JP2021506875A - アルキルグリコシドによるタンパク質精製およびウイルス不活化 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、アルキルグリコシドを組換えポリペプチドに添加する精製方法に基づくものである。発明者らは、アルキルグリコシド、および特にn−オクチル−ベータ−D−グルコピラノシドが、精製工程の間、例えば、精製工程に先立ち供給物質に添加されると、方法関連不純物の排除を改善し得ることを明らかにした。例えば、発明者らは、クロマトグラフィー精製工程の供給流にアルキルグリコシドが存在することによって、TNBP/PS80のような代替薬剤または対照緩衝液の使用と比較して、溶出段階における宿主細胞DNAおよび宿主細胞タンパク質レベルが有意に低減し得ることを発見した。さらに、アルキルグリコシドは、撹拌せずに短期間しか存在しない場合でも、効率的にウイルスを不活化することができ、これによってプロセス時間およびコストの削減が可能となる。該方法は、この効率的なウイルス不活化を保持しながら、広範囲の方法パラメーター下で実行することができる。n−オクチル−ベータ−D−グルコピラノシドに加え、発明者らは、n−デシル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−オクチル−ベータ−D−マルトシド、n−ドテシル−ベータ−D−マルトシド、n−ドテシル−ベータ−D−グルコピラノシド、およびn−デシル−ベータ−D−マルトシドが、本発明における使用に特に効果的なアルキルグリコシドであることを明らかにした。
i)該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程;
ii)該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程;および
iii)該組換えポリペプチドを精製する工程
を含む前記方法を提供する。
「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために使用される。ポリマーは直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾型アミノ酸を含んでいてもよく、非アミノ酸によって遮断されていてもよい。該用語はまた、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、硫酸化、または標識成分もしくは半減期を延ばす成分との結合などその他の操作もしくは改変などの天然にまたは介入によって修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する。該用語にはまた、例えば、アミノ酸の1つまたはそれ以上のアナログ(例えば、非天然アミノ酸などを含む)、および当技術分野で既知のその他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、別々のポリペプチドのマルチマーの形態であってもよい。
上記で論じたように、本方法において、さらなる精製工程を、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前または工程(iii)の後のいずれかにおいて含めてもよい。いずれのさらなる精製工程も、典型的には、クロマトグラフィーの工程である。クロマトグラフィーは、任意の好適なクロマトグラフィー、例えば、イムノアフィニティー、アフィニティ、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、サイズ排除、または金属キレートクロマトグラフィーから選択してもよい。
にみられるグルタチオンに結合するグルタチオンs−トランスフェラーゼ(GST)配列である。
「アルキルグリコシド」という用語は、当技術分野において既知であるように、本明細書において、何らかの疎水性アルキルへの結合によって連結されている任意の糖を概して指すために使用される。疎水性アルキル鎖と親水性サッカライドとの間の連結には、中でも特に、グリコシド、エステル、チオグリコシド、チオエステル、エーテル、アミド、もしくはウレイド結合または連結を挙げることができる。本発明における糖の典型的な選択肢としては、グルコース(グルコピラノシドとして)およびマルトースが挙げられる。疎水性アルキルの典型的な選択肢としては、n−オクチル、n−デシル、およびn−ドテシル基が挙げられる。連結は、具体的には、グリコシド連結であり、特に、ベータグリコシド連結(例えば、ベータ−Dグリコシド連結)であり得る。発明者らは、具体的には、糖はグルコースであり、疎水性アルキルはn−オクチル基であり、連結はベータ−Dグリコシド結合であるアルキルグリコシドを使用した。発明者らが使用したその他の個々の組合せとしては、:グルコース、n−デシル基、およびベータ−Dグリコシド結合;マルトース、n−オクチル基、およびベータ−Dグリコシド結合;マルトース、n−ドテシル基、およびベータ−Dグリコシド結合;グルコース、n−ドテシル基、およびベータ−Dグリコシド結合;ならびにマルトース、n−デシル基、およびベータ−Dグリコシド結合が含まれる。
