TW202246326A - 抗體–溶酶體酶融合蛋白質之製造方法 - Google Patents
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Abstract
本發明之課題係提供一種使抗體與溶酶體酶融合而成的融合蛋白質之製造方法。
解決手段為一種製造方法,其係使抗體與人類溶酶體酶融合而成的融合蛋白質之製造方法,包含下列而成:(a)在無血清培養基中培養產生該融合蛋白質的哺乳動物細胞而使該融合蛋白質被分泌於培養液中,(b)藉由從該培養液去除該哺乳動物細胞而回收培養上清液,(c)使用將已結合對該抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法,而從該培養上清液純化該融合蛋白質。
Description
本發明係關於使抗體與溶酶體酶融合而成的融合蛋白質之製造方法,例如關於將藉由培養經導入已併入編碼該融合蛋白質之基因之表現載體的宿主細胞所獲得的重組融合蛋白質純化至可作為醫藥利用之純度的方法。
目前,已市售許多含有重組蛋白質作為有效成分而成的醫藥。此種重組蛋白質,係藉由培養經導入已併入編碼目標蛋白質之基因之表現載體的宿主細胞,而在培養上清液中所獲得者。在培養上清液中所獲得的重組蛋白質因含有雜質而無法直接作為醫藥使用。為了作為醫藥使用,而必須純化培養上清液中所含的重組蛋白質。
已有報告使用哺乳動物細胞作為宿主細胞,培養此宿主細胞而將在培養上清液中所獲得的重組蛋白質純化至可作為醫藥使用之程度的方法。例如,已報告一種方法,係使用CHO細胞作為宿主細胞,而使人類紅血球生成素(hEPO)作為重組蛋白質表現,並使用包含染料親和管柱層析法的各種層析法而將其從培養上清液純化至可作為醫藥使用,該人類紅血球生成素(hEPO)為對紅血球前驅母細胞(erythroid progenitor)作用使其分化成紅血球而促進紅血球產生之糖蛋白質(專利文獻1)。又例如,已報告一種方法,係使用CHO細胞作為宿主細胞,而使人類濾泡刺激素(hFSH)作為重組蛋白質表現,並使用包含陽離子交換管柱層析法的各種層析法而將其由培養上清液純化至可使用於醫藥,該人類濾泡刺激素(hFSH)為一種具有促進在卵巢之雌激素的生產及分泌之活性的促性腺激素(專利文獻2)。又例如,已報告一種方法,係使用CHO細胞作為宿主細胞,而使人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)作為重組蛋白質表現,並使用包含陽離子交換管柱層析法的各種層析法而將其從培養上清液純化至可使用於醫藥,該人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(hI2S)為一種具有水解存在於如肝素硫酸或硫酸皮膚素之醣胺聚醣(glycosaminoglycan)(GAG)分子內的硫酸酯鍵之活性的溶酶體酶(專利文獻3)。又例如,已報告一種方法,係使用CHO細胞作為宿主細胞,而使人類α-半乳糖苷酶A(hα-Gal A)作為重組蛋白質表現,並並使用包含陰離子交換管柱層析法的各種層析法而將其從培養上清液純化至可使用於醫藥,該人類α-半乳糖苷酶A(hα-Gal A)為一種具有水解糖脂質及糖蛋白質之末端α-半乳糖基鍵之活性的溶酶體酶(專利文獻4,專利文獻5)。又例如,已報告一種方法,係使用CHO細胞作為宿主細胞,而使具有會鹼基序列非特異性地分解DNA之活性的人類DNaseI作為重組蛋白質表現,並使用包含陰離子交換管柱層析法及染料配位體親和管柱層析法的各種層析法而將其從培養上清液純化至可使用於醫藥(專利文獻6)。又例如,已報告一種方法,係使用CHO細胞作為宿主細胞,而使已結合人類艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶之抗hTfR抗體作為重組蛋白質表現,並使用蛋白質A親和管柱層析法、羥磷灰石管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法而將其從培養上清液純化至可使用於醫藥(專利文獻7)。
如此地,為了取得可作為醫藥使用的重組蛋白質,而對於各自的重組蛋白質已開發獨自的純化方法。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2010-511378號公報
[專利文獻2]日本特開2009-273427號公報
[專利文獻3]日本特表2014-508506號公報
[專利文獻4]國際公開第2014/017088號
[專利文獻5]國際公開第2016/117341號
[專利文獻6]國際公開第2016/067944號
[專利文獻7]國際公開第2018/038243號
[發明欲解決之課題]
本發明之目的係提供一種使融合蛋白質作為重組蛋白質表現,而將其純化至能夠作為醫藥於市場上流通之純度的方法,其中該融合蛋白質為使抗體與溶酶體酶融合而成的融合蛋白質。
[用以解決課題之手段]
於針對上述目標的研究中,本發明人等一再專心致力研究的結果,發現了:將藉由於無血清培養基中培養經導入已併入編碼融合蛋白質之基因之表現載體的哺乳動物細胞而在培養液中獲得融合蛋白質,使用將已結合對該抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法的組合而進行純化,藉此而可高純度且效率良好地進行純化,其中該融合蛋白質為使抗運鐵蛋白受體抗體與人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)融合而成的融合蛋白質。本發明係基於此等知識見解而更進一步檢討而完成者。即,本發明提供以下。
1.一種製造方法,其係使抗體與人類溶酶體酶融合而成的融合蛋白質之製造方法,其包含:
(a)在無血清培養基中培養產生該融合蛋白質的哺乳動物細胞而使該融合蛋白質被分泌於培養液中的步驟,
(b)藉由從上述步驟(a)所獲得的培養液去除該哺乳動物細胞而回收培養上清液的步驟,
(c)使用將已結合對該抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法,而從上述步驟(b)所獲得的培養上清液純化該融合蛋白質的步驟。
2.上述1之製造方法,其係在該步驟(c)中,依下述順序使用將已結合對該抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法而成。
3.上述1或2之製造方法,其中對該抗體具有親和性的物質係對該抗體之重鏈的CH
1區域具有親和性。
4.上述1至3中任一項之製造方法,其中於該陰離子交換管柱層析法中使用的陰離子交換體為強陰離子交換體。
5.上述1至4中任一項之製造方法,其中該陽離子交換管柱層析法中使用的陽離子交換體為弱陽離子交換體。
6.上述1至5中任一項之製造方法,其中與該人類溶酶體酶融合的該抗體為人類化抗體或人類抗體。
7.上述1至5中任一項之製造方法,其中與該人類溶酶體酶融合的該抗體為人類化抗體。
8.上述1至7中任一項之製造方法,其中與該人類溶酶體酶融合的該抗體係以存在於血管內皮細胞之表面的分子為抗原。
9.上述8之製造方法,其中存在於血管內皮細胞之表面的該分子選自包含運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F、有機陰離子運輸蛋白、MCT-8、單羧酸轉運蛋白、及Fc受體的群組。
10.上述8之製造方法,其中該血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。
11.上述10之製造方法,其中該存在於腦血管內皮細胞之表面的分子選自包含運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F、有機陰離子運輸蛋白、MCT-8、及單羧酸轉運蛋白的群組。
12.上述8至11中任一項之製造方法,其中該血管內皮細胞為人類之血管內皮細胞。
13.上述1至12中任一項之製造方法,其中該抗體為抗人類運鐵蛋白受體抗體,
該抗體係於重鏈之可變區中,CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成,CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成,及CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,且
該抗體係於輕鏈之可變區中,CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成,CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成,及CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
14.上述13之製造方法,其中該抗體係重鏈之框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
15.上述14之製造方法,其中該抗體中的該重鏈之可變區係包含序列識別號21之胺基酸序列而成。
16.上述13或14之製造方法,其中該抗體係於重鏈之可變區中,包含與序列識別號21之胺基酸序列具有80%以上之同一性的胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成,
CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及
框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
17.上述13或14之製造方法,其中該抗體係於重鏈之可變區中,包含與序列識別號21之胺基酸序列具有90%以上之同一性的胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成,
CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及
框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
18.上述13或14之製造方法,其中該抗體係於重鏈之可變區中,包含對序列識別號21之胺基酸序列經進行由1~5個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成,
CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及
框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
19.上述13或14之製造方法,其中該抗體係於重鏈之可變區中,包含對序列識別號21之胺基酸序列經進行由1~3個胺基酸的取代,刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成,
CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及
框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
20.上述13至19中任一項之製造方法,其中該抗體中的輕鏈之可變區係包含序列識別號20之胺基酸序列而成。
21.上述13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含與序列識別號20之胺基酸序列具有80%以上之同一性的胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成,
CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
22.上述13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含與序列識別號20之胺基酸序列具有90%以上之同一性的胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成,
CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
23.上述13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含對序列識別號20之胺基酸序列經進行由1~5個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成,
CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
24.上述13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區,包含對序列識別號20之胺基酸序列經進行由1~3個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且
CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成,
CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成,
CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
25.上述15之製造方法,其中該抗體之該重鏈包含序列識別號23之胺基酸序列。
26.上述20或25之製造方法,其中該抗體之該輕鏈包含序列識別號22之胺基酸序列。
27.上述1至26中任一項之製造方法,其中該抗體為Fab、F(ab’)
2、或F(ab’)。
28.上述1至27中任一項之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶係結合於該抗體之輕鏈的C末端側或N末端側。
29.上述28之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶係直接或透過連接子而結合於該輕鏈的C末端側或N末端側。
30.上述28之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶係透過連接子而結合於該重鏈的C末端側或N末端側。
31.上述29或30之製造方法,其中該連接子序列為包含1~50個胺基酸殘基的肽。
32.上述31之製造方法,其中該連接子為包含選自以下群組之胺基酸序列而成的肽,該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1之胺基酸序列、序列識別號2之胺基酸序列、序列識別號3之胺基酸序列、序列識別號4之胺基酸序列、及此等之胺基酸序列1~10個連續而成的胺基酸序列。
33.上述1至32中任一項之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶為人類α-L-艾杜糖醛酸酶。
34.上述33之製造方法,其中該融合蛋白質中的該抗體為Fab,
該抗體之輕鏈為由序列識別號22之胺基酸序列而成,且
該抗體之重鏈係藉由在其C末端側,透過由序列識別號4之胺基酸序列而成的連接子,與該人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合,而該融合蛋白質形成序列識別號27之胺基酸序列。
35.上述33之製造方法,其中該融合蛋白質中的該抗體為Fab,
該抗體之輕鏈為由序列識別號22之胺基酸序列而成,且
該抗體之重鏈為由序列識別號23之胺基酸序列而成,在其C末端側,透過由序列識別號4之胺基酸序列而成的連接子,與由序列識別號6之胺基酸序列而成的人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合。
36.上述33之製造方法,其中該人類α-L-艾杜糖醛酸酶係包含序列識別號6或7之胺基酸序列而成。
[發明之效果]
如依據本發明,則可提供一種融合蛋白質,其為抗運鐵蛋白受體抗體與溶酶體酶之融合蛋白質,係被純化至可作為伴隨中樞神經系統障礙的溶酶體病之治療劑在臨床上使用之純度的融合蛋白質。尤其,可提供一種融合蛋白質,其為抗運鐵蛋白受體抗體與人類IDUA之融合蛋白質,係被純化至可作為伴隨中樞神經系統障礙的賀勒氏症候群(Hurler syndrome)之治療劑在臨床上使用之純度的融合蛋白質。
