+^TM，ThermoFisher SCIENTIFIC社）を適宜培地に添加した。培養終了後に培地を回収した。回収した培地を，Millistak+HC Pod Filter grade D0HC（Merck社)でろ過し，更にMillistak+ HCgrade X0HC (Merck社)でろ過して，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUAを含む培養上清を得た。この培養上清を，Pellicon^TM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径：30 kDa，膜面積：1.14m²，Merck社)を用いて限外ろ過し，液量が約14分の1となるまで濃縮した。次いで，この濃縮液をOpticap XL600(0.22 μm， Merck社)を用いてろ過した。得られた液を濃縮培養上清とした。

〔実施例４〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの精製
　実施例３で得た濃縮培養上清に，0.25倍容の2 M アルギニン溶液(pH 7.0)を添加した。この溶液を，カラム体積の4倍容の400 mM アルギニンを含有する25 mM MES緩衝液(pH6.5)で平衡化した，Capture Select^TM CH1-XLカラム（カラム体積:約3.1 L，ベッド高:約20 cm，Thermo Fisher Scientific社）に，100 cm/時の一定流速で負荷し，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUAをカラムに吸着させた。Capture Select^TM CH1-XLカラムは，IgG抗体のCH1ドメインと特異的に結合する性質を有するリガンドが担体に固定化されたアフィニティーカラムである。

　次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を同流速で供給してカラムを洗浄した。次いでカラム体積の3倍容の25 mM MES緩衝液(pH 6.5)を同流速で供給してカラムを更に洗浄した。次いで，カラム体積の5倍容の10 mM 酢酸ナトリウム-HCl緩衝液(pH 3.5)で，カラムに吸着したヒト化抗hTfR抗体-hIDUAを溶出させた。溶出液は，予め250 mM MES緩衝液(pH 6.0)を入れた容器に受けて，直ちに中和した。

　上記のアフィニティーカラムからの溶出液に，250 mM MES緩衝液(pH 6.5)を添加し，溶出液のpHを6.0に調整した。次いで，この溶出液を，Opticap XL600(孔径：0.22 μm， Merck社)でろ過した。このろ過後の溶液を，カラム体積の5倍容の15 mM NaClを含有する50 mM MES緩衝液(pH 6.0)で平衡化した，マルチモーダル陰イオン交換カラムであるCapto adhereカラム(カラム体積:約1.5 L，ベッド高:約10 cm，GE Healthcare社)に，300 cm/時の一定流速で負荷させた。このヒト化抗hTfR抗体-hIDUAを含む負荷液を回収した。Capto adhereは，N-ベンジル-N-メチルエタノールアミンをリガンドとするもので，静電相互作用，水素結合，疎水性相互作用等に基づく選択性を有する強陰イオン交換体である。

　次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を同流速で供給してカラムを洗浄し，この洗浄液を回収した。

　上記負荷液及び洗浄液をカラム体積の4倍容の300 mM NaClを含有する25 mM MES緩衝液(pH 6.5)で平衡化した，マルチモーダル弱陽イオン交換カラムであるCapto MMCカラム(カラム体積:約3.1 L，ベッド高:約20 cm，GE Healthcare社)に，200 cm/時の一定流速で負荷させた。Capto MMCは，疎水性相互作用，水素結合形成等に基づく選択性を有する弱陽イオン交換体である。

　次いで，カラム体積の5倍容の同緩衝液を同流速で供給してカラムを洗浄した。次いで，カラム体積の10倍容の1 M NaClを含有する25 mM MES緩衝液(pH 6.5)で，弱陽イオン交換カラムに吸着したヒト化抗hTfR抗体-hIDUAを溶出させた。

　上記の弱陽イオン交換カラムからの溶出液に，0.5倍容の0.8 mg/mL NaCl及び75 mg/mL スクロースを含有する20 mM クエン酸緩衝液(pH 5.5)を加えてpHを5.8に調整した。次いで，Pellicon^TM 3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔径：30 kDa，膜面積：0.57 m²，Merck社)を用いて限外ろ過し，溶液中のヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの濃度が約30 mg/mLとなるまで濃縮した。次いで，この濃縮液をOpticap XL600 (0.22 μm， Merck社)を用いてろ過した。