組換えポリペプチドを含む溶液は、上記のようなアルキルグリコシドで処理される。特定の実施形態において、アルキルグリコシドは、n−オクチル−β−D−グルコピラノシドである。この処理は、該溶液を、所期の最終濃度の例えば10倍のアルキルグリコシドの保存液と混合することによって簡便になし得る。溶媒/界面活性剤、例えばTNBP/PS80による処理とは異なり、アルキルグリコシドは、水溶液で用意することができ、追加の溶媒、特にTNBPのような有機溶媒は必要としない。アルキルグリコシドがn−オクチル−β−D−グルコピラノシドである場合、200から1000mMの間の濃度を有する保存液を使用するのが便利である。組換えポリペプチドを含む溶液がクロマトグラフィー工程からの溶出物であれば、必要に応じて、次いで、アルキルグリコシドの添加に先立ち、該溶液をさらに溶出緩衝液で希釈してもよい。
上記で論じたように、工程(iii)における組換えポリペプチドの精製は、典型的には、溶液に対するクロマトグラフィーの工程を実行することによって行われる。クロマトグラフィーは、任意の好適なクロマトグラフィー、例えば、イムノアフィニティー、アフィニティ、疎水性相互作用、イオン交換、マルチモード、サイズ排除、または金属キレートクロマトグラフィーから選択してもよい。
マルチモードまたは混合モードクロマトグラフィーは、相互作用の複数のモード:イオン交換、ヒドロキシアパタイト、アフィニティ、サイズ排除、および疎水性相互作用が可能なリガンドで機能化されている媒体支持体に基づくものである。これらの分離方法を組み合わせる能力によって、ポリペプチド精製方法における選択性が高められる。特に、ヒドロキシアパタイト(静電的およびカルシウム配位化合物)に基づく、または疎水性イオン交換リガンドに基づく、様々なクロマトグラフィー要素を合わせもつ混合モード媒体が多数市販されている。
サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、ゲルに通す濾過によって、分子の大きさに基づきそれらを分離するものである。ゲルは、特定の粒径分布を含有する球状のビーズからなる。分離は、異なる大きさの分子がマトリックス内で選択されるかまたは細孔から排除されて起こる。低分子は細孔の中へ拡散し、カラムを通過するそれらの流れは大きさに基づき遅くなり、一方、大分子は、細孔に入り込むことなくカラムの空隙容量に溶出される。その結果、分子は、カラムを通過しながらそれらの大きさに基づいて分かれ、分子量が徐々に低くなる順で溶出される。
金属キレートクロマトグラフィーは、ヒスチジンタグ付きタンパク質の精製に有効であり、また、その他の露出したヒスチジン、システイン、およびトリプトファン残基を有するタンパク質を精製するためにも使用することができる。固定化アフィニティクロマトグラフィー(IMAC)樹脂が、ポリペプチドを精製するために使用される。Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+、またはFe3+のような使用する金属イオンによって高い選択的親和性を達成することができる。標的ポリペプチドの樹脂への結合強度は、主として使用する金属イオンおよび緩衝液のpHによって影響を受ける。結合したタンパク質は、イミダゾールによる競合溶出、またはpHを下げることによって溶出することができる。
疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)は、一般的に、タンパク質凝集物およびその他の方法関連不純物を除去するために実行される。該分離法を実行する場合、例えばバッチ精製技術またはカラムを使用して、試料混合物をHIC物質と接触させる。HIC精製に先立ち、例えば混合物をプレカラムに通すことによって、カオトロピック剤またはきわめて疎水性の物質を除去することが望ましい場合もある。
溶液を、工程(iii)の後のさらなる処理および上述のような任意の追加の精製工程にかけてもよい。
本発明の医薬組成物は、精製された本発明の組換えポリペプチドを、当技術分野において一般的に使用される任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤(これらすべては本明細書において「担体」と呼ぶ)、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、酸化防止剤、およびその他の多種多様な添加剤と混合することによって、凍結乾燥した調合物または水溶液として保管用に調製することができる(参考文献11を参照されたい)。そのような添加剤は、用いる用量および濃度でにおいて、レシピエントに対して非毒性でなければならない。
「含む(comprising)」という用語は、「含む(including)」および「なる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む」組成物は、排他的にXからなっていてもよく、または例えばX+Yのように、さらに何かを含んでいてもよい。
概要
