KR20110139216A - 소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제 방법 - Google Patents

소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20110139216A
KR20110139216A KR1020117021247A KR20117021247A KR20110139216A KR 20110139216 A KR20110139216 A KR 20110139216A KR 1020117021247 A KR1020117021247 A KR 1020117021247A KR 20117021247 A KR20117021247 A KR 20117021247A KR 20110139216 A KR20110139216 A KR 20110139216A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
thr
val
leu
Prior art date
Application number
KR1020117021247A
Other languages
English (en)
Inventor
크리스토퍼 갈로
수준 선
제임스 에드워드 부스
제이슨 코미어
다니엘 라카세
아론 노이스
Original Assignee
와이어쓰 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 와이어쓰 엘엘씨 filed Critical 와이어쓰 엘엘씨
Publication of KR20110139216A publication Critical patent/KR20110139216A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 특히 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 기초하여 고분자량 (HMW) 응집체 및 다른 불순물을 함유하는 단백질 제제로부터 단백질, 특히 소형 모듈형 면역약제 (SMIP™) 단백질을 정제 또는 회수하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피와 조합으로 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 본 발명의 방법은 3개 이하의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 본 발명은 본 발명에 따라 정제된 단백질, 예를 들어 SMIP™, 및 그를 함유하는 제약 조성물을 또한 제공한다.

Description

소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제 방법{METHODS OF PURIFYING SMALL MODULAR IMMUNOPHARMACEUTICAL PROTEINS}
관련 출원에 대한 참조
본원은 그 내용의 전체를 본원에 참고로 포함시킨, 2009년 3월 11일 출원된 미국 특허 가출원 61/159,347을 기초로 한 이익을 주장한다.
일반적으로, 단백질은 제약 용도를 위해 생산될 때, 단백질 제제로부터 오염물을 제거해야 하고, 그 후에야 진단 용도, 치료 용도, 응용 세포 생물학, 및 기능 연구에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 배양된 세포로부터 수거한 단백질 제제는 종종 원치 않는 성분, 예를 들어 세포에 의해 생산된 단백질의 고분자량 (HMW) 응집체를 함유한다. 고분자량 응집체는 투여 시에 보체 활성화 또는 아나필락시스 (anaphylaxis)를 유발함으로써 생성물 안전성에 불리한 영향을 미칠 수 있다. 추가로, 응집체는 생성물 수율 감소, 피크 (peak) 광역화 (broadening), 및 활성 손실을 유발함으로써 제조 공정을 방해할 수 있다.
소형 모듈형 면역약제 (SMIP™) 단백질은 항체 및 다른 치료 단백질에 비해 비교적 새로운 클래스의 제약 단백질에 속한다. 따라서, SMIP™ 단백질의 정제는 상기 종류의 단백질이 익숙하지 않기 때문에 특히 문제가 된다. 추가로, SMIP™ 단백질은 응집하는 경향이 크다. 예를 들어, 세포 배양액 내의 HMW 응집체의 백분율은 50-60% 정도로 높을 수 있다.
발명의 개요
본 발명은 특히, HMW 응집체를 함유하는 단백질을 정제하는 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명은 소형 모듈형 면역약제 단백질이 3개 이하의 크로마토그래피 단계를 이용하여 높은 백분율의 HMW 응집체 (예를 들어, 50-60%보다 많은)를 함유하는 단백질 제제로부터 정제될 수 있다는 발견을 포함한다. 따라서, 본 발명에 따른 본 발명의 방법은 컬럼 단계의 수를 감소시켜, 공정 시간을 유의하게 감소시키고 생성물 수율을 개선한다. 본 발명은 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하기 위해 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 다른 단백질, 특히, 응집하는 경향이 있는 단백질을 정제하기 위해 또한 사용될 수 있다.
하나의 측면에서, 본 발명은 단백질 제제를 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 4% 미만의 응집체 (예를 들어, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.8%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만)를 함유하도록 하는 작동 조건 하에 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제로부터 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 3개 이하의 크로마토그래피 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 작동 조건은 소형 모듈형 면역약제 단백질을 인산염 버퍼 내에서 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 내독소가 없다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 발열원이 제거된다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 인산나트륨, 인산칼륨 및/또는 인산리튬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 적합한 인산염 버퍼는 1 mM 내지 50 mM의 농도의 인산나트륨을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적합한 인산염 버퍼는 100 mM 내지 2.5 M의 농도의 염화나트륨을 추가로 함유한다. 일부 실시양태에서, 적합한 인산염 버퍼는 2 mM 내지 32 mM의 농도의 인산나트륨 및 100 mM 내지 1.6 M의 농도의 염화나트륨을 함유한다. 일부 실시양태에서, 적합한 인산염 버퍼의 pH는 6.5 내지 8.5이다.
일부 실시양태에서, 작동 조건은 소형 모듈형 면역약제 단백질을 NaCl 구배에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작동 조건은 소형 모듈형 면역약제 단백질을 NaCl 단계 용출 방법에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 작동 조건은 소형 모듈형 면역약제 단백질을 인산염 구배 (예를 들어, 선형 인산염 구배)에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피에서는 세라믹 히드록시아파타이트 타입 I 또는 타입 II 수지를 함유하는 컬럼을 사용한다. 일부 실시양태에서, 컬럼은 세라믹 히드록시아파타이트 타입 I 수지를 함유한다. 일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 적합한 수지의 직경은 1 ㎛ 내지 1,000 ㎛이다. 일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 적합한 수지의 직경은 10 ㎛ 내지 100 ㎛이다.
일부 실시양태에서, 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 단계 전에 친화도 크로마토그래피에 의해 단백질 제제를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피 단계에서는 불변 면역글로불린 도메인에 결합하는 단백질 흡착제를 사용한다. 일부 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피에서는 가변 면역글로불린 도메인에 결합하는 단백질 흡착제를 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 단백질 흡착제는 VH3 도메인, 또는 VH3에 상동성인 도메인 (예를 들어, VH3 패밀리로부터의 도메인)에 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 단백질 흡착제는 단백질 A를 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피 단계에서는 MabSelect™ r단백질 A 수지 컬럼을 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 단백질 흡착제에 대한 결합을 촉진하기 위해 첨가제 (예를 들어, PEG 및/또는 다른 비이온성 유기 중합체)를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피의 단계는 Hepes, 염화나트륨, 염화칼슘, 아르기닌, Tris, 염화마그네슘, 히스티딘, 우레아, 이미다졸, 하나 이상의 유기 용제 (예를 들어, 에탄올, 메탄올, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로판올, 이소프로판올, 및 부탄올), 및/또는 세제 (예를 들어, 이온성 또는 비이온성)를 포함하는 세척 버퍼를 사용하여 친화도 크로마토그래피 컬럼을 세척하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피의 단계는 Hepes, 인산, 글리신, 글리실글리신, 염화마그네슘, 우레아, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 하나 이상의 유기산 (예를 들어, 아세트산, 시트르산, 포름산, 락트산, 타르타르산, 말산, 말론산, 프탈산 및 살리실산), 및/또는 아르기닌을 포함하는 용출 버퍼를 사용하여 친화도 크로마토그래피 컬럼으로부터 소형 모듈형 면역약제 단백질을 용출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용출 버퍼는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 염은 1 mM 내지 1 M의 농도이다. 특정 실시양태에서, 염은 1 mM 내지 500 mM의 농도이다. 특정 실시양태에서, 염은 1 mM 내지 100 mM의 농도이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질 제제를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 친화도 크로마토그래피 후에, 그러나 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계 전에 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질 제제를 정제하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 대한 소형 모듈형 면역약제 단백질 및/또는 불순물의 결합을 향상시키기 위해 첨가제를 첨가하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 첨가된 첨가제는 단백질 제제로부터 하나 이상의 오염물 또는 불순물의 침전을 유도한다. 일부 실시양태에서, 침전된 오염물은 여과에 의해 단백질 제제로부터 제거된다. 일부 실시양태에서, 적합한 첨가제는 비이온성 유기 중합체 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 및/또는 폴리비닐피롤리돈)이거나 그를 함유한다.
일부 실시양태에서, 방법은 친화도 또는 음이온 교환 크로마토그래피 전에 단백질 제제를 심층 필터 (depth filter)에 적용하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 여과 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 여과 단계는 바이러스 보존 (retaining) 여과 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 여과 단계는 한외여과 (ultrafiltration) 및/또는 정용여과 (diafiltration) 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단백질 제제는 배양된 세균 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 무세포 배지, 트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 식물로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 단백질 제제는 세포 배양 배지 제제이다. 일부 실시양태에서, 배양 배지 제제는 배양된 세포로부터 분비된 소형 모듈형 면역약제 단백질을 함유한다. 특정 실시양태에서, 배양된 세포는 CHO 세포이다. 특정 실시양태에서, 배양 배지 제제는 대규모 생물반응기로부터 제조된다. 일부 실시양태에서, 정제할 단백질 제제는 세포 추출물을 함유한다. 일부 실시양태에서, 정제할 단백질 제제는 봉입체로부터 제조된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 4% 미만 (예를 들어, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.8%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.2%, 0.1% 미만)의 응집체를 함유하도록 하는 작동 조건 하에 단백질 제제를 (a) 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 1 또는 2개의 이온 교환 크로마토그래피 단계), 및 (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리함으로써, 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제로부터 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 단백질 제제를 (a1) 친화도 크로마토그래피, (a2) 이온 교환 크로마토그래피, 및 (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리한다. 일부 실시양태에서, 단백질 제제를 (a1) 양이온 교환 크로마토그래피, (a2) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리한다. 일부 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피는 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 수지는 Q 세파로즈 (Sepharose)™ FF, Q 세파로즈™ XL, DEAE 세파로즈™ FF, POROS® HQ50, 토요펄 (Toyopearl)® DEAE, 토요펄® 기가캡 (GigaCap) Q-650M, 토요펄® DEAE-650M, 캡토 (Capto)™ Q, 캡토™ DEAE, 및 촉수 (tentacle) 음이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 프랙토겔 (Fractogel)® TMAE HiCap(M)™, 프랙토겔® TMAE(S)™, 또는 프랙토프렙 (Fractoprep)® TMAE™)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지는 하전 막 흡착기 (예를 들어, 머스탕 (Mustang)® Q, 머스탕® E, 사르토빈드 (Sartobind)® 및/또는 크로마솔브 (Chromasorb)®)이다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 수지는 하전 모노리스 (monolithic) 지지체 (예를 들어, CIM®-DISK)이다. 특정 실시양태에서, 친화도 크로마토그래피는 MabSelect™ r단백질 A 친화도 크로마토그래피이고, 이온 교환 크로마토그래피는 촉수 음이온 교환 크로마토그래피이고, 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 타입 I 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피이다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 3개 이하의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 재사용을 위해 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 스트리핑 (stripping) 및/또는 재생하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 5% 초과 (예를 들어, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 그 초과)의 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 70% 미만 (예를 들어, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만)의 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 4-70% (예를 들어, 4-60%, 4-50%, 4-40%, 4-30%, 4-20%, 4-15%, 4-10%)의 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제를 정제하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD20에 특이적으로 결합하는 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-59 및 67-76 중 임의의 하나에 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하기 위해 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 정제된 단백질이 4% 미만 (예를 들어, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.8%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.2% 또는 0.1% 미만)의 응집체를 함유하도록 하는 작동 조건 하에 단백질 제제를 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하는, 20% 초과 (예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 또는 그 초과)의 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제로부터 단백질을 정제하기 위해 사용된다. 특정 실시양태에서, 단백질 제제는 60% 초과의 고분자량 응집체를 함유한다.
특정 실시양태에서, 작동 조건은 단백질을 인산염 버퍼 내에서 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 내독소가 없다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 발열원이 제거된다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 인산나트륨, 인산칼륨, 및/또는 인산리튬을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 1 mM 내지 50 mM의 농도의 인산나트륨을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼는 100 mM 내지 2.5 M의 농도의 염화나트륨을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 인산염 버퍼는 2 mM 내지 32 mM의 농도의 인산나트륨 및 100 mM 내지 1.6 M의 농도의 염화나트륨을 함유한다. 일부 실시양태에서, 인산염 버퍼의 pH는 6.5 내지 8.5이다.
일부 실시양태에서, 정제할 단백질은 소형 모듈형 면역약제 폴리펩티드를 함유한다.
본 발명은 본원에 기재된 방법을 이용하여 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질을 추가로 제공한다. 추가로, 본 발명은 소형 모듈형 면역약제 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공하고, 여기서 소형 모듈형 면역약제 단백질은 4% 미만 (예를 들어, 3.5%, 3%, 2.5%, 2%, 1.5%, 1%, 0.8%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.2%, 또는 0.1% 미만)의 응집체를 포함한다.
본원에서, "또는"의 사용은 달리 진술하지 않으면 "및/또는"을 의미한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "포함하다" 및 용어의 어미 변화, 예를 들어 "포함하는" 및 "포함하다"는 다른 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하는 의도가 없다. 본원에서 사용될 때, 용어 "약" 및 "대략"은 균등물로서 사용된다. 약/대략을 사용하여 또는 사용하지 않고 본원에서 사용되는 임의의 수치는 당업자가 이해하는 임의의 정상적인 변동을 포괄하는 의미이다.
본 발명의 다른 특색, 목적 및 잇점은 다음의 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위에서 자명하다. 그러나, 상세한 설명, 도면, 및 특허청구범위는 본 발명의 실시양태를 나타내지만, 단지 예시로서 제시되고 제한의 의미가 없음을 이해해야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 자명해질 것이다.
도면은 단지 예시를 위한 것이고, 제한의 의미는 없다.
도 1은 항-CD20 소형 모듈형 면역약제 단백질의 예시적인 구조를 도시한 것이다.
도 2는 용액 내에 존재할 수 있는 SMIP™ 분자의 예시적인 입체형상을 보여준다.
도 3a-3c는 다양한 도메인-스와핑 (swapping) 메카니즘이 SMIP™ 분자의 고분자량 응집체, 예를 들어 삼량체, 사량체 또는 다량체의 형성을 일으킬 수 있음을 보여준다.
도 4는 예시적인 세포 배양 및 수거 절차를 예시하는 개략도를 보여준다.
도 5는 12-14일의 배양 기간에 걸쳐 2가지 상이한 CHO 세포 클론에 의해 생산된 TRU-015의 생산 생물반응기의 예시적인 일일 역가 측정치 (㎍/mL)를 보여준다. 피크 역가 값은 생산 생물반응기 성장의 제12일 내지 제14일에 얻어졌다. 피크 역가 값은 1500 내지 3000 ㎍/mL이었다.
도 6은 배치 (batch) 결합 메카니즘을 이용하는 초고속 (high throughput) 스크리닝의 예시적인 디자인을 보여준다.
도 7은 단백질 A 컬럼 작업 및 초고속 스크리닝 모델의 예시적인 디자인을 보여준다.
도 8은 예시적인 단백질 A 초고속 스크린 결과를 보여준다.
도 9. (A) 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 대한 초고속 스크린에서 시험된 예시적인 변수의 요약. (B) cHA 정제 동안 변하는 농도의 인산염 및 NaCl을 사용할 때 % HMW 화합물을 입증하는 예시적인 등고선 (contour plot). (C) 대략 10의 Kp (또는 1의 로그 Kp)에서, 대부분의 HMW 화합물이 샘플로부터 제거된 것을 입증하는 예시적인 HMW 대 로그 Kp 플롯.
도 10은 cHA 크로마토그래피 단계의 개발을 위한 cHA 컬럼 및 NaCl 구배 용출을 이용하는 예시적인 선택적 (alternative) 스크리닝을 보여준다.
도 11은 예시적인 일반적인 cHA 크로마토그램을 보여준다.
도 12는 예시적인 TRU-015 정제 공정을 보여준다.
도 13은 MabSelect 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 HMW 응집체의 양의 감소와 CEX에 의한 감소의 예시적인 비교를 도시한 것이다.
도 14는 CEX 수지의 단백질 생성물 결합능을 설명하는 예시적인 결과를 도시한 것이다.
도 15는 25 대 75 mg/mLr 로딩 챌린지 (loading challenge)를 사용하는 CEX 피크를 설명하는 예시적인 결과를 도시한 것이다.
도 16은 AEX 컬럼을 이용하는 HMW의 효과적인 제거를 설명하는 예시적인 결과를 보여준다. 수집된 풀 (pool)은 >95% "단량체성" SMIP™ 단백질의 수율을 보이고, 순도가 88%이었다.
본 발명은 특히, 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 기초하여 HMW 응집체 및 다른 불순물을 함유하는 단백질 제제로부터 단백질, 특히, 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제 또는 회수하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피와 조합으로 사용한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 오염물을 추가로 제거하고/하거나, 단백질을 농축시키고/시키거나 버퍼 교환하기 위해 하나 이상의 여과 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 3개 이하의 크로마토그래피 단계 (예를 들어, 2개의 크로마토그래피 단계, 또는 3개의 크로마토그래피 단계)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 3개 이하의 여과 단계 (예를 들어, 2개의 여과 단계, 3개의 여과 단계)를 갖는다.
실시예 섹션에서 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 단백질 제제로부터 HMW 응집체 및 다른 불순물 (예를 들어, DNA, 숙주 세포 단백질, 바이러스, 및 다른 오염물)의 효과적인 제거를 허용하는 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피에 대한 적합한 작동 조건을 밝혀내었다. 일부 실시양태에서, HMW 응집체의 백분율은 출발 제제에서 20% 초과 (예를 들어, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% 이상)로부터 정제된 단백질 생성물에서 4% 미만 (예를 들어, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 0.1% 미만)으로 감소할 수 있다. 일부 실시양태에서, 출발 제제 내의 HMW 응집체는 적어도 약 5배, 또는 적어도 약 10배, 또는 적어도 약 20배, 또는 적어도 약 30배, 또는 적어도 약 40배, 또는 적어도 약 50배, 또는 적어도 약 60배, 또는 적어도 약 70배, 또는 적어도 약 80배, 또는 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배만큼 감소할 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 정제된 단백질 내의 다른 오염물 (예를 들어, HCP)의 백분율은 약 10,000 ppm 이하, 또는 약 5000 ppm 이하, 또는 약 2500 ppm 이하, 또는 약 400 ppm 이하, 또는 약 360 ppm 이하, 또는 약 320 ppm 이하, 또는 약 280 ppm 이하, 또는 약 240 ppm 이하, 또는 약 200 ppm 이하, 또는 약 160 ppm 이하, 또는 약 140 ppm 이하, 또는 약 120 ppm 이하, 또는 약 100 ppm 이하, 또는 약 80 ppm 이하, 또는 약 60 ppm 이하, 또는 약 40 ppm 이하, 또는 약 30 ppm 이하, 또는 약 20 ppm 이하, 또는 약 10 ppm 이하이다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 본 발명의 방법은 관심있는 단백질의 적어도 50%의 회수율 (예를 들어, 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%의 회수율)을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 적어도 20%의 생성물 수율 (예를 들어, 적어도 22%, 24%, 26%, 28%, 30%, 32%, 34%, 36%, 38%, 40%, 42%, 44%, 46%, 48%, 또는 50%의 수율)을 제공한다.