[用以實施發明的形態]
本發明係關於使抗運鐵蛋白受體抗體(抗TfR抗體)與人類溶酶體酶結合而成的蛋白質之製造方法。此處,與溶酶體酶結合的抗體只要為具有會與抗原特異性結合的性質者,則對於抗體之動物種類等並無特別限制,但尤其為人類抗體或人類化抗體。例如,抗體可為人類以外的哺乳動物的抗體,還可為人類抗體與人類以外的其它哺乳動物之抗體的嵌合抗體。
人類抗體係指其全體由源自人類的基因所編碼的抗體。惟,以使基因表現效率提升等之目的,而對原始人類基因施加變異而成的基因所編碼的抗體亦為人類抗體。又,組合編碼人類抗體的2個以上之基因,將某一個人類抗體的一部分置換為其它人類抗體的一部分的抗體亦為人類抗體。人類抗體具有免疫球蛋白輕鏈之3處的互補性決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處的互補性決定區域(CDR)。免疫球蛋白輕鏈之3處的CDR,係由位於N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。免疫球蛋白重鏈之3處的CDR,係由位於N末端側者依序稱為CDR1、CDR2及CDR3。藉由將某一個人類抗體的CDR置換為其它人類抗體的CDR,而改變了人類抗體的抗原特異性、親和性等之抗體,亦為人類抗體。
於本發明中,藉由改變原本的人類抗體基因,而對原本的抗體的胺基酸序列施加取代、缺失、加成等之變異而成的抗體,亦稱為人類抗體。使原本抗體的胺基酸序列中之胺基酸取代為其它胺基酸的情形,所取代的胺基酸個數較佳為1~20個,更佳為1~10個,進一步較佳為1~5個,進一步更佳為1~3個。使原本的抗體之胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形,所缺失的胺基酸個數較佳為1~20個,更佳為1~10個,進一步較佳為1~5個,更佳為1~3個。又,施加組合此等胺基酸的取代與缺失之變異的抗體,亦為人類抗體。使胺基酸加成的情形,於原本的抗體的胺基酸序列中或N末端側或者是C末端側,較佳為加成1~20個胺基酸,更佳為1~10個,進一步較佳為1~5個,進一步更佳為1~3個。施加組合此等胺基酸的加成、取代及缺失之變異的抗體,亦為人類抗體。經施加變異的抗體之胺基酸序列,係與原本的抗體之胺基酸序列較佳為顯示80%以上之同一性,更佳為顯示85%以上之同一性,進一步較佳為顯示90%以上之同一性,進一步更佳為顯示95%以上之同一性,還又進一步較佳為顯示98%以上之同一性。即,於本發明中稱為「源自人類的基因」時,除了源自人類之原本的基因之外,亦包含藉由對源自人類之原本的基因施加改變而獲得的基因。
於本發明中,「人類化抗體」之用語,係指可變區的一部分(例如,特別是CDR的全部或一部分)之胺基酸序列源自人類以外的哺乳動物,而其以外的區域源自人類的抗體。例如,作為人類化抗體,可列舉藉由將構成人類抗體的免疫球蛋白輕鏈之3處的互補性決定區域(CDR)與免疫球蛋白重鏈之3處的互補性決定區域(CDR),以其它哺乳動物的CDR取代而製作的抗體。成為被移植至人類抗體的適當位置之CDR的來源的其它哺乳動物的生物種,只要為人類以外的哺乳動物,則未特別限定,但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外的靈長類,更佳為小鼠及大鼠,例如小鼠。
針對於本發明中抗體為人類抗體或人類化抗體的情形,於以下進行詳述。於人類抗體及人類化抗體之輕鏈,有λ鏈及κ鏈。構成抗體的輕鏈可為λ鏈及κ鏈之任一者。又,於人類抗體及人類化抗體之重鏈,有γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈,分別對應IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。構成抗體的重鏈可為γ鏈、μ鏈、α鏈、σ鏈及ε鏈之任一者,但較佳為γ鏈。再者,於抗體重鏈的γ鏈,有γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈,分別對應IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。構成抗體的重鏈為γ鏈的情形,其γ鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者,但較佳為γ1鏈或γ4鏈。抗體為人類化抗體或人類抗體,且為IgG的情形,其抗體的輕鏈可為λ鏈及κ鏈之任一者,其抗體之重鏈可為γ1鏈、γ2鏈、γ3鏈及γ4鏈之任一者,但較佳為γ1鏈或γ4鏈。例如,作為較佳抗體之一個態樣,可列舉輕鏈為κ鏈且重鏈為γ1鏈者、輕鏈為λ鏈且重鏈為γ1鏈者。
於本發明中,「嵌合抗體」之用語,係指源自2個以上不同物種之2個以上不同抗體的片段經連結而成的抗體。
人類抗體與其它哺乳動物之抗體的嵌合抗體,係指人類抗體的一部分經人類以外的哺乳動物的抗體的一部分所取代的抗體。抗體包含以下說明的Fc區域、Fab區域及鉸鏈部。作為此種嵌合抗體之具體例,可列舉Fc區域源自人類抗體而另一方面Fab區域源自其它哺乳動物之抗體的嵌合抗體。鉸鏈部源自人類抗體或其它哺乳動物的抗體之任一者。相反地,可列舉Fc區域源自其它哺乳動物而另一方面Fab區域源自人類抗體的嵌合抗體。鉸鏈部可源自人類抗體或其它哺乳動物的抗體之任一者。
又,抗體亦可為包含可變區與恆定區。作為嵌合抗體之其它具體例,可列舉:重鏈之恆定區(C
H)與輕鏈之恆定區(C
L)源自人類抗體而另一方面重鏈之可變區(V
H)及輕鏈之可變區(V
L)源自其它哺乳動物的抗體者;和相反地,重鏈之恆定區(C
H)與輕鏈之恆定區(C
L)源自其它哺乳動物的抗體而另一方面重鏈之可變區(V
H)及輕鏈之可變區(V
L)源自人類抗體者。此處,其它哺乳動物的生物種只要為人類以外之哺乳動物則未特別限定,但較佳為小鼠、大鼠、兔、馬、或人類以外之靈長類,更佳為小鼠。
人類抗體與小鼠抗體之嵌合抗體,特別地稱為「人類/小鼠嵌合抗體」。於人類/小鼠嵌合抗體,可列舉:Fc區域源自人類抗體而另一方面Fab區域源自小鼠抗體的嵌合抗體;和相反地,Fc區域源自鼠抗體而另一方面Fab區域源自人類抗體的嵌合抗體。鉸鏈部源自人類抗體或小鼠抗體之任一者。作為人類/小鼠嵌合抗體之其它的具體例,可列舉:重鏈之恆定區(C
H)與輕鏈之恆定區(C
L)源自人類抗體而另一方面重鏈之可變區(V
H)及輕鏈之可變區(V
L)源自小鼠抗體者;和相反地,重鏈之恆定區(C
H)與輕鏈之恆定區(C
L)源自小鼠抗體而另一方面重鏈之可變區(V
H)及輕鏈之可變區(V
L)源自人類抗體者。
抗體原本具有由2條免疫球蛋白輕鏈與2條免疫球蛋白重鏈之共計4條多肽鏈而成的基本構造。惟,於本發明中,稱為「抗體」時,除了具有此基本構造者之外,亦包含:
(1)由1條免疫球蛋白輕鏈與1條免疫球蛋白重鏈之共計2條多肽鏈而成者;或如以下詳述,
(2)一種單股抗體,其為使連接子序列結合於免疫球蛋白輕鏈的C末端側,而且進一步使免疫球蛋白重鏈結合於其C末端側而成者;及
(3)一種單股抗體,使連接子序列結合於免疫球蛋白重鏈的C末端側,而且進一步使免疫球蛋白輕鏈之可變區結合於其C末端側而成者。又,本發明中的「抗體」亦包含:
(4)由從原本意義的抗體之基本構造缺失了Fc區域之Fab區域而成者及由Fab區域與鉸鏈部全部或一部分而成者(包含Fab、F(ab’)及F(ab’)
2)。
此處Fab係指包含可變區與C
L區域(輕鏈之恆定區)的1條輕鏈、及包含可變區與C
H1區域(重鏈之恆定區的部分1)的1條重鏈,以各自存在的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵而結合的分子。於Fab中,重鏈除了可變區與C
H1區域(重鏈之恆定區的部分1)之外,可進一步包含鉸鏈部之一部分,但此情形的鉸鏈部為欠缺存在於鉸鏈部而結合抗體之重鏈彼此的半胱胺酸殘基者。於Fab中,輕鏈與重鏈係藉由在存在於輕鏈之恆定區(C
L區域)的半胱胺酸殘基、和存在於重鏈之恆定區(C
H1區域)或存在於鉸鏈部的半胱胺酸殘基之間所形成的雙硫鍵而結合。將形成Fab的重鏈者稱為Fab重鏈。Fab由於欠缺存在於鉸鏈部而結合抗體之重鏈彼此的半胱胺酸殘基,因此由1條輕鏈與1條重鏈而成。構成Fab的輕鏈包含可變區與C
L區域。構成Fab的重鏈可為由可變區與C
H1區域而成者,亦可為除了可變區、C
H1區域之外還包含鉸鏈部的一部分者。但此情形,鉸鏈部係以不包含結合重鏈間的半胱胺酸殘基的方式選擇,使在鉸鏈部於2條重鏈之間不會形成雙硫鍵。於F(ab’)中,其重鏈除了可變區與C
H1區域之外,還包含全部或一部分之含有結合重鏈彼此的半胱胺酸殘基的鉸鏈部。F(ab’)
2係指2個F(ab’)以存在於雙方之鉸鏈部的半胱胺酸殘基彼此藉由雙硫鍵而結合的分子。將形成F(ab’)或F(ab’)
2的重鏈者稱為Fab’重鏈。又,複數之抗體直接或透過連接子結合而成的二聚體、三聚體等之聚合體,亦為抗體。再者,未限於此等,包含免疫球蛋白分子之一部分,且具有與抗原特異性地結合之性質者,任一者皆包含於本發明所謂的「抗體」中。即,於本發明中稱免疫球蛋白輕鏈時,係包含源自免疫球蛋白輕鏈,且具有其可變區全部或一部分之胺基酸序列者。又,稱免疫球蛋白重鏈時,係包含源自免疫球蛋白重鏈,且具有其可變區全部或一部分之胺基酸序列者。因此,只要具有可變區全部或一部分之胺基酸序列,則例如,Fc區域缺失者亦為免疫球蛋白重鏈。
又,此處Fc或Fc區域係指抗體分子中之包含由C
H2區域(重鏈之恆定區的部分2)、及C
H3區域(重鏈之恆定區的部分3)而成的片段的區域。
而且,於本發明中稱「抗體」時,亦包含:
(5)透過連接子序列使構成上述(4)所示之Fab、F(ab’)或F(ab’)
2的輕鏈與重鏈結合,而分別作成單股抗體的scFab、scF(ab’)、及scF(ab’)
2。此處,在scFab、scF(ab’)、及scF(ab’)
2,係可為使連接子序列結合於輕鏈的C末端側,而且進一步使重鏈結合於其C末端側而成者,又,亦可為使連接子序列結合於重鏈的C末端側,而且進一步使輕鏈結合於其C末端側而成者。再者,透過連接子序列使輕鏈之可變區與重鏈之可變區結合而作成單股抗體的scFv,亦包含於本發明中的抗體中。在scFv,係可為使連接子序列結合於輕鏈之可變區的C末端側,而且進一步使重鏈之可變區結合於其C末端側而成者,又,亦可為使連接子序列結合於重鏈之可變區的C末端側,而且進一步使輕鏈之可變區結合於其C末端側而成者。
再者,於本說明書中所稱「抗體」,係除了完全長度的抗體、上述(1)~(5)所示者之外,亦包含為完全長度的抗體之一部分有缺損者的抗原結合性片段(抗體片段)之任一者的形態,其即包含上述(4)及(5)之更廣的概念。
「抗原結合性片段」之用語,係指保持與抗原之特異的結合活性之至少一部分的抗體之片段。作為結合性片段之例,例如除了上述(4)及(5)所示者之外,還包含以適當連接子連結Fab、Fab’、F(ab’)
2、可變區(Fv)、重鏈之可變區(V
H)與輕鏈之可變區(V
L)而成的單股抗體(scFv)、為包含重鏈之可變區(V
H)與輕鏈之可變區(V
L)的多肽之二聚體的雙價抗體(diabodies)、為恆定區之一部分(C
H3)結合於scFv之重鏈(H鏈)者之二聚體的微型抗體(minibody)、其它低分子化抗體等。惟,只要具有與抗原的結合能力則並未限定於此等之分子。又,此等之結合性片段中,不僅包含將抗體蛋白質之全長分子以適當酵素處理而成者,亦包含使用經基因工程之改變的抗體基因而於適當宿主細胞中所產生的蛋白質。
於本發明中稱「單股抗體」時,係指連接子序列結合於包含免疫球蛋白輕鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列之C末端側,而包含免疫球蛋白重鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列再結合於其C末端側而成,且可與特定之抗原特異性結合的蛋白質。又,連接子序列結合於包含免疫球蛋白重鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列之C末端側,而包含免疫球蛋白輕鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列再結合於其C末端側而成,且可與特定之抗原特異性結合的蛋白質,亦為本發明中的「單股抗體」。例如,上述(2)及(3)所示者包含於單股抗體中。在免疫球蛋白輕鏈透過連接子序列而結合於免疫球蛋白重鏈的C末端側而成的單股抗體,通常免疫球蛋白重鏈係Fc區域缺失。免疫球蛋白輕鏈之可變區具有3個與抗體之抗原特異性有關的互補性決定區域(CDR)。同樣地,免疫球蛋白重鏈之可變區亦具有3個CDR。此等之CDR為決定抗體之抗原特異性的主要區域。因此,單股抗體中,較佳為包含免疫球蛋白重鏈之3個CDR全部及免疫球蛋白輕鏈之3個CDR全部。惟,只要可維持抗體之抗原特異的親和性,則亦可作成使CDR之1個或複數個缺失而成的單股抗體。
於單股抗體中,被配置於免疫球蛋白之輕鏈與重鏈之間的連接子序列,較佳為由2~50個、更佳為由8~50個、進一步較佳為由10~30個、進一步更佳為由12~18個或15~25個、例如由15個或25個之胺基酸殘基所構成的肽鏈。該種連接子序列,只要是兩鏈藉其而連結而成的抗hTfR抗體保持對hTfR的親和性,則對其胺基酸序列並沒有限定,但較佳為僅由甘胺酸或由甘胺酸和絲胺酸所構成者,例如具有胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號1)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號2)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號3)、或此等之胺基酸序列經2~10次或2~5次重複而成的序列者。例如,於透過連接子序列而使免疫球蛋白輕鏈之可變區結合於由包含免疫球蛋白重鏈之可變區的全部區域而成的胺基酸序列之C末端側,而作成ScFV的情形,可適合地使用相當於3個胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號1)連續而成者之由共計15個胺基酸而成的連接子序列(序列識別號4)。
於本發明中,作為抗體會特異性地辨識的抗原,係例如存在於血管內皮細胞之表面的分子(表面抗原)。作為該表面抗原,可列舉運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F等之有機陰離子運輸蛋白、MCT-8等之單羧酸轉運蛋白、Fc受體,但未限定於此等。抗原較佳為存在於人類血管內皮細胞之表面的此等分子(表面抗原)。
上述之表面抗原中,運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F等之有機陰離子運輸蛋白、MCT-8等之單羧酸轉運蛋白又為存在於形成血腦障壁(Blood Brain Barrier)的腦毛細血管內皮細胞(腦血管內皮細胞)之表面者。可辨識此等抗原的抗體可透過抗原而與腦毛細血管內皮細胞結合。而且與腦毛細血管內皮細胞結合的抗體,可通過血腦障壁而到達中樞神經系統。據此,可使目標蛋白質藉由與此種抗體結合而到達至中樞神經系統。作為目標之蛋白質,可列舉具有在中樞神經系統應發揮藥效的機能的蛋白質。作為目標蛋白質,可列舉例如,於伴隨中樞神經系統障礙的溶酶體病患者所缺損或機能不全的溶酶體酶。該溶酶體酶無法直接到達中樞神經系統,並不會對患者的中樞神經系統障礙顯示藥效,但由於藉由與此等抗體結合而可通過血腦障壁,因此可改善於溶酶體病患者中可見的中樞神經系統障礙。
於本發明中,「人類運鐵蛋白受體」或「hTfR」之用語,係指具有於序列識別號5所示的胺基酸序列的膜蛋白質。本發明之抗hTfR抗體,於其一實施態樣中,為對序列識別號5所示的胺基酸序列中由N末端側第89號的半胱胺酸殘基至C末端的苯丙胺酸為止的部分(hTfR之細胞外區域)特異性結合者,但並未限定於此。