上記の濃縮液を，カラム体積の1.5倍容の0.8 mg/mL NaCl及び75 mg/mL スクロースを含有する20 mM クエン酸緩衝液(pH 5.5)で平衡化した，サイズ排除カラムであるBioSECカラム(カラム体積:約9.4 L，ベッド高:30 cm， Merck社)に，40 cm/時の一定流速で負荷し，更に，同緩衝液を同じ流速で供給した。このとき，サイズ排除カラムからの溶出液の流路に，溶出液の吸光度を連続的に測定するための吸光光度計を配置して，280 nmの吸光度をモニターし，280 nmで吸収ピークを示した画分を，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUAを含む画分として回収し，これをヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品とした。

〔実施例５〕精製各ステップにおけるヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの回収率の測定
　アフィニティーカラムによる精製ステップにおけるヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの負荷量及び溶出液中に回収された量を実施例２に記載のELISA法を用いて測定した。また，それ以外の精製各ステップにおけるヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの負荷量及び溶出液中に回収された量を，分光光度計で280 nmにおける吸光度を測定して，算出した。その結果を表３に示す。当初，培養上清中に含まれた23.7 gのヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの約74.0%に相当する，17.5 gのヒト化抗hTfR抗体-hIDUAが，精製品として回収された。これらの結果は，上記実施例４に記載の精製法が，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの精製方法として非常に効率の高いものであることを示すものである。なお，表３において，工程回収率(%)は，各精製ステップにおける負荷したヒト化抗hTfR抗体-hIDUA量に対する回収されたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA量の比率を意味し，総回収率(%)は，精製工程に供したヒト化抗hTfR抗体-hIDUA量の初期量に対する各精製ステップで回収されたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA量の比率を意味する。

〔実施例６〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品の分析（HCPの定量）
　実施例４で得られたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品に含まれる宿主細胞由来蛋白質(HCP)の量をELISA法により定量した。まず，96ウェルプレート(Nunc社)の各ウェルに抗CHO細胞由来蛋白質抗体を100 μL添加し，一晩静置して抗体を吸着させた。各ウェルを3回洗浄した後，各ウェルにカゼインを含むブロッキング溶液を200 μL添加し，25℃で60分間振とうした。各ウェルを3回洗浄した後，各ウェルにヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品を含む溶液（サンプル溶液）又はHCP標準溶液をそれぞれ100 μL添加して，25℃で2時間振とうした。各ウェルを3回洗浄した後，各ウェルにビオチン化抗CHO細胞由来蛋白質抗体を100 μL添加し，25℃で60分間振とうした。各ウェルを3回洗浄した後，HRP-conjugated streptavidin (Jackson Immuno Research Laboratories社)を100 μL添加し，25℃で60分間振とうした。各ウェルを3回洗浄した後，各ウェルにTMB基質溶液を100 μL添加し，25℃で発色させた。TMB基質溶液には，TMB microwell peroxidase substrate system (KPL社)のTMB peroxidase substrateとPeroxidase substrate solution Bを等量混合したものを用いた。発色後，各ウェルに6.75%リン酸を100 μL添加して酵素反応を停止させ，各ウェルの450 nmにおける吸光度を96ウェル用プレートリーダーで測定した。HCP標準溶液の測定値から検量線を作成し，これにサンプル溶液の値を内挿してヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品に含まれるHCPを定量した。こうして求めたHCPの定量値と，実施例２に記載のELISA法を用いて測定したヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品の定量値とから，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品に含まれるHCPを定量した。その結果，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品に含まれるHCPの量は，約35 ppm（即ち，1 mgのヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品中に約35 ngのHCP）であることがわかった。

〔実施例７〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品の分析（SE-HPLC分析）
　TSKgel G3000SW_XLカラム（内径7.8 mm X 高さ30 cm，東ソー社）をLC-20Aシステム，SPD-20AVのUV/VIS検出器（島津製作所社）にセットした。カラムを5% 2－プロパノールと20 mM NaClとを含む200 mM リン酸緩衝液で平衡化した。このカラムに，実施例４で得られたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品を1.0 mg/mLの濃度で含有する10 μLの溶液を，0.6 mL/分の一定流速で負荷し，更に同緩衝液を同じ流速で供給した。215 nmにおける吸光度を測定して作成した溶出プロファイルを図１に示す。得られたプロファイルは，ほぼヒト化抗hTfR抗体-hIDUAに由来する単一のピークのみを示した。但し，主ピーク（図中単量体ピーク）よりも前に検出されるヒト化抗hTfR抗体-hIDUAの重合体に由来するピーク（図中重合体ピーク）が認められた。ピーク全体の面積と重合体ピークの面積の比率から，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA全体に占める重合体の比率は，約0.02%と計算された。