본 발명의 다양한 측면을 다음 섹션에서 상세히 설명한다. 섹션의 사용은 본 발명을 제한하는 의미는 없다. 각각의 섹션은 본 발명의 임의의 측면에 적용될 수 있다. 본원에서, "또는"의 사용은 달리 진술하지 않으면 "및/또는"을 의미한다.
정의
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 특정 용어를 먼저 정의한다. 다음 용어 및 다른 용어에 대한 추가의 정의는 본 명세서 전체에 기술된다.
흡착제: 흡착제는 고체 지지체에 고정된 적어도 하나의 분자, 또는 그 자체가 크로마토그래피를 수행하기 위해 사용되는 고체인 적어도 하나의 분자이다.
친화도 크로마토그래피: 크로마토그래피에 의한 분리를 수행하기 위해 분자의 일반적인 특성, 예를 들어 등전점, 소수도, 또는 크기보다는 생체분자들 사이의 특이적이고 가역적인 상호작용, 예를 들어, IgG 항체의 Fc 부분에 결합하는 단백질 A의 능력을 이용하는 친화도 크로마토그래피는 크로마토그래피이다. 실제에서, 친화도 크로마토그래피는 흡착제에 더 단단하게 또는 덜 단단하게 결합하는 분자들을 크로마토그래피에 의해 분리하기 위해 흡착제, 예를 들어 고체 지지체에 고정된 단백질 A를 사용하는 것을 수반한다 (그 전체를 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Ostrove (1990) in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology 182: 357-379] 참조).
대략: 본원에서 사용될 때, 용어 "대략" 또는 "약"은 하나 이상의 관심있는 값에 적용되는 경우에 진술된 참조 값에 유사한 값을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 진술하거나 문맥으로부터 달리 명백하지 않으면, 양쪽 방향으로 진술된 참조 값의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 미만에 놓이는 (더 큰 또는 더 적은) 값의 범위를 나타낸다 (그러한 수치가 가능한 값의 100%를 초과할 경우를 제외함).
결합-용출 ( bind - elute ) 방식: 용어 "결합-용출 방식" ("결합 방식"으로도 칭함)은 제제 내에 함유된 적어도 하나의 생성물이 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합하는 생성물 제제 분리 기술을 나타낸다. 상기 방식에서 결합된 생성물은 용출기 동안 용출된다.
크로마토그래피: 크로마토그래피는 상이한 분자들을 더 강하게 또는 덜 강하게 흡착 또는 보존하는 흡착제를 통한 혼합물의 삼출 (percolation)에 의해 혼합물 내의 화학적으로 상이한 분자들의 서로로부터의 분리이다. 흡착제에 의해 가장 덜 강하게 흡착 또는 보존되는 분자는 더 강하게 흡착 또는 보존된 분자가 방출되지 않는 조건 하에 흡착제로부터 방출된다.
불변 면역글로불린 도메인: 불변 항체 면역글로불린 도메인은 인간 또는 동물 기원의 CL, CH1, CH2, CH3 또는 CH4 도메인과 동일하거나 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인이다. 예를 들어 그 전체를 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Charles A Hasemann and J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, in William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, Second Edition, 209, 210-218 (1989)]을 참조한다. CH2 또는 CH3 도메인, 또는 CH2 또는 CH3 도메인에 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인은 또한 항체의 FC 부분으로서 칭한다.
오염물 또는 불순물: 오염물 또는 불순물은 정제되는 관심있는 단백질의 샘플 내에 또한 존재하는, 정제되는 관심있는 단백질 이외의 임의의 외래의 또는 부적당한 분자, 예를 들어 생물학적 거대분자, 예를 들어 DNA, RNA, 또는 단백질을 나타낸다. 불순물은 예를 들어 단백질 변이체, 예를 들어 응집된 단백질, 고분자량 종, 저분자량 종 및 단편, 및 탈아미드화 종; 정제되는 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터의 다른 단백질 (숙주 세포 단백질); 선행 정제 단계 동안 샘플 내로 침출될 수 있는 친화도 크로마토그래피에 사용된 흡착제의 일부인 단백질, 예를 들어 단백질 A; 내독소; 및 바이러스를 포함한다.
유동-관통 ( flow - through ) 방식: 용어 "유동-관통 방식"은 일반적으로 제제 내에 함유된 적어도 하나의 생성물이 크로마토그래피 수지 또는 매질을 관통하여 유동하도록 의도되는 한편, 적어도 하나의 잠재적인 오염물 또는 불순물은 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합하는 생성물 제제 분리 기술을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 유동-관통 방식은 약한 분배 (weak partitioning) 크로마토그래피 (WPC)이고, 여기서 생성물은 수지에 약하게 결합할 수 있는 한편, 적어도 하나의 잠재적인 오염물 또는 불순물은 크로마토그래피 수지 또는 매질에 보다 우선적으로 결합한다. 일반적으로, WPC는 전통적인 유동-관통 방식에서보다 더 높은 분배 계수에서, 그러나 결합-및-용출 방식보다 더 낮은 분배 계수에서 작동한다. 약한 분배에서, 로딩기 후에 보다 큰 로드 (load) 챌린지 및 짧은 세척을 적용하여 높은 회수율을 달성할 수 있다.
숙주 세포 단백질: 숙주 세포 단백질은 정제해야 하는 단백질을 코딩하는 DNA가 그에 도입되는 숙주 세포의 천연 발생 게놈에 의해 코딩되는 단백질이다. 숙주 세포 단백질은 정제할 단백질의 오염물일 수 있고, 그의 수준은 정제에 의해 감소할 수 있다. 숙주 세포 단백질은 특히 겔 전기영동 및 염색 및/또는 ELISA 분석을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 분석할 수 있다.
히드록시아파타이트 크로마토그래피: 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 흡착제로서 세라믹 히드록시아파타이트를 사용하는 크로마토그래피이다. 예를 들어, 그 전체를 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Marina J. Gorbunoff (1990), Protein Chromatography on Hydroxyapatite Columns, in Guide to Protein Purification, Murray P. Deutscher, ed., Methods in Enzymology 182: 329-339]을 참조한다.
로드: 용어 "로드"는 청정화된 세포 배양액 또는 발효 조건화 배지로부터 유래된, 생성물을 함유하는 임의의 로드 물질, 또는 크로마토그래피 단계로부터 유래된 부분적으로 정제된 중간체를 나타낸다. 용어 "로드 유체"는 본 발명의 작동 조건 하에 매질을 통해 통과시키기 위한, 로드 물질을 함유하는 액체를 나타낸다.
로드 챌린지 ( LC ): 용어 "로드 챌린지"는 크로마토그래피 단계의 로드 사이클에서 컬럼 상에 로딩된 또는 배치 결합에서 수지에 적용된 생성물의 총 질량을 나타내고, 이는 수지의 단위 부피당 생성물의 질량의 단위로 측정된다.
단백질 A: 단백질 A는 항체의 FC 부분 또는 가변 도메인에 결합하는, 스태필로코커스 (Stapphylococcus)의 세포벽에서 원래 발견된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질 A는 VH3 패밀리로부터의 도메인 (예를 들어, IgG 항체의 VH3 도메인)에 결합한다. 본 발명의 목적에서, "단백질 A"는 상업상 이용가능한 및/또는 재조합 형태의 단백질 A를 비롯한, 스태필로코커스 단백질 A에 동일하거나 실질적으로 유사한 임의의 단백질이다. 본 발명의 목적에서, 실질적인 유사성을 결정하는 목적을 위한 단백질 A의 생물학적 활성은 IgG 항체의 FC 부분 또는 가변 도메인 (예를 들어, VH3)에 결합하는 능력이다.
단백질 G: 단백질 G는 항체 (예를 들어, IgG)의 FC 부분 또는 가변 도메인에 결합하는 스트렙토코커스 (Streptococcus)의 세포벽에서 원래 발견된 단백질이다. 일부 실시양태에서, 단백질 G는 VH3 패밀리로부터의 도메인 (예를 들어, IgG 항체의 VH3 도메인)에 결합한다. 본 발명의 목적에서, "단백질 G"는 상업상 이용가능한 및/또는 재조합 형태의 단백질 G를 비롯한, 스트렙토코커스 단백질 G에 동일하거나 실질적으로 유사한 임의의 단백질이다. 본 발명의 목적에서, 실질적인 유사성을 결정하는 목적을 위한 단백질 G의 생물학적 활성은 IgG 항체의 FC 부분 또는 가변 도메인 (예를 들어, VH3)에 결합하는 능력이다.
단백질 LG: 단백질 LG는 단백질 G (상기 정의 참조) 및 단백질 L 둘 모두의 일부를 포함하는 IgG 항체에 결합하는 재조합 융합 단백질이다. 단백질 L은 펩토스트렙토코커스 (Peptostreptococcus)의 세포벽으로부터 원래 단리되었다. 단백질 LG는 단백질 L 및 G 둘 모두로부터의 IgG 결합 도메인을 포함한다. 그 전체를 본원에 참고로 포함시킨 문헌 [Vola et al. (1994) Cell. Biophys. 24-25: 27-36]을 참조한다. 본 발명의 목적에서, "단백질 LG"는 상업상 이용가능한 및/또는 재조합 형태의 단백질 LG를 비롯한, 단백질 LG에 동일하거나 실질적으로 유사한 단백질이다. 본 발명의 목적에서, 실질적인 유사성을 결정하는 목적을 위한 단백질 LG의 생물학적 활성은 IgG 항체에 결합하는 능력이다.
정제하다: 단백질을 정제한다는 것은 단백질의 샘플 내에 존재할 수 있는 외래의 또는 부적당한 요소, 특히 생물학적 거대분자, 예를 들어 단백질 또는 DNA의 양을 감소시키는 것을 의미한다. 외래 단백질의 존재는 겔 전기영동 및 염색 및/또는 ELISA 분석을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 분석할 수 있다. DNA의 존재는 겔 전기영동 및 염색 및/또는 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 분석을 비롯한 임의의 적절한 방법에 의해 분석할 수 있다.
가변 항체 면역글로불린 도메인: 가변 항체 면역글로불린 도메인은 인간 또는 동물 기원의 VL 또는 VH 도메인과 동일하거나 실질적으로 유사한 면역글로불린 도메인이다. 본 발명의 목적에서, 실질적인 유사성을 결정하는 목적을 위한 가변 항체 면역글로불린 도메인의 생물학적 활성은 항원 결합이다. 일부 실시양태에서, 가변 항체 면역글로불린 도메인은 VH3 도메인이다. VH3 도메인은 본원에서 사용될 때, VH3 자체, 또는 VH3 도메인에 상동성을 갖는 임의의 도메인을 나타낸다.
소형 모듈형 면역약제 단백질
본원에서 사용될 때, 소형 모듈형 면역약제 (SMIP™) 단백질은 다음 융합 도메인 중 하나 이상을 함유하는 단백질을 나타낸다: 결합 도메인, 면역글로불린 힌지 영역 또는 그로부터 유래된 도메인, 및 효과기 도메인 (이는 면역글로불린 중쇄 CH2 불변 영역 또는 그로부터 유래된 도메인, 및 면역글로불린 중쇄 CH3 불변 영역 또는 그로부터 유래된 도메인일 수 있다). SMIP™ 단백질 치료제는 바람직하게는 단일-특이적이다 (즉, 이들은 생물학적 활성을 개시하기 위해 단일 항원 표적을 인식하고 그에 부착한다). 본 발명은 또한 다중-특이적 및/또는 다가 분자, 예를 들어 스콜피온 (SCORPION)™ 치료제 (이는 SMIP™ 단백질을 포함하고 또한 분자의 SMIP™ 단백질 부분에 대해 C-말단에 위치하는 추가의 결합 도메인을 갖는다)에 관한 것이다. 바람직하게는, 스콜피온™ 치료제의 결합 도메인들은 각각 상이한 표적에 결합한다. 본 발명에 적합한 소형 모듈형 면역약제의 도메인은 유전 공학 처리된 및/또는 돌연변이된 폴리펩티드를 비롯한, 인간 유전자 서열, 임의의 다른 천연 또는 인공 공급원의 생성물인 폴리펩티드이거나 그로부터 유래된다. 소형 모듈형 면역약제는 결합 도메인-면역글로불린 융합 단백질로서 또한 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 소형 모듈형 면역약제에 적합한 힌지 영역은 면역글로불린, 예를 들어 IgG1, IgA, IgE 등으로부터 유래된다. 예를 들어, 힌지 영역은 0, 1 또는 2개의 시스테인 잔기를 갖는 돌연변이체 IgG1 힌지 영역 폴리펩티드일 수 있다.
소형 모듈형 면역약제 단백질에 적합한 결합 도메인은 동족 (cognate) 생물학적 분자, 예를 들어 항원, 수용체 (예를 들어, CD20), 또는 하나 초과의 분자의 복합체 또는 조립체 또는 응집체에 특이적으로 인식하고 결합하는 능력을 갖는 임의의 폴리펩티드일 수 있다.
결합 도메인은, 그가 항원 또는 관심있는 다른 목적하는 표적 구조에 특이적으로 결합할 수 있다면 적어도 하나의 면역글로불린 가변 영역 폴리펩티드, 예를 들어 중쇄 또는 경쇄 V-영역의 전부 또는 일부 또는 단편을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 결합 도메인은 단일쇄 면역글로불린-유래된 Fv 생성물을 포함할 수 있고, 이는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 V-영역의 전부 또는 일부 및 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 V-영역의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고, V-영역에 융합된 링커를 추가로 포함한다.
본 발명은 다양한 소형 모듈형 면역약제에 적용될 수 있다. 예시적인 소형 모듈형 면역약제는 수용체 또는 다른 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; HER 수용체 패밀리의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mol, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 성장 인자, 예를 들어 VEGF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; 단백질 C; EGFR, RAGE, P40, Dkk1, NOTCH1, IL-13, IL-21, IL-4 및 IL-22 등을 표적으로 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 CD20을 특이적으로 인식하는 소형 모듈형 면역약제를 정제하기 위해 사용된다. CD20에 특이적으로 결합하는 예시적인 소형 모듈형 면역약제 단백질을 도 1에 제시한다. 도 1에 제시된 바와 같이, 항-CD20 SMIP™ 단백질은 일반적으로 3가지의 구분되는 도메인, 즉 (1) 아미노산 링커 (예를 들어, 15-아미노산 링커)에 의해 연결된 가변 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 단편을 포함하는 키메라 (쥐/인간) CD20 결합 도메인; (2) 변형된 인간 면역글로불린 (예를 들어, IgG1) 힌지 도메인, 및 (3) IgG 효과기 도메인, 예를 들어 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 재조합 동종이량체성 융합 단백질이다.
전형적으로, SMIP™ 단백질은 2가지의 구분되게 회합된 동종이량체 형태, 즉, 예측된 사슬간 디술피드 연결된 공유 동종이량체 (CD)인 주 형태 및 사슬간 디술피드 결합을 갖지 않는 동종이량체 형태 (분리가능한 이량체, DD)로 존재할 수 있다. 분리가능한 이량체는 일반적으로 완전 활성이다. 전형적으로, 이량체의 이론적 분자량은 대략 106,000 달톤이다. SMIP™ 단백질은 또한 다가 복합체를 형성할 수 있다.
전형적으로, SMIP™ 단백질은 당단백질로서 존재한다. 예를 들어, 도 1에 도시된 바와 같이, 항-CD20 SMIP™ 단백질은 각각의 단백질 사슬의 CH2 도메인 내에서 N-연결된 당화 (glycosylation) 컨센서스 서열 (예를 들어, 327NST)에서 올리고당으로 변형될 수 있다 (도 1 참조). SMIP™ 단백질은 또한 코어-푸코실화 아시알로-아갈락토-비안테나리 (biantennary) N-연결된 올리고당 (G0F); 각각의 사슬 상에 COOH-말단 Gly476, 및 NH2-말단 피로글루타메이트 (G0F/G0F)를 또한 함유할 수 있다. 2가지의 소수 당 형태인 G1F/G0F 및 G1F/G1F, 및 다른 예상된 미량-수준의 N-연결된 당 형태가 또한 존재할 수 있다. 추가로, 낮은 수준의 코어 1 O-글리칸 변형이 또한 SMIP™ 단백질의 힌지 영역에서 관찰된다.
일부 실시양태에서, SMIP™ 단백질의 등전점 (pI 또는 IEP)은 대략 7.0 내지 9.0 (예를 들어, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 8.6, 8.8)이다.