以抗hTfR抗體為例,於以下說明抗體之製作方法。就抗hTfR抗體之製作方法而言,一般為使用經導入已併入hTfR基因之表現載體的細胞,製作重組人類運鐵蛋白受體(rhTfR),使用此rhTfR而使用小鼠等之動物進行免疫而獲得的方法。可藉由從免疫後的動物取出抗hTfR抗體產生細胞,使其與骨髓瘤細胞融合,而製作具有抗hTfR抗體產生能力的融合瘤細胞。
又,藉由將由小鼠等之動物獲得的免疫系統細胞利用體外免疫法以rhTfR進行免疫,亦可取得產生抗hTfR抗體的細胞。利用體外免疫法進行免疫的情形,該免疫系統細胞所源自的動物種類並未特別限定,但較佳為小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠、狗、貓、馬及包含人類的霊長類,更佳為小鼠、大鼠及人類,進一步較佳為小鼠及人類。作為小鼠之免疫系統細胞,可使用例如,由小鼠的脾臓調製的脾細胞。作為人類之免疫系統細胞,可使用由人類的末梢血液、骨髓、脾臓等調製的細胞。將人類的免疫系統細胞利用體外免疫法行免疫的情形,可獲得抗hTfR的人類抗體。
於本發明中,應與抗體結合的人類溶酶體酶並未特別限定,可列舉α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、葡萄糖腦苷酶、β-半乳糖苷酶、GM2活性化蛋白質、β-己醣胺酶A、β-己醣胺酶B、N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶、α-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、半乳糖基神經醯胺酶(galactosylceramidase)、蛋白皂角C(saposin C)、芳基硫酸酯酶A、α-L-岩藻糖苷酶、天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶酶(aspartylglucosaminidase)、α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶(α-N-acetyl-galactosaminidase)、酸性神經髓磷脂酶、α-半乳糖苷酶A、β-葡萄糖醛酸苷酶、肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶(α-N-acetyl-glucosaminidase)、乙醯基CoAα-胺基葡萄糖苷N-乙醯基轉移酶、N-乙醯基葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶、酸性神經醯胺酶、澱粉1,6-葡萄糖苷酶、唾液酸酶(sialidase)、天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶、軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1(PPT-1)、三肽基肽酶-1(TPP-1)、玻醣醛酸酶-1、CLN1、CLN2、CLN3、CLN6、及CLN8等之溶酶體酶。
抗體為會特異性地辨識存在於血管內皮細胞之表面的分子(表面抗原)者之情形,與抗體結合的人類溶酶體酶,係分別為α-L-艾杜糖醛酸酶可作為賀勒氏症候群、賀勒氏・沙伊氏症候群(Hurler-Scheie syndrome)、及沙伊氏症候群中的中樞神經系統障礙治療劑,艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶可作為韓特氏症候群中的中樞神經系統障礙治療劑,葡萄糖腦苷酶可作為高歇氏病(Gaucher disease)中的中樞神經系統障礙治療劑,β半乳糖苷酶可作為GM1-神經節苷脂症1~3型的中樞神經系統障礙治療劑,GM2活性化蛋白質可作為GM2-神經節苷脂症AB異型的中樞神經系統障礙治療劑,β-己醣胺酶A可作為山多夫氏病(Sandhoff disease)及戴氏-薩克斯氏病(Tay-Sachs disease)中的中樞神經系統障礙治療劑,β-己醣胺酶B可作為山多夫氏病中的中樞神經系統障礙治療劑,N-乙醯基葡萄糖胺-1-磷酸轉移酶可作為I-細胞病的中樞神經系統障礙治療劑,α-甘露糖苷酶可作為α-甘露醣儲積症的中樞神經系統障礙治療劑,β-甘露糖苷酶可作為β-甘露醣儲積症的中樞神經系統障礙治療劑,半乳糖基神經醯胺酶可作為克拉培氏病(Krabbe disease)的中樞神經系統障礙治療劑,蛋白皂角C可作為高歇氏病樣蓄積症的中樞神經系統障礙治療劑,芳基硫酸酯酶A可作為異染性白質變性症(異染性白質營養不良)的中樞神經系統障礙治療劑,α-L-岩藻糖苷酶可作為岩藻糖沉積症的中樞神經系統障礙治療劑,天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶可作為天冬胺醯基葡萄糖胺尿症的中樞神經系統障礙治療劑,α-N-乙醯基胺基半乳糖苷酶可作為舒特拉病(Schindler disease)及川崎病的中樞神經系統障礙治療劑,酸性神經髓磷脂酶可作為尼曼-匹克二氏病(Niemann‐Pick disease)的中樞神經系統障礙治療劑,α-半乳糖苷酶A可作為法布瑞氏症(Fabry disease)的中樞神經系統障礙治療劑,β-葡萄糖醛酸苷酶可作為史萊氏症候群(Sly syndrome)的中樞神經系統障礙治療劑,肝素N-硫酸酯酶、α-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶、乙醯基CoAα-胺基葡萄糖苷N-乙醯基轉移酶及N-乙醯基葡萄糖胺-6-硫酸硫酸酯酶可作為聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo syndrome)的中樞神經系統障礙治療劑,酸性神經醯胺酶可作為法伯病(Farber disease)的中樞神經系統障礙治療劑,澱粉1,6-葡萄糖苷酶可作為克芮氏症(Cori's disease)(富比士氏・克芮氏症(Forbes・Cori's disease))的中樞神經系統障礙治療劑,唾液酸酶可作為唾液酸酶欠損症的中樞神經系統障礙治療劑,天冬胺醯基胺基葡萄糖苷酶可作為天冬胺醯基葡萄糖胺尿症的中樞神經系統障礙治療劑,軟脂醯基蛋白質硫酯酶-1(PPT-1)可作為神經類蠟質脂褐質症或桑-哈二氏病(Santavuori-Haltia disease)的中樞神經系統障礙治療劑,三肽基肽酶-1(TPP-1)可作為神經類蠟質脂褐質症或詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)的中樞神經系統障礙治療劑,玻醣醛酸酶-1可作為玻醣醛酸酶欠損症的中樞神經系統障礙治療劑,CLN1、CLN2、CLN3、CLN6、及CLN8可作為巴登氏病(Batten disease)的中樞神經系統障礙治療劑來使用。
於抗體為會特異性地辨識存在於血管內皮細胞之表面的分子(表面抗原)者之情形,作為應與抗體結合的溶酶體酶,就適合者而言,可列舉人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)。hIDUA為一種溶酶體酶,其具有將存在於如肝素硫酸或硫酸皮膚素之醣胺聚醣(GAG)分子內的艾杜糖醛酸鍵水解的活性。黏多糖症I型為因編碼此酵素的基因之變異所致的基因疾病。黏多糖症I型被分類為賀勒氏症候群、賀勒氏・沙伊氏症候群、及沙伊氏症候群,賀勒氏症候群為重症型,賀勒氏・沙伊氏症候群為中間型,沙伊氏症候群為輕症型。此等之患者中,肝素硫酸、硫酸皮膚素蓄積於組織內的結果,會顯示角膜混濁、智能遲緩等諸症狀。惟,輕症型的情形,亦有時不會觀察到智能遲緩。該抗體與hIDUA之融合蛋白質由於可藉由通過BBB而分解蓄積於腦組織內的GAG,因此可藉由對表現智能遲緩的賀勒氏症候群之患者進行投予,而作為中樞神經系統障礙治療劑使用。
於本發明中,「人類α-L-艾杜糖醛酸酶」或「hIDUA」之用語,特別是指具有與野生型之hIDUA相同的胺基酸序列之hIDUA。野生型之hIDUA具有由序列識別號6所示的628個胺基酸所構成的胺基酸序列。具有由序列識別號7所示的626個胺基酸所構成的胺基酸序列的hIDUA之變異體亦為hIDUA。惟,並未限於此等,只要具有IDUA活性,則於野生型之hIDUA的胺基酸序列施加取代、缺失、加成等之變異而成者,亦包含於hIDUA中。使hIDUA之胺基酸序列的胺基酸取代為其它胺基酸的情形,所取代的胺基酸個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1~2個。使hIDUA之胺基酸序列中的胺基酸缺失的情形,所缺失的胺基酸個數較佳為1~10個,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1~2個。又,亦可施加組合此等胺基酸的取代和缺失之變異。於hIDUA中加成胺基酸的情形,於hIDUA之胺基酸序列中或N末端側或C末端側,較佳為加成1~10個胺基酸,更佳為1~5個,進一步較佳為1~3個,進一步更佳為1~2個。亦可施加組合此等胺基酸的加成、取代及缺失之變異。經施加變異的hIDUA之胺基酸序列,係與原本的hIDUA之胺基酸序列較佳為具有80%以上的同一性,更佳為顯示85%以上的同一性,進一步較佳為顯示90%以上的同一性,進一步更佳為顯示95%以上的同一性,進一步更佳為顯示99%以上的同一性。
又於本發明中,原本的蛋白質(包含抗體)之胺基酸序列與經施加變異的蛋白質之胺基酸序列的同一性,可使用周知之相同性計算演算法而容易地算出。例如,作為該種演算法,有BLAST(Altschul SF. J Mol. Biol. 215. 403-10, (1990)), Pearson及Lipman之類似性檢索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85. 2444 (1988)), Smith及Waterman之局部相同性演算法(Adv. Appl. Math. 2. 482-9(1981))等。
又,原本的蛋白質(包含抗體)之胺基酸序列中的胺基酸取代為其它胺基酸,係例如,於胺基酸之彼等之側鏈及化學性質上有關連性的胺基酸家族內發生者。作為該胺基酸家族,有以下:
(1)為酸性胺基酸的天冬胺酸及麩胺酸,
(2)為鹼基性胺基酸的組胺酸、離胺酸、及精胺酸
(3)為芳香族胺基酸的苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸,
(4)為羥基胺基酸的絲胺酸及蘇胺酸,
(5)為疏水性胺基酸的甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸,
(6)為中性之親水性胺基酸的半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、天冬醯胺酸、及麩醯胺酸,
(7)為影響肽鏈配向之胺基酸的甘胺酸及脯胺酸,
(8)為醯胺型胺基酸的天冬醯胺酸及麩醯胺酸,
(9)為脂肪族胺基酸的丙胺酸、白胺酸、異白胺酸、及纈胺酸,
(10)為側鏈小的胺基酸的丙胺酸、甘胺酸、絲胺酸、及蘇胺酸,
(11)為側鏈特小的胺基酸的丙胺酸及甘胺酸,
(12)為具有分支鏈之胺基酸的纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸。
於本發明中,稱hIDUA具有IDUA活性時,係指於使hIDUA與抗體融合而作成融合蛋白質時,相對於天然型之hIDUA原本具有的活性,而具有3%以上的活性。惟,該活性係相對於天然型之hIDUA原本具有的活性,而較佳為10%以上,更佳為20%以上,較一步較佳為50%以上,進一步更佳為80%以上。與抗體融合的hIDUA為經施加變異者之情形亦相同。抗體係例如為抗hTfR抗體。
於本發明中稱「融合蛋白質」時,係指使抗體與人類溶酶體酶透過非肽連接子或肽連接子或直接地結合而成的物質。使抗體與人類溶酶體酶結合的方法,係於以下詳述。
作為使抗體與人類溶酶體酶結合的方法,有透過非肽連接子或肽連接子結合的方法。作為非肽連接子,可使用聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇與丙二醇的共聚合物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、多糖類、聚葡糖、聚乙烯醚、生物分解性高分子、脂質聚合物、幾丁質類、及玻尿酸、或此等之衍生物、或者是組合此等者。肽連接子為由經肽鍵結之1~50個胺基酸所構成的肽鏈或其衍生物,係會藉由其N末端和C末端各自與抗體或人類溶酶體酶之任一者形成共價鍵,而使抗體與人類溶酶體酶結合者。
使用生物素-鏈親和素(biotin-streptavidin)作為非肽連接子之情形,可為生物素與抗體結合,鏈親和素與人類溶酶體酶結合,而透過此生物素和鏈親和素的結合,使抗體與人類溶酶體酶結合;相反地,亦可為鏈親和素與抗體結合,生物素與人類溶酶體酶結合,而透過此生物素和鏈親和素的結合使抗體與人類溶酶體酶結合。
使用PEG作為非肽連接子而使本發明之抗體與人類溶酶體酶結合而成者,特別稱為抗體-PEG-人類溶酶體酶。抗體-PEG-人類溶酶體酶係可藉由使抗體與PEG結合而製作抗體-PEG,且接著使抗體-PEG與人類溶酶體酶結合而製造。或,抗體-PEG-人類溶酶體酶亦可藉由使人類溶酶體酶與PEG結合而製作人類溶酶體酶-PEG,且接著使人類溶酶體酶-PEG與抗體結合而製造。於使PEG與抗體及人類溶酶體酶結合之際,係使用經碳酸酯、羰基咪唑、羧酸之活性酯、吖內酯(azlactone)、環狀醯亞胺硫酮(cyclic imidothione)、異氰酸酯、異硫氰酸酯、亞胺酯(imidate)、或醛等官能基修飾的PEG。藉由此等被導入PEG的官能基主要與抗體及人類溶酶體酶分子內的胺基反應,而PEG與抗體及人類溶酶體酶進行共價鍵結。此時所使用的PEG之分子量及形狀並未特別限定,其平均分子量(MW)較佳為MW=300~60000,更佳為MW=500~20000。例如,平均分子量為約300、約500、約1000、約2000、約4000、約10000、約20000等的PEG,可適合地使用作為非肽連接子。
例如,抗體-PEG係可藉由將抗體與具有醛基作為官能基的聚乙二醇(ALD-PEG-ALD)以ALD-PEG-ALD對該抗體之莫耳比成為11、12.5、15、110、120等的方式混合,且於其中添加NaCNBH
3等之還原劑而使反應進行而獲得。接著,藉由在NaCNBH
3等之還原劑存在下,使抗體-PEG與人類溶酶體酶反應,而可獲得抗體-PEG-人類溶酶體酶。相反地,亦可藉由先使人類溶酶體酶與ALD-PEG-ALD結合而製作人類溶酶體酶-PEG,且接著使人類溶酶體酶-PEG與抗體結合,而獲得抗體-PEG-人類溶酶體酶。
抗體與人類溶酶體酶亦可在抗體之重鏈或輕鏈的C末端側或N末端側,透過連接子序列或直接地,各自藉由肽鍵而使人類溶酶體酶之N末端或C末端結合。如此地使抗體與人類溶酶體酶結合而成的融合蛋白質,係可藉由下列方式獲得:將於編碼抗體之重鏈或輕鏈的cDNA之3’末端側或5’末端側有編碼人類溶酶體酶的cDNA直接或夾著編碼連接子序列的DNA片段而被配置於讀碼框內(in-frame)的DNA片段,併入哺乳動物細胞、酵母等之真核生物用的表現載體中,且培養已導入此表現載體的哺乳動物細胞。此哺乳動物細胞中,於使編碼人類溶酶體酶的DNA片段與重鏈結合的情形,已併入編碼抗體之輕鏈的cDNA片段之哺乳動物細胞用的表現載體亦被導入相同宿主細胞,又,於使編碼人類溶酶體酶的DNA片段與輕鏈結合的情形,已併入編碼抗體之重鏈的cDNA片段之哺乳動物細胞用的表現載體亦被導入相同宿主細胞。抗體為單股抗體的情形,使抗體與人類溶酶體酶結合而成的融合蛋白質係可藉由下列方式獲得:將於編碼人類溶酶體酶的cDNA之5’末端側或3’末端側直接或夾著編碼連接子序列的DNA片段而連結有編碼單股抗體之cDNA的DNA片段,併入哺乳動物細胞、酵母等之真核生物用的表現載體,且使其在已導入此表現載體之此等之細胞中表現。
使人類溶酶體酶結合於抗體之輕鏈的C末端側而成之類型的融合蛋白質,係抗體為包含含有輕鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列者,人類溶酶體酶為結合於此抗體之輕鏈的C末端側者。此處抗體之輕鏈與人類溶酶體酶可直接結合,亦可透過連接子而結合。