組換えD’D3−FP(参考文献7)の、ポリソルベート80とリン酸トリ−n−ブチル(PS80/TNBP)との典型的な溶媒/界面活性剤混合物による処理を、アルキルグリコシド、n−オクチル−β−D−グルコピラノシド(OG)による処理と比較した。初期実験で、rD’D3−FPは、アルキルグリコシドによる処理に対して依然として安定していることが示された。さらに重要なことには、リン酸トリ−n−ブチル(TNBP)の非存在下でも、アルキルグリコシドによって、3つのモデルウイルスの迅速な不活化が観察された。ウイルス不活化は、撹拌してまたはせずに、5℃という低い温度で、1時間以内に完了した。この効率的な手順では、効率的なウイルス不活化をもたらす予想外に広範囲のプロセスパラメーターを用いることができた(OGのために試験した範囲は、4〜25℃、30分以内(典型的には、120分間追跡した)、20mM以上の濃度であった)。予想外に、その次のクロマトグラフィー精製工程の供給流中にアルキルグリコシドが存在することによって、溶出段階において、PS80/TNBPまたは対照緩衝液の使用と比較して有意に低い宿主細胞DNAおよび宿主細胞タンパク質レベルが得られた。
rD’D3−FPは、組換えDNA技術によって生成したフォン・ウィルブランド因子(vWF)タンパク質のFVIII結合部位を含有する。rD’D3−FP cDNA配列を、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞へトランスフェクトし、ポリペプチドを発現させ、記載した調査を行った。様々な代表的なウイルスモデルを用いてアルキルグリコシド工程のウイルス不活化能を評価する実験室での研究を行った。関連のウイルスとしてのレトロウイルスMuLV(マウス白血病ウイルス)の使用は、CHO細胞が内在性レトロウイルス様粒子を含有することが知られているため、特にCHO細胞由来生成物に関連したものである。一般的にS/D処理に対してより安定なフラビウイルスBVDV(ウシウイルス性下痢症ウイルス)およびヘルペスウイルスPRV(仮性狂犬病ウイルス)を、アルキルグリコシド処理の広範なウイルス不活化能を実証するウイルス評価研究において使用した。
・タンパク質濃度の変化は、PRV不活化に影響しなかった(図3、表4)。
・6℃での20mM OGインキュベーション中の撹拌によって、PRV不活化は若干速まった(図4、表5)。それにもかかわらず、PRVは、OGインキュベーション中、全く撹拌しない20mM OG処理によって、完全に確実に不活化された。
・6℃でOG濃度を15mM(CMC以下)まで下げることによって、有意なPRV不活化は得られなかった(図5、表6)。
・同様の観察を、21℃で10mM OGで行った(図6、表7)。OG濃度を30mM以上に上げることによって、PRV不活化は速まった。さらに、OG保存液を7日間(暗所で)保管することによる不活化能への影響はなかった。
・30mM OGでは、インキュベーション温度を6℃から18℃に上げた場合、PRV不活化は速まらなかった(図7、表8)。この他の数種の60mMのアルキルグリコシドによって、PRVはきわめて速く完全に不活化された(図8、表9)。特に、低量のアルキルグリコシド(CMCの約2倍)によって、PRVはきわめて速く完全に不活化された(図9、表10a)。
観察された迅速な不活化速度論から、OGおよびその他のアルキル−グリコシドが、効果的に確実にエンベロープウイルスを不活化することが示された。
rD’D3−FPは、IAC樹脂にかける前に、OGまたはPS80/TNBPで処理した。この目的のために、rD’D3−FP試料を、OG保存液(600mM)で希釈して、60mM OGを含むウイルス不活化溶液を作出した。対照実験では、PS80/TNBP保存液(3%PS80/0.9%TNBP)を添加して、1%PS80、0.3%TNBPの最終濃度とした。次いで、溶液を濾過し、室温で2時間インキュベートした。その後、表11に従ってIAC実験を行った。クロマトグラフィーについては、イムノアフィニティー樹脂CaptureSelectヒトアルブミン(ThermoFisher)を使用した。使用したクロマトグラフィー装置は、AKTA Avantシステム(GE Healthcare)であった。
rD’D3−FPを、60mM OGもしくは表12に明記したようなその他のアルキルグリコシド、1%PS 80、0.3%TNBP、または緩衝液対照(500mM NaCl、20mM Tris pH7.4)で処理した。次いで、溶液を濾過し、室温で2時間インキュベートした。
概要
実施例1に記載した実験室研究と同様の研究をさらに行って、OGに加えて、アルキルグリコシドのウイルス不活化能を評価した。n−オクチル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−デシル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−オクチル−ベータ−D−マルトシド、n−ドテシル−ベータ−D−マルトシド、n−ドテシル−ベータ−D−グルコピラノシド、およびn−デシル−ベータ−D−マルトシドは、すべて、効果的であり(図8)、より低い濃度でも(それらのCMC値の約2倍、図9)効果的であることが認められた。
概要