본 발명은 본원에 논의된 다양한 형태 (예를 들어, 단량체성 폴리펩티드, 동종이량체, 분리가능한 이량체 또는 다가 복합체)의 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 다양한 변형된 SMIP™ 단백질, 예를 들어 인간화 SMIP™, 또는 키메라 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "인간화 SMIP™ 단백질은 적어도 하나의 인간화 면역글로불린 영역 (예를 들어, 인간화 면역글로불린 가변 또는 불변 영역)을 포함하는 SMIP™ 단백질을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 인간화 SMIP™ 단백질은 표적-특이적인 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR) (예를 들어, 적어도 하나의 CDR, 2개의 CDR, 또는 3개의 CDR)을 유지하면서, 실질적으로 인간 면역글로불린으로부터 유래된 가변 프레임워크 영역 (예를 들어, 전장 인간 FR1, FR2, FR3, 및/또는 FR4)을 포함하는 인간화 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 SMIP™ 단백질은 하나 이상의 인간 또는 인간화 불변 영역 (예를 들어, 인간 면역글로불린 CH2 및/또는 CH3 도메인)을 포함한다. 용어 "실질적으로 인간 면역글로불린 또는 항체로부터의" 또는 "실질적으로 인간"은 비교 목적으로 인간 면역글로불린 또는 항체 아미노 서열에 정렬될 때, 영역이 인간 프레임워크 또는 불변 영역 서열과 적어도 80-90%, 바람직하게는 90-95%, 보다 바람직하게는 95-99%의 동일성 (즉, 국소 서열 동일성)을 공유하여, 예를 들어 보존적 치환, 컨센서스 서열 치환, 생식계열 치환, 역돌연변이 등을 허용하는 것을 의미한다. 본원에서 사용될 때, 용어 "키메라 SMIP™ 단백질"은 그의 가변 영역은 제1 종으로부터 유래하고 그의 불변 영역은 제2 종으로부터 유래하는 SMIP™ 단백질을 나타낸다. 키메라 SMIP™ 단백질은 예를 들어 유전 공학 처리에 의해 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 세그먼트들로부터 제작될 수 있다. 인간화 및 키메라 SMIP™ 단백질은 본원에 참고로 포함되는 국제 특허 출원 공개 WO 2008/156713에 추가로 기재되어 있다.
본 발명은 효과기 기능을 변경시키는 힌지, CH2 및/또는 CH3 도메인에 대한 변형된 당화 패턴 및/또는 돌연변이를 갖는 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, SMIP™ 단백질은 수용체 결합에 대한 친화도에 영향을 미치는 힌지 링크 영역 내에서 인접한 또는 근접한 부위 상에 돌연변이를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명은 소형 모듈형 면역약제 폴리펩티드 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-76 (예시적인 SMIP™ 서열 섹션 참조) 중 임의의 하나 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 포함하는 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-59 중 임의의 하나 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인을 함유하는 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 1-59 중 임의의 하나 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인, 서열 60-64 중 임의의 하나 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 힌지 영역, 및/또는 서열 65 또는 66 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 불변 영역을 함유하는 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 서열 67-76 중 임의의 하나 또는 그의 변이체의 아미노산 서열을 갖는 SMIP™ 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, 모 서열의 변이체는 모 서열에 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 2개의 아미노산 서열의 동일성 %는 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있거나, 보다 바람직하게는 비교는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group: GCG; 미국 위스콘신주 매디슨) 위스콘신 패키지 버전 10.0 프로그램, "GAP" (Devereux et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12: 387) 또는 다른 비슷한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 이루어진다. "GAP" 프로그램에 대한 바람직한 디폴트 (default) 파라미터는 (1) 문헌 [Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)]에 설명된 바와 같은 문헌 [Gribskov and Burgess ((1986), Nucl. Acids Res. 14: 6745)]의 가중 (weighted) 아미노산 비교 매트릭스, 또는 다른 비슷한 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해 30의 페널티 (penalty) 및 아미노산 서열에 대한 각각의 갭 내에서 각각의 기호에 대해 1의 추가의 페널티; (3) 단부 갭에 대해 페널티 없음; 및 (4) 긴 갭에 대해 최대 페널티 없음을 포함한다. 당업자가 사용하는 다른 서열 비교 프로그램을 또한 사용할 수 있다.
추가의 소형 모듈형 면역약제는 예를 들어, 모두 본원에 참고로 포함시킨 미국 특허 공개 20030133939, 20030118592, 20040058445, 20050136049, 20050175614, 20050180970, 20050186216, 20050202012, 20050202023, 20050202028, 20050202534, 20050238646, 및 20080213273; 국제 특허 출원 공개 WO 02/056910, WO 2005/037989, 및 WO 2005/017148에 추가로 설명되어 있다.
단백질 응집
임의의 이론에 매이기를 바라지 않지만, 도메인 스와핑이 단백질 응집 메카니즘일 수 있음이 고려된다. 도메인 스와핑은 단백질 (도메인)의 구분되는 구조의 하위섹션이 또 다른 단량체의 것과 물리적으로 교환될 때 일어나, 이량체 또는 보다 고차 올리고머를 생성한다. 도메인-스와핑된 단백질에서, 각각의 도메인은 스와핑되지 않은 단량체에서 그의 구조에 상당하는 천연-유사 구체 구조를 유지한다. 다수의 도메인을 함유하는 접힌 (folded) 단백질이 낮은 pH, 승온 또는 전단력으로 스트레스를 받을 때, 부분적으로 접힌 또는 "열린" 입체형태 (해리되지만 접힌 도메인을 특징으로 함)가 유도될 수 있다. 일부 "열린" 분자는 접힌 도메인의 단순한 재회합 (re-association)에 의해 그들의 천연 구조로 다시 접힌다. 일부 경우에 (보다 높은 단백질 농도가 대체로 유리한), 도메인 재회합이 2개의 이웃하는 분자들 사이에서 일어나서, 도메인-스와핑된 이량체를 생성시킨다. 그러한 분자간 스와핑은 전파할 수 있어서, 보다 큰 응집체를 생성한다. 전형적으로, 도메인-스와핑된 단백질은 비-공유 (그러나 안정하게) 회합된 분자이고, 이는 천연-유사 도메인 폴딩 (folding) 및 도메인간 접촉을 갖는다. 그러한 경우에, 다량체성 단백질은 정상적으로 분자내에 존재할 바로 그 도메인-도메인 계면에 의해 함께 유지된다.
정제 공정에 앞서, SMIP™ 단백질은 유의한 양 (예를 들어, 20-60%)의 HMW 단백질 (응집체)를 함유한다. 과도한 HMW 함량은 SMIP™의 분자 구조의 분자 구조로 인한 것일 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 전형적인 SMIP™ 이량체 분자는 가요성 링커 (예를 들어,
Figure pct00001
)에 의해 연결된 VH 및 VL 도메인을 포함하는 2개의 동일한 단일쇄-Fv 영역을 포함하고, 이는 인간 IgG1 Fc 도메인에 융합된다 (도 1). 임의의 이론에 매이기를 바라지 않지만, SMIP™ 분자는 펴짐 (Fv의 열린 입체형태) 및 후속적인 도메인 스와핑에 보다 감수성일 수 있어서, 각각의 하위단위 내의 가요성 링커 때문에 단백질 응집을 일으킨다.
냉동-전자 현미경을 사용하는 연구에 따르면, SMIP™ 분자는 용액 내에서 예를 들어, 밀집형 (compact), 혼합형, 스트레치형 (stretched) 또는 디아바디 (diabody)-유사 입체형상으로 존재할 수 있다 (도 2). 임의의 이론에 매이기를 바라지 않지만, 스트레치형 또는 열린 사슬을 갖는 일부 SMIP™ 분자는 접힌 도메인의 단순한 재회합에 의해 그들의 천연 구조로 다시 접히도록 시도할 수 있음이 고려된다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 도메인 재회합이 2개의 이웃하는 SMIP™ 분자들 사이에서 일어날 수 있어서, 도메인-스와핑된 이량체를 생성시킨다. 그러한 분자간 스와핑은 전파할 수 있어서, 보다 큰 응집체, 예를 들어 삼량체, 사량체 또는 다량체를 생성한다 (도 3b 및 3c 참조).
단백질 제제
본원에 기재된 방법에서 사용되는 단백질 제제는 임의의 생체내 또는 시험관내 단백질 발현 시스템으로부터 얻을 수 있다. 본 발명에 적합한 단백질 제제에 대한 예시적인 공급원은 관심있는 단백질을 발현하는 재조합 세포주를 배양한 것으로부터, 또는 예를 들어, 생성물-생산 세포, 세균, 진균 세포, 곤충 세포, 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포, 트랜스제닉 동물 또는 동물 세포의 세포 추출물, 또는 동물의 혈청, 복수액, 하이브리도마 또는 골수종 상등액으로부터 유래된 조건화 배양 배지를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 세균 세포는 에셔리키아 콜라이 (Escherichia coli) 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 이. 콜라이 균주의 예는 HB101, DH5α, GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, 및 외래 DNA를 절단하지 못하는 임의의 이. 콜라이 균주를 포함한다. 사용할 수 있는 적합한 진균 숙주 세포는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피치아 패스토리스 (Pichia pastoris) 및 아스페르길루스 (Aspergillus) 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 곤충 세포는 S2 슈나이더 (Schneider) 세포, D. Mel-2 세포, SF9, SF21, High-5™, Mimic™-SF9, MG1 및 KC1 세포를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 적합한 예시적인 재조합 세포주는 BALB/c 마우스 골수종 세포주, 인간 망막모세포 (PER.C6), 원숭이 신장 세포, 인간 배아 신장 세포주 (293), 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK), 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO), 마우스 셀토리 세포, 아프리카 초록 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 인간 경부 암종 세포 (HeLa), 개 신장 세포, 버팔로 래트 간 세포, 인간 폐세포, 인간 간세포, 마우스 유방 종양 세포, TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 및 인간 간암주 (Hep G2)를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
관심있는 단백질은 당업계에 공지된 다양한 벡터 (예를 들어, 바이러스 벡터)를 사용하여 발현될 수 있고, 세포는 당업계에 공지된 다양한 조건 하에 배양할 수 있다 (예를 들어, 유가식 (fed-batch)). 단백질을 생산하기 위해 세포를 유전 공학 처리하는 다양한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausabel et al., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)] 참조).
SMIP™ 단백질을 발현하는 세포는 당업계에 공지된 다양한 세포 배양 배지 내에서 배양할 수 있다. 예시적인 세포 배양 배지는 DMEM, DMEM/F12, 햄 (Ham's) F-10, 햄 F-12, F-12K, 미디엄 (Medium) 199, MEM, RPMI 1640, 에임스 (Ames'), BGJb, 클릭 (Click's), CMRL-1066, 피셔스 (Fischers), GMEM, IMDM, L-15, 맥코이 (McCoy's) 5A 변형, NCTC, 스윅 (Swik's) S-77, 웨이마우쓰 (Waymouth), 윌리엄 (William's) 미디엄 E에 기초할 수 있다. 적합한 세포 배양 배지에는 혈청이 없을 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 세포 배양 배지는 태소 혈청, 신생 소 혈청, 송아지 소 혈청, 및 성체 소 혈청, 닭, 염소, 말, 돼지, 토끼, 양, 인간 혈청, 혈청 대체물 또는 소 양수를 포함하고 이로 제한되지 않는 혈청/배양 배지 첨가제를 포함할 수 있다. 적합한 세포 배양 배지는 L-글루타민 용액, L-알바니-L-글루타민 용액, 비-필수 아미노산 용액, 페니실린, 스트렙토마이신을 포함하고 이로 제한되지 않는 보충제 및/또는 항생제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 조질 단백질 제제를 정제하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 배양된 세포로부터 분비된 단백질을 함유하는 조건화 배양 배지로부터 단백질을 직접 정제하기 위해 사용될 수 있다. 조건화 배양 배지는 소규모 배양 (예를 들어, 진탕 플라스크, 웨이브백 (wavebag)), 또는 시드 (seed) 생물반응기 또는 생산 생물반응기 (예를 들어, 250L, 600L, 2500L, 또는 6000L 생물반응기)로부터 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 단백질-함유 세포로부터 제조된 조질 세포 용해물로부터 세포내 발현된 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 관심있는 단백질을 함유하는 혈청, 유즙, 또는 다른 유체로부터 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 부분적으로 정제된 제제, 예를 들어 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출액 또는 유동-관통액, 또는 저장 또는 제형화 공정으로부터 중간 단백질 제제로부터 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 봉입체 (예를 들어, 세균, 바이러스, 식물 세포 또는 임의의 다른 종류의 봉입체) 내에서 발현된 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 봉입체 내에서 발현된 단백질은 대개 응집체를 형성하고, 이는 정제에 대해 도전이 된다. 따라서, 본 발명은 봉입체 내에서 발현된 단백질을 정제하기 위해 특히 유용할 수 있다. 봉입체로부터 단백질의 정제는 대체로 먼저 세균 또는 다른 종류의 세포로부터 봉입체를 추출한 후 정제된 봉입체를 가용화하는 것을 필요로 한다. 봉입체 추출 및 가용화의 다양한 방법이 당업계에 잘 공지되어 있고 본 발명에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 강한 변성제 (예를 들어, 우레아 및 구아니딘 염산염), 변경된 pH 및/또는 온도, 물리적 파괴 (예를 들어, 초음파분해 등)가 특히 봉입체를 추출 및/또는 가용화하기 위해 사용될 수 있다. 봉입체 추출 및/또는 가용화 공정은 잘못 접힌 단백질을 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 봉입체 추출물은 본 발명에 따른 크로마토그래피 컬럼에 직접 로딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 봉입체로부터 추출된 단백질은 먼저 리폴딩 (refolding) 공정으로 처리된 후 본원에 기재된 크로마토그래피 단계로 처리된다. 일부 실시양태에서, 리폴딩 공정은 폴딩 버퍼 내로 단백질의 투석 또는 희석을 포함할 수 있다. 다양한 폴딩 버퍼가 당업계에 잘 공지되어 있고 본 발명에서 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 바람직하지 않은 단백질 변이체, 예를 들어 응집된 단백질, 예를 들어, 고분자량 종, 저분자량 종 및 단편, 및 탈아미드화 종; 정제되는 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터의 다른 단백질; 숙주 세포 DNA; 세포 배양 배지로부터의 성분, 선행 정제 단계 동안 샘플 내로 침출되는 친화도 크로마토그래피에 사용된 흡착제의 일부인 분자, 예를 들어, 단백질 A 및 단백질 G; 내독소; 핵산; 바이러스, 또는 임의의 상기한 것의 단편을 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 불순물을 함유하는 제제로부터 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명은 HMW 응집체를 제거하기 위해 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, 출발 단백질 제제는 적어도 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%의 HMW 응집체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 출발 단백질 제제는 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% 미만의 HMW 응집체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 출발 제제는 HMW 응집체를 상기 백분율의 조합 범위 (예를 들어, 약 4-95%, 5-70%, 10-60%, 4-30%, 4-25%, 4-20%, 4-15%, 4-10%, 및 상기 확인된 백분율의 임의의 조합)로 함유할 수 있다. 본원에서 사용될 때, 용어 "고분자량 (HMW) 응집체"는 적어도 2개의 단백질 단량체들의 회합을 나타낸다. 본 발명의 목적에서, 단량체는 임의의 생물학적 활성 형태의 관심있는 단백질의 단일 단위를 나타낸다. 예를 들어, 소형 모듈형 면역약제 단백질의 단량체는 SMIP™ 단백질의 단량체성 폴리펩티드, 또는 동종이량체, 또는 분리가능한 이량체, 또는 다가 복합체의 단위일 수 있다. 회합은 공유, 비-공유, 디술피드, 비-환원성 가교결합, 또는 다른 메카니즘에 의할 수 있다.
일부 실시양태에서, 적절한 단백질 제제는 수거 처리에 의해 얻을 수 있다. 실시예에 논의된 바와 같이, 조건화 배지는 생산 생물반응기로부터 원심분리를 통해 (예를 들어, 디스크 스택 (disc stack) 원심분리 (DSC)에 의해) 수거될 수 있다. 원심분리 단계는 분비된 단백질 (예를 들어, SMIP™)을 함유하는 조건화 배지로부터 세포 및 세포 파편을 분리할 수 있다. 일부 실시양태에서, DSC 후에, 내용물을 패드 (pad) 여과 기구에 적용한 후, 여과액 용기 (vessel) 또는 백 내로 여과할 수 있다. 일부 실시양태에서, DSC 및 친화도 크로마토그래피 단계 사이의 공정내 (in-process) 보유 기간 동안 산성 종의 생성을 감소시키기 위해 Hepes/EDTA 버퍼 용액을 여과된 농축액 풀에 첨가할 수 있다. 추가로, 메탈로프로테아제 활성, 특정 세린 프로테아제 또는 다른 프로테아제 활성을 억제하기 위해 프로테아제 억제제, 예를 들어 EDTA 또는 이미다졸을 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 프로테아제 억제제를 단백질 제제에 약 0.001 μM 내지 약 100 mM의 양으로 첨가할 수 있다. 프로테아제 억제제(들)은 단백질 A 친화도 크로마토그래피 전에 및/또는 동안 단백질 제제에 첨가할 수 있다. 프로테아제 억제제 (예를 들어, EDTA)의 첨가는 또한 단백질 A 침출을 감소시킬 수 있다. 단백질 A 침출을 감소시키기 위해 온도 및 pH와 같은 다른 조건을 또한 조정할 수 있다. 단백질 A 침출을 감소시키기 위한 방법 및 조건은 본원에 참고로 포함시킨 미국 특허 출원 공개 20050038231에 상세히 설명되어 있다.
정제 방법
본 발명에 따른 정제 공정은 하나 이상의 크로마토그래피 단계 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 또는 이온 교환 크로마토그래피)를 수반한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 정제 방법은 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 단계를 수반한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 정제 방법은 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피와 조합한 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 단계를 수반한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 막 여과 단계 (예를 들어, 한외여과, 정용여과, 및/또는 최종 여과)를 추가로 포함한다. 예시적인 정제 공정을 실시예 섹션에 상세히 설명한다.
친화도 크로마토그래피
친화도 크로마토그래피 단계의 1차 목적은 출발 제제 (예를 들어, 특히 무세포 조건화 배지, 세포 용해물, 봉입체 추출물)로부터 생성물 포획 및 공정-유래된 불순물 (예를 들어, 숙주 세포 DNA 및 숙주 세포 단백질, 배지 성분, 및 외래 물질)로부터 관심있는 단백질의 분리를 포함한다.
따라서, 본 발명에 적합한 친화도 크로마토그래피는 SMIP™ 단백질에 결합할 수 있는 흡착제의 사용을 수반한다. 예를 들어, 적합한 흡착제는 불변 항체 면역글로불린 도메인에 결합하는 단백질일 수 있다. 적합한 흡착제는 단백질 G, 단백질 LG, 또는 단백질 A일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 흡착제는 가변 항체 면역글로불린 도메인 (예를 들어, VH3 도메인, 또는 VH3 도메인에 상동성인 도메인)에 결합하는 단백질이다. 흡착제는 아가로스, 세파로즈, 실리카, 콜로디온 숯 (collodion charcoal), 모래 및 임의의 다른 적합한 물질을 비롯한 임의의 적합한 고체 지지체에 고정될 수 있다. 그러한 물질은 당업계에 잘 공지되어 있다. 흡착제를 고체 지지체에 고정하기 위해 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 단백질을 적합한 고체 지지체에 고정시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ostrove (1990), in Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182: 357-371] 참조).