使人類溶酶體酶結合於抗體之重鏈的C末端側而成之類型的融合蛋白質,係抗體為包含含有輕鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列者,人類溶酶體酶為結合於此抗體之重鏈的C末端側者。此處抗體之重鏈與人類溶酶體酶可直接結合,亦可透過連接子而結合。
使人類溶酶體酶結合於抗體之輕鏈的N末端側而成之類型的融合蛋白質,係抗體為包含含有輕鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列,人類溶酶體酶為結合於此抗體之輕鏈的N末端側結合者。此處抗體之輕鏈與人類溶酶體酶可直接結合,亦可透過連接子而結合。
使人類溶酶體酶結合於抗體之重鏈的N末端側而成之類型的融合蛋白質,係抗體為包含含有輕鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列、及含有重鏈之可變區全部或一部分的胺基酸序列,人類溶酶體酶為結合於此抗體之重鏈的N末端側者。此處抗體之重鏈與人類溶酶體酶可直接結合,亦可透過連接子而結合。
此時於抗體與人類溶酶體酶之間配置連接子序列的情形,該序列較佳為由1~50個、更佳為由1~17個、進一步較佳為由1~10個、進一步更佳為由1~5個胺基酸所構成者,但依據應與抗體結合的人類溶酶體酶,而構成連接子序列的胺基酸個數可適當調整為1個、2個、3個、1~17個、1~10個、10~40個、20~34個、23~31個、25~29個等。此種連接子序列只要藉此而連結的抗體保持與hTfR的親和性,且藉由該連接子序列而連結的人類溶酶體酶於生理的條件下可發揮該蛋白質的生理活性,則並未限定於此胺基酸序列,較佳為由甘胺酸和絲胺酸所構成者,例如具有由甘胺酸或絲胺酸之任一個胺基酸而成者、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號1)、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號2)、胺基酸序列Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(序列識別號3)、或此等之胺基酸序列1~10個、或2~5個連續而成之由1~50個胺基酸而成的序列、由2~17個、2~10個、10~40個、20~34個、23~31個、25~29個胺基酸而成的序列等。例如,具有由胺基酸序列Gly-Ser而成者、胺基酸序列Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(序列識別號1)3個連續而成之由15個胺基酸而成的序列(序列識別號4)者,可適合地使用作為連接子序列。即使抗體為單股抗體亦相同。
又,於本發明中,1個肽鏈中包含複數個連接子序列的情形,為了方便,各連接子序列係從N末端側依序命名為第1連接子序列,第2連接子序列。
就抗體為抗人類運鐵蛋白受體抗體的情形之抗體的較佳一實施形態而言,可例示一種抗體,其係
於輕鏈之可變區中:
(a)CDR1包含序列識別號8或9所示的胺基酸序列而成,
(b)CDR2包含序列識別號10或11所示的胺基酸序列而成,且
(c)CDR3包含序列識別號12所示的胺基酸序列而成者;
於重鏈之可變區中:
(d)CDR1包含序列識別號13或14所示的胺基酸序列而成,
(e)CDR2包含序列識別號15或16所示的胺基酸序列而成,且
(f)CDR3包含序列識別號17或18所示的胺基酸序列而成者。此處抗體較佳為人類抗體或人類化抗體。
上述之(a)~(f)所示的各CDR之胺基酸序列的組合,可為任一組合,可列舉例如表1所示者。
[表1]
(表1) 輕鏈及重鏈之CDR的胺基酸序列的組合之例1 | ||||||
輕鏈 | 重鏈 | |||||
CDR1 | CDR2 | CDR3 | CDR1 | CDR2 | CDR3 | |
序列識別號 | 8 | 10 | 12 | 13 | 15 | 17 |
8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | |
9 | 11 | 12 | 13 | 15 | 17 | |
9 | 11 | 12 | 14 | 16 | 18 |
就抗體為抗人類運鐵蛋白受體抗體的情形之抗體的更佳一實施形態而言,可例示一種抗體,其係
(x)輕鏈之可變區為具有序列識別號20所示的胺基酸序列者,重鏈之可變區為包含序列識別號21所示的胺基酸序列而成者。此處抗體較佳為人類抗體或人類化抗體。
此處,序列識別號20所示的輕鏈之可變區的胺基酸序列,係包含序列識別號8及序列識別號9所示的胺基酸序列作為CDR1,包含序列識別號10及序列識別號11所示的胺基酸序列作為CDR2,包含序列識別號12所示的胺基酸序列作為CDR3。又,序列識別號21所示的重鏈之可變區的胺基酸序列,係包含序列識別號13及序列識別號14所示的胺基酸序列作為CDR1,包含序列識別號15及序列識別號16所示的胺基酸序列作為CDR2,包含序列識別號17及序列識別號18所示的胺基酸序列作為CDR3。進一步,包含序列識別號19所示的胺基酸序列作為重鏈框架區域3。
惟,抗體為人類化抗體且為抗人類運鐵蛋白受體抗體的情形之抗體的較佳實施形態,並未限於上述之(x)。例如,下述抗體亦只要對於hTfR具有親和性,則可於本發明中使用,其係輕鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列具有80%以上的同一性者,且重鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列具有80%以上的同一性者。
再者,下述抗體亦只要對於hTfR具有親和性,則可於本發明中使用,其係:
輕鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列具有85%以上的同一性者,且重鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列具有85%以上的同一性者;
輕鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列具有90%以上的同一性者,且重鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列具有90%以上的同一性者;及
輕鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列具有95%以上的同一性者,且重鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列具有95%以上的同一性者。
就輕鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列具有同一性者,且重鏈之可變區的胺基酸序列為與上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列具有同一性者之抗體而言,可列舉:
(x-a)輕鏈之可變區包含與序列識別號20所示的胺基酸序列具有80%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈之可變區包含與序列識別號21所示的胺基酸序列具有80%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(x-b)輕鏈之可變區包含與序列識別號20所示的胺基酸序列具有85%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列;重鏈之可變區包含與序列識別號21所示的胺基酸序列具有85%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(x-c)輕鏈之可變區包含與序列識別號20所示的胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈之可變區包含與序列識別號21所示的胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(x-d)輕鏈之可變區包含與序列識別號20所示的胺基酸序列具有95%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈之可變區包含與序列識別號21所示的胺基酸序列具有95%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者。
再者,作為抗體為抗人類運鐵蛋白受體抗體的情形之抗體的較佳實施形態,下述抗體亦只要對於hTfR具有親和性,則可於本發明中使用,其係:
於上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,
於上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,及
於上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者。此處抗體較佳為人類抗體或人類化抗體。
作為抗體之輕鏈之可變區的胺基酸序列為於上述之(x)中的輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中的胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(x)中的重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中的胺基酸經取代、缺失或加成者之抗體,可列舉:
(x-e)
為於輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成,且為於重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(x-f)
為於輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成,且為於重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(x-g)
為於輕鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成,且為於重鏈之可變區的胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者。
於上述之(x-a)~(x-g)中,各CDR之胺基酸序列的組合,可為任一組合,可列舉例如表2所示者。於下述之(y-a)~(y-g)亦相同。
[表2]
(表2) 輕鏈及重鏈之CDR的胺基酸序列的組合之例2 | ||||||
輕鏈 | 重鏈 | |||||
CDR1 | CDR2 | CDR3 | CDR1 | CDR2 | CDR3 | |
序列識別號 | 8 | 10 | 12 | 13 | 15 | 17 |
8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | |
9 | 11 | 12 | 13 | 15 | 17 | |
9 | 11 | 12 | 14 | 16 | 18 |
作為於本發明中,抗體為人類化抗體且為抗人類運鐵蛋白受體抗體的Fab的情形之較佳一實施形態,可例示一種為Fab的抗體,其係
(y)輕鏈為包含序列識別號22所示的胺基酸序列者,重鏈為包含序列識別號23所示的胺基酸序列而成者。此處,輕鏈包含作為可變區之序列識別號20所示的胺基酸序列,重鏈包含作為可變區之序列識別號21所示的胺基酸序列。於本發明中,將構成Fab的重鏈稱為Fab重鏈。即,由序列識別號23所示的胺基酸序列而成的重鏈為Fab重鏈。
抗體為人類化抗體且為抗人類運鐵蛋白受體抗體的情形之抗體的較佳實施形態,並未限於上述之(y)。例如,下述抗體亦只要對於hTfR具有親和性,則可於本發明中使用,其係輕鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列具有80%以上的同一性者,且重鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列具有80%以上的同一性者。
再者,下述抗體亦只要對於hTfR具有親和性,則可於本發明中使用,其係:
輕鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列具有85%以上的同一性者,且重鏈之胺基酸序列與上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列具有85%以上的同一性者,
輕鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列具有90%以上的同一性者,且重鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列具有90%以上的同一性者,及
輕鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列具有95%以上的同一性者,且重鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列具有95%以上的同一性者。
作為輕鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列具有同一性者,且重鏈之胺基酸序列為與上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列具有同一性者之抗體,可列舉:
(y-a)輕鏈包含與序列識別號22所示的胺基酸序列具有80%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈包含與序列識別號23所示的胺基酸序列具有80%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(y-b)輕鏈包含與序列識別號22所示的胺基酸序列具有85%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈包含與序列識別號23所示的胺基酸序列具有85%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(y-c)輕鏈包含與序列識別號22所示的胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈包含與序列識別號23所示的胺基酸序列具有90%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(y-d)輕鏈包含與序列識別號22所示的胺基酸序列具有95%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成;重鏈包含與序列識別號23所示的胺基酸序列具有95%以上的序列同一性的胺基酸序列,且分別包含作為序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成。
再者,作為於抗體為人類化抗體且為抗人類運鐵蛋白受體抗體的Fab的情形之抗體的較佳實施形態,抗體之胺基酸序列為下述者,亦只要對於hTfR具有親和性,則可於本發明中使用,其係:
於上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,
於上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,及,
於上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者。
作為輕鏈之胺基酸序列為於上述之(y)中的輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中的胺基酸經取代、缺失或加成者,且於上述之(y)中的重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中的胺基酸經取代、缺失或加成者之抗體,可列舉:
(y-e)
為於輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成,且為於重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~5個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(y-f)
為於輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成,且為於重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1~3個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者,
(y-g)
為於輕鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號8或9之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號10或11之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號12之胺基酸序列而成,且為於重鏈之胺基酸序列中,構成其之胺基酸序列中1或2個胺基酸經取代、缺失或加成者,且分別包含作為CDR1之序列識別號13或14之胺基酸序列、作為CDR2之序列識別號15或16之胺基酸序列、及作為CDR3之序列識別號17或18之胺基酸序列而成者。
作為抗體為人類化抗人類運鐵蛋白受體抗體,且人類溶酶體酶為人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)的情形之融合蛋白質的較佳形態,可列舉以下者。即,
一種融合蛋白質,其係由具有序列識別號22所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之輕鏈、及序列識別號6所示的人類α-L-艾杜糖醛酸酶透過序列識別號4所示的連接子序列而結合於具有序列識別號23所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈的C末端側者而成。
又,作為抗體為人類化抗人類運鐵蛋白受體抗體,且人類溶酶體酶為人類α-L-艾杜糖醛酸酶(hIDUA)的情形之融合蛋白質的較佳形態,可列舉以下者。即,
一種融合蛋白質,其中該人類化抗hTfR抗體之輕鏈為具有序列識別號22所示的胺基酸序列者,
該人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈在其C末端側,透過具有序列識別號4所示的胺基酸序列的連接子,而與序列識別號6所示的人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合,且作為全體而具有序列識別號27所示的胺基酸序列。
於本發明中,抗體與人類溶酶體酶之融合蛋白質,係例如可藉由培養以利用編碼該融合蛋白質的基因會表現或強表現而產生該融合蛋白質之方式施加了人為操作之哺乳動物細胞而產生。此時於產生融合蛋白質的哺乳動物細胞內會強表現的該基因,通常藉由以來進行轉形而導入至該哺乳動物細胞。又,對於此時所使用的哺乳動物細胞並未特別限定,但較佳為源自人類、小鼠、中國倉鼠的細胞,特別是源自中國倉鼠卵巢細胞的CHO細胞為較佳。於本發明中稱融合蛋白質時,係特別指於培養此種產生融合蛋白質的哺乳動物細胞時,被分泌於培養基中的重組融合蛋白質。
抗體與人類溶酶體酶之融合蛋白質,亦可藉由分別使抗體與人類溶酶體酶產生後,以非肽連接子或肽連接子使此等結合而製造。此時,抗體與人類溶酶體酶,可藉由培養以利用編碼此等的基因會表現或強表現而產生此等之方式施加了人為操作之哺乳動物細胞,而使其作為重組蛋白質產生。
用以將編碼融合蛋白質、抗體或人類溶酶體酶的基因併入且使表現用的表現載體,若為於導入至哺乳動物細胞內時使該基因表現者,則可無特別限定地使用。被併入表現載體的該基因,被配置於可在哺乳動物細胞內調節基因轉錄的頻率之DNA序列(基因表現控制部位)的下游。就本發明中可使用的基因表現控制部位而言,可舉出例如源自細胞巨大病毒(cytomegalovirus)的啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α(EF-1α)啟動子、人類泛蛋白C啟動子等。
經導入此種表現載體的哺乳動物細胞,係會表現已併入表現載體的期望蛋白質,但其表現量會依各個細胞而異,並不相同。因此,為了效率良好地生產重組蛋白質,則必須有從經導入表現載體的哺乳動物細胞中選擇期望蛋白質之表現水平高的細胞之步驟。為了進行此選擇步驟,在表現載體中係併入作為選擇標記而作用之基因。
作為選擇標記之最一般性者為分解嘌黴素(puromycin)、新黴素(neomycin)等藥劑的酵素(藥劑耐性標記)。哺乳動物細胞於一定濃度以上的上述藥劑的存在下會死亡。然而,經導入表現載體的哺乳動物細胞,由於可藉由被併入表現載體中的耐藥性標記而分解上述藥劑,且將其無毒化或弱毒化,所以即使於上述藥劑存在下亦可生存。若將已併入耐藥性標記作為選擇標記的表現載體導入至哺乳動物細胞,於含有對應該耐藥性標記之藥劑的選擇培養基中,一邊使該藥劑濃度緩緩上升一邊持續培養,則可獲得即使於較高濃度的藥劑存在下亦可增殖的細胞。由於在以如此方式所選擇的細胞中,與耐藥性標記一起,而通常已併入表現載體之編碼期望蛋白質之基因的表現量也會增加,所以其結果會選出期望蛋白質之表現水平高的細胞。
又,亦可使用麩醯胺酸合成酵素(GS)作為選擇標記。麩醯胺酸合成酵素為從麩胺酸和氨合成麩醯胺酸的酵素。若將哺乳動物細胞,於含有麩醯胺酸合成酵素抑制劑、例如甲硫胺酸磺醯亞胺(MSX),且不含有麩醯胺酸的選擇培養基中培養,則細胞會死亡。然而,若將已併入麩醯胺酸合成酵素作為選擇標記的表現載體導入至哺乳動物細胞中,則在該細胞中,由於成為麩醯胺酸合成酵素的表現水平會上升,所以即使於較高濃度的MSX存在下亦可增殖。此時,若一邊使MSX的濃度緩緩上升一邊持續培養,則可獲得即使於較高濃度的MSX存在下亦可增殖的細胞。在以這種方式選擇的細胞中,由於與麩醯胺酸合成酵素一起,而通常已併入表現載體之編碼期望蛋白質之基因的表現量也會增加,所以其結果會選出期望蛋白質之表現水平高的細胞。
又,亦可使用二氫葉酸還原酶(DHFR)作為選擇標記。使用DHFR作為選擇標記的情形,經導入表現載體的哺乳動物細胞係於含有胺甲喋呤(methotrexate)、胺蝶呤(aminopterin)等DHFR抑制劑的選擇培養基中培養。若一邊使DHFR抑制劑的濃度緩緩上升一邊持續培養,則可獲得即使於較高濃度的DHFR抑制劑存在下亦可增殖的細胞。在以這種方式選擇的細胞中,由於與DHFR一起,而通常已併入表現載體之編碼期望蛋白質之基因的表現量也會增加,所以其結果會選出期望蛋白質之表現水平高的細胞。
已知一種表現載體,其係在編碼期望蛋白質的基因的下游側透過內部核糖體結合部位(IRES: internal ribosome entry site)而配置作為選擇標記的麩醯胺酸合成酵素(GS)而成(國際專利公報WO2012/063799,WO2013/161958)。此等文獻所記載的表現載體可特別適合地使用在本發明之製造方法中。
例如,下述表現載體可適合地用於本發明之製造方法,其為用以使蛋白質表現的表現載體,包含基因表現控制部位、以及在其下游處之編碼該蛋白質的基因、在更下游處之內部核糖體結合部位、及在更下游處之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因,且進一步包含在該基因表現控制部位或與該基因表現控制部位不同的基因表現控制部位的下游處之二氫葉酸還原酶基因或耐藥劑基因。於此表現載體中,就基因表現控制部位或其它的基因表現控制部位而言,可適合地使用源自細胞巨大病毒的啟動子、SV40早期啟動子、人類延長因子-1α啟動子(hEF-1α啟動子)、人類泛蛋白C啟動子,但hEF-1α啟動子為特別適合。
又,就內部核糖體結合部位而言,可適合地使用源自選自包含小核糖核酸病毒科(picornavirus)之病毒、口蹄疫病毒、A型肝炎病毒、C型肝炎病毒、冠狀病毒、牛腸病毒(enterovirus)、泰勒氏鼠腦脊髓炎病毒(Theiler's mouse encephalomyelitis virus)、柯薩奇B型病毒(Coxsackievirus type B)、人類免疫球蛋白重鏈結合蛋白質基因、果蠅觸角足基因(Drosophila Antennapedia gene)、果蠅超級雙胸基因(Drosophila Ultrabithorax gene)之群組的病毒或基因的5’非轉譯區域者,但源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域之內部核糖體結合部位為特別適合。使用源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域之內部核糖體結合部位的情形,除野生型者以外,亦可適合地使用野生型之內部核糖體結合部位中所含的複數起始密碼子中的一部分被破壞者。又,於此表現載體中,可適合地使用的耐藥劑基因,較佳為嘌黴素或新黴素耐性基因,更佳為嘌黴素耐性基因。
又,例如,下述表現載體可適合地用於本發明之製造方法,其為用以使蛋白質表現的表現載體,為包含hEF-1α啟動子、在其下游處之編碼該蛋白質的基因、在更下游處之源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域之內部核糖體結合部位、及在更下游處之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因,且進一步包含其它基因表現控制部位及在其下游之二氫葉酸還原酶基因的表現載體,而該內部核糖體結合部位為野生型之內部核糖體結合部位中所含的複數起始密碼子中的一部分被破壞者。作為此種表現載體,可列舉記載於WO2013/161958的表現載體。
又,例如,下述表現載體可適合地用於本發明之製造方法,其為用以使蛋白質表現的表現載體,為包含hEF-1α啟動子、在其下游處之編碼該蛋白質的基因、在更下游處之源自小鼠腦心肌炎病毒的5’非轉譯區域之內部核糖體結合部位、及在更下游處之編碼麩醯胺酸合成酵素的基因,且進一步包含其它基因表現控制部位及在其下游之耐藥劑基因的表現載體,而該內部核糖體結合部位為野生型之內部核糖體結合部位中所含的複數起始密碼子中的一部分被破壞者。作為此種表現載體,可列舉記載於WO2012/063799的pE-mIRES-GS-puro及記載於WO2013/161958的pE-mIRES-GS-mNeo。
於本發明中,經導入已併入融合蛋白質、編碼抗體或人類溶酶體酶之基因之表現載體的哺乳動物細胞,係為了選擇融合蛋白質、抗體或人類溶酶體酶之表現水平高的細胞,而於選擇培養基中被選擇培養。
於選擇培養中,使用DHFR作為選擇標記的情形,使選擇培養基中所含的DHFR抑制劑的濃度階段性地上升。DHFR抑制劑為胺甲喋呤的情形,其最大濃度較佳為0.25~5μM,更佳為0.5~1.5μM,進一步較佳為約1.0μM。
使用GS作為選擇標記之情形,使選擇培養基所含之GS抑制劑的濃度階段性地上升。GS抑制劑為MSX的情形,其最大濃度較佳為100~1000μM,更佳為200~500μM,進一步較佳為約300μM。又,此時,一般使用不含有麩醯胺酸的培養基作為選擇培養基。
使用分解嘌黴素的酵素作為選擇標記之情形,選擇培養基所含之嘌黴素的最大濃度較佳為3~30μg/mL,更佳為5~20μg/mL,進一步較佳為約10μg/mL。
使用分解新黴素的酵素作為選擇標記之情形,選擇培養基所含之G418的最大濃度較佳為0.1mg~2mg/mL,更佳為0.5~1.5mg/mL,進一步較佳為約1mg/mL。
又,就用以培養哺乳動物細胞的培養基而言,選擇培養中使用的培養基、為了使後述的融合蛋白質、抗體或人類溶酶體酶產生而使用的培養基(重組蛋白質產生用培養基)都只要是可培養哺乳動物細胞而使其增殖者,則可無特別限定地使用,但較佳為使用無血清培養基。
藉由選擇培養而選出的融合蛋白質、抗體或人類溶酶體酶之表現水平高的細胞,係作為此等之產生細胞,而用於此等之生產。融合蛋白質、抗體或人類溶酶體酶的生產,係藉由在重組蛋白質產生用培養基中培養此等之產生細胞於而進行。將此培養稱為生產培養。
於本發明中,就作為重組蛋白質產生用培養基使用的無血清培養基而言,例如,可適合地使用含有3~700mg/L之胺基酸、0.001~50mg/L之維生素類、0.3~10g/L之單醣類、0.1~10000mg/L之無機鹽、0.001~0.1mg/L之微量元素、0.1~50mg/L之核苷、0.001~10mg/L之脂肪酸、0.01~1mg/L之生物素、0.1~20μg/L之氫化可體松(hydrocortisone)、0.1~20mg/L之胰島素、0.1~10mg/L之維生素B12、0.01~1mg/L之腐胺(putrescine)、10~500mg/L之丙酮酸鈉、及水溶性鐵化合物的培養基。亦可視期望,而在培養基中添加胸苷、次黃嘌呤、慣用的pH指示劑及抗生素。
又,就作為重組蛋白質產生用培養基所使用的無血清培養基而言,可使用DMEM/F12培養基(DMEM和F12的混合培養基)作為基本培養基,此等各培養基為所屬技術領域中具有通常知識者所周知。再者,又可使用DMEM(HG)HAM改良型(R5)培養基作為無血清培養基,其包含碳酸氫鈉、L-麩醯胺酸、D-葡萄糖、胰島素、亞硒酸鈉、二胺基丁烷、氫化可體松、硫酸鐵(II)、天冬醯胺酸、天冬胺酸、絲胺酸及聚乙烯醇。再者,亦可使用市售的無血清培養基,例如CD OptiCHO
TM培養基、CHO-S-SFM II培養基或CD CHO培養基(Thermo Fisher Scientific公司)、EX-CELL
TM302培養基或EX-CELL
TM325-PF培養基(SAFC Biosciences公司)等作為基本培養基。例如EX-CELL
TMAdvanced CHO Fed-batch培養基(SAFC Biosciences公司),可適合地使用於產生融合蛋白質的細胞的培養,其係包含16μmol/L胸苷、100μmol/L次黃嘌呤、及4mmol/L L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸的無血清培養基。又例如,CD OptiCHO
TM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)亦可適合地使用於產生融合蛋白質的細胞之培養,其係包含16μmol/L胸苷、100μmol/L次黃嘌呤、及10mg/L胰島素的無血清培養基。
融合蛋白質、抗體或人類溶酶體酶之產生細胞的生產培養,較佳為將此等產生細胞在重組蛋白質產生用培養基中的密度調整成0.2X10
5~5X10
5個/mL而開始,更佳為調整成1X10
5~4X10
5個/mL,進一步較佳為調整成約3X10
5個/mL。
生產培養係一邊經時地觀察細胞的生存率(%)而一邊進行,且以使生產培養期間中的細胞之生存率較佳為被維持在80%以上,更佳為被維持在85%以上的方式進行。
又,生產培養期間中,培養溫度較佳為被維持在33.5~37.5℃,生產培養基中的溶氧飽和度,較佳為被維持在28~32%,更佳為被維持在約30%。此處,溶氧飽和度係指將氧的飽和溶解量設為100%時之在相同條件下的氧的溶解量。
又,生產培養期間中,生產培養基以葉輪(impeller)攪拌。此時之葉輪的旋轉速度較佳為50~100旋轉/分鐘,更佳為調整為60~110旋轉/分鐘,例如90旋轉/分鐘、100旋轉/分鐘、110旋轉/分鐘等,但依葉輪的形狀等,其旋轉速度可適宜變更。
作為生產培養中之適合的培養條件之初期條件,可列舉例如,生產培養之開始時的產生細胞在重組蛋白質產生用培養基中的密度為3╳10
5個/mL,生產培養期間中的培養溫度為34~37℃,生產培養基中的溶氧飽和度為30%,且以約100旋轉/分鐘的速度旋轉的葉輪攪拌培養基。