〔実施例８〕ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品の分析（まとめ）
　以上のヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品の分析結果は，実施例４で得られたヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品が，HCPを含む夾雑物をほとんど含まないものであること，及び，重合体の存在比率が極めて低いことを示すものである。すなわち，ヒト化抗hTfR抗体-hIDUA精製品は，医薬，例えば，静脈内，筋肉内，皮下，腹腔内，動脈内，又は病巣内投与剤として，そのまま使用できる品質のものであるといえる。

　本発明によれば，例えば，医薬としてそのまま用いることのできる純度にまで精製された，抗体とリソソーム酵素とを結合させた融合蛋白質，特に抗体とhIDUAとを結合させた融合蛋白質を提供することができる。

配列番号１：リンカー例１のアミノ酸配列
配列番号２：リンカー例２のアミノ酸配列
配列番号３：リンカー例３のアミノ酸配列
配列番号４：リンカー例４のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトトランスフェリン受容体のアミノ酸配列
配列番号６：ヒトＩＤＵＡのアミノ酸配列１
配列番号７：ヒトＩＤＵＡのアミノ酸配列２
配列番号８：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号９：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１０：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１１：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１２：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１３：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列１
配列番号１４：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列２
配列番号１５：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列１
配列番号１６：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列２
配列番号１７：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列１
配列番号１８：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列２
配列番号１９：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖フレームワーク領域３のアミノ酸配列
配列番号２０：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２１：抗ｈＴｆＲ抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号２２：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２３：抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：プライマーＨｙｇ－Ｓｆｉ５’，合成配列
配列番号２５：プライマーＨｙｇ－ＢｓｔＸ３’，合成配列
配列番号２６：抗ｈＴｆＲ抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列，合成配列
配列番号２７：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖とヒトＩＤＵＡの融合蛋白質のアミノ酸配列
配列番号２８：ヒト化抗ｈＴｆＲ抗体のFab重鎖とヒトＩＤＵＡの融合蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を含む塩基配列，合成配列
配列番号２９：プライマーIRES5'，合成配列
配列番号３０：プライマーIRES3'，合成配列
配列番号３１：プライマーmPGKP5'，合成配列
配列番号３２：プライマーmPGKP3'，合成配列
配列番号３３：プライマーGS5'，合成配列
配列番号３４：プライマーGS3'，合成配列
配列番号３５：プライマーpuro5'，合成配列
配列番号３６：プライマーpuro3'，合成配列
配列番号３７：プライマーSV40polyA5'，合成配列
配列番号３８：プライマーSV40polyA3'，合成配列
配列番号３９：プライマーmIRES-GS5'，合成配列
配列番号４０：プライマーmIRES-GS3'，合成配列
配列番号４１：CMVE-EF-1αp-IFNβMAR，合成配列
配列番号４２：IRES-HygroR-mPGKpA，合成配列

Claims

　抗体とヒトリソソーム酵素とを融合させた融合蛋白質の製造方法であって；
（ａ）該融合蛋白質を産生する哺乳動物細胞を無血清培地中で培養して該融合蛋白質を培養液中に分泌させ，
（ｂ）該培養液から該哺乳動物細胞を除去することにより培養上清を回収し，
（ｃ）該培養上清から，該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと，陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと，陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと，及びサイズ排除カラムクロマトグラフィーとを用いて，該融合蛋白質を精製する，
ことを含んでなるものである，製造方法。
　該抗体に親和性を有する物質を結合させた材料を固定相として用いたカラムクロマトグラフィーと，該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーと，該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーと、及び該サイズ排除カラムクロマトグラフィーとを，この順で用いてなるものである，請求項１に記載の製造方法。
　該抗体に親和性を有する物質が，該抗体の重鎖のＣＨ_１領域に親和性を有するものである、請求項１又は２に記載の製造方法。
　該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陰イオン交換体が，強陰イオン交換体である，請求項１乃至３のいずれかに記載の製造方法。
　該陽イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陽イオン交換体が，弱陽イオン交換体である，請求項１乃至４のいずれかに記載の製造方法。
　該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が，ヒト化抗体又はヒト抗体である，請求項１乃至５のいずれかに記載の製造方法。
　該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が，ヒト化抗体である，請求項１乃至５のいずれかに記載の製造方法。
　該ヒトリソソーム酵素と融合させた該抗体が，血管内皮細胞の表面に存在する分子を抗原とするものである，請求項１乃至７のいずれかに記載の製造方法。
　血管内皮細胞の表面に存在する該分子が，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ－Ｆ，有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ－８，モノカルボン酸トランスポーター，及びＦｃ受容体からなる群から選択されるものである，請求項８に記載の製造方法。
　該血管内皮細胞が脳血管内皮細胞である，請求項８に記載の製造方法。
　該脳血管内皮細胞の表面に存在する分子が，トランスフェリン受容体（ＴｆＲ），インスリン受容体，レプチン受容体，リポ蛋白質受容体，ＩＧＦ受容体，ＯＡＴＰ－Ｆ，有機アニオントランスポーター，ＭＣＴ－８，及びモノカルボン酸トランスポーターからなる群から選択されるものである，請求項１０に記載の製造方法。
　該血管内皮細胞が，ヒトの血管内皮細胞である，請求項８乃至１１のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体が，抗ヒトトランスフェリン受容体抗体であって，
　該抗体が重鎖の可変領域において，ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
　該抗体が軽鎖の可変領域において，ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，及びＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１乃至１２のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体が，重鎖のフレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３に記載の製造方法。
　該抗体における該重鎖の可変領域が，配列番号２１のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１４に記載の製造方法。
　該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３又は１４に記載の製造方法。
　該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３又は１４に記載の製造方法。
　該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列に対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３又は１４に記載の製造方法。
　該抗体が重鎖の可変領域において，配列番号２１のアミノ酸配列に対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１５又は配列番号１６のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１７又は配列番号１８のアミノ酸配列を含んでなり，及び
　フレームワーク領域３が配列番号１９のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３又は１４に記載の製造方法。
　該抗体の軽鎖の可変領域が，配列番号２０のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３乃至１９のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３乃至１９のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３乃至１９のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列に対し１～５個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３乃至１９のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体が軽鎖の可変領域において，配列番号２０のアミノ酸配列に対し１～３個のアミノ酸の置換，欠失又は付加による改変がなされたアミノ酸配列を含んでなるものであり，且つ
　ＣＤＲ１が配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列を含んでなり，
　ＣＤＲ２が配列番号１０若しくは配列番号１１のアミノ酸配列，又はアミノ酸配列Lys-Val-Serを含んでなり，
　ＣＤＲ３が配列番号１２のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項１３乃至１９のいずれかに記載の製造方法。
　該抗体の該重鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列を含むものである，上記１５に記載の製造方法。
　該抗体の該軽鎖が，配列番号２２のアミノ酸配列を含むものである，上記２０又は２５に記載の製造方法。
　該抗体がＦａｂ，Ｆ（ａｂ’）_２，又はＦ（ａｂ’）である，請求項１乃至２６のいずれかに記載の製造方法。
　該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，該抗体の軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に結合しているものである，請求項１乃至２７のいずれかに記載の製造方法。
　該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，該軽鎖のＣ末端側又はＮ末端側に，直接又はリンカーを介して，結合しているものである，請求項２８に記載の製造方法。
　該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，該重鎖のＣ末端側又はＮ末端側においてリンカーを介して結合しているものである，請求項２８に記載の製造方法。
　該リンカー配列が，１～５０個のアミノ酸残基からなるペプチドである，請求項２９又は３０に記載の製造方法。
　該リンカーが，１個のグリシン，１個のセリン，アミノ酸配列Gly-Ser，アミノ酸配列Gly-Gly-Ser，配列番号１のアミノ酸配列，配列番号２のアミノ酸配列，配列番号３のアミノ酸配列，配列番号４のアミノ酸配列，及びこれらのアミノ酸配列が１～１０個連続してなるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである，請求項３１に記載の製造方法。
　該融合蛋白質における該ヒトリソソーム酵素が，ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼである，請求項１乃至３２のいずれかに記載の製造方法。
　該融合蛋白質における該抗体がＦａｂであり，
　該抗体の軽鎖が，配列番号２２のアミノ酸配列を含んでなり，且つ
　該抗体の重鎖が，そのＣ末端側で，配列番号４のアミノ酸配列を介して，ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合し，それにより該融合蛋白質が配列番号２７のアミノ酸配列を形成しているものである，請求項３３に記載の製造方法。
　該融合蛋白質における該抗体がＦａｂであり，
　該抗体の軽鎖が，配列番号２２のアミノ酸配列からなり，且つ
　該抗体の重鎖が，配列番号２３のアミノ酸配列からなり，そのＣ末端側で，配列番号４のアミノ酸配列からなるリンカーを介して，配列番号６のアミノ酸配列からなるヒトα－Ｌ－イズロニダーゼと結合するものである，請求項３３に記載の製造方法。
　該ヒトα－Ｌ－イズロニダーゼが，配列番号６又は７のアミノ酸配列を含んでなるものである，請求項３３に記載の製造方法。