일부 실시양태에서, 적합한 친화도 크로마토그래피 단계는 단백질 A 크로마토그래피 컬럼 또는 단백질 G 크로마토그래피 컬럼을 사용할 수 있다. 단백질 A 크로마토그래피 컬럼은 예를 들어 프로셉 (PROSEP)-A™ (밀리포어 (Millipore, 영국)), 단백질 A 세파로즈 패스트 플로우 (FAST FLOW)™ (지이 헬스케어 (GE Healthcare, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)), 토요펄™ 650M 단백질 A (토소하스 코. (TosoHass Co., 미국 펜실배니아주 필라델피아)), 또는 MabSelect™ 단백질 A 컬럼 (지이 헬스케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이))일 수 있다.
단백질 제제를 친화도 크로마토그래피 컬럼에 적용하기 전에, pH, 이온 강도, 및 온도와 같은 파라미터를 조정하고 일부 경우에 상이한 종류의 물질을 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 단백질 생성물의 결합 및 정제를 위해 적합한 특징을 부여하는 용액 (예를 들어, pH, 이온 강도 등을 조정하기 위한, 또는 세제의 도입을 위한 버퍼)으로 세척함으로써 친화도 크로마토그래피 컬럼의 평형화를 수행하는 것은 선택적인 단계이다.
일부 실시양태에서, 단백질 A 컬럼은 염, 예를 들어, 약 100 mM 내지 약 150 mM 인산나트륨, 약 100 mM 내지 약 150 mM 아세트산나트륨, 및 약 100 mM 내지 약 150 mM NaCl을 함유하는 용액을 사용하여 평형화시킬 수 있다. 평형화 버퍼의 pH는 약 6.0 내지 약 8.0일 수 있다. 한 실시양태에서, 평형화 버퍼의 pH는 약 7.5이다. 평형화 버퍼는 약 10 mM 내지 약 50 mM Tris를 또한 함유할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 버퍼는 약 20 mM Tris를 함유할 수 있다.
단백질 제제를 로딩한 후, 결합된 컬럼을 세척 용액을 사용하여 세척할 수 있다. 적합한 세척 용액은 염 (예를 들어, Hepes, 염화나트륨, 염화칼슘, 염화마그네슘), 아르기닌, 히스티딘, Tris 및/또는 다른 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 세척 용액은 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유할 수 있다. 적합한 아르기닌 유도체는 아세틸 아르기닌, 아그마틴, 알긴산, N-알파-부티로일-L-아르기닌, 또는 N-알파-피발로일 아르기닌일 수 있지만 그로 제한되지 않는다. 세척 용액 내의 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 적합한 농도는 약 0.1 M 내지 약 2.0 M (예를 들어, 0.1 M, 0.4 M, 0.5 M, 1.0 M, 1.5 M, 또는 2.0 M), 또는 약 0.5 M 내지 약 1.0 M (예를 들어, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 또는 1.0 M)이다. 친화도 크로마토그래피에서 아르기닌 또는 아르기닌 유도체의 사용은 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 2008/0064860에 상세히 설명되어 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 세척 용액은 이미다졸 또는 이미다졸 유도체를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 세척 용액은 무질서유발 (chaotropic) 시약 (예를 들어, 우레아, 티오시안산나트륨, 및/또는 구아니디늄 염산염)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 세척 용액은 소수성 변형제 (예를 들어, 유기 용매, 예를 들어 에탄올, 메탄올, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜, 프로판올, 부탄올 및 이소프로판올)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 세척 용액은 세제 (예를 들어, 비이온성 세제 및/또는 이온성 세제)를 함유할 수 있다.
세척 용액의 pH는 일반적으로 약 4.5 내지 약 8.0, 예를 들어, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0이다. 일부 경우에, 세척 용액의 pH는 5.0보다 크고 약 8.0보다 작고, 예를 들어, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 및 8.0이다. 세척 용액은 20 mM 내지 50 mM Tris (예를 들어, 20 mM, 30 mM, 40 mM 또는 50 mM)를 함유할 수 있다.
생성물은 세척된 컬럼, 예를 들어, 단백질 A 컬럼으로부터 용출 버퍼에 의해 용출될 수 있다. 일반적으로, 적합한 용출 버퍼는 Hepes, 인산, 글리신, 글리실글리신, 하나 이상의 유기산 (예를 들어, 아세트산, 시트르산, 포름산, 락트산, 타르타르산, 말산, 말론산, 프탈산, 살리실산), 및/또는 아르기닌을 함유할 수 있다. 적합한 용출 버퍼는 염 (예를 들어, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄, 칼슘염, 및/또는 마그네슘염)을 추가로 함유할 수 있다. 적합한 염 농도는 0 mM 내지 1 M (예를 들어, 0 mM 내지 500 mM, 0 mM 내지 100 mM, 0 mM 내지 50 mM)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 용출 버퍼는 약 15 mM 내지 약 100 mM NaCl을 함유한다. 일부 실시양태에서, 용출 버퍼 내의 NaCl 농도는 4개 수준 (예를 들어, 0 mM, 15 mM, 30 mM, 및 50 mM)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 용출 버퍼는 약 20 mM 내지 약 200 mM 아르기닌 또는 아르기닌 유도체를 함유할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 용출 버퍼는 20 mM 내지 200 mM 글리신을 함유할 수 있다. 용출 버퍼는 약 20 mM 내지 약 100 mM HEPES를 또한 함유할 수 있다. 용출 버퍼는 약 25 mM 내지 약 100 mM 아세트산을 또한 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용출 버퍼는 시트르산 (예를 들어, 약 10 mM 내지 약 500 mM 시트르산)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 용출 버퍼는 글리실글리신 (예를 들어, 약 10-50 mM, 약 50-100 mM, 또는 약 100-200 mM)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 용출 버퍼는 무질서유발 시약 (예를 들어, 우레아, 티오시안산나트륨, 및/또는 구아니디늄 염산염)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 용출 버퍼는 알킬 글리콜 (예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 헥사에틸렌 글리콜)을 함유할 수 있다. 용출 버퍼의 pH는 약 2.5 내지 약 4.0일 수 있다. 한 실시양태에서, 용출 버퍼의 pH는 약 3.0이다.
친화도 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용출액은 중화 버퍼에 의해 중화시킬 수 있다. 적합한 중화 버퍼는 Tris, Hepes, 및/또는 이미다졸을 함유할 수 있다.
용출 후에, 친화도 크로마토그래피 컬럼은 임의로 단백질의 용출 후 세척, 즉, 스트리핑 및/또는 재생될 수 있다. 상기 절차는 고체상의 표면 상에 불순물의 축적을 최소화하고/하거나 미생물에 의한 생성물 오염을 피하도록 매트릭스를 멸균하기 위해 대개 규칙적으로 수행된다. 스트리핑 및/또는 재생된 컬럼은 반복적으로 사용할 수 있다.
버퍼 성분은 당업자의 지식에 따라 조정할 수 있다. 샘플 버퍼 조성물 범위를 아래 실시예에 제공한다. 모든 버퍼 또는 단계가 필요한 것이 아니라, 단지 예시를 위해 제공한다. 실시예에 설명된 바와 같은 초고속 스크리닝을 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 위한 버퍼 조건을 효율적으로 최적화하기 위해 사용할 수 있다.
이온 교환 크로마토그래피
이온 교환 크로마토그래피 단계의 1차 목적은 공정-유래된 불순물 (예를 들어, 침출된 단백질 A, 숙주 세포 DNA 및/또는 단백질, 외래 물질) 및 생성물-관련 불순물, 예를 들어 HMW 응집체의 제거를 포함한다.
일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피를 본 발명에 따라 친화도 크로마토그래피와 조합으로 사용한다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 양이온 교환 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피)를 친화도 크로마토그래피 대신에 사용할 수 있다.
크로마토그래피를 위한 음이온성 또는 양이온성 지지체를 형성하기 위해 다양한 음이온성 또는 양이온성 치환체를 매트릭스에 부착할 수 있다. 음이온성 교환 치환체는 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸 아크릴아미드 (TMAE), 4원 아미노에틸 (QAE) 및 4원 아민 (Q)기를 포함한다. 양이온성 교환 치환체는 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 술포프로필 (SP), 인산염 (P) 및 술포네이트 (S)를 포함한다. 폴리에틸렌이민 관능기를 가진 이온 교환 수지, 예를 들어 POROS® HQ50은 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티)로부터 이용가능하다. 고정된 재조합 단백질 A 관능기를 가진 교환 수지, 예를 들어 POROS® A50은 어플라이드 바이오시스템즈 (미국 캘리포니아주 포스터 시티)로부터 이용가능하다. 셀룰로직 이온 교환 수지, 예를 들어 DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52는 와트만 엘티디. (Whatman Ltd. 영국 켄트주 메이드스톤)로부터 이용가능하다. 세파덱스 (Sephadex)-기반 및 가교결합된 이온 교환 수지가 또한 공지되어 있다. 예를 들어, CAPTO Q, DEAE-, QAE-, CM-, 및 SP-세파덱스, 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-세파로즈 (예를 들어, DEAE 세파로즈 FF, Q 세파로즈 FF 및 Q 세파로즈 XL), 및 세파로즈는 모두 지이 헬스케어 (미국 뉴저지주 피스카타웨이)로부터 이용가능하다. 추가로, DEAE 및 CM 유도체화 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체, 예를 들어 토요펄™ DEAE-650S 또는 M, 토요펄™ CM-650S 또는 M, 토요펄™ 기가캡 Q-650, 및 토요펄™ 기가캡 CM-650은 토소 하스 코. (미국 펜실배니아주 필라델피아)로부터 이용가능하다. 이온 교환 모노리스 크로마토그래피 지지체, 예를 들어 CIM®-DISK를 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있고, 바이아 세퍼레이션즈 (Bia Separations, 오스트리아)로부터 이용가능하다. 이온 교환 막 흡착기, 예를 들어 머스탕® Q 및 머스탕® E (폴 코퍼레이션 (Pall Corporation, 미국 뉴욕주)), 사르토빈드® Q (싸토리우스 스테딤 바이오테크 에스. 에이. (Sartorius Stedim Biotech S.A., 프랑스)), 및 크로마솔브™ (밀리포어 (Millipore, 미국 매사추세츠주))를 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 음이온 교환 컬럼을 사용한다. 음이온 교환 컬럼을 단백질과 접촉하기 전에 먼저 고염 (high salt) 버퍼, 이어서 저염 (low salt) 버퍼로 평형화시킬 수 있다. 전형적으로, SMIP™은 컬럼에 단지 약하게 결합하고, 이는 대다수의 생성물이 관통 유동하는 반면 음전하를 가진 불순물, 예를 들어 숙주 세포 DNA 및 HCP는 강하게 결합하고 보존되도록 허용한다. 이어서, 수지에 약하게 결합된 추가의 생성물을 수집하기 위해, 컬럼을 평형화 버퍼로 세척할 수 있다. 일단 생성물이 컬럼으로부터 제거된 후, 고염 버퍼를 사용하여 불순물을 스트리핑할 수 있다. 수지를 재생하고, 살균한 후, 에탄올 용액 내에 저장할 수 있다.
일부 실시양태에서, 불순물 용적 및 이온 교환 크로마토그래피에 사용된 수지의 수명을 증가시키기 위해, 이온 교환 크로마토그래피 전에 흡착성 심층 필터를 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 프랙토겔® EMD TMAE Hi-Cap(M) 수지는 합성 메타크릴레이트 중합체 베이스를 갖는 강한 음이온 교환 수지이다. 얽힌 (intertwined) 중합체 덩어리로부터 형성된 공극은 어림 크기가 800 옹스트롬이다. 표면은 중합체 내의 에테르 연결기로 인해 강한 친수성이다. 긴 선형 중합체 사슬은 관능적 리간드를 보유한다. 이들 중합체 사슬은 촉수로서 알려져 있다. 모든 촉수는 메타크릴레이트 백본의 히드록실기에 공유 부착된다. 추가의 촉수 수지, 예를 들어 프랙토겔® EMD TMAE(M), 프랙토겔® EMD TMAE(S), 및 프랙토프렙® TMAE를 또한 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 흡착성 심층 프리필터 (pre-filter)의 사용은 TMAE 컬럼을 단백질 로드 (예를 들어, ProA 피크 풀) 내의 불순물로부터 보호할 수 있다. 아마도 이들 불순물은 TMAE 컬럼의 결합 부위를 소모 또는 차단할 수 있어서, 불순물에 대한 수지 용적을 감소시키는 것 같다. 이들 불순물은 예를 들어, 흡착성 심층 필터를 통한 전여과 또는 단백질의 침전에 의해 제거할 수 있다.
용출 후에, 이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 단백질의 용출 후에 임의로 세척, 즉, 스트리핑 및/또는 재생될 수 있다. 상기 절차는 고체상의 표면 상에 불순물의 축적을 최소화하고/하거나 미생물에 의한 생성물 오염 가능성을 감소시키기 위해 대개 규칙적으로 수행된다. 일부 실시양태에서, 이온 교환 컬럼은 10 mM 내지 2M NaOH의 농도를 이용하는 NaOH 용액를 사용한 처리에 의해 재생된다. 스트리핑 및/또는 재생된 컬럼은 반복적으로 사용할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 심층 여과는 단백질 제제 내의 불순물을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 심층 여과 매질은 셀룰로스 섬유, 규조토, 및 양이온성 수지 바인더로 이루어진 고도 다공질 필터이다. 심층 필터는 불순물을 셀룰로스 섬유를 통한 체질, 규조토에 소수성 흡착, 및 양이온성 바인더에 이온성 흡착에 의해 제거할 수 있다. 심층 필터는 예를 들어, 두께가 0.5 cm, 1 cm, 1.5 cm, 2.0 cm일 수 있다.
일부 실시양태에서, 침전을 유도하고/하거나 이온 교환 컬럼에 대한 단백질 흡착을 향상시키기 위해 하나 이상의 첨가제를 단백질 제제에 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 침전은 불순물의 양을 감소시키기 위해 첨가제에 의해 유도할 수 있다. 다양한 단백질 침전 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 염석에 의해 (예를 들어, 중성 염을 사용하여) 침전시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질은 유기 용매 (예를 들어, 메탄올, 에탄올)의 첨가에 의해 침전시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 표면에 대한 단백질 결합 및/또는 침전을 촉진하기 위해 비이온성 유기 중합체를 사용할 수 있다. 다양한 비이온성 유기 중합체가 상업상 이용가능하고, 본 발명에서 사용할 수 있다. 그 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 및 폴리비닐피롤리돈을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, PEG를 첨가제로서 사용한다. 다양한 분자량을 갖는 PEG를 본 발명에서 사용할 수 있다. 적합한 PEG의 평균 중합체 분자량은 예를 들어 약 100 내지 약 20,000 달톤일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 PEG는 평균 분자량이 200-12,000, 400-20,000, 400-1000, 200-1000, 400-2000, 1000-5000, 800-8,000, 1000-10,000, 2,000-12,000 달톤일 수 있다. 일부 실시양태에서, 예시적인 PEG는 평균 분자량이 예를 들어 200, 400, 800, 1000, 2,000, 4,000, 6,000, 8000, 10,000, 12,000, 14,000, 16,000, 18,000, 20,000 달톤 등인 PEG를 포함한다. PEG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 보다 저분자량 PEG는 보다 고분자량 PEG와 유사한 효과를 달성하기 위해 일반적으로 보다 높은 농도를 요구할 것이다. 예시적인 적합한 PEG 농도는 0-25% (예를 들어, 0-6%, 0-9%, 0-12%, 0-15%, 0-18%, 0-20%, 3-9%, 3-15%, 6-12%, 6-20%, 또는 6-25%)일 수 있다. PEG 또는 다른 유기 중합체는 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다.
PEG의 결합 또는 침전 효과는 일반적으로 단백질의 분자량에 의존적인 것이 고려된다. 전형적으로, PEG 효과는 보다 큰 단백질에 대해 더 크다. 예를 들어, 단량체성 단백질 또는 LMW 불순물의 동일한 양의 향상된 결합을 생성시키기 위해 필요한 PEG의 농도에 비해, 보다 큰 단백질 (예를 들어, HMW 응집체) 및 바이러스의 결합을 향상시키기 위해 더 낮은 농도의 주어진 분자량의 PEG가 일반적으로 사용된다. 따라서, 응집체, 복합체 및 다른 큰 분자 오염물의 체류는 일반적으로 그들이 유도되는 응집되지 않은 형태의 단백질보다 더 큰 정도로 향상될 수 있다. 따라서, 약한 분배 크로마토그래피를 통해 불순물, 특히 약하게 결합하는 HMW 응집체의 제거를 향상시키기 위해 PEG 또는 다른 비이온성 중합체 변형이 특히 유용하다. 일부 실시양태에서, PEG는 음이온 교환 크로마토그래피 전에, 그러나 친화도 크로마토그래피 단계 후에 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단백질 침전을 위한 비이온성 유기 중합체의 사용은 단백질 변성을 감소 또는 제거하고, 또한 세제 및 다른 불순물을 제거하는 것을 도울 수 있다. 일부 실시양태에서, 생성물을 농축시키기 위해 첨가제 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜)를 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 침전물은 원심분리, 여과, 또는 당업계에 공지된 다른 분리 방법에 의해 분리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 침전물은 오염물, 예를 들어 HMW 응집체를 함유한다. 일부 실시양태에서, 오염물-함유 침전물을 (예를 들어, 여과에 의해) 제거하는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, SMIP™이 침전물 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, SMIP™-함유 침전물을 재현탁 버퍼에 용해시키는 것이 바람직하다. 일부 실시양태에서, 재현탁 버퍼는 이온 교환 컬럼 상으로의 직접 로딩에 적합한 pH 및/또는 전도율을 갖는다.
실시예에 설명된 바와 같은 초고속 스크리닝을 이온 교환 크로마토그래피를 위한 버퍼 조건을 효율적으로 최적화하기 위해 사용할 수 있다.