可於生產培養結束後回收培養基,且將回收的培養基藉由離心分離或藉由膜過濾,來去除細胞等而獲得培養上清液。此培養上清液中所含的目標之融合蛋白質,係藉由使用各種層析法的步驟而純化。純化過程可於室溫或低溫環境下進行,但較佳為於低溫環境下進行,特別是於1~10℃之溫度下進行為較佳。
以下,針對培養上清液中所含的抗體和人類溶酶體酶的融合蛋白質之純化方法的一實施形態進行詳細說明。此實施形態,可特別適合地使用於特別是抗體為Fab的人類IgG抗體,且人類溶酶體酶為hIDUA的融合蛋白質時。適合作為例如下述融合蛋白質之純化方法,該融合蛋白質係人類化抗hTfR抗體之輕鏈具有序列識別號22所示的胺基酸序列,該人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈在其C末端側透過具有序列識別號4所示的胺基酸序列的連接子,而與序列識別號6所示的人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合,且作為全體而具有序列識別號27所示的胺基酸序列。
純化步驟之第一步驟為將已結合對抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法。此時所使用之對抗體具有親和性的物質並未特別限定,但較佳為對Fab具有親和性的物質,尤其是對Fab之重鏈的CH
1區域具有親和性的物質。對該區域的抗體,可作為對抗體具有親和性的物質使用。Fab為人類IgG抗體的情形,可適合地使用抗人類IgG-CH
1抗體。對抗體具有親和性的物質為抗體的情形,固定相為抗體與擔體(carrier)結合而成者。此處擔體並未特別限定,但例如為瓊脂糖。藉由負荷培養上清液,而使培養上清液中所含的融合蛋白質與管柱結合,且於清洗管柱之後,使融合蛋白質從管柱溶出。可如此進行而去除大部分的雜質。
培養上清液因容量大,而較佳為在被供給於純化步驟前進行濃縮,但濃縮操作並非必須。於純化步驟之第一步驟中,在培養上清液或其濃縮液中,係於將其負荷於管柱前,添加精胺酸。此時精胺酸係以溶液中之濃度較佳成為0.1M~1.0M,更佳成為0.25M~1.0M,進一步較佳成為0.3M~1.0M,進一步更佳成為0.3~0.5M,例如成為0.4M的方式添加。又,固定相係於負荷培養上清液之前,預先以包含精胺酸的緩衝液平衡化。此時使用的緩衝液之精胺酸濃度較佳為0.1M~1.0M,更佳為0.2M~0.8M,進一步較佳為0.2M~0.6M,進一步更佳為0.3~0.5M,例如0.4M。又,此時使用的緩衝液並未特別限定,但較佳為MES緩衝液,其pH較佳為6.0~7.0,更佳為約6.5。
清洗結合了融合蛋白質的固定相之後,以不含鹽的酸性緩衝液使融合蛋白質溶出,回收含有融合蛋白質的劃分。此時使用的緩衝液,較佳為甘胺酸緩衝液或乙酸緩衝液,其pH較佳為3.2~3.8,更佳為3.5。含有所回收之融合蛋白質的溶液的pH,被迅速調整成中性附近。
純化步驟之第二步驟為陰離子交換管柱層析法。此時使用的陰離子交換體並未特別限定,但較佳為強陰離子交換體,特別是具有基於靜電相互作用、疏水性相互作用及氫鍵形成之選擇性的陰離子交換體。多模式陰離子交換體可適合地使用於本發明中,例如,具有N-苄基-N-甲基乙醇胺基作為官能基的強陰離子交換體可特別適合地使用。Capto adhere(GE Healthcare公司)為具有N-苄基-N-甲基乙醇胺基的多模式強陰離子交換體之一者。
於被供給至陰離子交換管柱層析法之前,在以純化步驟之第一步驟回收的溶液中,係添加緩衝液使pH調整為中性附近。此時使用的緩衝液並未特別限定,但例如為MES緩衝液。又,此時pH被調整成較佳為5.5~6.5,更佳為5.7~6.3,例如6.0。又,固定相係事先以緩衝液平衡化。此時使用的緩衝液並未特別限定,但較佳為MES緩衝液,其pH較佳為5.5~6.5,例如6.0。
將上述pH經調整的純化步驟之第一步驟中的管柱層析法回收劃份,負荷於上述事先平衡化的陰離子交換管柱,回收包含融合蛋白質的非吸附劃份後,以緩衝液清洗管柱。此時獲得的清洗液亦回收作為非吸附劃份。管柱之清洗所使用的緩衝液較佳為MES緩衝液,其pH較佳為5.5~6.5,例如6.0。
純化步驟之第三步驟為陽離子交換層析法。於陽離子交換層析法中,對於使用何種陽離子交換樹脂並未特別限定,但較佳為弱陽離子交換體,更佳為具有基於疏水性相互作用及氫鍵形成雙方之選擇性的弱陽離子交換體。例如,可使用如Capto MMC(GE Healthcare公司)等之具備苯基、醯胺鍵及羧基且具有基於疏水性相互作用及氫鍵形成雙方之選擇性的弱陽離子交換體。
於陽離子交換層析法中,管柱係事先以緩衝液平衡化。此時使用的緩衝液較佳為MES緩衝液,其pH較佳為6.0~7.0,更佳為約6.5。
將含有純化步驟之第二步驟中所回收的融合蛋白質之劃份及清洗液,負荷於陽離子交換管柱,清洗結合了融合蛋白質的管柱之後,使融合蛋白質溶出。溶出可藉由提高了鹽濃度的緩衝液而進行。此時使用的緩衝液較佳為MES緩衝液,其pH較佳為6.0~7.0,更佳為約6.5。於緩衝液中添加的鹽較佳為氯化鈉,鹽濃度較佳為0.5~1.5M之範圍,更佳為0.8~1.2M之範圍,進一步較佳為約1M。
第三步驟中所獲得的溶出液之含有融合蛋白質之劃份的pH,較佳為調整成5.5~6.1,更佳為約5.8。
純化步驟之第四步驟為粒徑篩析管柱層析法。此步驟係用以去除內毒素等之低分子雜質、融合蛋白質之多量體、分解物等,藉此而可獲得實質上純的融合蛋白質。
此外,於依序包含將已結合對抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法而成的上述之純化方法中,可進一步導入1個或2個以上之管柱層析法。此種追加的管柱層析法,係例如使用具有對磷酸基之親和性的固相的管柱層析法、將已結合對抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、疏水性管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及色素親和性管柱層析法。適合為:於純化步驟之第一步驟前、或純化步驟之第一步驟和第二步驟之間,導入以藍三(Blue triazine)色素作為配體的色素親和性管柱層析法。
亦可於融合蛋白質之純化步驟中,追加使有從培養上清液被帶入之虞的病毒不活化的步驟。此病毒不活化步驟可於純化步驟之第一步驟之前實施,亦可於純化步驟之各步驟之間實施,也可於純化步驟結束之後實施,但例如,於純化步驟之第一步驟之前、或純化步驟之第一步驟和第二步驟之間實施。
病毒不活化步驟係藉由對包含融合蛋白質的溶液添加非離子性界面活性劑,且於20~60℃攪拌2~6小時而進行。作為此時使用的非離子性界面活性劑之適合者,可列舉聚山梨醇酯20、80及三正丁基磷酸、或此等之混合物。
病毒不活化步驟亦可使用病毒去除膜來進行。可藉由使包含人類化抗hTfR抗體-hIDUA的溶液通過孔徑為35 nm、20 nm的病毒去除膜,而去除溶液中所含的病毒。
使用本發明之製造方法而獲得的融合蛋白質之純化品,為可直接作為醫藥使用之純度者。特別是融合蛋白質係人類化抗hTfR抗體之輕鏈為具有序列識別號22所示的胺基酸序列者,該人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈在其C末端側,透過具有序列識別號4所示的胺基酸序列的連接子,與序列識別號6所示的人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合,且為作為全體而具有序列識別號27所示的胺基酸序列者的情形(人類化抗hTfR抗體-hIDUA),可獲得可直接作為醫藥使用之純度的純化品。
使用本發明之製造方法而獲得的融合蛋白質、特別是人類化抗hTfR抗體-hIDUA之純化品中所含的源自宿主細胞的蛋白質(HCP)之濃度,係低於100 ppm,例如低於60 ppm、低於40 ppm,例如1~50 ppm、1~40 ppm。
使用本發明之製造方法而獲得的融合蛋白質、特別是人類化抗hTfR抗體-hIDUA之純化品中所含的聚合物佔融合蛋白質全體之比率,係低於0.5%,例如低於0.2%、低於0.1%、低於0.05%等,例如0.01~0.1%、0.001~0.1%。
使用本發明之製造方法而獲得的融合蛋白質、特別是人類化抗hTfR抗體-hIDUA之純化品,在作為醫藥而供給的情形,可作成包含適當賦形劑的水性液劑或冷凍乾燥製劑而供給。作成水性液劑的情形,可作成填充於小瓶的形態,也可作成預先填充至注射器之載藥型的製劑供給。冷凍乾燥製劑的情形,係於使用前溶解於水性介質而使用。
[實施例]
以下,參照實施例而進一步詳細地說明本發明,但本發明並未意圖限定於實施例。
〔實施例1〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質表現用載體之構築
人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質表現用載體,係使用編碼具有序列識別號22所示的胺基酸序列的輕鏈及具有序列識別號23所示的胺基酸序列的重鏈之Fab區域的基因作為抗體部分而構築。
〔pE-neo載體及pE-hygr載體之構築〕
將pEF/myc/nuc載體(Invitrogen公司)以KpnI和NcoI消化,切出包含EF-1啟動子及其第一內含子的區域,將其以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。另於將pCI-neo(Invitrogen公司)以BglII及EcoRI消化而切除包含CMV的增強子/啟動子及內含子的區域之後,以T4 DNA聚合酶進行平滑末端化處理。於此插入上述之包含EF-1α啟動子及其第一內含子的區域(平滑末端化處理後者),而構築pE-neo載體。將pE-neo載體以SfiI及BstXI消化,切除包含新黴素耐性基因的約1 kbp之區域。以pcDNA3.1/Hygro(+)(Invitrogen公司)為模板,而使用引子Hyg-Sfi5'(序列識別號13)及引子Hyg-BstX3'(序列識別號14),藉由PCR反應而使潮黴素(hygromycin)基因增幅。將所增幅的潮黴素基因,以SfiI及BstXI消化,插入上述之pE-neo載體中,而構築pE-hygr載體。又,pE-neo載體及pE-hygr載體之構築係參考專利文獻(日本專利第6279466號)而進行。
〔pE-IRES-GS-puro之構築〕
將表現載體pPGKIH(Miyahara M. et.al.,J. Biol. Chem. 275,613-618(2000))以限制酶(XhoI及BamHI)消化,切出包含源自小鼠腦心肌炎病毒(EMCV)的內部核糖體結合部位(IRES)、潮黴素耐性基因(Hyg
r基因)及小鼠磷酸甘油酯激酶(phosphoglycerate kinase)(mPGK)之多腺苷化區域(mPGKpA)的DNA片段。將此DNA片段插入pBluescript SK(-)(Stratagene公司)之XhoI及BamHI位間,將其設為pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)。
以pBSK (IRES-Hygr-mPGKpA)為模板,且使用引子IRES5'(序列識別號29)及引子IRES3'(序列識別號30),藉由PCR而使包含EMCV之IRES的一部分的DNA片段增幅。將此DNA片段以限制酶(XhoI及HindIII)消化,插入pBSK(IRES-Hygr-mPGKpA)之XhoI及HindIII位間,將其設為pBSK (NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)。將pBSK(NotI-IRES-Hygr-mPGKpA)以限制酶(NotI及BamHI)消化,插入pE-hygr載體之NotI及BamHI位間,將其設為質體pE-IRES-Hygr。
將表現載體pPGKIH以EcoRI消化,切出由包含mPGK之啟動子區域(mPGKp)的鹼基序列而成的DNA片段。將此DNA片段插入pBluescript SK(-)(Stratagene公司)之EcoRI位,將其設為mPGK promoter/pBS(-)。以mPGK promoter/pBS(-)為模板,且使用引子mPGKP5'(序列識別號31)及引子mPGKP3'(序列識別號32),藉由PCR而使包含mPGK之啟動子區域(mPGKp)的DNA片段增幅。將此DNA片段以限制酶(BglII及EcoRI)消化,插入pCI-neo(Promega公司)之BglII及EcoRI位間,將其設為pPGK-neo。將pE-IRES-Hygr以限制酶(NotI及BamHI)消化而切出DNA片段(IRES-Hygr),且插入pPGK-neo之NotI及BamHI位間,將其設為pPGK-IRES-Hygr。
從CHO-K1細胞調製cDNA,以此為模板,且使用引子GS5'(序列識別號33)及引子GS3'(序列識別號34),藉由PCR而使包含GS基因的DNA片段增幅。將此DNA片段以限制酶(BalI及BamHI)消化,插入pPGK-IRES-Hygr之BalI及BamHI位間,將其設為pPGK-IRES-GS-ΔpolyA。
以pCAGIPuro(Miyahara M. et.al.,J. Biol. Chem. 275,613-618(2000))為模板,且使用引子puro5'(序列識別號35)及引子puro3'(序列識別號36),藉由PCR而使包含嘌黴素耐性基因(puro
r基因)的DNA片段增幅。將此DNA片段插入pT7Blue T-Vector(Novagen公司),將其設為pT7-puro。
將pT7-puro以限制酶(AflII及BstXI)消化,插入表現載體pE-neo之AflII及BstXI位間,將其設為pE-puro。
以pE-puro為模板,且使用引子SV40polyA5'(序列識別號37)及引子SV40polyA3'(序列識別號38),藉由PCR而使包含SV40後期多腺苷化區域的DNA片段增幅。將此DNA片段以限制酶(NotI及HpaI)消化,插入表現載體pE-puro之NotI及HpaI位間,將其設為pE-puro(XhoI)。將pPGK-IRES-GS-ΔpolyA以限制酶(NotI及XhoI)消化,切出包含IRES-GS區域的DNA片段,將其插入表現載體pE-puro(XhoI)之NotI及XhoI位間,將其設為pE-IRES-GS-puro。又,pE-IRES-GS-puro之構築係參考專利文獻(日本專利第6279466號)而進行。
〔pE-mIRES-GS-puro(ΔE)之構築〕
以表現載體pE-IRES-GS-puro為模板,且使用引子mIRES-GS5'(序列識別號39)及引子mIRES-GS3'(序列識別號40),藉由PCR,而使從EMCV之IRES直到GS的區域增幅,使對於位於EMCV之IRES的5'側起第2號的起始密碼子(ATG)施加變異而破壞的DNA片段增幅。以表現載體pE-IRES-GS-puro為模板,而使用此DNA片段和上述之引子IRES5',藉由PCR而使包含從IRES直到GS的上述區域的DNA片段增幅。將此DNA片段以限制酶(NotI及PstI)消化,將所切出的DNA片段插入pBluescript SK(-)(Stratagene公司)之NotI及PstI位間,將其設為mIRES/pBlueScript SK(-)。
將表現載體pE-IRES-GS-puro,以SphI消化,並切除SV40增強子區域。將剩餘的DNA片段自我連接(self-ligation),將其設為pE-IRES-GS-puro(ΔE)。將mIRES/pBlueScript SK(-)以NotI及PstI消化,切出包含改變型IRES(mIRES)及GS基因之一部分的區域。另將pE-IRES-GS-puro(ΔE)以NotI及PstI消化,插入上述之包含mIRES及GS基因之一部分的區域,而構築pE-mIRES-GS-puro(ΔE)。
〔pEM-hygr(LC3)及pE-mIRES-GSp-Fab-IDUA之構築〕