さらなる研究を行って、クロマトグラフィー装置において洗浄剤としてアルキルグリコシドを使用することを評価し、プロセス関連不純物、特にタンパク質不純物の排除への効果を検討した。本実施例では、バイオリアクタープロセスから回収したrD’D3−FPの細胞フリーの物質を、陰イオン交換カラム(Poros XQ、Thermo Scientific)にかけた。rD’D3−FPは、フォン・ウィルブランド因子(VWF)プロペプチドと一緒に発現される。このフォン・ウィルブランド因子(VWF)プロペプチドは、細胞中で切り離されるがrD’D3−FPと共に細胞上清へ分泌されるため、産物と同等のレベルで存在する。よって、このタンパク質不純物のレベルを低減することが重要である。クロマトグラフィープロトコールを改変し、OGを洗浄緩衝液のうちの1つに添加した。
陰イオン交換クロマトグラフィーの精製の詳細は、表14でみることができる。2つの実験を行った。選択1では、工程5(洗浄工程2)をOGなしで実行し、選択2では、60mM OGを洗浄緩衝液中に追加的に含めた。
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Claims (31)
- 組換えポリペプチドを精製する方法であって、
i)該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程;
ii)該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程;および
iii)該溶液に対してクロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程
を含む前記方法。 - アルキルグリコシドは、追加的に、クロマトグラフィー工程の洗浄バッファーに含まれるか;別法として、アルキルグリコシドは、工程ii)において該溶液に添加されず、クロマトグラフィー工程の洗浄バッファーにだけ含まれる、請求項1に記載の方法。
- 工程(iii)は、溶液中の宿主細胞DNAおよび/もしくは宿主細胞タンパク質からの組換えポリペプチドの分離、ならびに/または溶液中の他のタンパク質不純物からの組換えポリペプチドの分離をもたらす、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 工程(iii)は、溶液へアルキルグリコシドを添加しない同じ方法と比較して、溶液中の宿主細胞DNAおよび/または宿主細胞タンパク質からの組換えポリペプチドの分離を改善する、請求項3に記載の方法。
- クロマトグラフィーは、イムノアフィニティークロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、マルチモードクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または金属キレートクロマトグラフィーである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- クロマトグラフィーはイムノアフィニティークロマトグラフィーである、請求項5に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー工程は、溶液へアルキルグリコシドを添加する工程の前に、該溶液に対して実行される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 疎水性相互作用クロマトグラフィー工程は、工程(iii)の後に、溶液に対して実行される、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- マルチモードクロマトグラフィー工程は、工程(iii)の後に、溶液に対して実行される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- イオン交換クロマトグラフィー工程は、疎水性相互作用またはマルチモードクロマトグラフィー工程の後に、溶液に対して実行される、請求項8または請求項9に記載の方法。
- 宿主細胞DNAおよび/または宿主細胞タンパク質から組換えポリペプチドを分離するためのものであり、
a)該組換えポリペプチドを含む溶液を用意する工程;
b)該溶液に対してイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程;
c)該溶液へアルキルグリコシドを添加する工程;
d)該該溶液に対してイムノアフィニティークロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程;
e)該溶液に対して疎水性相互作用またはマルチモードクロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程;および
f)該溶液に対してさらにイオン交換クロマトグラフィーの工程を実行することによって該組換えポリペプチドを精製する工程
を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - イオン交換クロマトグラフィーは陰イオン交換クロマトグラフィーである、請求項5、7、10、または11のいずれか1項に記載の方法。
- 5000pg/ml未満であるレベルの宿主細胞DNA混入を含む溶液を提供し;かつ/または、アルキルグリコシドを使用しないことを除いてもしくはTNBP/PS80のような従来のS/D処理を使用することを除いて前記方法に同一である参照方法と比較した場合、1.5分の1以下、好ましくは、2分の1以下、5分の1以下、10分の1以下、20分の1以下、50分の1以下、100分の1以下、150分の1以下、もしくは200分の1以下に低減したレベルの宿主細胞DNA混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 5000ng/ml未満である宿主細胞DNAの混入のレベルを含む溶液を提供し;かつ/または、アルキルグリコシドを使用しないことを除いてもしくはTNBP/PS80のような従来のS/D処理を使用することを除いて前記方法に同一である参照方法と比較した場合、1.5分の1以下、好ましくは、2分の1以下、2.5分の1以下、3分の1以下、もしくは3.5分の1以下に低減したレベルの宿主細胞タンパク質(HCP)混入を含む組換えポリペプチドの溶液を提供する、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 工程ii)は、溶液をインキュベートすることをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 溶液中に存在し得る1つまたはそれ以上のウイルスを不活化する方法であって、該溶液へアルキルグリコシドを添加し、該溶液をインキュベートする工程を含む前記方法。
- 溶液は、i)組換えポリペプチドを含む溶液、またはii)血漿由来物質である、請求項16に記載の方法。
- インキュベーションは、20分から5時間の間で行われる、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- インキュベーションは、室温または4℃から10℃の間で行われる、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- インキュベーション前のアルキルグリコシドの最終濃度は、該アルキルグリコシドの臨界ミセル濃度(CMC)を超えている、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
- インキュベーションは撹拌なしで行われる、請求項15〜20のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドは、遺伝子組換えにより該ポリペプチドを産生する細胞株由来のものである、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- ポリペプチドは、血液凝固タンパク質、アルブミン、免疫グロブリン、または融合タンパク質である、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(i)における溶液は、0.1μg/mlから50μg/mlの間の宿主細胞DNA、および/または50μg/mlから1000μg/mlの間の宿主細胞タンパク質を有する、請求項1〜23のいずれか1項に記載の方法。
- アルキルグリコシドは、n−オクチル−β−D−グルコピラノシドであるか、またはn−デシル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−オクチル−ベータ−D−マルトシド、n−ドテシル−ベータ−D−マルトシド、n−ドテシル−ベータ−D−グルコピラノシド、およびn−デシル−ベータ−D−マルトシドからなる群から選択される、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 溶液は、工程(iii)および任意の追加の精製工程の後にウイルスの濾過の工程によりさらに処理される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法。
- 溶液は、工程(iii)および任意の追加の精製工程の後に限外濾過および/またはダイアフィルトレーションの1つまたはそれ以上の工程によりさらに処理される、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法。
- 精製された組換えポリペプチドは、医薬組成物を作製するために薬学的に許容される担体と混合される、請求項1〜27のいずれか1項に記載の方法。
- アルキルグリコシドは任意の有機溶媒なしに添加され、かつ/またはアルキルグリコシドは事前に有機溶媒と混合することなく添加される、請求項1〜28のいずれか1項に記載の方法。
- 組換えポリペプチドおよびアルキルグリコシドを含む溶液であって、請求項1〜29のいずれか1項に記載の工程(ii)から得られる前記溶液。
- 精製された組換えポリペプチドを含む溶液であって、請求項1〜29のいずれか1項に記載の方法によって得られる前記溶液。
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