히드록시아파타이트 크로마토그래피
세라믹 히드록시아파타이트 (cHA) 단계의 1차 목적은 분자량 (HMW) 응집체, 침출된 단백질 A, 침전 또는 흡착제에 대한 결합을 촉진하기 위해 사용된 첨가제 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜), 및 숙주 세포-유래 불순물, 예를 들어 DNA 및 HCP의 제거이다. 약 중성 pH 및 낮은 이온 강도의 인산염을 채운 cHA 수지를 단량체 단백질 생성물 (예를 들어, SMIP™) 및 HMW 응집체 모두에 결합하도록 사용할 수 있다. HMW 응집체는 cHA 수지에 단량체보다 더 단단히 결합하므로, 미산성 내지 미염기성 pH에서 적합한 이온 강도를 갖는 용출 버퍼를 사용하여 단량체를 선택적으로 용출시킬 수 있다. HMW 응집체는 임의로 후속적으로 중성 pH에서 훨씬 더 높은 이온 강도 및 보다 높은 인산염 농도 버퍼를 사용하여 수지로부터 세척 제거할 수 있다. 실시예에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 단백질 제제로부터 HMW 응집체를 효과적으로 제거할 수 있는 cHA 작동 조건을 밝혀냈다. 일부 실시양태에서, HMW 응집체의 백분율은 로드 물질 내에서 5% 초과 (예를 들어, 5%, 10%, 15%. 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%)에서 정제된 단백질 생성물 내에서 4% 미만 (예를 들어, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2%, 0.1% 미만)으로 감소할 수 있다. 일부 실시양태에서, HMW 응집체는 cHA 크로마토그래피 후에 적어도 약 2배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배만큼 감소할 수 있다.
1. 히드록시아파타이트 수지
다양한 히드록시아파타이트 크로마토그래피 수지가 상업상 이용가능하고, 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 히드록시아파타이트는 결정질 형태로 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 적합한 히드록시아파타이트는 입자를 형성하도록 덩어리지고 고온에서 안정한 다공질 세라믹 덩어리로 소결된 것일 수 있다. 히드록시아파타이트의 입자 크기는 넓게 변할 수 있지만, 전형적인 입자 크기는 직경 1 ㎛ 내지 1,000 ㎛이고, 10 ㎛ 내지 100 ㎛ (예를 들어, 20 ㎛, 40 ㎛, 60 ㎛, 또는 80 ㎛)일 수 있다.
많은 크로마토그래피 수지를 cHA 컬럼의 제조에 사용할 수 있고, 가장 광범하게 사용되는 것은 타입 I 및 타입 II 히드록시아파타이트이다. 타입 I은 높은 단백질 결합능 및 산성 단백질에 대한 보다 우수한 용적을 갖는다. 타입 I은 소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제에 특히 적합하다. 그러나, 타입 II는 보다 낮은 단백질 결합능을 갖지만, 핵산 및 특정 단백질의 보다 우수한 분해능을 갖는다. 타입 II 물질은 또한 알부민에 대해 매우 낮은 친화도를 갖고, 많은 종 및 클래스의 면역글로불린의 정제에 특히 적합하다. 특정 히드록시아파타이트 종류의 선택은 당업자가 결정할 수 있다.
본 발명은 컬럼 내에 또는 연속 애뉴얼 (annual) 크로마토그래프 내에 느슨하게 충전된 히드록시아파타이트 수지와 함께 사용할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세라믹 히드록시아파타이트 수지를 컬럼 내에 충전한다. 컬럼 치수의 선택은 당업자가 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 층 (bed) 높이가 약 20 cm인 적어도 0.5 cm의 컬럼 직경을 소규모 정제를 위해 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 약 35 cm 내지 약 60 cm의 컬럼 직경을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 60 cm 내지 85 cm의 컬럼 직경을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, pH 9.0에서 200 mM Na2HPO4 용액 중 세라믹 히드록시아파타이트 수지의 슬러리를, 약 4 cm/min의 불변 유속에서 또는 중력으로 컬럼을 충전하기 위해 사용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 수지는 단백질의 용출 후에 임의로 세척, 즉, 스트리핑 및/또는 재생될 수 있다. 스트리핑 및/또는 재생된 컬럼은 반복적으로 사용할 수 있다.
2. 작동 버퍼 및 조건
히드록시아파타이트 수지를 로드 물질과 접촉시키기 전에, pH, 이온 강도, 및 온도와 같은 파라미터를 조정하고 일부 경우에 상이한 종류의 물질을 첨가하는 것이 중요할 수 있다. 따라서, 관심있는 단백질 (예를 들어, SMIP™ 단백질)의 정제를 위해 필요한 특징을 부여하는 용액 (예를 들어, pH, 이온 강도 등을 조정하기 위한, 또는 세제의 도입을 위한 버퍼)으로 세척함으로써 히드록시아파타이트 매트릭스의 평형화를 수행하는 것은 선택적인 단계이다.
일부 실시양태에서, 히드록시아파타이트 매트릭스는 미염기성 내지 미산성 pH에서 0.01 내지 2.0 M NaCl을 함유하는 용액을 사용하여 평형화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 평형화 버퍼는 인산나트륨, 인산칼륨, 및/또는 인산리튬을 함유할 수 있다. 예를 들어, 평형화 버퍼는 1 내지 20 mM 인산나트륨 (예를 들어, 1 내지 10 mM 인산나트륨, 2 내지 5 mM 인산나트륨, 2 mM 인산나트륨, 또는 5 mM 인산나트륨)을 함유할 수 있다. 평형화 버퍼는 0.01 내지 0.2 M NaCl (예를 들어, 0.025 내지 0.1 M NaCl, 0.05 내지 0.2 M NaCl, 0.05 내지 0.1 M NaCl, 0.05 M NaCl, 또는 0.1 M NaCl)을 함유할 수 있다. 로드 버퍼의 pH는 6.2 내지 8.0 (예를 들어, 6.6 내지 7.7, 6.5 내지 7.5, 6.8, 7.0, 7.1, 7.2, 또는 7.3)일 수 있다. 평형화 버퍼는 0 내지 200 mM 아르기닌 (예를 들어, 50 mM, 100 mM, 120 mM 아르기닌, 140 mM, 160, 또는 180 mM 아르기닌)을 또한 함유할 수 있다. 평형화 버퍼는 0 내지 200 mM HEPES (예를 들어, 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 120 mM, 140 mM, 160 mM, 180 mM HEPES)를 함유할 수 있다. 1회 초과의 평형화 단계를 수행할 수 있다.
다양한 단백질 제제를 로드 물질 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피로부터 피크 풀, 이온 교환 크로마토그래피로부터의 유동-관통액 또는 미처리 제제)로서 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 로드를 적절한 로딩 버퍼로 버퍼 교환할 수 있다. 예를 들어, 단백질 제제를 미산성 내지 미염기성 pH에서 0.2 내지 2.5 M NaCl을 함유하는 로딩 버퍼로 버퍼 교환할 수 있다. 예를 들어, 로딩 버퍼는 1 내지 20 mM 인산나트륨 (예를 들어, 2 내지 8 mM 인산나트륨, 3 내지 7 mM 인산나트륨, 또는 5 mM 인산나트륨)을 함유할 수 있다. 로딩 버퍼는 0.01 내지 0.2 M NaCl (예를 들어, 0.025 내지 0.1 M NaCl, 0.05 내지 0.2 M NaCl, 0.05 내지 0.1 M NaCl, 0.05 M NaCl, 또는 0.1 M NaCl)을 함유할 수 있다. 로딩 버퍼의 pH는 6.4 내지 7.6 (예를 들어, 6.5 내지 7.0, 또는 6.6 내지 7.2)일 수 있다.
로딩은 단백질 제제를 충전된 층 컬럼 (고체상 매트릭스를 함유하는 유동화/팽창된 층 컬럼)에 작용하고/하거나 단백질 제제를 히드록시아파타이트 수지와, 고체상 매트릭스가 특정 시간 동안 용액과 혼합될 수 있는 단순한 배치 작업으로 혼합함으로써 수행할 수 있다.
로딩 후에, 히드록시아파타이트 수지는 느슨하게 결합된 불순물을 제거하기 위해 임의로 세척 버퍼 (예를 들어, 인산염 버퍼)를 사용하여 세척할 수 있다. 사용할 수 있는 세척 버퍼는 히드록시아파타이트 수지의 성질에 의존할 것이고, 당업자가 결정할 수 있다.
선택적인 세척 절차 후에 결합된 생성물을 컬럼으로부터 용출할 수 있다. 컬럼으로부터 SMIP™ 단백질의 단량체를 효과적으로 용출하기 위해, 본 발명에서는 미산성 내지 미염기성 pH에서 고이온 강도 인산염 버퍼를 사용한다. 일부 실시양태에서, 용출 버퍼는 인산나트륨, 인산칼륨, 및/또는 인산리튬을 함유할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용출 버퍼는 1 내지 100 mM 인산나트륨 (예를 들어, 2 내지 50 mM, 2 내지 40 mM, 2 내지 35 mM, 2 내지 32 mM, 2 내지 30 mM, 4 내지 35 mM, 4 내지 20 mM, 10 내지 40 mM, 10 내지 35 mM, 4 내지 10 mM, 또는 2 내지 6 mM 인산나트륨)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 용출 버퍼는 2 mM, 3 mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 또는 60 mM 인산나트륨을 함유할 수 있다.
적합한 용출 버퍼는 또한 0.01 내지 2.5 M NaCl (예를 들어, 0.1 내지 2.5 M, 0.1 내지 2.0 M, 0.1 내지 1.6 M, 0.1 내지 1.2 M, 0.1 내지 1.0 M, 0.1 내지 0.8 M, 0.1 내지 0.5 M, 0.2 내지 2.5 M, 0.2 내지 1.5 M, 0.2 내지 1.2 M NaCl, 0.2 내지 1.0 M, 0.2 내지 0.8 M, 0.3 내지 1.1 M, 또는 0.2 내지 0.5 M NaCl)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 용출 버퍼는 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 500 mM, 1.0 M, 1.5 M, 2.0 M, 또는 2.5 M NaCl을 함유한다.
적합한 용출 버퍼의 pH는 6.4 내지 8.5 (예를 들어, 6.4 내지 8.0, 6.4 내지 7.8, 6.5 내지 7.7, 또는 6.5 내지 7.3)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 용출 버퍼의 pH는 6.4, 6.5, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2, 8.4, 또는 8.5)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 변하는 염 농도를 함유하는 용출 버퍼를 연속식 또는 단계식 구배로 컬럼으로부터 결합된 생성물의 용출을 위해 사용할 수 있다.
예시적인 버퍼 및 작동 조건은 실시예 섹션에 설명되어 있다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 위한 버퍼 및 작동 조건을 효율적으로 최적화하기 위해, 실시예에 설명된 바와 같은 초고속 스크린 또는 선택적 스크린 (예를 들어, 구배 용출 스크린)을 사용할 수 있다.
전형적으로, 결합 방식 cHA 크로마토그래피를 본 발명에 사용한다. 별법으로 또는 추가로, 유동-관통 방식을 사용할 수 있다. 유동-관통 방식에서, 단백질 제제를 대개 본원에 설명되는 바와 같은 적합한 로드 버퍼로 버퍼-교환한다. 이어서, 단백질 제제를 히드록시아파타이트 컬럼을 통해 유동시키는 한편, 불순물, 예를 들어 HMW 응집체는 컬럼에 결합한다. 추가의 정제된 단백질을 컬럼을 통해 유동하도록 하기 위해, 컬럼을 임의로 후속적으로 세척한다.
결합/유동-관통 방식의 조합에서, 단백질 제제는 히드록시아파타이트 컬럼을 통해 유동되고, 여기서 단백질 단량체 및 HMW 응집체는 모두 초기에 결합한다. 그러나, 로딩이 계속됨에 따라, 유입하는 HMW 응집체는 단백질 단량체보다 더 단단히 결합할 수 있고, 따라서 결합된 단량체를 치환한다. 결과적으로, 치환된 단량체는 컬럼을 통해 유동한다. 추가의 치환된 단량체가 컬럼을 통해 유동하도록 하기 위해, 컬럼을 임의로 후속적으로 세척한다.
상기 구체적으로 논의한 염 및 버퍼에 추가로, 크로마토그래피 및 로딩은 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘, 클로라이드, 플루오라이드, 아세테이트, 인산염, 시트레이트 및/또는 Tris 버퍼를 비롯한 다양한 버퍼 및/또는 염 내에서 일어날 수 있다. 그러한 버퍼 및 염의 구체적인 예는 Tris, 인산나트륨, 인산칼륨, 인산암모늄, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화암모늄, 염화마그네슘, 염화칼슘, 불화나트륨, 불화칼륨, 불화암모늄, 불화칼슘, 불화마그네슘, 시트르산나트륨, 시트르산칼륨, 시트르산암모늄, 아세트산마그네슘, 아세트산칼슘, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 또는 아세트산암모늄이다. cHA 크로마토그래피를 위한 버퍼 조건을 효율적으로 최적화하기 위해, 실시예에 설명된 바와 같은 초고속 스크린을 사용할 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 다양한 버퍼 및 용액은 내독소 및/또는 외독소가 없도록 보장하기 위해 처리될 수 있다. 특히, 정제된 단백질 제제가 제약 및/또는 임상 목적에 사용되도록 의도되면, 내독소- 및/또는 외독소-미함유 버퍼를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 버퍼 또는 용액으로부터 내독소 및/또는 외독소를 제거하기 위한 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고 본 발명에서 사용할 수 있다. 예를 들어, 버퍼 및 용액은 발열원이 제거될 수 있다. 발열원 제거는 특히 예를 들어, 산-기반 가수분해, 산화, 가열, 수산화나트륨에 의해 달성할 수 있다.
추가의 여과 단계
외래 바이러스 및 다른 오염물을 감소시키고 농축 및/또는 버퍼 교환을 위해, 추가의 막 여과 단계를 사용할 수 있다. 특히 플라노바 (Planova) 20N 바이러스 보존 여과 (VRF) 및 플라노바 35N 바이러스 보존 여과 (VRF)를 포함하고 이로 제한되지 않는 다양한 바이러스-보존 필터를 본 발명에서 사용할 수 있다. 제형화 버퍼 내에 공정 스트림을 농축 및/또는 버퍼 교환하기 위해, 다양한 한외여과 및/또는 정용여과 스키드 (skid) (예를 들어, 분자량 컷-오프 (cut-off) 10 kDa)를 사용할 수 있다. 최종 약물 물질은 임의의 잠재적인 외래 미생물 오염물 및 입자형 물질을 제거하기 위해 예를 들어, 일회용 0.2 pm 필터를 통해 통과시킬 수 있다.
정제된 SMIP ™ 단백질을 함유하는 제약 조성물
본원에 기재된 정제된 단백질 제제는 제약 용도를 위해 제형화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 정제된 SMIP™ 단백질을 4% 미만 (예를 들어, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.0%, 0.8%, 0.6%, 0.4%, 0.2, 0.1% 미만)의 HMW 응집체와 함께 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 제약 조성물은 정제된 SMIP™ 단백질을 70% 초과 (예를 들어, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98%, 99% 초과)의 생물학적 활성 단량체 형태로 존재하는 단백질과 함께 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 그러한 제약상 허용되는 담체는 제약 투여에 적합한 임의의 모든 용제, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등을 포함하고자 의도된다. 제약상 활성 물질에 대한 그러한 매질 및 물질의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 물질은 활성 화합물과 적합하지 않은 한을 제외하고는, 조성물 내에서 그의 사용이 고려된다. 보충적 활성 화합물 (본 발명에 따라 확인된 및/또는 당업계에 공지된)이 또한 약학/미생물학 업계에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 그의 의도된 투여 경로에 적합하도록 제형화된다. 투여를 위해 사용되는 용액 또는 현탁액은 당업계에 잘 공지된 성분, 예를 들어 특히 멸균 희석제, 예를 들어 주사용수, 염수 용액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용제; 항균제, 예를 들어 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이팅제, 예를 들어 에틸렌디아민테트라아세트산; 버퍼, 예를 들어 아세테이트, 시트레이트 또는 인산염 및 등장도를 조정하기 위한 물질, 예를 들어 염화나트륨 또는 덱스트로스, 및/또는 산 또는 염기, 예를 들어 염산 또는 수산화나트륨을 포함할 수 있다.
투여에 적합한 본 발명의 제형은 당업계에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 제형은 특히 캡슐, 젤라틴 캡슐, 사세 (sachet), 정제, 트로키, 로젠지, 분말, 과립, 수성 액체 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼일 수 있다. 치료제는 또한 볼러스, 연약 (electuary) 또는 페이스트 형태로 투여할 수 있다. 또 다른 예로서, 주사가능 용도에 적합한 제형은 멸균 수용액 (수용성인 경우에) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해, 적합한 담체는 생리 염수, 정균수, 크레모포르 (Cremophor) ELTM (바스프 (BASF, 미국 뉴저지주 파시파니)) 또는 인산염 완충 염수 (PBS)를 포함한다. 관절내 투여에 적합한 제형은 미정질 형태, 예를 들어 수성 미정질 현탁액 형태일 수 있는 치료제의 멸균 수성 제제 형태로 존재할 수 있다. 리포좀 제형 또는 생분해성 중합체 시스템도 또한 관절내 및 안과 투여 모두를 위한 치료제를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 눈 치료를 비롯한 국소 투여에 적합한 제형은 액체 또는 반-액체 제제, 예를 들어 도찰제 (liniment), 로션, 겔, 도포제 (applicant), 수중유 또는 유중수 에멀젼, 예를 들어 크림, 연고 또는 페이스트; 또는 용액 또는 현탁액, 예를 들어 점적액 (drop)을 포함한다. 천식에 대한 것과 같은 흡입 치료를 위해, 스프레이 캔, 연무기, 또는 분무기로 분배되는 분말의 흡입 (자가 추진형 또는 스프레이 제형)을 이용할 수 있다. 그러한 제형은 분말 흡입 장치 또는 자가 추진형 분말-분배 제형으로부터 폐 투여를 위한 곱게 세분된 분말 형태로 존재할 수 있다. 전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라, 정제된 단백질 제제를 포함하는 제약 조성물을 임의의 경로에 의해 포유동물 숙주에게 투여할 수 있다. 따라서, 적절한 경우에, 투여는 경구 또는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피부내, 흡입, 경피 (국소), 경점막, 및 직장내 투여일 수 있다.