人工合成包含β-Globin MAR (Matrix Attachment Region)、CMV增強子、人類EF-1α啟動子、MluI及BamHI切斷位、干擾素β Mar的DNA片段(CMVE-EF-1αp-IFNβMAR)(序列識別號41)。於此DNA片段之5’側係導入了HindIII序列,於3’側係導入了EcoRI序列。將此DNA片段以HindIII及EcoRI消化,插入pUC57載體之HindIII及EcoRI位間,將其設為JCR69 in pUC57。人工合成包含MluI及BamHI切斷位、IRES、潮黴素耐性基因及mPGK多腺苷酸訊號的DNA片段(IRES-HygroR-mPGKpA)(序列識別號42)。將此DNA片段插入JCR69 in pUC57的MluI及BamHI位,將其設為pEM hygro。
人工合成包含編碼具有序列識別號22所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之輕鏈全長的基因的DNA片段(序列識別號26)而插入pUC57-Amp,將其設為JCR131 in pUC57-Amp。於此DNA片段之5’側係導入了MluI序列,於3’側係導入了NotI序列。將此質體DNA以MluI和NotI消化,併入表現載體pEM hygro之MluI-NotI間。將獲得的載體設為人類化抗hTfR抗體之輕鏈表現用載體pEM-hygr(LC3)。
人工合成具有包含編碼作為全體而具有序列識別號27所示的胺基酸序列之蛋白質的基因之序列識別號28所示的鹼基序列的DNA片段,其係透過序列識別號4所示的連接子序列而具有序列識別號6所示的胺基酸序列的人類IDUA結合於具有序列識別號27所示的胺基酸序列的人類化抗hTfR抗體之重鏈的Fab區域之C末端側。於此DNA片段之5’側係導入了MluI序列,於3’側係導入了NotI序列。將此DNA片段以MluI及NotI消化,併入pE-mIRES-GS-puro(ΔE)之MluI和NotI之間。將獲得的載體設為使hIDUA結合於人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈的C末端側而成的蛋白質之表現用載體pE-mIRES-GSp-Fab-IDUA。
〔實施例2〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質之高表現細胞株之製作
將CHO細胞(CHO-K1:從美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)取得),藉由下述方法,使用NEPA21(NEPAGENE公司),以實施例1構築的pEM-hygr(LC3)和pE-mIRES-GSp-Fab-IDUA進行轉形。
細胞之轉形大致以下列方法進行。將CHO-K1細胞以CD OptiCHO
TM培養基(Thermo Fisher Scientific公司)及PBS之1:1混合液懸浮,使其成為2×10
7細胞/mL之密度。採取50 μL之細胞懸浮液,於其中添加50 μL之以CD OptiCHO
TM培養基及PBS的1:1混合液稀釋為200 μg/mL的pEM-hygr(LC3)質體DNA溶液。使用NEPA21(NEPAGENE公司),實施電穿孔,將pEM-hygr(LC3)質體DNA導入細胞中。於37℃,5% CO
2的條件下培養一晩之後,將細胞以添加0.5 mg/mL潮黴素的CD OptiCHO
TM培養基選擇培養。藉由相同手法而將pE-mIRES-GSp-Fab-IDUA質體DNA(以AhdI消化,並線性化者)導入所獲得的細胞。於37℃,5% CO
2的條件下培養一晩後,將細胞以添加0.5 mg/mL潮黴素及10 μg/mL嘌黴素的CD OptiCHO
TM培養基選擇培養。選擇培養之際,使MSX之濃度階段性上升,最終將MSX濃度作成300 μM,選擇性地增殖顯示藥劑耐性的細胞。
接著,藉由限制稀釋法(limiting dilution method),以每1孔會有1個以下的細胞增殖之方式,在96孔盤上接種以選擇培養選出的細胞,培養約2週使各細胞形成單株群落。採取有單株群落形成的孔的培養上清液,以ELISA法調查人類化抗體含量,並選出人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質之高表現細胞株。
此時之ELISA法大致以下列方法實施。於96孔微量滴定盤(Nunc公司)之各孔中,各添加100 μL之將雞抗IDUA多株抗體溶液以0.05 M碳酸氫鹽緩衝液稀釋成5 μg/mL者,於室溫或4℃下靜置至少1小時而使抗體吸附於平盤。接著,以於Tris緩衝生理食鹽水(pH 8.0)中添加了0.05% Tween20者(TBS-T)清洗各孔3次之後,於各孔中各添加300 μL之於Tris緩衝生理食鹽水(pH8.0)中添加了1% BSA者,而將平盤於室溫靜置1小時。接著,以TBS-T清洗各孔3次之後,將以於Tris緩衝生理食鹽水(pH 8.0)中添加了0.1% BSA及0.05% Tween20者(TBS-BT)稀釋成適當濃度的培養上清液或人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質純化品,於各孔中各添加100 μL,將平盤於室溫靜置1小時。接著,以TBS-T清洗平盤3次之後,將以TBS-BT稀釋的HRP標識抗人類IgG多株抗體溶液,於各孔中各添加50 μL,將平盤於室溫靜置1小時。以TBS-T清洗各孔3次後,使用ELISA POD基質TMB套組(Nakalai Tesque公司)而使顯色。接著,於各孔中各添加50 μL之1 mol/L硫酸而停止反應,使用96孔盤讀數機,對各孔測量在450 nm的吸光度。選出對應顯示高測量值的孔的細胞,作為人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質之高表現細胞株。將如此進行而獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質之高表現細胞株,設為人類化抗hTfR抗體-hIDUA表現株。將此細胞株表現的人類化抗hTfR抗體與hIDUA之融合蛋白質,設為人類化抗hTfR抗體-hIDUA融合蛋白質(人類化抗hTfR抗體-hIDUA)。
使獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA表現株懸浮於含有10 mg/L胰島素、16 μmol/L胸苷、100 μmol/L次黃嘌呤、500 μg/mL潮黴素B、10 μg/mL嘌黴素、300 μmol/L MSX及10% (v/v) DMSO的CD OptiCHO
TM培養基後,分注於Cryotube,並保存在液態氮中作為種細胞。
〔實施例3〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA表現株的培養
為了取得人類化抗hTfR抗體-hIDUA,而以下列方法培養人類化抗hTfR抗體-hIDUA表現株。使實施例2所獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA表現株,懸浮於含有10 mg/L胰島素、16 μmol/L胸苷、100 μmol/L次黃嘌呤之已調整為pH6.9的約170 L之無血清培養基(CD OptiCHO
TM培養基,ThermoFisher SCIENTIFIC公司),而使細胞密度成為約3×10
5個/mL。將此細胞懸浮液170 L移至培養槽。將培養基以葉輪以大約100 rpm的速度進行攪拌,將培養基的溶氧飽和度保持於約30%,在34~37℃的溫度範圍下,培養細胞約10日。培養期間中,監看細胞密度、細胞的生存率、培養基的葡萄糖濃度及乳酸濃度。培養基的葡萄糖濃度成為3.0 g/L以下的情形,係立即於培養基中添加葡萄糖溶液而使葡萄糖濃度成為3.5 g/L。培養期間中,將Feed液(EFFICIENTFEED A+
TM,ThermoFisher SCIENTIFIC公司)添加至適當培養基。培養結束後回收培養基。將所回收的培養基,以Millistak+HC Pod Filter grade D0HC(Merck公司)過濾,且進一步以Millistak+ HCgrade X0HC (Merck公司)過濾,而獲得含有人類化抗hTfR抗體-hIDUA的培養上清液。將此培養上清液,使用Pellicon
TM3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔徑:30 kDa,膜面積:1.14m
2,Merck公司)進行超過濾,進行濃縮至液量成為約14分之1。接著,使用Opticap XL600(0.22 μm, Merck公司)過濾此濃縮液。將獲得之液設為濃縮培養上清液。
〔實施例4〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA之純化
於實施例3獲得的濃縮培養上清液中,添加0.25倍容量的2 M精胺酸溶液(pH 7.0)。將此溶液以100 cm/小時之一定流速負荷於以管柱體積之4倍容量的含有400 mM精胺酸的25 mM MES緩衝液(pH6.5)進行了平衡化之Capture Select
TMCH1-XL管柱(管柱體積:約3.1 L,床高:約20 cm,Thermo Fisher Scientific公司),使人類化抗hTfR抗體-hIDUA吸附於管柱。Capture Select
TMCH1-XL管柱為具有與IgG抗體之CH1域特異性結合之性質的配位體被固定於擔體而成的親和性管柱。
接著,以相同流速供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而清洗管柱。接著以相同流速供給管柱體積之3倍容量的25 mM MES緩衝液(pH 6.5)而進一步清洗管柱。接著,以管柱體積之5倍容量的10 mM乙酸鈉-HCl緩衝液(pH 3.5),使吸附於管柱的人類化抗hTfR抗體-hIDUA溶出。溶出液係以事先置入250 mM MES緩衝液(pH 6.0)的容器盛接,而立即中和。
對上述來自親和性管柱的溶出液中,添加250 mM MES緩衝液(pH 6.5),將溶出液之pH調整為6.0。接著,將此溶出液以Opticap XL600(孔徑:0.22 μm,Merck公司)過濾。將此過濾後的溶液,以300 cm/時之一定流速負荷於以管柱體積之5倍容量的含有15 mM NaCl的50 mM MES緩衝液(pH 6.0)進行了平衡化之為多模式陰離子交換管柱的Capto adhere管柱(管柱體積:約1.5 L,床高:約10 cm,GE Healthcare公司)。回收此含有人類化抗hTfR抗體-hIDUA的負荷液。Capto adhere係以N-苄基-N-甲基乙醇胺為配位體者,為具有基於靜電相互作用、氫鍵、疏水性相互作用等之選擇性的強陰離子交換體。
接著,以相同流速供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而清洗管柱,且回收此清洗液。
將上述負荷液及清洗液以200 cm/小時的一定流速負荷於以管柱體積之4倍容量的含有300 mM NaCl的25 mM MES緩衝液(pH 6.5)進行了平衡化之為多模式弱陽離子交換管柱的Capto MMC管柱(管柱體積:約3.1 L,床高:約20 cm,GE Healthcare公司)。Capto MMC為具有基於疏水性相互作用、氫鍵形成等之選擇性的弱陽離子交換體。
接著,以相同流速供給管柱體積之5倍容量的相同緩衝液而清洗管柱。接著,以管柱體積之10倍容量的含有1 M NaCl的25 mM MES緩衝液(pH 6.5),使吸附於弱陽離子交換管柱的人類化抗hTfR抗體-hIDUA溶出。
對上述來自弱陽離子交換管柱的溶出液,添加0.5倍容量之含有0.8 mg/mL NaCl及75 mg/mL蔗糖的20 mM檸檬酸緩衝液(pH 5.5)而將pH調整為5.8。接著,使用Pellicon
TM3 Cassette w/Ultracel PLCTK Membrane(孔徑:30 kDa,膜面積:0.57 m
2,Merck公司)而進行超過濾,進行濃縮至溶液中之人類化抗hTfR抗體-hIDUA的濃度成為約30 mg/mL。接著,將此濃縮液使用Opticap XL600 (0.22 μm,Merck公司)而進行過濾。
將上述之濃縮液,以40 cm/小時之一定流速負荷於以管柱體積之1.5倍容量的含有0.8 mg/mL NaCl及75 mg/mL蔗糖的20 mM 檸檬酸緩衝液(pH 5.5)進行了平衡化之為粒徑篩析管柱的BioSEC管柱(管柱體積:約9.4 L,床高:30 cm,Merck公司),再以相同流速供給相同緩衝液。此時,於來自粒徑篩析管柱的溶出液之流路,配置用以連續測量溶出液之吸光度的吸光光度計,監測280 nm之吸光度,將於280 nm顯示吸收波峰的劃份,作為含有人類化抗hTfR抗體-hIDUA的劃份而回收,將其設為人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品。
〔實施例5〕純化各步驟中的人類化抗hTfR抗體-hIDUA之回收率的測量
使用實施例2記載之ELISA法測量利用親和性管柱的純化步驟中的人類化抗hTfR抗體-hIDUA之負荷量及溶出液中回收之量。又,將其以外的純化各步驟中的人類化抗hTfR抗體-hIDUA之負荷量及溶出液中回收之量,以分光光度計測量280 nm中的吸光度而算出。將其結果示於表3。回收到相當於當初培養上清液中所含的23.7 g之人類化抗hTfR抗體-hIDUA的約74.0%的17.5 g之人類化抗hTfR抗體-hIDUA作為純化品。此等之結果顯示:上述實施例4記載之純化法為作為人類化抗hTfR抗體-hIDUA之純化方法而非常高效率者。又,於表3中,步驟回收率(%)意指各純化步驟中之所回收的人類化抗hTfR抗體-hIDUA量對負荷的人類化抗hTfR抗體-hIDUA量之比率,總回收率(%)意指各純化步驟中所回收的人類化抗hTfR抗體-hIDUA量對供給於純化步驟的人類化抗hTfR抗體-hIDUA量的初期量之比率。
[表3]
(表3)各純化步驟中的人類化抗hTfR抗體-hIDUA之回收率 | ||||
純化步驟 | 人類化抗hTfR抗體-hIDUA | |||
負荷量 (g) | 溶出量 (g) | 步驟回收率(%) | 總回收率 (%) | |
親和性管柱 | 23.7 | 22.2 | 93.7 | 93.7 |
多模式陰離子交換管柱 | 22.0 | 22.0 | 100.0 | 92.7 |
多模式弱離子交換管柱 | 21.6 | 20.5 | 94.7 | 86.4 |
凝膠過濾管柱 | 20.1 | 17.5 | 87.1 | 74.0 |
〔實施例6〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品之分析(HCP之定量)
藉由ELISA法定量實施例4所獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品中所含的源自宿主細胞的蛋白質(HCP)之量。首先,於96孔盤(Nunc公司)之各孔中添加100 μL之源自抗CHO細胞的蛋白質抗體,靜置一晩而使抗體吸附。清洗各孔3次之後,於各孔中添加200 μL之含酪蛋白的封阻溶液,於25℃震盪60分鐘。清洗各孔3次之後,於各孔中分別添加100 μL之含有人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品的溶液(樣品溶液)或HCP標準溶液,於25℃震盪2小時。清洗各孔3次之後,於各孔中添加100 μL之生物素化之源自抗CHO細胞的蛋白質抗體,於25℃震盪60分鐘。清洗各孔3次之後,添加100 μL之HRP-conjugated streptavidin (Jackson Immuno Research Laboratories公司),於25℃震盪60分鐘。清洗各孔3次之後,於各孔中添加100 μL之TMB基質溶液,於25℃使其顯色。於TMB基質溶液中,係使用將TMB microwell peroxidase substrate system (KPL公司)之TMB過氧化酶受質和過氧化酶受質溶液B等量混合之物。顯色後,於各孔中添加100 μL之6.75%磷酸而使酵素反應停止,以96孔用平盤讀數機測量各孔之450 nm的吸光度。從HCP標準溶液之測量值作成校正線,對其內插樣品溶液的值而定量人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品中所含的HCP。由如此進行而求得的HCP之定量值及使用實施例2記載之ELISA法而測量的人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品之定量值,定量人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品中所含的HCP。其結果得知,人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品中所含的HCP的量為約35 ppm(即,在1 mg之人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品中約35 ng之HCP)。
〔實施例7〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品之分析(SE-HPLC分析)
將TSKgel G3000SW
XL管柱(內徑7.8 mm X 高度30 cm,TOSOH公司)設置於LC-20A系統、SPD-20AV之UV/VIS偵測器(島津製作所公司)。將管柱以含有5% 2-丙醇和20 mM NaCl的200 mM磷酸緩衝液平衡化。以1.0 mg/mL之濃度含有實施例4所獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品之10 μL的溶液以0.6 mL/分鐘之一定流速負荷於此管柱,且進一步以相同流速供給相同緩衝液。將測量215 nm中的吸光度而作成的沖提概貌示於圖1。獲得的概貌幾乎僅顯示源自人類化抗hTfR抗體-hIDUA的單一波峰。惟,觀察到會在主波峰(圖中單體波峰)之前被偵測到的源自人類化抗hTfR抗體-hIDUA之聚合物的波峰(圖中聚合物波峰)。由波峰全體的面積與聚合物波峰的面積的比率,計算出聚合物佔人類化抗hTfR抗體-hIDUA全體的比率為約0.02%。
〔實施例8〕人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品之分析(總結)
以上之人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品的分析結果顯示:實施例4所獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品為幾乎不包含包含HCP的雜質者,及聚合物之存在比率極低。即,人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品可謂為作為醫藥,例如靜脈內、肌肉內、皮下、腹腔內、動脈內、或病灶內投予劑,可直接使用之品質者。
[產業上利用之可能性]
如依據本發明,則可提供例如經純化至可直接作為醫藥使用之純度的使抗體與溶酶體酶結合而成的融合蛋白質,特別是使抗體與hIDUA結合而成的融合蛋白質。
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1:連接子例1之胺基酸序列
序列識別號2:連接子例2之胺基酸序列
序列識別號3:連接子例3之胺基酸序列
序列識別號4:連接子例4之胺基酸序列
序列識別號5:人類運鐵蛋白受體之胺基酸序列
序列識別號6:人類IDUA之胺基酸序列1
序列識別號7:人類IDUA之胺基酸序列2
序列識別號8:抗hTfR抗體之輕鏈CDR1之胺基酸序列1
序列識別號9:抗hTfR抗體之輕鏈CDR1之胺基酸序列2
序列識別號10:抗hTfR抗體之輕鏈CDR2之胺基酸序列1
序列識別號11:抗hTfR抗體之輕鏈CDR2之胺基酸序列2
序列識別號12:抗hTfR抗體之輕鏈CDR3之胺基酸序列1
序列識別號13:抗hTfR抗體之重鏈CDR1之胺基酸序列1
序列識別號14:抗hTfR抗體之重鏈CDR1之胺基酸序列2
序列識別號15:抗hTfR抗體之重鏈CDR2之胺基酸序列1
序列識別號16:抗hTfR抗體之重鏈CDR2之胺基酸序列2
序列識別號17:抗hTfR抗體之重鏈CDR3之胺基酸序列1
序列識別號18:抗hTfR抗體之重鏈CDR3之胺基酸序列2
序列識別號19:抗hTfR抗體之重鏈框架區域3之胺基酸序列
序列識別號20:抗hTfR抗體之輕鏈之可變區的胺基酸序列
序列識別號21:抗hTfR抗體之重鏈的可變區的胺基酸序列
序列識別號22:抗hTfR抗體之輕鏈之胺基酸序列
序列識別號23:抗hTfR抗體之Fab重鏈之胺基酸序列
序列識別號24:引子Hyg-Sfi5’,合成序列
序列識別號25:引子Hyg-BstX3’,合成序列
序列識別號26:編碼抗hTfR抗體之輕鏈之胺基酸序列的鹼基序列,合成序列
序列識別號27:人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈與人類IDUA的融合蛋白質之胺基酸序列
序列識別號28:包含編碼人類化抗hTfR抗體之Fab重鏈與人類IDUA的融合蛋白質之胺基酸序列之基因的鹼基序列,合成序列
序列識別號29:引子IRES5',合成序列
序列識別號30:引子IRES3',合成序列
序列識別號31:引子mPGKP5',合成序列
序列識別號32:引子mPGKP3',合成序列
序列識別號33:引子GS5',合成序列
序列識別號34:引子GS3',合成序列
序列識別號35:引子puro5',合成序列
序列識別號36:引子puro3',合成序列
序列識別號37:引子SV40polyA5',合成序列
序列識別號38:引子SV40polyA3',合成序列
序列識別號39:引子mIRES-GS5',合成序列
序列識別號40:引子mIRES-GS3',合成序列
序列識別號41:CMVE-EF-1αp-IFNβMAR,合成序列
無
圖1為呈示實施例4中所獲得的人類化抗hTfR抗體-hIDUA純化品之SE-HPLC的圖表之圖。縱軸表示在215 nm的吸光度,橫軸表示保持時間(分鐘)。各自於(A)呈示源自人類化抗hTfR抗體-hIDUA之單體的波峰,於(B)及(C)呈示源自人類化抗hTfR抗體-hIDUA之聚合物的波峰。
Claims (36)
- 一種製造方法,其係使抗體與人類溶酶體酶融合而成的融合蛋白質之製造方法,其包含: (a)在無血清培養基中培養產生該融合蛋白質的哺乳動物細胞而使該融合蛋白質被分泌於培養液中, (b)藉由從該培養液去除該哺乳動物細胞而回收培養上清液, (c)使用將已結合對該抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、陰離子交換管柱層析法、陽離子交換管柱層析法、及粒徑篩析管柱層析法,而從該培養上清液純化該融合蛋白質。
- 如請求項1之製造方法,其係依下述順序使用將已結合對該抗體具有親和性的物質之材料作為固定相使用的管柱層析法、該陰離子交換管柱層析法、該陽離子交換管柱層析法、及該粒徑篩析管柱層析法而成。
- 如請求項1或2之製造方法,其中對該抗體具有親和性的物質係對該抗體之重鏈的CH 1區域具有親和性。
- 如請求項1至3中任一項之製造方法,其中該陰離子交換管柱層析法中使用的陰離子交換體為強陰離子交換體。
- 如請求項1至4中任一項之製造方法,其中該陽離子交換管柱層析法中使用的陽離子交換體為弱陽離子交換體。
- 如請求項1至5中任一項之製造方法,其中與該人類溶酶體酶融合的該抗體為人類化抗體或人類抗體。
- 如請求項1至5中任一項之製造方法,其中與該人類溶酶體酶融合的該抗體為人類化抗體。
- 如請求項1至7中任一項之製造方法,其中與該人類溶酶體酶融合的該抗體係以存在於血管內皮細胞之表面的分子為抗原。
- 如請求項8之製造方法,其中存在於血管內皮細胞之表面的該分子選自包含運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F、有機陰離子運輸蛋白、MCT-8、單羧酸轉運蛋白、及Fc受體的群組。
- 如請求項8之製造方法,其中該血管內皮細胞為腦血管內皮細胞。
- 如請求項10之製造方法,其中該存在於腦血管內皮細胞之表面的分子選自包含運鐵蛋白受體(TfR)、胰島素受體、瘦素受體、脂蛋白受體、IGF受體、OATP-F、有機陰離子運輸蛋白、MCT-8、及單羧酸轉運蛋白的群組。
- 如請求項8至11中任一項之製造方法,其中該血管內皮細胞為人類之血管內皮細胞。
- 如請求項1至12中任一項之製造方法,其中 該抗體為抗人類運鐵蛋白受體抗體, 該抗體係於重鏈之可變區中,CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成,CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成,及CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,且 該抗體係於輕鏈之可變區中,CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成,CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成,及CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
- 如請求項13之製造方法,其中該抗體係重鏈之框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
- 如請求項14之製造方法,其中該抗體中的該重鏈之可變區係包含序列識別號21之胺基酸序列而成。
- 如請求項13或14之製造方法,其中 該抗體係於重鏈之可變區中,包含與序列識別號21之胺基酸序列具有80%以上之同一性的胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成, CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及 框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
- 如請求項13或14之製造方法,其中 該抗體係於重鏈之可變區中,包含與序列識別號21之胺基酸序列具有90%以上之同一性的胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成, CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及 框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
- 如請求項13或14之製造方法,其中 該抗體係於重鏈之可變區中,包含對序列識別號21之胺基酸序列經進行由1~5個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成, CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及 框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
- 如請求項13或14之製造方法,其中 該抗體係於重鏈之可變區中,包含對序列識別號21之胺基酸序列經進行由1~3個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號13或序列識別號14之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號15或序列識別號16之胺基酸序列而成, CDR3包含序列識別號17或序列識別號18之胺基酸序列而成,及 框架區域3包含序列識別號19之胺基酸序列而成。
- 如請求項13至19中任一項之製造方法,其中該抗體之輕鏈之可變區係包含序列識別號20之胺基酸序列而成。
- 如請求項13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含與序列識別號20之胺基酸序列具有80%以上之同一性的胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成, CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
- 如請求項13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含與序列識別號20之胺基酸序列具有90%以上之同一性的胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成, CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
- 如請求項13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含對序列識別號20之胺基酸序列經進行由1~5個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成, CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
- 如請求項13至19中任一項之製造方法,其中該抗體係於輕鏈之可變區中,包含對序列識別號20之胺基酸序列經進行由1~3個胺基酸的取代、刪除或加成所致的修飾之胺基酸序列而成,且 CDR1包含序列識別號8或序列識別號9之胺基酸序列而成, CDR2包含序列識別號10或序列識別號11之胺基酸序列、或胺基酸序列Lys-Val-Ser而成, CDR3包含序列識別號12之胺基酸序列而成。
- 如請求項15之製造方法,其中該抗體之該重鏈包含序列識別號23之胺基酸序列。
- 如上述20或25之製造方法,其中該抗體之該輕鏈包含序列識別號22之胺基酸序列。
- 如請求項1至26任一項之製造方法,其中該抗體為Fab、F(ab’) 2、或F(ab’)。
- 如請求項1至27任一項之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶係結合於該抗體之輕鏈的C末端側或N末端側。
- 如請求項28之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶係直接或透過連接子而結合於該輕鏈的C末端側或N末端側。
- 如請求項28之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶係透過連接子而結合於該重鏈的C末端側或N末端側。
- 請求項29或30之製造方法,其中該連接子序列為包含1~50個胺基酸殘基的肽。
- 如請求項31之製造方法,其中該連接子為包含選自以下群組之胺基酸序列而成的肽,該群組包含1個甘胺酸、1個絲胺酸、胺基酸序列Gly-Ser、胺基酸序列Gly-Gly-Ser、序列識別號1之胺基酸序列、序列識別號2之胺基酸序列、序列識別號3之胺基酸序列、序列識別號4之胺基酸序列、及此等之胺基酸序列1~10個連續而成的胺基酸序列。
- 如請求項1至32中任一項之製造方法,其中該融合蛋白質中的該人類溶酶體酶為人類α-L-艾杜糖醛酸酶。
- 如請求項33之製造方法,其中該融合蛋白質中的該抗體為Fab, 該抗體之輕鏈係包含序列識別號22之胺基酸序列而成,且 該抗體之重鏈係藉由在其C末端側,透過序列識別號4之胺基酸序列與人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合,而該融合蛋白質形成序列識別號27之胺基酸序列。
- 如請求項33之製造方法,其中 該融合蛋白質中的該抗體為Fab, 該抗體之輕鏈係由序列識別號22之胺基酸序列而成,且 該抗體之重鏈係由序列識別號23之胺基酸序列而成,在其C末端側,透過由序列識別號4之胺基酸序列而成的連接子,與由序列識別號6之胺基酸序列而成的人類α-L-艾杜糖醛酸酶結合。
- 如請求項33之製造方法,其中該人類α-L-艾杜糖醛酸酶係包含序列識別號6或7之胺基酸序列而成。
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