따라서 일반적으로 설명된 본 발명은 예시를 위해 제공되고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는 다음 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다.
실시예
실시예 1. 세포 배양 및 수거
항-CD20 SMIP™ 단백질 TRU-015를 현탁 배양으로 성장시킨 재조합 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포주를 사용하여 생산하였다. TRU-015의 생산을 위한 예시적인 세포 배양 및 수거 공정을 도 4에 예시한다. 본원에 기재된 모든 세포 배양 단계에 대해, 단계에 첨가된 액체는 첨가 전에 0.2 ㎛ 필터를 통해 적어도 1회 여과하였다. 그러한 필터를 통해 통과할 수 없는 소포제 현탁액은 첨가 전에 고압멸균하였다. 세포를 함유하는 배양 브로쓰 (broth)는 단계들 사이에 여과하지 않았다.
TRU-015를 발현하는 CHO 세포주를 함유하는 세포 바이알을 해동시키고, 선택 압력을 위해 0.45 μM 메토트렉세이트를 갖는 예비-가온한 진탕 플라스크 배지를 함유하는 배양 플라스크에 옮겼다.
플라스크 및 웨이브백에서 세포 배양액의 팽창 및 유지
세포 배양액을 배치-재공급 (refeed) 공정을 이용하여 일회용 진탕 플라스크 (최대 작업 부피 1 L) 내에서 초기에 팽창시켰다. 각각의 배양 플라스크를 배치-재공급 사이클 내내 제어된 온도 및 CO2 분위기 하에 교반하면서 인큐베이팅하였다. 사이클이 끝난 후에, 배양액의 전부 또는 일부를 하나 이상의 다른 진탕 플라스크 (또는 충분한 수의 세포가 존재하는 경우에 웨이브백 - 아래 참조)에 옮기고, 진탕 플라스크 배지로 미리-규정된 표적 초기 세포 밀도로 희석하였다. 재공급 후에, 각각의 희석된 배양액을 인큐베이터로 다시 보내고, 여기서 또 다른 배치-재공급 사이클 내내 교반하였다. 사용된 모든 세포 배양 배지는 말단 유가식 배양의 단계까지, 선택적인 압력을 유지하기 위해 임의로 메토트렉세이트를 함유하였다.
일단 진탕 플라스크 내에서 성장에 의해 충분한 수의 세포가 얻어지면, 웨이브백 내에서 배양액 팽창을 계속하였다. 성장 사이클 및 인큐베이터 조건은 웨이브백을 진탕시키는 대신에 요동시키는 것을 제외하고는 플라스크에 대한 것과 동일하였다. 웨이브백 배지는 진탕 플라스크 배지와 동일하였다.
진탕 플라스크 및 웨이브백 배양을 해동으로부터 명시된 최대 수의 세대까지 필요한 만큼 상기 방식으로 계속하였다. 전형적으로, 시드 트레인 (seed train) 생물반응기는 충분한 수의 세포가 웨이브백에서 이용가능하자마자 접종하고, 적어도 하나의 웨이브백을 시드 트레인 생물반응기에 대한 백업 (backup)으로서 유지하였다.
시드 트레인 생물반응기 내에서 세포 배양액 팽창 및 유지
접종물 팽창을 시드 트레인 생물반응기 내에서 계속하였다. 시드 생물반응기 배지를 생물반응기에 첨가하고, 염수 내의 소포제의 고압멸균된 현탁액을 보충하였다. 웨이브백으로부터의 접종물 배양액을 미리-규정된 표적 세포 밀도로 첨가하여, 각각의 배치-재공급 통과를 개시하였다. 배양액을 통과 내내 제어된 조건 하에 교반하면서 유지하고, 그 후에 일부를 취하여 다음 생물반응기에 접종하기 위해 사용하거나, 필요하지 않으면 폐기하였다. 온도는 37℃에서 또는 그 부근에서 제어하였다. 용존 산소 (DO2)는 분사된 0.2 ㎛ 여과된 공기, 산소 또는 두 기체의 블렌드를 이용하여 제어하고, pH는 카르보네이트 용액 (염기성 적정액)을 사용하여 제어하였다.
각각의 후속적인 시드 트레인 생물반응기 배치-재공급 통과는 선행 사이클로부터의 배양액 일부의 체류로 시작하고, 시드 생물반응기 배지로 희석하고, 소포제 현탁액을 첨가하였다. 시드 트레인 생물반응기 및 웨이브백을 둘 모두 서로에 대한 백업으로서 기능하고 다수의 생산 생물반응기 배치에 대한 접종물을 제공하기 위해 필요한 만큼 배치-재공급 작업으로 유지하였다. 일단 충분한 수의 세포가 이용가능하면, 생산 생물반응기를 접종하였다.
생산 생물반응기
TRU-015를 함유하는 조건화 배지를 10 내지 15일 지속하는 말단 유가식 공정을 이용하여 생산 생물반응기 내에서 생성하였다. 시드 트레인 생물반응기로부터의 접종물 배양액을 생물반응기 내의 초기 생산 배지에 첨가하였다. 소포제 현탁액을 첨가하였다. 생성되는 배양액을 배치 내내 제어된 조건 하에 교반하면서 유지하였다. 접종 약 4일 후에, 온도 설정점을 37℃에서 31℃로 옮겼다. 생산 세포 배양 공정 내내, DO2는 분사된 0.2 ㎛ 여과된 공기, 산소 또는 블렌드를 사용하여 제어하고, pH는 카르보네이트 용액 (염기성 적정액)을 사용하여 제어하였다. 또한, 농축된 공급 배지 용액을 유가식 배양 동안 첨가하였다. 접종 10 내지 15일 후에, 생산 생물반응기 배양액의 전체 부피를 수거하였다. 수거일은 스케쥴 고려사항 및/또는 배양액 생활력 고려사항에 기초하여 선택하였다.
도 5는 14일의 배양 기간에 걸쳐 2가지 상이한 CHO 세포 클론에 의해 생산된 TRU-015의 생산 생물반응기의 예시적인 일일 역가 측정치 (㎍/mL)를 보여준다. 피크 역가 값은 생산 생물반응기 성장의 제12일 내지 제14일에 얻어졌다. 피크 역가 값은 1500 내지 3000 ㎍/mL이었다.
디스크 스택 원심분리 ( DSC )에 의한 수거
생산 생물반응기로부터의 조건화 배지는 디스크-스택형 원심분리를 통해 수거하여, 청정화된 조건화 배지 (CCM)를 얻었다. DSC 단계의 하나의 목적은 SMIP™ 단백질을 함유하는 조건화 배지로부터 CHO 세포 및 세포 파편을 분리하는 것이었다. 생물반응기 용기의 내용물을 압력을 통해 DSC, 이어서 패드 여과 기구, 이어서 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과액 용기 또는 백으로 공급하였다. 수거 처리의 완료 시에, HEPES/EDTA 버퍼 용액을 여과된 농축 풀 내로 스파이킹 (spiking)하였다. 상기 스파이크의 하나의 목적은 DSC 및 후속적인 단계 사이의 공정내 보유 기간 동안 산성 화학종의 생성을 감소시키기 위한 것이다. EDTA는 또한 프로테아제 활성을 억제하고 단백질 A 침출을 감소시킬 수 있다. DSC 단계는 실온에서 작업하였다.
실시예 2. 크로마토그래피 조건의 초고속 스크리닝
초고속 스크린을 이용하여 정제 공정에 대한 최적 조건을 개발하였다. 잠재적인 크로마토그래피 선택사항의 초기 초고속 스크리닝으로 작동창을 신속하게 확인하였다. 초고속 스크리닝 결과를 데이타베이스에 비교하여 작동 조건을 추가로 좁힌다. 초고속 스크리닝은 컬럼 실행의 수 및 필요한 공정내 물질을 최소화하고, 평행 개발 노력을 가능하게 한다.
단백질 A 크로마토그래피
단백질 A 크로마토그래피 단계의 1차 목적은 무세포 청정화된 조건화 배지로부터 생성물 포획, 및 공정-유래된 불순물 (예를 들어, 숙주 세포 DNA 및 숙주 세포 단백질 [HCP], 배지 성분, 및 외래 물질)로부터 TRU-015의 분리를 포함한다.
생성물 포획, 불순물 제거를 증가시키고 용출액 침전을 최소화하도록 단백질 A 컬럼 조건을 최적화하기 위해, 초고속 스크린을 수행하였다. 배치 결합 메카니즘을 이용하는 초고속 스크린의 예시적인 디자인을 도 6에 예시하고, 단백질 A 컬럼 작업 및 초고속 스크린 모델의 예시적인 디자인을 도 7에 예시한다. 도시된 바와 같이, 부형제 세척, 용출 및 중화 조건의 상이한 조합을 스크리닝하였다. 특히, 스크린에서는 적어도 세척 부형제로서 염화나트륨, 염화칼슘, 아르기닌, 및 Tris; 용출 버퍼로서 HEPES, 아세트산 및 글리신; 중화 버퍼로서 Tris, HEPES, 및 이미다졸; 및 용출액 내의 염화나트륨 농도 수준 (예를 들어, 0 mM, 15 mM, 30 mM, 및 50 mM)의 수준을 변화시켰다.
스크린에서는 각각 조건이 상이한 96 웰을 갖는 필터판을 사용하였다. 각각의 웰에는 약 50 ㎕의 수지 및 300 ㎕의 액체가 존재하였다. 수지 및 액체를 테칸 로봇 (Tecan Robot) (테칸 유에스, 인크. (Tecan US, Inc., 미국 27703 노스캐롤라이나주 더햄 스위트 310 스터럽 크릭 드라이브 4022))을 사용하여 약 20분 동안 혼합하고, 플레이트를 원심분리하여 상등액을 수거하였다. 각각의 웰로부터의 상등액을 생성물의 회수율, 단량체 및 응집체의 양, 및 숙주 세포 단백질의 존재를 결정하기 위해 분석하였다. 예를 들어, A280에서의 UV 흡광도를 전체 단백질 농도를 결정하기 위해 사용하였다. 혼탁도는 A320에서 흡광도에 의해 측정하였다. 단량체 및 응집체의 양은 크기 배제 HPLC에 의해 측정하였다. 숙주 세포 단백질은 ELISA에 의해 특성 결정하였다.
예시적인 단백질 A 초고속 스크린 결과를 도 8에 도시한다. 본 실험에서 확인된 하나의 예시적인 유리한 조건은 칼슘 세척, 염화나트륨을 사용한 아세트산 용출, 및 HEPES 중화를 포함하였다 (도 8 참조).
이온 교환 크로마토그래피
이온 교환 크로마토그래피의 1차 목적은 공정-유래된 불순물 (예를 들어, 침출된 단백질 A, 숙주 세포 DNA 및 단백질, 및 외래 물질) 및 또한 생성물-관련 불순물, 예를 들어 고분자량 (HMW) 종의 제거를 포함한다. 유사하게, 초고속 스크린은 불순물을 제거하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피 (AEX) 조건 및 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 대한 가능한 작동 조건을 확인하기 위해 사용하였다. 시험된 예시적인 변수를 표 1에 제시한다.
세라믹 히드록시아파타이트 ( cHA ) 크로마토그래피
세라믹 히드록시아파타이트 (cHA) 크로마토그래피의 1차 목적은 고분자량 (HMW) 응집체, 침출된 단백질 A, 및 숙주 세포-유래된 불순물, 예를 들어 DNA 및 HCP의 제거를 포함한다.
세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 대한 작동 조건을 최적화하기 위해, 초고속 스크린을 또한 수행하였다. 스크린에서는 적어도 pH, 염 농도 및 인산염 농도를 변화시켰다. 예시적인 변수를 도 9에 제시한다. HMW 응집체의 제거에 관하여 예시적인 결과를 또한 도 9에 제시한다.
실시예 3. cHA 크로마토그래피 단계의 개발
초고속 스크린은 컬럼 정제 계획에서 적합한 단량체 회수율 및 HMW 응집체 제거 조건을 정성적으로 예측할 수 있었다. 예를 들어, 초고속 스크린으로 cHA 크로마토그래피 단계가 HMW 응집체를 제거하는데 효과적임을 확인하였다. HMW 응집체를 제거하기 위해 적합한 염 또는 버퍼 조건의 어림 범위를 또한 예측하였다 (도 9 참조). 초고속 스크린에 의해 확인된 조건을 추가로 세밀화하기 위해 선택적 스크린을 사용할 수 있다.
cHA 컬럼 및 염화나트륨 구배 용출을 이용하는 선택적 스크린을 수행하였다. 예시적인 계획 및 결과를 도 10에 도시한다.
초고속 스크리닝 및 선택적 스크리닝에 기초한 잠재적인 용출 버퍼를 단계-용출 방식으로 추가로 평가하였다. 예를 들어, 60% HMW 응집체 6000 ppm HCP를 갖는 단백질 A 컬럼 피크 풀을 표 2에 제시된 바와 같이 인산염 및 NaCl 농도의 상이한 조합을 갖는 cHA 컬럼을 이용하여 정제하였다.
Figure pct00003
59% HMW 및 290 ppm HCP를 갖는 음이온 교환 크로마토그래피 풀을 표 3에 제시된 바와 같이 상이한 조합의 인산염 및 NaCl 농도를 갖는 cHA 컬럼을 이용하여 정제하였다.
Figure pct00004
본원에 기재된 실험을 기초로 하여 개발된 예시적인 전형적인 cHA 크로마토그래피 단계를 도 11에 도시한다.
실시예 4. TRU -015에 대한 정제 공정
상기 기재된 실험에 기초하여, SMIP™ 단백질의 정제 공정을 개발하였다. TRU-015의 예시적인 정제 공정을 도 12에 예시한다. 본 공정은 3개의 크로마토그래피 단계 및 3개의 막 여과 단계를 포함한다. 모든 단계는 달리 나타내지 않으면 실온에서 수행하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 청정화된 무세포 조건화 배지를 먼저 MabSelect™ 단백질 A 친화도 크로마토그래피로 처리하였다. 재조합 단백질 A 수지 (지이 헬스케어, 미국 뉴저지주 피스카타웨이)를 갖는 17.7 L (30 cm 직경 x 25 cm 높이) MabSelect™ 컬럼을 사용하였다. 단백질 A 컬럼을 Hepes-완충 염수로 평형화시키고, 청정화된 조건화 배지를 로딩하였다. 로딩된 수지를 불순물 수준을 추가로 감소시키기 위해 염화칼슘을 함유하는 Hepes 버퍼로 세척한 후, 낮은 농도의 Hepes 버퍼 및 염화나트륨을 함유하는 세척액으로 세척하였다. 결합된 생성물은 낮은 pH 아세트산 버퍼를 갖는 컬럼으로부터 용출되었다.
생성물 풀을 pH≤4.1에서 약 1.5±0.5시간 동안 18℃ 내지 24℃에서 유지하였다. 낮은 pH 유지는 외피 바이러스를 불활성화하기 위해 고안되었다. 이어서, 용출 풀을 농축된 Hepes 버퍼로 중화시켰다. 수지를 재생하고, 살균한 후, 에탄올 용액 내에 저장하였다.
TMAE HiCap(M) 컬럼을 먼저 고염 버퍼 및 이어서 저염 버퍼로 평형화시켰다. 컬럼에 중화된 MabSelect r단백질 A 피크를 로딩하였다. 하나 또는 다수의 중화된 MabSelect r단백질 A 피크 풀을 TMAE HiCap(M) 컬럼 상에 로딩하였다. TRU-015는 컬럼에 단지 약하게 결합하고, 이는 대다수의 생성물이 관통 유동하는 반면 음전하를 가진 불순물, 예를 들어 숙주 세포 DNA 및 HCP는 강하게 결합하고 보존되도록 허용한다. 이어서, 수지에 약하게 결합된 추가의 생성물을 수집하기 위해, TMAE HiCap(M) 컬럼을 평형화 버퍼로 세척하였다. 일단 생성물이 TMAE HiCap(M) 컬럼으로부터 제거된 후, 고염 버퍼를 사용하여 불순물을 스트리핑하였다. 수지를 재생하고, 살균한 후, 에탄올 용액 내에 저장하였다.
cHA 컬럼을 먼저 고염 버퍼로 평형화시킨 후 저염 버퍼로 평형화시켰다. 이어서, TMAE 유동-관통 풀을 cHA 컬럼에 적용하였다. 로딩 후에, 컬럼을 저염 평형화 버퍼로 세척하고, 보다 고염 버퍼를 사용하여 TRU-015를 회수하였다 (실시예 3 참조). HMW 종 및 다른 불순물은 훨씬 더 고염 및 인산염 농도에서 컬럼으로부터 제거되었다. 컬럼을 재생한 후 수산화나트륨 용액 내에 저장하였다.
플라노바 20N 바이러스 보존 여과 (VRF) 단계는 잠재적인 외래 바이러스 오염물을 나타낼 수 있는 입자의 제거에 의해 생성물 안전성의 보장을 위한 유의한 수준의 바이러스 청소를 제공한다. 일회용 플라노바 20N VRF 장치를 평형화하고, cHA 생성물 풀을 로딩하였다. TRU-015 단백질은 침투 스트림 내에 수집되었다. 로드가 처리된 후, 시스템 내에 남아있는 추가의 생성물을 회수하기 위해 평형화 버퍼 플러시 (flush)를 사용하였다.
공정 스트림을 농축하고 제형화 버퍼 내에 버퍼 교환하기 위해 한외여과/정용여과 스키드 (분자량 컷-오프 10 kDa)를 사용하였다. 평형화 후에, 로드 용액을 초기에 대략 8배 농축시킨 후, 제형화 버퍼 (예를 들어, 20 mM L-히스티딘, 4% 만니톨, 1% 수크로스, pH 6.0)로 적어도 10배 정용여과하였다. 추가의 농축 후에, 제형화 버퍼 플러시를 사용하여 시스템으로부터 풀을 회수하였다.
임의의 잠재적인 외래 미생물 오염물 및 입자형 물질을 제거하기 위해, 약물 물질을 일회용 0.2 ㎛ 필터를 통해 통과시켰다.
여과된 TRU-015 약물 물질을 예를 들어 스테인레스 스틸 용기 내에 충전시키고, 동결시키고, -50℃±10℃에서 저장하였다.
생성물 회수율 및 불순물 제거 효율을 결정하기 위해 각각의 단계에서의 컬럼 성능을 분석하였다. 예시적인 결과를 표 4에 요약한다.
Figure pct00005
표 4에 제시된 바와 같이, cHA 크로마토그래피 단계는 대부분의 HMW 응집체를 효과적으로 제거하였다. 관심있는 생성물에 대한 총 공정 회수율은 51-73%이었고, 생성물 수율은 약 23-32%이었다. 표 4에 제시된 결과는 실험실 규모 정제 공정을 기초로 한 것이다. 임상 제조 공정에 대해 비슷한 결과가 얻어졌다. 예를 들어, 다수의 임상 규모 공정을 기초로 할 때, 평균 수율은 약 28%이었고, 정제된 생성물 내의 HMW 응집체의 백분율은 약 0.8% 또는 그 미만이었다 (출발 물질 내에서 50-60%로부터 감소됨). 기존의 공정에 비해, 단백질 발현/수거 및 정제 수율의 증가에 의해 생산성이 8배 초과로 증가한다.
실시예 5. 로드 물질의 패드 여과
불순물에 대한 용적 및 음이온 교환 컬럼의 수명을 증가시키기 위해, 로드 물질을 임의로 패드 여과로 처리할 수 있다. 예를 들어, TMAE Hi-cap 수지는 합성 메타크릴레이트 중합체 베이스를 갖는 강한 음이온 교환 수지이다. 얽힌 중합체 덩어리로부터 형성된 공극은 어림 크기가 800 옹스트롬이다. 표면은 중합체 내의 에테르 연결기로 인해 강한 친수성이다. 촉수로서 알려져 있는 긴 선형 중합체 사슬은 관능적 리간드를 보유한다. 촉수는 메타크릴레이트 백본의 히드록실기에 공유 부착된다. 불순물은 TMAE 컬럼의 결합 표면을 소모 또는 차단할 수 있어서, 용적을 감소시킨다.
흡착성 심층 프리필터의 사용은 컬럼, 예를 들어 TMAE 컬럼을 로드 물질 (예를 들어, MabSelect™ ProA 피크 풀) 내의 불순물로부터 보호할 수 있다. 심층 여과 매질은 일반적으로 심층 여과 매질은 셀룰로스 섬유, 규조토, 및 양이온성 수지 바인더로 이루어진 고도 다공질 1 cm 두께 필터이다. 심층 필터는 불순물을 셀룰로스 섬유를 통한 체질, 규조토에 소수성 흡착, 및 양이온성 바인더에 이온성 흡착에 의해 제거할 수 있다.
TRU-015의 정제 동안, TMAE 컬럼에 로딩하기 전에 MabSelect ProA 피크 풀로부터 불순물을 제거하기 위해 밀리스택 (Millistack) A1HC PAD 필터 (밀리포어, 미국 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하였고, TMAE 용적을 적어도 2배 개선하였다. 예를 들어, 흡착성 심층 필터 밀리스택 AIHC를 사용한 생성물 로드의 예비 여과는 오염물의 2차 파괴에 의해 나타내어 지는 바와 같이 후속적인 TMAE Hi-Cap 수지 컬럼 상의 로드 챌린지를 100에서 200 mg/mL로 증가시켰다. AIHC는 200 리터/m2/시간의 유속 (flux)으로 실행시키고, 200 리터/m2로 로딩하였다.
실시예 6. 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하는 SBI -087의 포획
본 실시예는 친화도 크로마토그래피 대신에 SMIP™을 효과적으로 포획하기 위해 CEX를 사용할 수 있음을 입증한다. CEX의 사용은 특히, 보다 낮은 포획 비용, 가능하게는 특정 친화도 컬럼보다 더 큰 용적, HMW 감소에 대한 잠재적인 고체, 및 cHA 또는 음이온 교환 단계의 잠재적인 제거를 비롯한 다양한 잇점을 가질 수 있는 것으로 고려된다.
SBI-087을 본 실험에서 사용하였다. CEX를 위한 로드 물질은 임의의 적합한 산을 사용하여 산성화시킬 수 있다. 예시적인 산성화 조건을 표 5에 제시한다.
Figure pct00006
MabSelect™ 단백질 A 친화도 크로마토그래피에 의한 HMW 응집체의 양의 감소를 배치-결합 방법을 이용하여 CEX에 의한 감소에 비교하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, CEX에 의한 HMW 응집체의 제거는 MabSelect™ 친화도 크로마토그래피와 비슷하거나 이보다 양호하고, 이것은 CEX가 단백질 제제로부터 HMW 응집체의 제거를 위한 친화도 크로마토그래피를 대체하기 위해 사용될 수 있음을 나타낸다.
예시적인 CEX 단계는 로드 및 용출을 포함한다. CEX 포획을 위한 작동 조건은 초고속 스크린 방법을 사용하여 최적화하였다. 예를 들어, 두 종류의 CEX 수지, 즉 기가캡® 및 캡토™ S를 사용하였다. 25 mg/mLr 대 75 mg/mLr의 로드 챌린지를 사용하였다. 로드 pH (1M 아세트산으로 조정함)는 4.25, 4.5, 4.75, 또는 5.0이었다. 용출 조건은 다음과 같았다:
용출 (총 mM Na+):
pH 5 (아세테이트): 100, 125, 150, 175 mM
pH 6.5 (MES): 40, 65, 90, 115
pH 8.0 (Tris): 20, 40, 60, 80
50 mM 버퍼를 가정함.
실온에서 2시간 인큐베이션을 이용한 결합능을 보여주는 예시적인 결과를 도 14에 도시한다. 보다 높은 또는 보다 긴 챌린지는 용출된 풀 내에 보다 많은 LMW 종을 얻을 수 있음이 또한 관찰되었다. 25 대 75 mg/mLr LC를 로딩한 컬럼으로부터 용출된 CEX 피크를 예시하는 예시적인 결과를 도 15에 도시한다. 사용된 예시적인 스트립 조건은 8M 우레아, 2M NaCl, pH 6이었다. CEX 수지는 스트리핑되고/되거나 재사용될 수 있다.
실시예 7. 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 HMW 의 제거
본 실시예는 SMIP™ 제제로부터 HMW 불순물을 효과적으로 제거하기 위해 음이온 교환 크로마토그래피를 사용할 수 있음을 입증한다. 본 실험에서, SBI-087을 예시적인 SMIP™ 단백질로서 사용하였다.
음이온 교환 크로마토그래피 단계는 표 1에 개략된 초고속 스크린 방법을 이용하여 개발하였다. 그 스크린으로부터 유래된 크로마토그래피 조건을 37% HMW를 갖는 단백질 A 피크 풀을 함유하는 로드를 사용하는 예시적인 실행에서 사용하였다. 프랙토겔® TMAE HiCap의 충진된 컬럼을 각각 100 및 93 mg/mL의 로드 챌린지에 대해 약한 분배 크로마토그래피 방식으로 실행하였다. 도 16은 HMW의 예시적인 효과적인 제거를 보여준다. 수집된 풀은 >95% "단량체성" SMIP™의 수율을 보이고, 순도가 88%이었다. 로드 후 세척은 "단량체성" SMIP™ 단백질의 보다 큰 회수율을 허용하였다.
이들 결과는 제2 컬럼 (예를 들어, AEX) 크로마토그래피가 HMW의 실질적인 제거를 수행할 수 있음을 입증하였고, 이는 하류 cHA 단계를 개발하고 실행하는데 있어서 보다 큰 유연성 및 보다 낮은 비용을 허용한다. 추가로, 이들 결과는 또한 단백질 제제로부터 실질적인 양의 HMW 불순물을 제거하기 위해 2-컬럼 (예를 들어, 단백질 A 내지 AEX) 공정을 개발하는 것이 실행가능함을 나타낸다.
예시적인 SMIP ™ 서열
이탤릭체: 링커 서열
밑줄: CDR 서열
구축물 명칭
Figure pct00007
Figure pct00008
구축물 명칭
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
예시적인 전장
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
균등물
상기한 내용은 본 발명의 비제한적인 특정 실시양태에 대한 설명이었다. 당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시양태에 대한 많은 균등물을 알거나 확인할 수 있을 것이다. 당업자는 다음 특허청구범위에서 규정된 바와 같은 본 발명의 취지 또는 범위를 벗어나지 않으면서 본 설명에 대한 다양한 변화 및 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
청구항에서, 관사 ("a", "an" 및 "the")는 반대로 지시하거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않다면 하나보다는 하나 이상을 의미할 수 있다. 집단의 하나 이상의 구성원들 사이에서 "또는"을 포함하는 청구항 또는 설명은 반대로 지시하거나 달리 문맥으로부터 명백하지 않다면 하나, 하나 초과 또는 모든 집단 구성원이 주어진 생성물 또는 공정 내에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 경우에 만족하는 것으로 고려된다. 본 발명은 집단의 정확하게 하나의 구성원이 주어진 생성물 또는 공정 내에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시양태를 포함한다. 본 발명은 하나 초과 또는 모든 집단 구성원이 주어진 생성물 또는 공정 내에 존재하거나, 사용되거나, 달리 관련되는 실시양태를 또한 포함한다. 추가로, 본 발명은 하나 이상의 청구항으로부터 또는 설명의 관련 부분으로부터 하나 이상의 제한, 요소, 조항, 서술적 용어 (descriptive terms) 등이 또 다른 특허청구범위로 도입되는 모든 변이, 조합, 및 변경 (permutation)을 포괄함을 이해해야 한다. 예를 들어, 또 다른 청구항에 의존하는 임의의 청구항은 동일한 기초 청구항에 의존하는 임의의 다른 청구항에서 발견되는 하나 이상의 제한을 포함하도록 변형될 수 있다. 추가로, 청구항이 조성물을 인용하는 경우에, 달리 지시되지 않거나 모순 또는 불일치가 일어날 것이 당업자에게 명백하지 않으면, 본원에 개시된 임의의 목적을 위해 조성물을 사용하는 방법이 포함되고, 본원에 개시된 임의의 제조 방법 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 따라 조성물을 제조하는 방법이 포함됨을 이해해야 한다. 추가로, 본 발명은 본원에 개시된 조성물을 제조하기 위한 임의의 방법에 따라 제조된 조성물을 포함한다.
요소들이 목록으로서, 예를 들어, 마쿠쉬 (Markush) 집단 형식으로 제시되면, 요소의 각각의 하위군이 또한 개시되고, 임의의 요소(들)은 집단으로부터 제거될 수 있음을 이해해야 한다. 용어 "포함하는"은 열린 의미로 의도되고 추가의 요소 또는 단계의 포함을 허용하는 것에 또한 주목한다. 일반적으로, 본 발명 또는 본 발명의 측면들이 특정 요소, 특색, 단계 등을 포함하는 것으로 언급되는 경우에, 본 발명의 특정 실시양태 또는 본 발명의 측면은 그러한 요소, 특색, 단계 등으로 구성되거나 본질적으로 구성됨을 이해해야 한다. 단순함을 위해, 이들 실시양태는 본원에서 같은 단어를 사용하여 (in haec verba) 구체적으로 제시되지 않았다. 따라서, 하나 이상의 요소, 특색, 단계 등을 포함하는 본 발명의 각각의 실시양태에 대해, 본 발명은 이들 요소, 특색, 단계 등으로 구성되거나 본질적으로 구성되는 실시양태를 또한 제공한다.
범위가 제시되는 경우에, 종점들이 포함된다. 또한, 달리 지시하거나 문맥 및/또는 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않으면, 범위로서 표현된 값은 문맥이 분명하게 달리 진술하지 않으면 본 발명의 상이한 실시양태에서 범위의 하한의 단위의 1/10까지, 진술된 범위 내의 임의의 구체적인 값을 취할 수 있음을 이해해야 한다. 달리 지시되거나 문맥 및/또는 당업자의 이해로부터 달리 명백하지 않으면, 범위로서 표현된 값은 주어진 범위 내의 임의의 하위범위를 취할 수 있음을 또한 이해해야 하고, 여기서 하위범위의 종점은 범위의 하한의 단위의 1/10과 동일한 정도의 정확도로 표현된다.
추가로, 본 발명의 임의의 특정 실시양태는 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 명백하게 배제될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 조성물 및/또는 방법의 임의의 실시양태, 요소, 특색, 용도, 또는 측면은 임의의 하나 이상의 청구항으로부터 배제될 수 있다. 간결함을 위해, 하나 이상의 요소, 특색, 목적, 또는 측면이 배제되는 모든 실시양태가 본원에 명백하게 제시되지는 않는다.
참조문의 포함
본원에 인용된 모든 공개문 및 특허 문헌은 각각의 개별 공개문 또는 특허 문헌의 내용이 본원에 포함되는 것과 동일한 정도로 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Wyeth LLC Gallo, Christopher Sun, Shujun Booth, James Cormier, Jason LaCasse, Daniel Noyes, Aaron <120> METHODS OF PURIFYING SMALL MODULAR IMMUNOPHARMACEUTICAL PROTEINS <130> 2004658-2428 (AM103397) <150> US 61/159347 <151> 2009-03-11 <160> 77 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 18011 <400> 1 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 2 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 18008 <400> 2 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 3 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 18010 <400> 3 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 4 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 18009 <400> 4 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 5 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5 2H3m3 <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Leu 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Tyr Pro 165 170 175 Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 6 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2L 2Hm <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro 165 170 175 Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr 180 185 190 Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser 195 200 205 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr 210 215 220 Tyr Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 7 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm 2Hm <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 8 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm 2H <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 9 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm1 2Hm <400> 9 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ser Val Ser Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro 165 170 175 Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr 180 185 190 Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser 195 200 205 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr 210 215 220 Tyr Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 10 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm1 2H <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ser Val Ser Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro 165 170 175 Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr 180 185 190 Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser 195 200 205 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr 210 215 220 Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 11 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm2 2Hm <400> 11 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 12 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm3 2Hm <400> 12 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 13 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm4 2Hm <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val 115 120 125 Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140 Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro 165 170 175 Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr 180 185 190 Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser 195 200 205 Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr 210 215 220 Tyr Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 14 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5 2Hm <400> 14 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 15 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5-1 2Hm3 <400> 15 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 16 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5-2 2Hm4 <400> 16 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 17 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5-3 2Hm5 <400> 17 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 18 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm6 2Hm <400> 18 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 19 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm6-1 2Hm3 <400> 19 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 20 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm6-2 2Hm4 <400> 20 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 21 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm6-3 2Hm5 <400> 21 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 22 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm7 2Hm <400> 22 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 23 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm8 2Hm <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 24 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm9 2Hm <400> 24 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 25 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm10 2Hm <400> 25 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 26 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm11 2Hm <400> 26 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 27 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm12 2Hm <400> 27 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 28 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm13 2Hm <400> 28 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 29 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm14 2Hm <400> 29 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 30 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm15 2Hm <400> 30 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 31 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm16 2Hm3 <400> 31 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 32 <211> 242 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm17-3 2Hm3 <400> 32 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Tyr Tyr Ser Asn 210 215 220 Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 33 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm17-4 2Hm3 <400> 33 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 1 5 10 Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val 15 20 25 Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu 30 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 65 70 75 Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn 80 85 90 Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly 95 100 105 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln 110 115 120 125 Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys 130 135 140 Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His 145 150 155 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile 160 165 170 Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg 175 180 185 Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu 190 195 200 205 Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser 210 215 220 Tyr Tyr Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 225 230 235 Leu Val Thr Val Ser Ser 240 <210> 34 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm17-6 2Hm3 <400> 34 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 35 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm17-8 2Hm3 <400> 35 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 36 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm17-12 2Hm3 <400> 36 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 37 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm17-14 2Hm3 <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 38 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm18-2 2Hm3 <400> 38 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 39 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm18-3 2Hm3 <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 40 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm18-4 2Hm3 <400> 40 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 41 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm18-5 2Hm3 <400> 41 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 42 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm18-14 2Hm3 <400> 42 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Leu 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 43 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-1 2Hm3 <400> 43 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 44 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-2 2Hm3 <400> 44 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 45 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-3 2Hm3 <400> 45 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 46 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-4 2Hm3 <400> 46 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 47 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-7 2Hm3 <400> 47 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 48 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-9 2Hm3 <400> 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 49 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-12 2Hm3 <400> 49 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Pro Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 50 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm19-14 2Hm3 <400> 50 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 51 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-1 2Hm3 <400> 51 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 52 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-2 2Hm3 <400> 52 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 53 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-4 2Hm3 <400> 53 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 54 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-8 2Hm3 <400> 54 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 55 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-11 2Hm3 <400> 55 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 56 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-12 2Hm3 <400> 56 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 57 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm20-13 2Hm3 <400> 57 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 58 <211> 244 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5 2H5m3 <400> 58 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 59 <211> 243 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SMIP 2Lm5 2H3m3 <400> 59 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser <210> 60 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge CSSS <400> 60 Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Ser 1 5 10 15 Ser <210> 61 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge WT <400> 61 Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge CSCS <400> 62 Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys 1 5 10 15 Ser <210> 63 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge SCCS <400> 63 Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Ser <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Hinge SCCP <400> 64 Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro <210> 65 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 CH3 WT <400> 65 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 66 <211> 217 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH2 CH3 P331S <400> 66 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 165 170 175 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 180 185 190 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 195 200 205 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 <210> 67 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full lenth SMIP <400> 67 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 68 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 68 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 69 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 69 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Ala Tyr Leu Gln Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Ser Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Lys 145 150 155 160 Gln Thr Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser 245 250 255 Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 70 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 70 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 71 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 71 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 72 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 72 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser 245 250 255 Pro Pro Ser Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 73 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 73 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 74 <211> 478 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full legth SMIP <400> 74 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Glu Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys 130 135 140 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Gln Val Thr Ile 180 185 190 Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 195 200 205 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 245 250 255 Ser Pro Pro Cys Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 260 265 270 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 275 280 285 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 290 295 300 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 305 310 315 320 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 325 330 335 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 340 345 350 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 355 360 365 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 370 375 380 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 385 390 395 400 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 405 410 415 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 420 425 430 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 435 440 445 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 450 455 460 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 75 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 75 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ile Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Val Tyr Tyr 210 215 220 Ser Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 76 <211> 477 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary full length SMIP <400> 76 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Ile Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Gln 115 120 125 Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Ala Ile Tyr Pro Gly 165 170 175 Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu 195 200 205 Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Tyr Tyr Ser 210 215 220 Asn Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Asp Gln Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Ser 245 250 255 Pro Pro Ser Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 475 <210> 77 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 77 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10

Claims (102)

  1. 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 4% 미만의 응집체를 함유하도록 하는 작동 조건 하에 단백질 제제를 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제로부터 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 3개 이하의 크로마토그래피 단계를 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 작동 조건이 소형 모듈형 면역약제 단백질을 인산염 버퍼 내에서 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 인산염 버퍼가 내독소가 없는 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 인산염 버퍼가 발열원이 제거되는 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 인산염 버퍼가 인산나트륨, 인산칼륨, 및/또는 인산리튬을 포함하는 것인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 인산염 버퍼가 1 mM 내지 50 mM의 농도의 인산나트륨을 포함하는 것인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 인산염 버퍼가 100 mM 내지 2.5 M의 농도의 염화나트륨을 추가로 포함하는 것인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 인산염 버퍼가 2 mM 내지 32 mM의 농도의 인산나트륨 및 100 mM 내지 1.6 M의 농도의 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 인산염 버퍼의 pH가 6.5 내지 8.5인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 작동 조건이 소형 모듈형 면역약제 단백질을 NaCl 구배에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 작동 조건이 소형 모듈형 면역약제 단백질을 NaCl 단계 용출 방법에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 작동 조건이 소형 모듈형 면역약제 단백질을 인산염 구배에 의해 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 인산염 구배가 선형 구배인 방법.
  15. 제13항에 있어서, 인산염 구배가 단계 구배인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 세라믹 히드록시아파타이트 타입 I 또는 타입 II 수지를 함유하는 컬럼을 사용하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 컬럼이 세라믹 히드록시아파타이트 타입 I 수지를 함유하는 것인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 수지의 직경이 1 ㎛ 내지 1,000 ㎛인 방법.
  19. 제16항 또는 제17항에 있어서, 수지의 직경이 10 ㎛ 내지 100 ㎛인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전에 친화도 크로마토그래피에 의해 단백질 제제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 친화도 크로마토그래피가 불변 면역글로불린 도메인에 결합하는 단백질 흡착제를 사용하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 친화도 크로마토그래피가 가변 면역글로불린 도메인에 결합하는 단백질 흡착제를 사용하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 단백질 흡착제가 VH3 도메인에 결합하는 것인 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 흡착제가 단백질 A를 포함하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 친화도 크로마토그래피가 MabSelect r단백질 A 수지 컬럼을 사용하는 것인 방법.
  26. 제20항에 있어서, 친화도 크로마토그래피의 단계가 Hepes, 염화나트륨, 염화칼슘, 아르기닌, Tris, 염화마그네슘, 히스티딘, 우레아, 이미다졸, 하나 이상의 유기 용매, 이온성 및/또는 비이온성 세제를 포함하는 세척 버퍼를 사용하여 친화도 크로마토그래피 컬럼을 세척하는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 유기 용매가 에탄올, 메탄올, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제20항에 있어서, 친화도 크로마토그래피의 단계가 소형 모듈형 면역약제 단백질을 Hepes, 인산, 글리신, 글리실글리신, 염화마그네슘, 우레아, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 하나 이상의 유기산, 및/또는 아르기닌을 포함하는 용출 버퍼를 사용하여 친화도 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 하나 이상의 유기산이 아세트산, 시트르산, 포름산, 락트산, 타르타르산, 말산, 말론산, 프탈산 및 살리실산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 용출 버퍼가 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 염화마그네슘, 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염을 추가로 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 염의 농도가 1 mM 내지 1 M인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 염의 농도가 1 mM 내지 500 mM인 방법.
  33. 제30항에 있어서, 염의 농도가 1 mM 내지 100 mM인 방법.
  34. 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 흡착제에 대한 결합을 촉진하기 위해 첨가제를 첨가하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  35. 제1항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질 제제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 친화도 크로마토그래피 후에, 그러나 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전에 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 단백질 제제를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지에 대한 소형 모듈형 면역약제 단백질 및/또는 불순물의 결합을 향상시키기 위해 첨가제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 첨가제가 비이온성 유기 중합체를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 비이온성 유기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
  40. 제35항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 전에 심층 필터 단계를 추가로 포함하는 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 여과 단계를 추가로 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 하나 이상의 여과 단계가 바이러스 보존 여과 단계를 포함하는 것인 방법.
  43. 제41항에 있어서, 하나 이상의 여과 단계가 한외여과 및/또는 정용여과 단계를 포함하는 것인 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 오염물로부터 추가로 분리될 수 있도록 단백질 제제로부터 하나 이상의 오염물의 단백질 침전을 유도하기 위해 첨가제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 첨가제가 비이온성 유기 중합체를 포함하는 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 비이온성 유기 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)인 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 침전이 음이온 교환 크로마토그래피 전에 유도되고, 방법이 여과에 의해 단백질 제제로부터 침전된 오염물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 2% 미만의 응집체를 함유하는 것인 방법.
  49. 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 1% 미만의 응집체를 함유하는 것인 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 10% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 20% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 30% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  53. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 60% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  54. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 30% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  55. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 20% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  56. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 15% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  57. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 10% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  58. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 5% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  59. 제1항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 서열 1-59 및 67-76 중 임의의 하나에 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 배양된 세균 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 세포, 무세포 배지, 트랜스제닉 (transgenic) 동물 또는 식물로부터 제조되는 것인 방법.
  62. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 세포 배양 배지 제제인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 배양 배지 제제가 배양된 세포로부터 분비된 소형 모듈형 면역약제 단백질을 포함하는 것인 방법.
  64. 제63항에 있어서, 배양된 세포가 CHO 세포인 방법.
  65. 제62항에 있어서, 배양 배지 제제가 대규모 생물반응기로부터 제조되는 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 세포 추출물을 포함하는 것인 방법.
  67. 제1항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 봉입체로부터 제조되는 것인 방법.
  68. 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 4% 미만의 응집체를 함유하도록 하는 작동 조건 하에 단백질 제제를 (a) 친화도 크로마토그래피 및/또는 이온 교환 크로마토그래피, 및 (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 것을 포함하는, 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제로부터 소형 모듈형 면역약제 단백질을 정제하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 단백질 제제를 (a1) 친화도 크로마토그래피, (a2) 이온 교환 크로마토그래피, 및 (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 것인 방법.
  70. 제68항에 있어서, 단백질 제제를 (a1) 양이온 교환 크로마토그래피, (a2) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (b) 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 것인 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 3개 이하의 크로마토그래피 단계를 포함하는 것인 방법.
  72. 제68항 또는 제69항에 있어서, 친화도 크로마토그래피가 단백질 A 크로마토그래피인 방법.
  73. 제68항 또는 제69항에 있어서, 이온 교환 크로마토그래피가 음이온 교환 크로마토그래피 수지를 사용하는 음이온 교환 크로마토그래피인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지가 Q 세파로즈 (Sepharose) FF, Q 세파로즈 XL, DEAE 세파로즈 FF, POROS® HQ50, POROS® A50, 토요펄 (Toyopearl)® DEAE, 토요펄® 기가캡 (GigaCap) Q-650M, 토요펄® DEAE-650M, 캡토 (Capto)™ Q, 캡토™ DEAE, 및 촉수 (tentacle) 음이온 교환 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  75. 제73항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지가 하전 막 흡착기인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 머스탕 (Mustang)® Q, 머스탕® E, 사르토빈드 (Sartobind)® Q 및 크로마솔브 (Chromasorb)™으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  77. 제73항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피 수지가 하전 모노리스 (monolithic) 지지체인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 음이온 교환 크로마토그래피가 CIM®-DISK인 방법.
  79. 제69항에 있어서, 친화도 크로마토그래피가 MabSelect™ r단백질 A 친화도 크로마토그래피이고, 이온 교환 크로마토그래피가 촉수 음이온 교환 크로마토그래피이고, 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 타입 I 세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 촉수 음이온 교환 크로마토그래피가 프랙토겔 (Fractogel)® TMAE HiCap(M)™, 프랙토겔® TMAE(S)™, 및 프랙토프렙 (Fractoprep)® TMAE™으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 재사용을 위해 하나 이상의 크로마토그래피 컬럼을 스트리핑 (stripping) 및/또는 재생하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  82. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 2% 미만의 응집체를 함유하는 것인 방법.
  83. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질이 1% 미만의 응집체를 함유하는 것인 방법.
  84. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 20% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 단백질 제제가 60% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  86. 제68항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 제제가 30% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  87. 제68항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 CD20에 특이적으로 결합하는 것인 방법.
  88. 제87항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 서열 1-59 및 67-76에 적어도 80% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 정제된 소형 모듈형 면역약제 단백질.
  90. 정제된 단백질이 4% 미만의 응집체를 함유하도록 하는 작동 조건 하에 단백질 제제를 히드록시아파타이트 크로마토그래피로 처리하는 단계를 포함하는, 20% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 단백질 제제로부터 단백질을 정제하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 단백질 제제가 60% 초과의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 방법.
  92. 제90항에 있어서, 작동 조건이 단백질을 인산염 버퍼 내에서 히드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출하는 것을 포함하는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 인산염 버퍼가 인산나트륨, 인산칼륨, 및/또는 인산리튬을 포함하는 것인 방법.
  94. 제92항에 있어서, 인산염 버퍼가 1 mM 내지 50 mM의 농도의 인산나트륨을 포함하는 것인 방법.
  95. 제92항에 있어서, 인산염 버퍼가 100 mM 내지 2.5 M의 농도의 염화나트륨을 추가로 포함하는 것인 방법.
  96. 제92항에 있어서, 인산염 버퍼가 2 mM 내지 32 mM의 농도의 인산나트륨 및 100 mM 내지 1.6 M의 농도의 염화나트륨을 포함하는 것인 방법.
  97. 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 인산염 버퍼의 pH가 6.5 내지 8.5인 방법.
  98. 제90항에 있어서, 단백질이 소형 모듈형 면역약제 폴리펩티드를 포함하는 것인 방법.
  99. 4% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는 소형 모듈형 면역약제 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  100. 제99항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 3% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 제약 조성물.
  101. 제99항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 2% 미만의 고분자량 응집체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  102. 제99항에 있어서, 소형 모듈형 면역약제 단백질이 1% 미만의 고분자량 응집체를 함유하는 것인 제약 조성물.
KR1020117021247A 2009-03-11 2010-03-11 소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제 방법 KR20110139216A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15934709P 2009-03-11 2009-03-11
US61/159,347 2009-03-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20110139216A true KR20110139216A (ko) 2011-12-28

Family

ID=43012630

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117021247A KR20110139216A (ko) 2009-03-11 2010-03-11 소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20120141497A1 (ko)
EP (1) EP2406274A2 (ko)
JP (1) JP2010209068A (ko)
KR (1) KR20110139216A (ko)
CN (1) CN102395597A (ko)
AU (1) AU2010260476A1 (ko)
BR (1) BRPI1009447A2 (ko)
CA (1) CA2751000A1 (ko)
IL (1) IL215082A0 (ko)
RU (1) RU2011137030A (ko)
WO (1) WO2010147686A2 (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3037104T (lt) * 2009-10-20 2020-09-10 Abbvie Inc. Anti-il-13 antikūnų izoliavimas ir gryninimas, naudojant afininę baltymo a chromatografiją
SG182553A1 (en) * 2010-01-22 2012-08-30 Boehringer Ingelheim Int Chromatographic method for purifying fc-containing proteins
US20110301333A1 (en) * 2010-06-08 2011-12-08 Millipore Corporation Removal of protein aggregates from biopharmaceutical preparations using calcium phosphate salts
AR082963A1 (es) 2010-09-17 2013-01-23 Sumitomo Chemical Co Composicion para aerosol de control de plagas
CA2813747A1 (en) * 2010-10-11 2012-04-19 Chen Wang Processes for purification of proteins
DK2742152T3 (en) * 2011-08-12 2017-07-31 Qiagen Gmbh PROCEDURE FOR ISOLATING NUCLEIC ACIDS
CN102492040B (zh) * 2011-12-29 2014-06-25 嘉和生物药业有限公司 一种抗her2或/和抗her3抗体蛋白的纯化方法
US10415024B2 (en) 2012-11-16 2019-09-17 Poseida Therapeutics, Inc. Site-specific enzymes and methods of use
CN102993266B (zh) * 2012-11-30 2019-08-23 广州白云山拜迪生物医药有限公司 一种融合蛋白的纯化和复性方法
LT3395423T (lt) 2013-03-14 2023-12-11 Amgen Inc. Pratekančių giminingumo gryninimo ligandų pašalinimas
CN105263952A (zh) * 2013-03-15 2016-01-20 建新公司 用于生物过程监控的生物治疗剂的基于亲和力的分析纯化
US20170107541A1 (en) * 2014-06-17 2017-04-20 Poseida Therapeutics, Inc. A method for directing proteins to specific loci in the genome and uses thereof
EP3180027A4 (en) * 2014-08-15 2018-01-10 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Rspo1 binding agents and uses thereof
WO2016096071A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Merck Patent Gmbh Target molecule capture from crude solutions
CN104693303B (zh) * 2015-02-28 2018-03-13 苏州金盟生物技术有限公司 一种蛋白制品中的核酸去除方法
JP2018521689A (ja) 2015-06-17 2018-08-09 ポセイダ セラピューティクス， インコーポレイテッド タンパク質をゲノム内の特定の遺伝子座に導くための組成物および方法
JP2019108274A (ja) * 2016-04-18 2019-07-04 昭和電工株式会社 タンパク質凝集体の除去方法
WO2018063980A1 (en) * 2016-09-29 2018-04-05 Bio-Rad Laboratories, Inc. Agarose-filled ceramic apatite
CN111902720A (zh) 2018-03-21 2020-11-06 沃特世科技公司 基于非抗体高亲和力的样品制备、吸附剂、装置和方法
WO2020125757A1 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. A method for improving aggregate removal by protein a chromatography
US20220314142A1 (en) * 2019-07-01 2022-10-06 Pfizer Inc. Improvements to wash solutions for protein a chromatography in an antibody purification process
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
JP2023509759A (ja) * 2020-01-08 2023-03-09 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 質量スペクトル分析においてシグナルを増強するためのアミノ酸の使用
JP7462762B2 (ja) * 2020-01-20 2024-04-05 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド アフィニティークロマトグラフィー用の新規な洗浄緩衝液
WO2023154822A2 (en) * 2022-02-10 2023-08-17 Kodiak Sciences Inc. Methods of purifying a product
CN115894604B (zh) * 2022-12-16 2024-01-23 康日百奥生物科技(苏州)有限公司 重组蛋白澄清纯化方法
CN116120392B (zh) * 2023-04-18 2023-08-01 上海健士拜生物科技有限公司 聚体蛋白的纯化方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
CA2433877C (en) 2001-01-17 2014-11-18 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20040058445A1 (en) 2001-04-26 2004-03-25 Ledbetter Jeffrey Alan Activation of tumor-reactive lymphocytes via antibodies or genes recognizing CD3 or 4-1BB
DK3095793T3 (da) 2003-07-28 2020-05-25 Genentech Inc Reducering af udvaskning af protein A under en protein A-affinitetskromatografi
RU2409591C2 (ru) * 2003-10-27 2011-01-20 Вайет Удаление агрегатов с высокой молекулярной массой путем хроматографии на гидроксиапатитах
CN101267836A (zh) * 2005-07-25 2008-09-17 特鲁比昂药品公司 单剂量cd20特异性结合分子的用途
EP2059258B1 (en) 2006-09-08 2019-11-13 Wyeth LLC Arginine wash in protein purification using affinity chromatography
BRPI0719250A2 (pt) * 2006-10-12 2015-06-16 Wyeth Corp Métodos e composições com opalescência reduzida.
US7846434B2 (en) * 2006-10-24 2010-12-07 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Materials and methods for improved immunoglycoproteins
AU2008266952A1 (en) 2007-06-12 2008-12-24 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Anti-CD20 therapeutic compositions and methods
CA2739352C (en) * 2008-10-29 2021-07-13 Wyeth Llc Methods for purification of single domain antigen binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
US20120141497A1 (en) 2012-06-07
BRPI1009447A2 (pt) 2016-03-01
WO2010147686A2 (en) 2010-12-23
WO2010147686A3 (en) 2011-02-24
CN102395597A (zh) 2012-03-28
JP2010209068A (ja) 2010-09-24
AU2010260476A1 (en) 2011-10-13
EP2406274A2 (en) 2012-01-18
IL215082A0 (en) 2011-11-30
RU2011137030A (ru) 2013-04-20
CA2751000A1 (en) 2010-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20110139216A (ko) 소형 모듈형 면역약제 단백질의 정제 방법
US9957318B2 (en) Protein purification methods to reduce acidic species
US9708399B2 (en) Protein purification using displacement chromatography
KR101921552B1 (ko) 사전 세정 단계를 이용하는 면역글로불린 정제
US8168185B2 (en) Process for the purification of anti CD-25 antibodies
US20140288278A1 (en) Chromatography process for resolving heterogeneous antibody aggregates
TW201348247A (zh) 利用蛋白質ａ親和性層析之非人類抗體之新穎純化
WO2013176754A9 (en) Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
KR20110079693A (ko) 단일 도메인 항원 결합 분자의 정제 방법
AU2010266093B2 (en) Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system
KR20120118013A (ko) Ｆｃ?함유 단백질을 정제하는 크로마토그래피 방법
KR20130131307A (ko) 단백질 정제
WO2013004587A1 (en) Method for separation of monomeric polypeptides from aggregated polypeptides
EP3980119A1 (en) Antibody purification methods and compositions thereof
AU2021399935A1 (en) Methods for the purification of refolded fc-peptide fusion protein
KR20240154657A (ko) 임상 인간 igg 제품의 친화도 크로마토그래피 생산
WO2014142882A1 (en) Protein purification using displacement chromatography
CN117043181A (zh) 蛋白质组合物以及其产生和使用方法
Chakrapani Lakshmi et al. Downstream Processing of Antibodies: Potential of Affinity Chromatography

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid