JP2023509759A

JP2023509759A - 質量スペクトル分析においてシグナルを増強するためのアミノ酸の使用

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Publication number: JP2023509759A
Application number: JP2022541935A
Authority: JP
Inventors: ユェン・マオ; アンドリュー・クラインバーグ; ユンロン・ザオ; リリ・グォ
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-01-08
Filing date: 2021-01-07
Publication date: 2023-03-09
Also published as: KR20220123116A; EP4088120A1; CN115280151A; BR112022013481A2; IL294319A; CA3163987A1; MX2022008323A; US20230417759A1; US20210223259A1; WO2021142137A1; AU2021205910A1

Abstract

質量スペクトルシグナルを増強する方法が開示される。本方法は、試料成分が担体に結合することを可能にする条件下で、試料を分離カラムに接触させることと、第１の移動勾配を分離カラムに適用することであって、第１の移動相勾配は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および小分子添加剤（例えば、アミノ酸）またはギ酸（ＦＡ）および小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、第２の移動勾配を分離カラムに適用することであって、第２の移動相勾配は、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＴＦＡおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）またはＡＣＮ中のギ酸（ＦＡ）および小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、溶出した試料成分に対して質量分析を行うことと、を含む。【選択図】図３

Description

配列表の参照
本出願は、２０２１年１月７日に作成され、１８，８７８バイトを含むファイル１０６７５ＷＯ０１－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｔｘｔとしてコンピュータ可読形式で提出された配列表を参照により組み込む。

本発明は、質量スペクトル分析に関し、グリシンなどのアミノ酸または修飾アミノ酸の使用によって質量分析シグナルを増強する方法に関する。

液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）は、ペプチドおよびタンパク質治療薬を含む生体分子の特徴付けに使用される。ＬＣ－ＭＳは、組換えタンパク質ならびに翻訳後およびタンパク質修飾（例えば、ジスルフィド結合、グリコシル化およびリン酸化）の特徴付けのための強力な技術であるが、分離および感度が不十分であることが分かっている。例えば、グリコシル化は、抗体のトリプシン消化から生成された糖ペプチドを分析することによってペプチドレベルで特徴付けることができる。しかしながら、不均一なグリコフォームを有する糖ペプチドは、従来からペプチドマッピングに用いられる逆相ベースの液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）によっては十分に分離されないことが多い。さらに、オンライン質量分析（ＭＳ）によって誘発される糖ペプチドの糖鎖のインソース断片化が起こると、切断されたグリコフォームのアーチファクトが生じる場合があり、これにより、ＭＳを用いた異なるグリコフォームの相対存在量の正確な定量化が損なわれる可能性がある。

一態様において、本発明は、質量スペクトルシグナルを増強する方法を提供し、該方法は、試料成分が担体に結合することを可能にする条件下で、試料を分離カラムに接触させることと、第１の移動相勾配を分離カラムに適用することであって、第１の移動相勾配は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および小分子添加剤（例えば、アミノ酸）またはギ酸（ＦＡ）および小分子添加剤（例えば、アミノ酸）またはギ酸アンモニウムおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、第２の移動相勾配を分離カラムに適用することであって、第２の移動相勾配は、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＴＦＡおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のギ酸（ＦＡ）および小分子添加剤（例えば、アミノ酸）、または水およびアセトニトリル（ＡＣＮ）中のギ酸アンモニウムおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、溶出した試料成分に対して質量分析を行うことと、を含む。

一部の実施形態では、第１の移動相中の小分子添加剤は、グリシンである。

一部の実施形態では、第１の移動相中の小分子添加剤は、グリシンであり、濃度が約１ｍＭ～約２ｍＭのグリシンである。

一部の実施形態では、第１の移動相中のグリシン濃度は、約１ｍＭである。

一部の実施形態では、第１の移動相中のグリシン濃度は、約２ｍＭである。

一部の実施形態では、第２の移動相中の小分子添加剤は、グリシンである。

一部の実施形態では、第２の移動相中の小分子添加剤はグリシンであり、濃度が約１ｍＭ～約２ｍＭのグリシンである。

一部の実施形態では、第２の移動相中のグリシン濃度は、約１ｍＭである。

一部の実施形態では、第２の移動相中のグリシン濃度は、約２ｍＭである。

一部の実施形態では、第１の移動相中のＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中の約０．０５％～０．１％ＴＦＡであり、または第１の移動相中のＦＡ濃度は、約０．１％ＦＡである。

一部の実施形態では、第２の移動相中のＴＦＡ濃度は、８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の約０．０５％ＴＦＡまたは８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の約０．１％ＴＦＡを含む。

一部の実施形態では、第１の移動相中のギ酸アンモニウム濃度は５０ｍＭであり、ｐＨは４．４である。

一部の実施形態では、第２の移動相は、Ｈ_２Ｏ中で１５％の５０ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ４．４）、および８５％のＡＣＮを含む。

一部の実施形態では、試料は、ペプチド、ヌクレオチドまたはグリカンを含む。

一部の実施形態では、ペプチドは、糖ペプチドである。

一部の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される。

一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。

一部の実施形態では、本方法は、試料成分が担体に結合することを可能にする条件下で試料を分離カラムに接触させる前に試料を調製することをさらに含む。

一部の実施形態では、試料を調製することは、試料変性および還元を可能にする条件下で試料を変性および還元溶液と接触させることと、試料のアルキル化を可能にする条件下で変性および還元された試料をアルキル化溶液と接触させることと、試料の消化を可能にする条件下で、アルキル化された試料を消化溶液と接触させることと、試料の消化を停止する条件下で消化された試料をクエンチ溶液と接触させること、を含む。

一部の実施形態では、試料を調製することは、酵素または化学反応を使用して試料からグリカンを放出させることと、放出されたグリカンを蛍光標識で標識するか、または還元剤を使用して放出されたグリカンを還元することと、を含む。

一部の実施形態では、試料はモノクローナル抗体であり、消化溶液はプロテアーゼを含む。

一部の実施形態では、プロテアーゼはトリプシンを含む。

一部の実施形態では、分離カラムは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離カラムである。

一部の実施形態では、ＬＣ分離カラムは、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）液体クロマトグラフィーカラムを含む。

一部の実施形態では、溶出した試料成分に対して質量分析を行うことは、エレクトロスプレーイオン化を適用して溶出した試料成分から荷電イオンを生成することと、生成された荷電イオンを測定することと、を含む。

一部の実施形態では、本方法は、高荷電状態種（例えば、ｚ≧３）において、平均で約５～１４倍および／またはおよそ約２～１０００倍の増加によって示される、質量スペクトルシグナルを増強する。

一部の実施形態では、スペクトルシグナルは、高荷電状態種において、およそ１４倍および／またはおよそ１０００倍増加する。

一部の実施形態では、試料は糖ペプチドまたはグリカンを含有し、溶出した試料成分について取得された質量スペクトルシグナルは、小分子添加剤の非存在下で対照試料について取得される質量スペクトルシグナルに対して２倍～５０倍増強される。一部の場合では、糖ペプチドは、Ｏ－グリカン含有糖ペプチドである。一部の場合では、糖ペプチドは、Ｎ－グリカン含有糖ペプチドである。一部の場合では、グリカンは、Ｏ－グリカンである。一部の場合では、グリカンは、Ｎ－グリカンである。一部の場合では、Ｏ－グリカンまたはＮ－グリカンは、標識、任意選択でプロカインアミド、２－アミノベンズアミドまたはＲａｐｉＦｌｕｏｒに連結される。これらの実施形態のいずれにおいても、小分子添加剤はグリシンであってもよい。

様々な実施形態では、上記または本明細書で考察される実施形態の特徴または構成要素のうちのいずれかは組み合わせられ得、そのような組み合わせは本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察されるいずれの特定の値も、上記または本明細書で考察される別の関連値と組み合わされて、それらの値が範囲の上限および下限を表す範囲を列挙することができ、かかる範囲およびかかる範囲内にあるすべての値は本開示の範囲内に包含される。上記または本明細書で考察される値のうちの各々は、１％、５％、１０％または２０％の変動で表され得る。例えば、１０ｍＭの濃度は、１０ｍＭ±０．１ｍＭ（１％変動）、１０ｍＭ±０．５ｍＭ（５％変動）、１０ｍＭ±１ｍＭ（１０％変動）、または１０ｍＭ±２ｍＭとして表され得る（２０％変動）。他の実施形態は、後述の発明を実施するための形態の精査から明らかとなるであろう。

ＭＳブーストに対する種々の濃度のグリシンの効果、およびＭＳブーストに対する種々の試料ローディング量の効果を示す。ＭＳブーストに対する種々の濃度のグリシンの効果、およびＭＳブーストに対する種々の試料ローディング量の効果を示す。ＮＩＳＴｍＡｂの重鎖（配列番号１）および軽鎖（配列番号２）を示す。グリシン誘導体の化学構造を提供する。試薬（２ｍＭ）によるＮＩＳＴｍＡｂトリプシンペプチドの平均ＭＳ１ブースト倍率を示す。ＴＦＡ緩衝液にグリシンを添加した後のペプチドのクロマトグラフィー分離における最小の変化を示す。０．２５μｇのローディングＮＩＳＴｍＡｂを含むＴＦＡ緩衝液中の２ｍＭグリシンによるブーストの再現性を示す。図５に、以下のペプチド、すなわちＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＫ（配列番号３）、ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号４）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号３４）、ＤＭＩＦＮＦＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号５）、ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ（配列番号６）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号７）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号８）、ＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＡＧＭＳＶＧＷＩＲ（配列番号９）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）、ＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＧＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫ（配列番号１１）、ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号１２）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号１３）、ＨＹＮＰＳＬＫ（配列番号１４）、ＬＡＳＧＶＰＳＲ（配列番号１５）、ＬＬＩＹＤＴＳＫ（配列番号１６）、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号１７）、ＮＱＶＶＬＫ（配列番号１８）、ＱＶＴＬＲ（配列番号１９）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号２０）、ＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号２２）、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号２３）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ（配列番号２４）、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２５）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ（配列番号２６）、ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ（配列番号２７）、ＶＧＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号２８）、ＶＴＩＴＣＳＡＳＳＲ（配列番号２９）、ＶＴＮＭＤＰＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号３０）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３１）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号３２）、およびＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号３３）を示す。ＴＦＡ対照およびグリシンが存在し、ＮＩＳＴｍＡｂ消化物を２．５μｇ添加したＴＦＡで観察されたシグナル対ノイズ比を示す。グリシンが存在する場合の荷電状態の変化を示す。図７に、以下のペプチド、すなわちＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＫ（配列番号３）、ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号４）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号３４）、ＤＭＩＦＮＦＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号５）、ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ（配列番号６）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号７）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号８）、ＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＡＧＭＳＶＧＷＩＲ（配列番号９）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）、ＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＧＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫ（配列番号１１）、ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号１２）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号１３）、ＨＹＮＰＳＬＫ（配列番号１４）、ＬＡＳＧＶＰＳＲ（配列番号１５）、ＬＬＩＹＤＴＳＫ（配列番号１６）、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号１７）、ＮＱＶＶＬＫ（配列番号１８）、ＱＶＴＬＲ（配列番号１９）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号２０）、ＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号２２）、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号２３）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ（配列番号２４）、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２５）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ（配列番号２６）、ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ（配列番号２７）、ＶＧＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号２８）、ＶＴＩＴＣＳＡＳＳＲ（配列番号２９）、ＶＴＮＭＤＰＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号３０）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３１）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号３２）、およびＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号３３）を示す。配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドを用いて実施した研究を図８Ａに示し、配列番号１８の残基を有するペプチドを図８Ｂに示す。グリシンが存在する場合の荷電状態の変化を示す。図７に、以下のペプチド、すなわちＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＫ（配列番号３）、ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号４）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号３４）、ＤＭＩＦＮＦＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号５）、ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ（配列番号６）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号７）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号８）、ＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＡＧＭＳＶＧＷＩＲ（配列番号９）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）、ＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＧＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫ（配列番号１１）、ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号１２）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号１３）、ＨＹＮＰＳＬＫ（配列番号１４）、ＬＡＳＧＶＰＳＲ（配列番号１５）、ＬＬＩＹＤＴＳＫ（配列番号１６）、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号１７）、ＮＱＶＶＬＫ（配列番号１８）、ＱＶＴＬＲ（配列番号１９）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号２０）、ＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号２２）、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号２３）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ（配列番号２４）、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２５）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ（配列番号２６）、ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ（配列番号２７）、ＶＧＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号２８）、ＶＴＩＴＣＳＡＳＳＲ（配列番号２９）、ＶＴＮＭＤＰＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号３０）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３１）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号３２）、およびＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号３３）を示す。配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドを用いて実施した研究を図８Ａに示し、配列番号１８の残基を有するペプチドを図８Ｂに示す。グリシンが存在する場合の荷電状態の変化を示す。図７に、以下のペプチド、すなわちＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＫ（配列番号３）、ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号４）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号３４）、ＤＭＩＦＮＦＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号５）、ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ（配列番号６）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号７）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号８）、ＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＡＧＭＳＶＧＷＩＲ（配列番号９）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）、ＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＧＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫ（配列番号１１）、ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号１２）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号１３）、ＨＹＮＰＳＬＫ（配列番号１４）、ＬＡＳＧＶＰＳＲ（配列番号１５）、ＬＬＩＹＤＴＳＫ（配列番号１６）、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号１７）、ＮＱＶＶＬＫ（配列番号１８）、ＱＶＴＬＲ（配列番号１９）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号２０）、ＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号２２）、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号２３）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ（配列番号２４）、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２５）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ（配列番号２６）、ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ（配列番号２７）、ＶＧＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号２８）、ＶＴＩＴＣＳＡＳＳＲ（配列番号２９）、ＶＴＮＭＤＰＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号３０）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３１）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号３２）、およびＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号３３）を示す。配列番号９のアミノ酸配列を有するペプチドを用いて実施した研究を図８Ａに示し、配列番号１８の残基を有するペプチドを図８Ｂに示す。２ｍＭグリシン（ＴＦＡ緩衝液、０．２５μｇＮＩＳＴｍＡｂローディング）の存在および不在下でのＰＴＭ定量％を示す。ＴＦＡ対照と比較して、ＴＦＡまたはＦＡまたはＦＡ単独でのグリシンの存在によるブースト倍率を示す。図１０に、以下の残基を有するペプチド、すなわちＡＬＥＷＬＡＤＩＷＷＤＤＫ（配列番号３）、ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号４）、ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲ（配列番号３４）、ＤＭＩＦＮＦＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫ（配列番号５）、ＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫ（配列番号６）、ＤＴＬＭＩＳＲ（配列番号７）、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号８）、ＥＳＧＰＡＬＶＫＰＴＱＴＬＴＬＴＣＴＦＳＧＦＳＬＳＴＡＧＭＳＶＧＷＩＲ（配列番号９）、ＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫ（配列番号１０）、ＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＧＹＰＦＴＦＧＧＧＴＫ（配列番号１１）、ＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫ（配列番号１２）、ＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号１３）、ＨＹＮＰＳＬＫ（配列番号１４）、ＬＡＳＧＶＰＳＲ（配列番号１５）、ＬＬＩＹＤＴＳＫ（配列番号１６）、ＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫ（配列番号１７）、ＮＱＶＶＬＫ（配列番号１８）、ＱＶＴＬＲ（配列番号１９）、ＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲ（配列番号２０）、ＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号２１）、ＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号２２）、ＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫ（配列番号２３）、ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫ（配列番号２４）、ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２５）、ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫ（配列番号２６）、ＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫ（配列番号２７）、ＶＧＹＭＨＷＹＱＱＫＰＧＫ（配列番号２８）、ＶＴＩＴＣＳＡＳＳＲ（配列番号２９）、ＶＴＮＭＤＰＡＤＴＡＴＹＹＣＡＲ（配列番号３０）、ＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号３１）、ＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫ（配列番号３２）、およびＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫ（配列番号３３）を示す。２ｍＭグリシンによる個々のアミノ酸のブースト倍率を示す。ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ（配列番号２５）ペプチドに対する市販のグリシン製剤中の微量ナトリウムの効果を示す。ＰＲＭおよびフルスキャンを使用したＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫ（配列番号２２）ペプチドの定量化の比較を提供する。９残基ペプチドの糖ペプチド分析について、逆相に対するＨＩＬＩＣベースの液体クロマトグラフィーの一部の利点を示す。ＭＳ１およびＭＳ２の両方についてグリシン添加緩衝液中で観察されたシグナルブーストを示す。２ｍＭのグリシンが結合を妨げることを示す。ＩＰ－ＨＩＬＩＣベースのＬＣによる糖ペプチド分析のための例示的な試料調製ワークフロー概略図である。ＳｅｐＰａｋ３０カートリッジによる脱塩が上昇したベースラインを排除した脱塩の効果を示す（矢印を参照）。ピーク面積に対するグリシンの効果を示す表を提供する。ピーク面積に対するグリシンの効果を示す表を提供する。評価されたｍＡｂにおけるすべてのグリコフォームのピーク面積を示す。評価されたｍＡｂにおけるすべてのグリコフォームのピーク面積を示す。９残基ペプチドの１ｍＭグリシンの存在における荷電状態シフトによる断片化能力の増強を示す。グリシンがＶＥＧＦＴＲＡＰにおいてペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）およびグリコフォームの数を増加させたことを示す。Ｂｙｏｌｏｇｉｃ検証後にＦＡと比較してＴＦＡ＋グリシンを使用した場合に同定された配列変異体の数を示す。ギ酸アンモニウム移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清中Ｎ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたヒト血清からのＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの質量分析（ＭＳ）抽出イオンクロマトグラフ（ＥＩＣ）および蛍光（ＦＬＲ）クロマトグラムトレースを示す。ギ酸アンモニウム移動相中のＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの総ＭＳシグナルを示す。図２６Ａおよび２６Ｃは、ギ酸アンモニウム移動相中に１ｍＭグリシンを含めることによる、ＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強の倍率を示す。図２６Ｂは、ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンのＭＳＥＩＣピーク面積を示す。ギ酸アンモニウム移動相中のＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの総ＭＳシグナルを示す。図２６Ａおよび２６Ｃは、ギ酸アンモニウム移動相中に１ｍＭグリシンを含めることによる、ＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強の倍率を示す。図２６Ｂは、ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンのＭＳＥＩＣピーク面積を示す。ギ酸アンモニウム移動相中のＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの総ＭＳシグナルを示す。図２６Ａおよび２６Ｃは、ギ酸アンモニウム移動相中に１ｍＭグリシンを含めることによる、ＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強の倍率を示す。図２６Ｂは、ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンのＭＳＥＩＣピーク面積を示す。グリシン含有移動相を用いた質量クロマトグラムが、対照移動相における質量クロマトグラムよりもＦＬＲによく似ていることを示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相を使用してＨＩＬＩＣによって分析したヒト血清からのＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの質量ＥＩＣおよびＦＬＲクロマトグラムトレースを重ね合わせたものを示す。ギ酸アンモニウム移動相中のグリシンを含む場合および含まない場合のＰＲＯＣＡ標識血清中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたＦＡ２Ｇ２のピーク面積に対して正規化されたＦＬＲまたはＭＳＥＩＣピーク面積に基づくＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの相対レベルを示す。ギ酸アンモニウム移動相中のグリシンを含む場合および含まない場合のＰＲＯＣＡ標識血清中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたＦＡ２Ｇ２のピーク面積に対して正規化されたＦＬＲまたはＭＳＥＩＣピーク面積に基づくＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの相対レベルを示す。ギ酸アンモニウム移動相中のグリシンを含む場合および含まない場合のＰＲＯＣＡ標識血清中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたＦＡ２Ｇ２のピーク面積に対して正規化されたＦＬＲまたはＭＳＥＩＣピーク面積に基づくＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンの相対レベルを示す。ＰＲＯＣＡ標識グリカンＭＳピーク面積が、グリシンを含むギ酸アンモニウム移動相におけるＦＬＲピーク面積により比例することを示す。１ｍＭグリシン添加剤を含まない（対照）および含む（グリシン）ギ酸アンモニウム移動相を使用した分析についての血清Ｎ－グリカンＥＩＣピーク面積対ＦＬＲピーク面積（対数スケール）の散布図を示す。各条件についての式および線形回帰のＲ二乗値を示す。対照条件と比較してグリシン条件のＲ二乗値が小さいことは、移動相にグリシンを添加したＭＳによって、ＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンをより正確に定量化できることを実証している。ギ酸移動相中のグリシンによるＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンのＭＳシグナルブーストを示す。図３０Ａおよび図３０Ｃは、ＨＩＬＩＣによって分析された０．１％ＦＡ移動相中に１ｍＭグリシンを含めることによる、ＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強の倍率を示す。図３０Ｂは、０．１％ＦＡ移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンのＭＳＥＩＣピーク面積を示す。ギ酸移動相中のグリシンによるＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンのＭＳシグナルブーストを示す。図３０Ａおよび図３０Ｃは、ＨＩＬＩＣによって分析された０．１％ＦＡ移動相中に１ｍＭグリシンを含めることによる、ＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強の倍率を示す。図３０Ｂは、０．１％ＦＡ移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンのＭＳＥＩＣピーク面積を示す。ギ酸移動相中のグリシンによるＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンのＭＳシグナルブーストを示す。図３０Ａおよび図３０Ｃは、ＨＩＬＩＣによって分析された０．１％ＦＡ移動相中に１ｍＭグリシンを含めることによる、ＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強の倍率を示す。図３０Ｂは、０．１％ＦＡ移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相におけるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンのＭＳＥＩＣピーク面積を示す。ギ酸アンモニウム移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合のＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識血漿中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたＦＡ２Ｇ２のピーク面積に対して正規化されたＦＬＲまたはＭＳＥＩＣピーク面積に基づくＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識Ｎ－グリカンの相対レベルを示す。図３１Ａはまた、グリシン添加剤によるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強および荷電状態シフトの倍率を示す。ギ酸アンモニウム移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合のＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識血漿中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたＦＡ２Ｇ２のピーク面積に対して正規化されたＦＬＲまたはＭＳＥＩＣピーク面積に基づくＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識Ｎ－グリカンの相対レベルを示す。図３１Ａはまた、グリシン添加剤によるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強および荷電状態シフトの倍率を示す。ギ酸アンモニウム移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合のＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識血漿中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析されたＦＡ２Ｇ２のピーク面積に対して正規化されたＦＬＲまたはＭＳＥＩＣピーク面積に基づくＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識Ｎ－グリカンの相対レベルを示す。図３１Ａはまた、グリシン添加剤によるＰＲＯＣＡ標識血清Ｎ－グリカンについてのＭＳシグナル増強および荷電状態シフトの倍率を示す。ギ酸アンモニウム移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合の減少した血清中Ｎ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシンを含む同じ移動相（グリシン）を使用してＨＩＬＩＣによって分析した還元血清Ｎ－グリカンのＭＳシグナル変化および平均荷電状態を示す表を示す。標識または還元Ｎ－グリカンの分析のためのＬＣ－ＦＬＲ－ＭＳ条件を示す。Ｏ－グリカン調製ならびにＬＣ－ＭＳおよびＦＬＲ検出による分析のための例示的な方法を示す。カラム上のウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）２μｇからのＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカン、蛍光および最適化還元的アミン化を示す。ＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカンＦＬおよびＭＳＴＩＣプロファイルがほぼ同等であることを実証する。ギ酸アンモニウム移動相中のグリシンを含む場合および含まない場合のＰＲＯＣＡ標識ウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）Ｏ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。図３７Ａは、ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相を使用してＨＩＬＩＣによって分析したＢＳＭからのＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカンのＭＳＥＩＣおよびＦＬＲクロマトグラムトレースを示す。図３７Ｂは、移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合のＯ－グリカンＦＬＲおよびＭＳピーク強度（ＨｅｘＮＡｃ１ＮｅｕＡｃ１のものに対して正規化された）の比較を示す。ギ酸アンモニウム移動相中のグリシンを含む場合および含まない場合のＰＲＯＣＡ標識ウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）Ｏ－グリカンＭＳピーク強度の比較を示す。図３７Ａは、ギ酸アンモニウム含有移動相（対照）および追加の１ｍＭグリシン（グリシン）を含む同じ移動相を使用してＨＩＬＩＣによって分析したＢＳＭからのＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカンのＭＳＥＩＣおよびＦＬＲクロマトグラムトレースを示す。図３７Ｂは、移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合のＯ－グリカンＦＬＲおよびＭＳピーク強度（ＨｅｘＮＡｃ１ＮｅｕＡｃ１のものに対して正規化された）の比較を示す。種々の標識の有無におけるＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ａは、ＰＲＯＣＡ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ｂは、２ＡＢ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ｃは、還元ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。種々の標識の有無におけるＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ａは、ＰＲＯＣＡ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ｂは、２ＡＢ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ｃは、還元ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。種々の標識の有無におけるＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ａは、ＰＲＯＣＡ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ｂは、２ＡＢ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。図３８Ｃは、還元ＢＳＭＯ－グリカンに対するグリシンのブースト効果を示す。標識または還元Ｏ－グリカンの分析のための例示的なＬＣ－ＦＬＲ－ＭＳ条件を示す。ビーズ精製を使用した場合に非常に低いレベルを有するＯ－グリカン構造のＭＳ２確認に対するグリシンの効果を示す。ビーズ精製を使用した場合に非常に低いレベルを有するＯ－グリカン構造のＭＳ２確認に対するグリシンの効果を示す。グリシン添加剤の存在およびグリシンなしでの最適化されたＩＰ－ＨＩＬＩＣ条件下での典型的なＩｇＧ４のＴＩＣプロファイルを示す。１ｍＭグリシンを含有する移動相および対照条件を使用するＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析のためのｍＡｂ１トリプシン消化物のＵＶクロマトグラムトレースを示す。ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳについて異なる長さの線形勾配を用いたアイソフォーム（左）と複数のグリコフォーム（右）の分離の比較を示す。ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳについて異なる長さの線形勾配を用いたアイソフォーム（左）と複数のグリコフォーム（右）の分離の比較を示す。ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳについて異なる長さの線形勾配を用いたアイソフォーム（左）と複数のグリコフォーム（右）の分離の比較を示す。ＩｇＧ４由来の糖ペプチドのタンデム質量スペクトルの例を示す。糖ペプチドについてすべてのＰＳＭ内で最高スコアを有するスペクトルを示す。ＩｇＧ４由来の糖ペプチドのタンデム質量スペクトルの例を示す。糖ペプチドについてすべてのＰＳＭ内で最高スコアを有するスペクトルを示す。ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを用いて分析したｍＡｂ２の糖ペプチドのＥＩＣピークを示す。カートンは、グリカンの統一記号命名法（ＳＮＦＧ）、すなわち、四角（Ｎ－アセチルグルコサミン）、三角（フコース）、丸（マンノース）、丸（ガラクトース、菱形（Ｎ－アセチルノイラミン酸）を用いたグリカン構造を表す。ｐＨ５．５でＨＩＬＩＣ－ＦＬＲ－ＭＳを使用して分析したｍＡｂ２から放出されたグリカンのＥＩＣピークを示す。８０分の勾配を用いたＩｇＧ４からのトリプシンペプチドのＲＰＬＣ－ＭＳを示す。すべてのグリコフォームが単一クラスターで溶出しており（右パネル）、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳにおける効率的なグリコフォーム分離は、インソース断片化から生成された人工グリコフォームを排除する（左パネル）。８０分の勾配を用いたＩｇＧ４からのトリプシンペプチドのＲＰＬＣ－ＭＳを示す。すべてのグリコフォームが単一クラスターで溶出しており（右パネル）、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳにおける効率的なグリコフォーム分離は、インソース断片化から生成された人工グリコフォームを排除する（左パネル）。図３５Ａの絶対ＥＩＣピーク面積および図３５Ｂの各個々のグリカンの相対存在量として示されるように、Ｆｃグリコシル化部位Ｎ２９７におけるｍＡｂ１のすべてのグリコフォームを、グリシンを含む場合および含まない場合のＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ実行に基づいて定量化して示す。図３５Ａの絶対ＥＩＣピーク面積および図３５Ｂの各個々のグリカンの相対存在量として示されるように、Ｆｃグリコシル化部位Ｎ２９７におけるｍＡｂ１のすべてのグリコフォームを、グリシンを含む場合および含まない場合のＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ実行に基づいて定量化して示す。ｍＡｂ１（ＩｇＧ４）からの個々のグリコフォームについて測定されたＥＩＣピーク面積および相対的定量の表を示す。ｍＡｂ５（ＩｇＧ１）－ＴＩＣクロマトグラムについての糖ペプチド分析と、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用して分析された最も豊富な１０種のグリコフォームの溶出プロファイルと、ＲＰＬＣ－ＭＳを使用して分析された最も豊富な１０種のグリコフォームの溶出プロファイルと、それぞれの個々のグリコフォームについてのグリシン支援ＥＳＩシグナルブーストと、それぞれの同定されたグリコフォームの相対割合と、を示す。ｍＡｂ５（ＩｇＧ１）－ＴＩＣクロマトグラムについての糖ペプチド分析と、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用して分析された最も豊富な１０種のグリコフォームの溶出プロファイルと、ＲＰＬＣ－ＭＳを使用して分析された最も豊富な１０種のグリコフォームの溶出プロファイルと、それぞれの個々のグリコフォームについてのグリシン支援ＥＳＩシグナルブーストと、それぞれの同定されたグリコフォームの相対割合と、を示す。ｍＡｂ５（ＩｇＧ１）－ＴＩＣクロマトグラムについての糖ペプチド分析と、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用して分析された最も豊富な１０種のグリコフォームの溶出プロファイルと、ＲＰＬＣ－ＭＳを使用して分析された最も豊富な１０種のグリコフォームの溶出プロファイルと、それぞれの個々のグリコフォームについてのグリシン支援ＥＳＩシグナルブーストと、それぞれの同定されたグリコフォームの相対割合と、を示す。ｍＡｂ５（ＩｇＧ１）からの個々のグリコフォームについて測定されたＥＩＣピーク面積および相対的定量の表を示す。＊対照試料中のグリコフォームのピーク面積が不十分な検出のために低い場合、倍率変化は劇的に増加する。０．１％ＴＦＡ（図３５Ｇ）またはシグナルブースターとして０．１％ＴＦＡ＋１ｍＭグリシン（図３５Ｆ）を含有する移動相を使用するＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳによって分析されたｆＰ１由来のトリプシンペプチドからのタンデム質量スペクトルの例を示す。両方のスペクトルは、この糖ペプチドについてすべてのＰＳＭ内でランク付けされた最も高いスコアを有する。０．１％ＴＦＡ（図３５Ｇ）またはシグナルブースターとして０．１％ＴＦＡ＋１ｍＭグリシン（図３５Ｆ）を含有する移動相を使用するＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳによって分析されたｆＰ１由来のトリプシンペプチドからのタンデム質量スペクトルの例を示す。両方のスペクトルは、この糖ペプチドについてすべてのＰＳＭ内でランク付けされた最も高いスコアを有する。異なる分離方法（ＴＦＡを用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ、ＦＡを用いたＨＩＬＩＣおよびＴＦＡを用いたＲＰＬＣ）の間でのＦｃドメイン融合タンパク質ｆＰ１の糖ペプチド同定の比較を示す。１ｍＭのグリシンをすべての実験に適用して、ＭＳ検出中のイオン抑制の影響を排除する。図３６Ａは、完全な部位特異的グリコシル化マップを示す。図３６Ｂは、異なる方法で同定された糖ペプチドの数をまとめたものを示す。異なる分離方法（ＴＦＡを用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ、ＦＡを用いたＨＩＬＩＣおよびＴＦＡを用いたＲＰＬＣ）の間でのＦｃドメイン融合タンパク質ｆＰ１の糖ペプチド同定の比較を示す。１ｍＭのグリシンをすべての実験に適用して、ＭＳ検出中のイオン抑制の影響を排除する。図３６Ａは、完全な部位特異的グリコシル化マップを示す。図３６Ｂは、異なる方法で同定された糖ペプチドの数をまとめたものを示す。異なるグリコサイト含有ペプチドについてのグリシンベースのシグナル倍率変化を示す。ＴＦＡを用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ（上パネル）、ＦＡを用いたＨＩＬＩＣ－ＭＳ（中パネル）、およびＴＦＡを用いたＲＰＬＣ－ＭＳ（下パネル）によって分析された消化されたｆＰ１のオキソニウムイオン抽出（黄色トレース）およびＴＩＣ（他のトレース）プロファイルを示す。ｆＰ１由来の７つのグリコサイト含有ペプチドにおける４つの代表的なグリコフォームのＥＩＣピークを示す。ペプチド配列上の色は、ヒドロキシル、アミドまたは一級アミン基を含有する極性残基（オレンジ色）およびグアニジノ基を含有する強い極性残基（赤色）、およびグリコシル化アスパラギン（青色）として示される、親水性に潜在的に寄与するアミノ酸を示す。非標準Ｎ－グリコシル化部位における糖ペプチドおよびｍＡｂ３において同定された非占有ペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。非標準Ｎ－グリコシル化部位における糖ペプチドおよびｍＡｂ３において同定された非占有ペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用して分析されたｍＡｂ３の非標準部位における低存在量Ｎ－グリコシル化の相対割合を示す。ｍＡｂ４において同定されたＯ－結合糖ペプチドおよび非占有ペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。ｍＡｂ４において同定されたＯ－結合糖ペプチドおよび非占有ペプチドのタンデム質量スペクトルを示す。（Ａ）（Ｃ）グリシンを用いたＲＰＬＣ－ＭＳおよび（Ｂ）（Ｄ）４．５μｇの試料注入を用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳの下で取得されたｍＡｂ３についての低存在量非標準Ｎ－グリコシル化ペプチドおよびベースピーククロマトグラム（ＢＰＣ）についてのＥＩＣを示す。ＭＳピーク強度は、最も高いピークを使用して正規化されている。ピーク番号１～４は、それぞれＮ９１でのＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびＮ１６３でのＦＡ２Ｇ２を表す。（Ａ）（Ｃ）グリシンを用いたＲＰＬＣ－ＭＳおよび（Ｂ）（Ｄ）４．５μｇの試料注入を用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳの下で取得されたｍＡｂ３についての低存在量非標準Ｎ－グリコシル化ペプチドおよびベースピーククロマトグラム（ＢＰＣ）についてのＥＩＣを示す。ＭＳピーク強度は、最も高いピークを使用して正規化されている。ピーク番号１～４は、それぞれＮ９１でのＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびＮ１６３でのＦＡ２Ｇ２を表す。（Ａ）（Ｃ）グリシンを用いたＲＰＬＣ－ＭＳおよび（Ｂ）（Ｄ）４．５μｇの試料注入を用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳの下で取得されたｍＡｂ３についての低存在量非標準Ｎ－グリコシル化ペプチドおよびベースピーククロマトグラム（ＢＰＣ）についてのＥＩＣを示す。ＭＳピーク強度は、最も高いピークを使用して正規化されている。ピーク番号１～４は、それぞれＮ９１でのＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびＮ１６３でのＦＡ２Ｇ２を表す。（Ａ）（Ｃ）グリシンを用いたＲＰＬＣ－ＭＳおよび（Ｂ）（Ｄ）４．５μｇの試料注入を用いたＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳの下で取得されたｍＡｂ３についての低存在量非標準Ｎ－グリコシル化ペプチドおよびベースピーククロマトグラム（ＢＰＣ）についてのＥＩＣを示す。ＭＳピーク強度は、最も高いピークを使用して正規化されている。ピーク番号１～４は、それぞれＮ９１でのＭａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７およびＮ１６３でのＦＡ２Ｇ２を表す。ｍＡｂ４中の同定されたＯ－結合糖ペプチドのＭＳ１抽出を示す。

本発明が記載される前に、記載される特定の方法および実験条件が異なり得るため、本発明がかかる方法および条件に限定されないことを、理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲が添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを企図するものではないことも理解されるべきである。任意の実施形態または実施形態の特徴は、互いに組み合わせることができ、そのような組み合わせは、本発明の範囲内に明示的に含まれる。

別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の列挙された数値に関して使用されるとき、その値が列挙された値から１％以下だけ変動し得ることを意味する。例えば、本明細書で使用される場合、「約１００」という表現は、９９および１０１ならびにそれらの間の全ての値（例えば、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４など）を含む。

本明細書に記載されるものと同様または同等のいずれの方法および材料も本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料をこれから説明する。本明細書において言及されるすべての特許、出願および非特許刊行物は、それらの全体の参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される略語
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＥＳＩ－ＭＳ：エレクトロスプレーイオン化質量分析
ＦＡ：ギ酸
ＦＬＲ：蛍光検出
ＨＣ：重鎖
ＨＥＳＩ：加熱エレクトロスプレーイオン化
ＨＩＬＩＣ：親水性相互作用液体クロマトグラフィー
ＩＰ－ＨＩＬＩＣ：イオン対親水性相互作用クロマトグラフィー
ＩｇＧ：免疫グロブリンＧ
ＬＣ：軽鎖
ＬＣ－ＭＳ：液体クロマトグラフィー－質量分析
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＰＡ：移動相Ａ
ＭＰＢ：移動相Ｂ
ＭＳ：質量分析
ＭＷ：分子量
ＰＲＯＣＡ：プロカインアミド
２－ＡＢ：２－アミノベンズアミド
ＰＴＭ：翻訳後修飾
ＲＰＬＣ：逆相液体クロマトグラフィー
ＲＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ：逆相液体クロマトグラフィータンデム質量分析
ＳＰＥ：固相抽出
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＵＶ：紫外線

定義
本明細書で使用する「抗体」という用語は、４つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続された２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖からなる免疫グロブリン分子（すなわち、「完全抗体分子」）、ならびにこれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）またはその抗原結合断片を指すよう企図される。各重鎖は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」または「Ｖ_Ｈ」）および重鎖定常領域（Ｃ_Ｈ１ドメイン、Ｃ_Ｈ２ドメインおよびＣ_Ｈ３ドメインからなる）からなる。種々の実施形態において、重鎖は、ＩｇＧアイソタイプのものであり得る。一部の場合において、重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４から選択される。一部の実施形態、重鎖は、アイソタイプＩｇＧ１／ＩｇＧ２またはＩｇＧ４／ＩｇＧ２のキメラヒンジ領域を任意で含む、アイソタイプＩｇＧ１またはＩｇＧ４の重鎖である。各軽鎖は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲまたは「Ｖ_Ｌ」）および軽鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）からなる。Ｖ_Ｈ領域およびＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域へとさらに細分することができる。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなる。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプまたはサブクラスのグリコシル化および非グリコシル化免疫グロブリンの両方への言及を含む。「抗体」という用語は、組換え手段によって調製、発現、作製または単離された抗体分子、例えば、抗体を発現するようにトランスフェクトされた宿主細胞から単離された抗体を含む。抗体構造に関する総説については、Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．，ＩＭＧＴｕｎｉｑｕｅｎｕｍｂｅｒｉｎｇｆｏｒｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎａｎｄＴｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒｖａｒｉａｂｌｅｄｏｍａｉｎｓａｎｄＩｇｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙＶ－ｌｉｋｅｄｏｍａｉｎｓ，２７（１）Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５－７７（２００３）；およびＭ．Ｐｏｔｔｅｒ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｏｆｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，２（１）Ｓｕｒｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．２７－４２（１９８３）を参照されたい。

抗体という用語はまた、２つ以上の異なるエピトープに結合することができるヘテロ四量体免疫グロブリンを含む「二重特異性抗体」を包含する。単一の重鎖および単一の軽鎖ならびに６つのＣＤＲを含む二重特異性抗体の半分は、１つの抗原またはエピトープに結合し、抗体のもう半分は、異なる抗原またはエピトープに結合する。一部の場合において、二重特異性抗体は、同じ抗原に結合することができるが、異なるエピトープまたは非重複エピトープにおいて結合することができる。一部の場合において、二重特異性抗体の両半分は、二重特異性を保持しながら同一の軽鎖を有する。二重特異性抗体は、米国特許出願公開第２０１０／０３３１５２７号（２０１０年１２月３０日）に概して記載されている。

抗体の「抗原結合部分」（または「抗体断片」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片と、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片と、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄｅｔａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ２４１：５４４－５４６）と、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、および（ｖｉｉ）ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖を形成するように合成リンカーによって連結されたＦｖ断片の２つのドメインである、ＶＬおよびＶＨからなるｓｃＦｖと、が挙げられる。ダイアボディなどの一本鎖抗体の他の形態も、「抗体」という用語に包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒｅｔａｔ．（１９９３）９０ＰＮＡＳＵ．Ｓ．Ａ．６４４４－６４４８；およびＰｏｌｊａｋｅｔａｔ．（１９９４）２Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ１１２１－１１２３を参照されたい）。

さらに、抗体およびその抗原結合断片は、当該分野で概して公知の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９を参照されたい）。トランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するための方法もまた、当該分野で公知である。例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５９６，５４１号、ＲｅｇｅｎｅｒｏｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）を参照されたい）またはモノクローナル抗体を生成するための任意の他の公知の方法を使用して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する所望の抗原に対する高親和性キメラ抗体が最初に単離される。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に対する応答においてヒト可変領域と、マウス定常領域と、を含む、抗体を生成するように、ヒト重鎖可変領域と、ヒト軽鎖可変領域と、を含む、ゲノムが内在性マウス定常領域座に動作可能に連結されたトランスジェニックマウスの生成を包含する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域をコードするＤＮＡに動作可能に連結する。次に、完全ヒト抗体を発現することができる細胞においてＤＮＡを発現させる。

「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を含むことを意図する。本発明のヒトｍＡｂは、例えば、ＣＤＲ、特にＣＤＲ３における、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列（例えば、インビトロでのランダムもしくは部位特異的変異誘発によってまたはインビボでの体細胞突変異によって導入された変異）によってコードされないアミノ酸残基を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトＦＲ配列へと移植されたｍＡｂを含むことは企図されない。この用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組換え産生された抗体を含む。この用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生成された抗体を含むよう意図されるものではない。

本明細書で使用される「糖ペプチド／糖タンパク質」という用語は、それらの合成中または合成後に、共有結合した炭水化物またはグリカンを有する修飾されたペプチド／タンパク質である。ある特定の実施形態では、糖ペプチドは、モノクローナル抗体から、例えば、モノクローナル抗体のプロテアーゼ消化物から取得される。

本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、１つ以上の糖単位を含む化合物である。これらは概してグルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、フコース（Ｆｕｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびＮ－アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＮＡｃ）を含む（ＦｒａｎｋＫｊｅｌｄｓｅｎ，ｅｔａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３，７５，２３５５－２３６１）。モノクローナル抗体などの糖タンパク質のグリカン部分は、その機能または細胞内の位置を特定するための重要な特性である。例えば特定のモノクローナル抗体は、特定のグリカン部分で修飾される。

「親水性相互作用クロマトグラフィー」という用語またはＨＩＬＩＣは、親水性化合物が疎水性化合物より長く保持される、親水性固定相および疎水性有機移動相を使用するプロセスを含むことが意図される。ある特定の実施形態では、本方法は、水混和性溶媒移動相を利用する。

本明細書で使用される「試料」という用語は、少なくとも分析物分子、例えば、モノクローナル抗体から得られるような糖ペプチドを含み、例えば、分離、分析、抽出、濃縮、または「プロファイリング」を含む、本発明の方法に従って操作される分子の混合物を指す。

「分析」または「分析すること」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的に使用され、目的の分子（糖タンパク質など）を分離、検出、単離、精製、可溶化、検出、および／または特性評価する種々の方法のいずれかを指す。例としては、これらに限定されないが、固相抽出、固相マイクロ抽出、電気泳動、質量分析（例えば、ＥＳＩ－ＭＳ、ＳＰＥＨＩＬＩＣ、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー（例えば、高速、例えば、逆相、順相、またはサイズ排除）、イオン対液体クロマトグラフィー、液－液抽出（例えば、加速流体抽出、超臨界流体抽出、マイクロ波支援抽出、膜抽出、ソックスレー抽出）、沈殿、清澄化、電気化学検出、染色、元素分析、エドモンド分解、核磁気共鳴、赤外線分析、フローインジェクション分析、キャピラリー電気クロマトグラフィー、紫外線検出、およびそれらの組み合わせなどが挙げられる。

本明細書で使用される「プロファイリング」という用語は、試料中の糖ペプチドの含量、組成、または特徴的な比を提供するために組み合わせて使用される種々の分析方法のいずれかを指す。

「エレクトロスプレーイオン化質量分析」または「ＥＳＩ－ＭＳ」は、高電圧が液体に印加されてエアロゾルを生成するエレクトロスプレーを使用してイオンを生成するために質量分析において使用される技術である。例えば、エレクトロスプレーでは、イオンは溶液中のタンパク質から生成され、脆弱な分子を無傷でイオン化することを可能にし、非共有結合相互作用を保存することができる。エレクトロスプレーイオン化は、液体クロマトグラフィーと質量分析（ＬＣ－ＭＳ）とを組み合わせるためのイオン源として選択される。分析は、ＬＣカラムから溶出する液体をエレクトロスプレーに直接供給することによってオンラインで、または古典的なナノエレクトロスプレー質量分析装置で後に分析される画分を収集することによってオフラインで行うことができる。ＬＣ－ＭＳは、タンパク質の特徴付けに使用することができ、これには、バイオマーカーの定量化、配列変異体の分析、ならびに糖ペプチドの同定および定量化が含まれる。

本明細書で使用される場合、「接触させること」は、少なくとも２つの物質を溶液または固相で一緒にすることを含む。

一般的な説明
したがって、感度が向上したタンパク質特徴付け方法が必要とされている。開示された発明は、かかる必要性に応えるものである。

質量分析検出感度を増加させる、ＬＣ－ＭＳベースのタンパク質特徴付けの新しい方法が本明細書に開示される。この新しい方法は、本明細書において報告される研究に基づいており、本発明者らは、液体クロマトグラフィー中に移動相溶液中に小分子添加剤（例えば、アミノ酸または修飾アミノ酸）を含めることが、かかる小分子添加剤の非存在下で生成されるシグナルと比較して、質量スペクトルシグナルの有意なブーストをもたらすという驚くべき発見をした。本発明者らはまた、かかる添加剤、例えば、アミノ酸（例えば、グリシン）の存在が、移動相緩衝液に添加された場合、ＬＣカラム上のペプチドおよびグリカンの保持およびクロマトグラフィー分離に影響を及ぼさないことを見出した。さらに、ペプチドおよびグリカンのシグナルブースト、荷電状態シフトおよびＰＴＭ定量に対する添加剤、例えばグリシンなどのアミノ酸の効果は再現可能であった。さらに、ＴＦＡおよびグリシン緩衝液は、タンパク質定量において定量化下限（ＬＬＯＱ）を改善し、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＬＣ－ＭＳ法において通常のＴＦＡ緩衝液と比較して相対的定量に影響を及ぼすことなく糖ペプチドをより確実に同定し、配列変異体分析に通常使用されるＦＡ緩衝液と比較して相補的情報を生成しながらより多くの配列変異体を同定することが見出された。したがって、開示される発見は、質量分析検出感度を改善することを介して、ＬＣ－ＭＳベースのタンパク質特徴付けに対して非常に広範囲の用途を有している。一部の実施形態では、開示される方法は、バイオマーカー定量、配列変異体分析および／もしくはペプチド、例えば、糖ペプチド、ならびに／またはＬＣ－ＭＳによるグリカンの同定および定量のために使用することができる。

一部の実施形態では、本方法は、試料成分が担体に結合することを可能にする条件下で、試料を分離カラムに接触させることと、分離カラムに移動勾配を適用することであって、移動勾配緩衝液は、小分子添加剤（例えば、アミノ酸）およびＴＦＡ、ＦＡ、ギ酸アンモニウムおよび／またはＡＣＮを含む、適用することと、溶出した試料成分に対して質量分析を行うことと、を含む。

使用される移動相は、イオン対形成剤（例えば、アセトニトリルおよび水）を含む緩衝液および含まない緩衝液を含み得る。イオン対形成剤としては、ギ酸塩、酢酸塩、ＴＦＡおよび塩が挙げられる。緩衝液の勾配を使用することができ、例えば、２つの緩衝液が使用される場合、第１の緩衝液の濃度または割合が減少し得る一方で、第２の緩衝液の濃度または割合は、クロマトグラフィー実行の過程にわたって増加する。例えば、第１の緩衝液の割合は、クロマトグラフィー実行の過程にわたって、約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、または約４０％から、約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％まで減少し得る。別の例として、第２の緩衝液の割合は、同じ実行の過程にわたって、約０％、約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、または約４０％から、約１００％、約９９％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５０％、約４５％、または約４０％まで増加し得る。任意選択で、第１および第２の緩衝液の濃度または割合は、クロマトグラフィー実行の終了時にそれらの出発値に戻ることができる。一例として、第１の緩衝液の割合は、８５％から６３％、５９％、１０％、８５％の５段階で変化し得るが、同じ段階における第２の緩衝液の割合は、１５％から３７％、４１％、９０％、１５％の５段階で変化する。割合は、線形勾配として、または非線形（例えば、段階的）方式で徐々に変化し得る。例えば、勾配は、多相（例えば、二相、三相など）であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、イオン対形成剤を使用せずに移動相の極性の増加に対応するアセトニトリル緩衝液勾配の減少を使用する。

一部の実施形態では、分離カラムに移動勾配を適用することは、第１の移動勾配緩衝液を分離カラムに適用することであって、第１の移動相緩衝液は、ＴＦＡおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）、ＦＡおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）、またはギ酸アンモニウムおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）を含む、適用することと、第２の移動勾配を分離カラムに適用することであって、第２の移動相緩衝液は、ＡＣＮ中のＴＦＡおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）、ＡＣＮ中のＦＡおよび小分子添加剤（例えば、アミノ酸）、または水／ＡＣＮ中のギ酸アンモニウムおよび小分子添加剤を含む、適用することと、を含む。

種々の実施形態では、小分子添加剤は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、またはＮ－メチルグリシンから選択される。一部の場合では、アミノ酸は、グリシン、アラニン、セリンまたはバリンから選択される。一部の実施形態では、アミノ酸はアラニンである。一部の実施形態では、アミノ酸はセリンである。一部の実施形態では、アミノ酸はバリンである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンである。一部の実施形態では、第１および第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンである。一部の実施形態では、第１および／または第２の移動相緩衝液中の小分子添加剤（例えば、アミノ酸）は、小分子（例えば、修飾アミノ酸）または上記もしくは本明細書中で同定された他のアミノ酸のうちの１つである。

移動相緩衝液中の小分子添加剤（例えば、アミノ酸）の濃度は、約０．５ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．５ｍＭ～約３ｍＭ、約１ｍＭ～約２ｍＭであり、０．５ｍＭ、０．６ｍＭ、０．７ｍＭ、０．８ｍＭ、０．９ｍＭ、１．０ｍＭ、１．１ｍＭ、１．２ｍＭ、１．３ｍＭ、１．４ｍＭ、１．５ｍＭ、１．６ｍＭ、１．７ｍＭ、１．８ｍＭ、１．９ｍＭ、２．０ｍＭ、２．１ｍＭ、２．２ｍＭ、２．３ｍＭ、２．４ｍＭ、２．５ｍＭ、２．６ｍＭ、２．７ｍＭ、２．８ｍＭ、２．９ｍＭ、３．０ｍＭ、３．１ｍＭ、３．２ｍＭ、３．３ｍＭ、３．４ｍＭ、３．５ｍＭ、３．６ｍＭ、３．７ｍＭ、３．８ｍＭ、３．９ｍＭ、４．０ｍＭ、４．１ｍＭ、４．２ｍＭ、４．３ｍＭ、４．４ｍＭ、４．５ｍＭ、４．６ｍＭ、４．７ｍＭ、４．８ｍＭ、４．９ｍＭまたは５．０ｍＭを含む。一部の実施形態では、小分子添加剤（例えば、アミノ酸）は、５ｍＭ未満である。一部の実施形態では、小分子添加剤は、５ｍＭ未満の濃度のグリシンである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度が約１～約２ｍＭのグリシンである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度が約１～約２ｍＭのグリシンである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約１ｍＭである。一部の実施形態では、第１の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約２ｍＭである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度が約１～約２ｍＭのグリシンである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約１ｍＭである。一部の実施形態では、第２の移動相緩衝液中のグリシン濃度は、約２ｍＭである。一部の実施形態では、第１および第２の移動相緩衝液中のアミノ酸はグリシンであり、濃度が約１～約２ｍＭのグリシンである。

一部の実施形態では、第１の移動相中のＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中の約０．０３％～０．１５％ＴＦＡ、例えば約０．０３％～０．１％であり、またはＦＡは、Ｈ_２Ｏ中の約０．０５％～約０．１５％、例えば約０．１％ＦＡである。一部の実施形態では、ＴＦＡ濃度はＨ_２Ｏ中の約０．０５％～約０．１％ＴＦＡであり、または第１の移動相中のＦＡ濃度は約０．１％ＦＡである。例えば、ＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中で約０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、または０．１％である。一部の実施形態では、第２の移動相中のＴＦＡ濃度は、８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の約０．０５％ＴＦＡまたは８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の約０．１％ＴＦＡを含む。一部の実施形態では、第２の移動相中のＡＣＮの濃度は、約６０％～１００％、例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％を含む８０％～１００％である。

一部の実施形態では、第１の移動相中のギ酸アンモニウム濃度は、Ｈ_２Ｏ中で５０ｍＭである。一部の実施形態では、第２の移動相は、Ｈ_２Ｏ中で１５％の５０ｍＭおよび８５％のＡＣＮである。

一部の実施形態では、試料は、ペプチド、ヌクレオチドまたはグリカンを含む。例えば、試料は、モノクローナル抗体から取得される糖ペプチドなどの糖ペプチドを含んでもよい。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである。

一部の実施形態では、本方法は、試料成分が担体に結合することを可能にする条件下で試料を分離カラムに接触させる前に試料を調製することを含む。一部の実施形態では、試料の調製は、試料変性および還元を可能にする条件下で試料を変性および還元溶液と接触させることと、試料のアルキル化を可能にする条件下で変性および還元された試料をアルキル化溶液と接触させることと、試料の消化を可能にする条件下で、アルキル化された試料を消化溶液と接触させることと、試料の消化を停止する条件下で消化された試料をクエンチ溶液と接触させること、を含む。

一部の実施形態では、Ｎ－グリカンは、ＰＮＧａｓｅＦを使用して糖タンパク質から放出され得る。一部の実施形態では、Ｏ－グリカンは、塩基性化学物質によって糖タンパク質から放出される。放出されたＮ－グリカンは、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ蛍光標識と反応することができる。放出されたＮ－グリカンおよびＯ－グリカンは、水素化ホウ素ナトリウムによって還元され得るか、または酢酸およびシアノ水素化ホウ素ナトリウムとともにインキュベートすることによってＰＲＯＣＡまたは２－ＡＢに連結され得る。

一部の実施形態では、試料はモノクローナル抗体であり、消化溶液はトリプシンなどの１つ以上のプロテアーゼを含む。一部の例では、本方法は、１つ以上のプロテアーゼで消化された抗体などのモノクローナル抗体から取得される糖ペプチドなどの糖ペプチドを特徴付ける／分析するために使用される。一部の実施形態では、試料中の抗体は、得られた試料を担体に接触させる前に、還元、酵素分解、変性または断片化によって処理および調製することができる。例えば、本方法は、ＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析などの断片およびペプチドレベルＬＣ－ＭＳによって、タンパク質、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）治療薬のグリコシル化を特徴付けるために使用することができる。ある特定の実施形態では、任意の介在ステップにおける試料は、濃縮、希釈、脱塩などを行ってもよい。

糖ペプチドは、モノクローナル抗体などのグリコシル化タンパク質から取得される。グリコシル化モノクローナル抗体は、還元、酵素消化、変性、断片化、化学的切断およびそれらの組み合わせによって調製することができる。本明細書に開示される方法は、任意の抗体アイソタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプに適用可能である。還元とは、モノクローナル抗体などの三次元タンパク質においてジスルフィド結合を２つのチオールに還元することである。還元は、還元剤、例えばＴＣＥＰ－ＨＣｌの存在下で、熱変性、界面活性剤の添加、または変性剤、例えばグアニジンＨＣｌ（６Ｍ）の添加によって行うことができる。酵素分解とは、プロテアーゼ、例えばトリプシンまたはアクロモバクタープロテアーゼＩ（Ｌｙｓ－Ｃ）によるタンパク質の消化である。加えて、糖タンパク質は、熱もしくは化学物質、またはそれらの組み合わせによって変性され得る。断片化は、モノクローナル抗体などの単一または複数のサブユニットタンパク質のタンパク質部分を、物理的、生物学的または化学的方法で切断することを含む。

一部の実施形態では、分離カラムは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離カラムである。ＨＰＬＣを含む液体クロマトグラフィーを使用して、糖ペプチドを含むペプチドなどの構造を分析することができる。陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、高速陰イオン交換クロマトグラフィー、および順相（ＮＰ）クロマトグラフィー（ＮＰ－ＨＰＬＣを含む）を含む種々の形態の液体クロマトグラフィーを使用して、これらの構造を研究することができる（例えば、Ａｌｐｅｒｔｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ６７６：１９１－２０２（１９９４）を参照されたい）。親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）は、部分的に水性の移動相を用いて行うことができるＮＰ－ＨＰＬＣの変形であり、ペプチド、炭水化物、核酸、および多くのタンパク質の順相分離を可能にする。ＨＩＬＩＣの溶出順序は、最も極性が低いものから最も極性が高いものであり、逆相ＨＰＬＣにおけるものとは反対である。ＨＰＬＣは、例えば、Ｗａｔｅｒｓ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ２６９５ＡｌｌｉａｎｃｅＨＰＬＣシステム）、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＧｉｌｓｏｎなどからのＨＰＬＣシステムで行うことができる。

ＮＰ－ＨＰＬＣ、好ましくはＨＩＬＩＣは、本明細書に記載の方法において使用することができるＨＰＬＣの特に有用な形態である。ＮＰ－ＨＰＬＣは、分析物と固定相（例えば、担体）との間の極性相互作用に基づいて分析物を分離する。極性分析物は、極性固定相と会合し、極性固定相によって保持される。吸着強度は、分析物極性の増加とともに増加し、極性分析物と極性固定相との間の相互作用（移動相に対する）は、溶出時間を増加させる。移動相におけるより極性の溶媒の使用は、分析物の保持時間を減少させるが、より疎水性の溶媒は、保持時間を増加させる傾向がある。

ＮＰ－ＨＰＬＣでは、シリカ、アミノ、アミド、セルロース、シクロデキストリン、ポリスチレンの担体など、様々な種類の担体をカラムクロマトグラフィーに使用することができる。例えば、カラムクロマトグラフィーにおいて使用され得る有用な担体の例としては、ポリスルホエチルアスパルトアミド（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、スルホベタイン担体、例えば、ＺＩＣ（登録商標）－ＨＩＬＩＣ（例えば、ＳｅＱｕａｎｔ製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｓ（例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）、ポリヒドロエチルアスパルトアミド（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＣＸ（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ製）、ＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ（登録商標）（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、アミド－８０（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ製）、ＴＳＫＧＥＬ（登録商標）アミド－８０（例えば、Ｔｏｓｏｈａａｓ製）、ポリヒドロキシエチルＡ（例えば、ＰｏｌｙＬＣ製）、Ｇｌｙｃｏ－Ｓｅｐ－Ｎ（例えば、ＯｘｆｏｒｄＧｌｙｃｏＳｃｉｅｎｃｅｓ製）、およびＡｔｌａｎｔｉｓＨＩＬＩＣ（例えば、Ｗａｔｅｒｓ製）が挙げられる。一部の実施形態では、開示される方法は、以下の官能基、すなわちカルバモイル基、スルホプロピル基、スルホエチル基（例えば、ポリ（２－スルホエチルアスパルトアミド））、ヒドロキシエチル基（例えば、ポリ（２－ヒドロキシエチルアスパルトアミド））および芳香族スルホン酸基のうちの１つ以上を利用するカラムを含む。

カラム温度は、例えば、市販のカラムヒーターを使用して、クロマトグラフィーの実行を通して一定温度に維持することができる。一部の実施形態では、カラムは、約１８℃～約７０℃、例えば、約３０℃～約６０℃、約４０℃～約５０℃、例えば、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、または約７０℃の温度で維持される。一部の実施形態では、カラム温度は約４０℃である。

移動相の流速は、約０～約１００ｍｌ／分であり得る。分析目的では、流速は典型的には０～１０ｍｌ／分の範囲であり、分取ＨＰＬＣでは、１００ｍｌ／分を超える流速を使用することができる。例えば、流量は、約０．５、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、または約５ｍｌ／分であってもよい。同じ充填剤で同じ長さのカラムをより小さい直径を有するカラムに置換することは、より広い直径のカラムで見られるのと同じ保持時間およびピークについての分解能を保持するために、流速の減少を必要とする。一部の実施形態では、４．６×１００ｍｍ、５μｍカラムにおいて約１ｍｌ／分に相当する流速が使用される。

一部の実施形態では、実行時間は、約１５～約２４０分、例えば、約２０～約７０分、約３０～約６０分、約４０～約９０分、約５０分～約１００分、約６０～約１２０分、約５０～約８０分であり得る。

ＮＰ－ＨＰＬＣは、例えば、約７５μｍの内径を有するカラムを使用して、ナノスケールで実施されるように調整することができる（例えば、Ｗｕｈｒｅｒｅｔａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７６：８３３－８３８（２００４）；Ｗｕｈｒｅｒｅｔａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃ．２３２：５１－５７（２００４）を参照されたい）。

ある特定の実施形態では、分離カラムは、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）分離カラムであり、糖ペプチドなどの分子は、その後、例えば移動相勾配を使用してＨＩＬＩＣ分離カラムから溶出されて、糖ペプチドの個々の種を分解し、それによって試料中の糖ペプチドを精製および／または分離する。特定の例において、ＨＩＬＩＣから溶出した糖ペプチドは、１つ以上の画分に分離される。かかる画分は、ＭＳ分析などのその後の分析に使用することができる。ある特定の実施形態では、本方法は、画分のうちの１つ以上に存在する糖ペプチドおよび／またはグリカンなどの分子を同定することを含む。ある特定の実施形態では、グリカンは、Ｎ－グリカンまたはＯ－グリカンである。一部の実施形態では、本方法は、例えば、糖ペプチドのペプチド部分からのＵＶシグナルを使用して、糖ペプチドを検出することをさらに含む。これは、試料の画分に対して行うことができ、さらなる分析、例えば質量分析（ＭＳ）分析のための特定の画分の選択を可能にする。一部の実施形態では、方法は、グリカンに連結された蛍光標識からのＦＬＲシグナルを使用してグリカンを検出することを含む。

生体分子の分析のための質量分析の適用において、分子は、液相または固相から気相および真空相に移される。多くの生体分子は大きく壊れやすいので（タンパク質はその主な例である）、真空相へのそれらの移動のための最も効果的な方法のうちの２つは、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）またはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）である。概して、ＥＳＩはより高感度であり、ＭＡＬＤＩはより高速である。重要なことに、一部のペプチドは、ＥＳＩよりもＭＡＬＤＩモードで良好にイオン化し、逆もまた同様である（ＧｅｎｏｍｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｕｎｅ２２０，ｐ５２）。ＥＳＩは、試料を揮発性酸および有機溶媒と混合し、高電圧で荷電された導電性針を通して注入することによって行われる。ニードル端部から噴霧（または放出）される荷電液滴は、質量分析計内に誘導され、それらが飛行する際に熱および真空によって乾燥される。液滴が乾燥した後、残りの荷電分子は、電磁レンズによって質量検出器に向けられ、質量分析される。一実施形態では、溶出した試料は、キャピラリーからエレクトロスプレーノズルに直接堆積され、例えば、キャピラリーは、試料ローダーとして機能する。別の実施形態では、キャピラリー自体が、抽出デバイスおよびエレクトロスプレーノズルの両方として機能する。一部の実施形態では、本方法は、高荷電状態種（例えば、ｚ≧３）において、平均で約２～２７倍、例えば約５～１４倍および／またはおよそ約２～１０００倍の増加によって示される、質量スペクトルシグナルを増強する。一部の実施形態では、グリシン１ｍＭで、試料ローディング量が１０ｕｇである場合、倍率変化は約５である。一部の実施形態では、スペクトルシグナルは、高荷電状態種において、およそ１４倍および／またはおよそ１０００倍増加する。グリシンのブースト倍率は、試料ローディング量およびグリシン濃度に依存し得ることが企図される。例えば、グリシン濃度が高いほど、異なる試料ローディング量に対して低いグリシン濃度よりも高いブーストを生成し、試料ローディング量の減少に伴いブーストは全体的に増加する。（図１Ａ、１Ｂおよび２に実証されるように）ローディング量によるブースト倍率の有意な変化（＜１０％）が観察され得ない特定の点が存在する。

一部の実施形態では、他のイオン化モード、例えば、ターボスプレーイオン化質量分析、ナノスプレーイオン化質量分析、サーモスプレーイオン化質量分析、ソニックスプレーイオン化質量分析、ＳＥＬＤＩ－ＭＳおよびＭＡＬＤＩ－ＭＳが使用される。概して、これらの方法の利点は、試料の「ジャストインタイム」精製およびイオン化環境への直接導入を可能にすることである。なお、種々のイオン化モードおよび検出モードは、使用される脱着溶液の性質に対してそれら自体の制約を導入し、脱着溶液が両方と適合性であることが重要である。例えば、多くの用途における試料マトリックスは、低いイオン強度を有するか、または特定のｐＨ範囲内に存在する必要がある。ＥＳＩにおいて、試料中の塩は、イオン化を低下させることによって、またはノズルを詰まらせることによって検出を妨げる可能性がある。この問題は、分析物を低塩で提示することによって、かつ／または揮発性塩を使用することによって対処される。

一部の実施形態では、担体は、洗浄、例えば予洗ステップによって、試料の添加のために調製される。一部の実施形態では、担体は、糖ペプチド試料との接触の前に洗浄される。種々の実施形態では、担体は、濃縮のために、糖ペプチドなどの生体分子を含有する試料と接触させられる。試料溶液に関して、試料溶液は、糖ペプチドなどの生体分子が可溶であり、糖ペプチドなどの生体分子が担体に結合する溶媒に溶解された糖ペプチドなどの生体分子を含む。好ましくは、結合は強く、生体分子の実質的な部分、例えば、生体分子の５０％超、例えば、糖ペプチドの５０％超を含む実質的な部分の結合をもたらす。一部の場合では、糖ペプチドなどの生体分子の実質的にすべて、９５％超が結合される。種々の実施形態では、溶媒は水溶液であり、典型的には、糖ペプチドなどの生体分子を可溶化および安定化するための緩衝液、塩、および／または界面活性剤を含有する。一部の実施形態では、糖ペプチド試料などの生体分子試料は、約６．５、６．０、５．５、５．０、４．５、４．０、３．５または３．０未満など、約６．５未満の低ｐＨを有する溶液である。

１つの特定の実施形態では、質量スペクトルシグナルを増強する方法は、モノクローナル抗体を変性および還元することを含む。例えば、モノクローナル抗体は、ＴＣＥＰ－ＨＣｌの存在下、酢酸（例えば、５ｍＭ酢酸）を用いて、変性および還元が生じるのに十分な時間（例えば、８０℃で１０分間）加熱しながら、変性および還元されてもよい。変性および還元の後、試料をアルキル化する。一部の例では、試料は最初に希釈され、次いでアルキル化される。例えば、８Ｍ尿素を含む１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈した後、ヨードアセトアミドで暗所、室温で３０分間アルキル化することができる。アルキル化後、試料をさらに希釈して尿素濃度を低下させ、例えば１００ｍＭのＴｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈して尿素濃度を１Ｍ未満に低下させる。次いで、試料をプロテアーゼで消化する。例えば、試料をトリプシンで、酵素対担体比１：２０（ｗ／ｗ）で、３７℃で４時間処理する。所望の時間に、１０％ＴＦＡなどのＴＦＡで試料をクエンチするなどして、消化を停止する。次いで、消化された試料をオンラインＬＣ－ＭＳ分析に供する。例えば、トリプシン消化（還元／アルキル化）試料は、十分な濃度（例えば、０．２５μｇ）でロードされ、移動相勾配Ａ（ＭＰ－Ａ）は、１～２ｍＭグリシンを含むＨ_２Ｏ中のＴＦＡ、例えば、２ｍＭグリシンを含むＨ_２Ｏ中のＴＦＡを含み、続いて、１～２ｍＭグリシンを含むＡＣＮ中のＴＦＡの移動相勾配Ｂ、例えば、２ｍＭグリシンを含む８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の０．０５％ＴＦＡとなる。

以下の実施例は、本発明の方法をどのように作製および使用するかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力はしてきたが、いくつかの実験上の誤差および偏差が考慮されるべきである。別段に示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、室温は約２５℃であり、圧力は大気圧またはそれに近い。

実施例１：グリシン添加剤を用いたＥＳＩ－ＭＳシグナルブーストのための新しい方法
ＮＩＳＴｍＡｂのトリプシン消化：１００μｇのＮＩＳＴｍＡｂを変性させ、５ｍＭのＴＣＥＰ－ＨＣｌが存在する５ｍＭの酢酸中で８０℃で１０分間還元した。変性および還元後、試料を８Ｍ尿素を含有する１００ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で希釈し、暗所、室温で３０分間ヨードアセトアミドでアルキル化した。アルキル化後、試料を１００ｍＭＴｒｉ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）でさらに希釈して、尿素濃度を１Ｍ未満に低下させた。試料をトリプシンとともに１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対担体比で３７℃で４時間インキュベートした。消化された試料を１０％ＴＦＡの添加によってクエンチしてトリプシン消化を停止させ、次いでオンラインＬＣ－ＭＳ分析に供した。ＮＩＳＴｍＡｂトリプシン消化物（還元／アルキル化）を、０．０５～１０μｇＭＰ－Ａ：０．０５％ＴＦＡ、Ｈ_２Ｏ中０．０６２５～５ｍＭグリシン、ＭＰ－Ｂ：０．０５％ＴＦＡ、８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中０．０６２５～５ｍＭグリシンの異なる量でロードした。カラムはＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣペプチドＢＥＨＣ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）であり、ＬＣ条件は０．２５ｍＬ／分、４０℃カラム温度であった。

ＭＳブーストに対する異なる小分子試薬を調査するために（図３に示すように）、ＮＩＳＴｍＡｂトリプシン消化物（還元／アルキル化）を、０．２５μｇ、ＭＰ－Ａ：Ｈ_２Ｏ中０．０５％ＴＦＡ、ＭＰ－Ｂ：ＡＣＮ中０．０４５％ＴＦＡの濃度でロードした。カラムはＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣペプチドＢＥＨＣ１８、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）であり、ＬＣ条件は０．２５ｍＬ／分、４０℃カラム温度であり、シリンジポンプを使用して５０：５０Ｈ_２Ｏ／ＡＣＮ中の１２５ｍＭの異なる小分子溶液を１０μＬ／分で送達してＬＣカラムからの溶出液と混合し、最終小分子濃度はおよそ５ｍＭであった。

表１は、種々の時点での％Ａおよび％Ｂを提供する。

図１Ａおよび１Ｂは、ＭＳブーストに対する種々の濃度のグリシンの効果、およびＭＳブーストに対する種々の試料ローディング量の効果を示す。図１Ａおよび１Ｂは、ポストカラムシリンジポンプ構成によってではなく、グリシンをＴＦＡ移動相ボトル（ＭＰＡ：水中０．０５％ＴＦＡおよびグリシン、ＭＰＢ：８０％ＡＣＮおよび２０％水およびグリシン中０．０５％ＴＦＡ）に直接添加することによって生成した。図１Ａでは、試料ローディング量に対するグリシンのブーストの明らかな依存性が示されている。低いローディング量における低グリシン濃度と同じブースト倍率を得るために、高いローディング量では高グリシン濃度が必要であった。

図１Ｂは、試料ローディング量の増加が、ペプチドの応答に対するグリシンのブースト力を全体的に減少させたことを示している。２ｍＭのグリシンは、異なる試料ローディング量について、１ｍＭよりも高いブーストを示した。また、試料ローディング量が減少するにつれて、ブースト倍率の増加傾向は徐々に遅くなった。試料ローディング量が１および２ｍＭのグリシン濃度でそれぞれ０．２および０．５μｇ未満であった場合に、ローディング量によるブースト倍率の最小変化（＜１０％）が観察された。

試料ローディング量の増加とともにブースト倍率の低下が観察されたが、質量分析応答（すなわち、ペプチドのＥＩＣピーク面積）は、高ブースト倍率であっても、低ローディング量よりも高ローディング量で依然として高かった。

図２は、側鎖の異なる化学特性に基づく１０個のアミノ酸の化学構造を提供しており、これには、アラニンおよびバリン（疎水性側鎖）、セリン（親水性側鎖）、プロリン（環状側鎖）、メチオニン（硫黄含有側鎖）、グルタミン（アミド含有側鎖）、グルタミン酸（酸性側鎖）、リジンおよびアルギニン（塩基性側鎖）およびヒスチジン（芳香族側鎖）を含む側鎖、ならびにアミン基（例えば、Ｎ，Ｎ－ジメチルグリシン、Ｎ－アセチルグリシン、Ｎ－メチルグリシンおよびプロピオン酸）、側鎖（例えば、３，３，３－トリフルオロ－ＤＬ－アラニン）もしくはカルボキシル基（例えば、エチルアミン）上のグリシンを修飾すること、またはアミン基とカルボキシル基との間の距離を延長するために追加の炭素原子を有するグリシンを挿入すること（例えば、β－アラニンおよびγ－アミノ酪酸）に由来する複数のグリシン変異体が含まれる。図３は、異なる小分子量試薬（２ｍＭ）によるＮＩＳＴｍＡｂトリプシンペプチドの平均ＭＳ１ブースト倍率を示すグラフである。図３に示されるように、グリシンは最も高い平均ブーストを示した。グリシンはまた、最も低い分子量を有する分子である。図４は、ＴＦＡ緩衝液にグリシンを添加した後のペプチドのクロマトグラフィー分離における最小の変化を示すトレースである。研究の条件は、２．５μｇローディングのＮＩＳＴｍＡｂトリプシン消化物（還元／アルキル化）、ＭＰ－Ａ：２ｍＭグリシンを含むまたは含まないＨ_２Ｏ中の０．０５％ＴＦＡ、ＭＰ－Ｂ：２ｍＭグリシンを含むまたは含まない８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の０．０５％ＴＦＡであった。カラムは、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣペプチドＢＥＨＣ１８、１３０Ａ、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、ＬＣ条件０．２５ｍＬ／分、４０℃カラム温度）であった。１００％ＡＣＮ中の２ｍＭグリシンの溶解度問題のために、ＭＰ－Ｂを、ＡＣＮ中の０．０５％ＴＦＡの従来の条件から８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の０．０５％ＴＦＡに変更したことに留意されたい。以下の表２は、ＬＣ勾配全体にわたるＵＶクロマトグラム（図４を参照されたい）において選択された８つの代表的なペプチドピーク（Ｐ１～Ｐ８）についてのＵＰＬＣ性能メトリックを示しており、保持時間差＜０．０６分、ピーク幅％差＜１．４％およびピーク面積％差＜１．９％を有する２つの移動相システム間でほぼ同等のＵＰＬＣ性能メトリックを示している。ピーク幅は、５０％ピーク高さで接線を引くことによって得られるピークのベースの対応する幅である。表３は、種々の時点での％Ａおよび％Ｂを提供する。

図５は、０．２５μｇのローディングＮＩＳＴｍＡｂを含むＴＦＡ緩衝液中の２ｍＭグリシンによるブーストの再現性を、各試料を１０回反復して示す棒グラフである。ペプチド依存性応答ブーストが観察され、異なるトリプシンペプチドのブースト倍率は、２～２７倍の広い範囲にわたっており、平均でおよそ１３．２倍であった。大部分のペプチドは少なくとも５倍の応答ブーストを示し、ペプチドの半分超が１０倍超を示した。すべてのペプチドについて、平均ブーストは１３．２倍であり、％相対標準偏差（ＲＳＤ）は５％未満であった。図６は、ＴＦＡ対照およびグリシンが存在するＴＦＡ、２．５μｇのＮＩＳＴｍＡｂローディングで観察されたシグナル対ノイズ比を示す総イオン電流（ＴＩＣ）プロットである。全ＬＣ勾配にわたって異なる保持時間を有する１０個の代表的なトリプシンペプチドを選択して、グリシン添加剤を含むＴＦＡ移動相と含まないＴＦＡ移動相との間の全イオンクロマトグラムにおけるそれらのシグナル対ノイズ比を比較した。シグナル対ノイズ比は、実際に、これらの１０個のトリプシンペプチドについてグリシン添加剤でブーストされた。ペプチド依存性応答ブーストと同様に、選択されたペプチドもまた、１桁超までの広い範囲ので異なるシグナル対ノイズ比のブーストを示した。グリシン添加剤はトリプシンペプチドの質量分析応答をブーストしたが、エレクトロスプレーイオン化中に周囲環境から生成される小分子汚染物質に由来するバックグラウンドノイズに対してブーストは観察されなかった。このブースト特徴は、トリプシンペプチドのシグナル対ノイズ比の改善をもたらすことができ、一方、絶対応答がブーストされた。

図７、８Ａおよび８Ｂは、グリシンが存在する場合の荷電状態シフトを示す棒グラフである。％ＲＳＤは、すべてのペプチドについて０．４％未満であった（１０回の反復）。平均荷電状態シフトはペプチド依存性であり、上方シフトおよび下方シフトの両方が観察された。図９は、２ｍＭグリシン（ＴＦＡ緩衝液、０．２５μｇＮＩＳＴｍＡｂローディング）の存在および不在下でのＰＴＭ定量（％）を示す棒グラフである（１０回の反復）。図１０は、ＴＦＡまたはＦＡまたはＦＡ単独でのグリシンの存在によるブースト倍率をＴＦＡ対照と対比して示す棒グラフである（３回反復）。図１０に示されるように、２ｍＭグリシンの存在下でのＴＦＡは、２ｍＭグリシンの存在下でのＦＡで観察された１２．３倍ブーストまたはＦＡでの６．１倍ブーストと比較して、１３．２倍ブーストをもたらした。

図１１は、２ｍＭグリシン（Ｃｏｌｕｍ：ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＨＳＦ５－３、１５ｃｍ×２．１ｍｍ、３μｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）；各アミノ酸１ｎｍｏｌローディング）による個々のアミノ酸のブースト倍率を示すグラフである。図１２は、市販のグリシン製剤中の微量ナトリウムの効果を示している。

タンパク質定量化のためのグリシン添加剤によるＥＳＩ－ＭＳシグナルブーストを評価した。図１３は、ＰＲＭおよびフルスキャンを使用したＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫペプチド（配列番号２２）の定量化の比較を提供する。３桁にわたる同じ応答線形範囲が、ＴＦＡおよびＦＡ対照移動相と同様の回帰傾斜を有するグリシン移動相を用いたＴＦＡおよびＦＡについて観察され、広いタンパク質濃度におけるグリシン添加剤の一貫した応答ブーストを示した。ＴＦＡおよびＦＡ移動相におけるグリシン添加剤の応答ブーストのために、応答線形範囲もまた、ＴＦＡおよびＦＡ対照移動相と比較してより低いタンパク質濃度に達した。この特徴は、グリシンベースの移動相を、増加した感度を有する複合マトリックス中の低存在量タンパク質を定量化するための代替として考慮する機会を広げる可能性があるものである。

実施例２：グリシン添加剤を用いたＥＳＩ－ＭＳシグナルブースト：ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳベースの糖ペプチド同定および定量
図１４は、糖ペプチド分析のための逆相に対するＨＩＬＩＣベースの液体クロマトグラフィーの利点を示している。ペプチドは、日常的に行われている還元または非還元ペプチドマッピング法のいずれかによって調製した。図１４に示すように、ＨＩＬＩＣでは糖ペプチドのより良好な分離が得られたが、逆相では糖ペプチドのクラスター化が観察された。例えば、Ｇ１Ｆなどの異性体の分離の増加が、逆相に対してＩＰ－ＨＩＬＩＣで見られた。さらに、ＨＩＬＩＣカラム上の糖ペプチド溶出順序は、ペプチドに結合したグリカンのサイズと相関しており、大きなグリカンのインソース断片化により生成されたアーチファクトと実際のピーク（重複しない別個の溶出時間）とを容易に区別することができた。

図１５は、シグナルブーストがＭＳ１およびＭＳ２の両方についてグリシン添加緩衝液中で観察されたことを示している。試料はトリプシン消化プールＶＥＧＦトラップＩＮＤロットであり、カラムはＷａｔｅｒｓＢＥＨ－アミドであり、移動相はＡ：０．１％ＴＦＡおよびＢ：８０％ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡであった。図１６は、高濃度のグリシンが結合を防止したことを示している。

図１７は、ＨＩＬＩＣベースのＬＣによる糖ペプチド分析のための例示的な試料調製ワークフロー概略図を提供する。図１８は、ＳｅｐＰａｋ３０カートリッジによる脱塩が上昇したベースラインを排除した脱塩の効果を示す（矢印を参照）。移動相Ｂ（８０％アセトニトリル中０．１％ＴＦＡ）によるペプチドの溶出は、脱塩後の乾燥ステップを排除し、それによって時間を節約し、プロセスの効率を増加させた。また、金属付加物が、ガラスボトルと比較して、移動相中にポリエチレン溶媒容器（Ｂｅｌａｒｔ製のポリエチレンボトルなど）を使用することによって低減され得ることが研究により明らかとなった。移動相の間、ガラスボトルと比較してプラスチックボトルを使用した場合、２．７倍の強度ブーストおよび１．７倍の強度ブーストが観察された。プラスチックボトルは、ナトリウムによって引き起こされる不均一性を減少させ、それにより、ＭＳシグナルがブーストされたと考えられる。さらに、６０％イソプロピルアルコール中に一晩浸漬すると、浸出可能な不純物／硬化剤が除去された。図１９および２０は、グリシンの効果を示す表を提供する。図１９は、グリシンが、ＩＧＧ１においてすべてのグリコフォームのピーク面積を２０倍増加させたことを示す（＊この表中のグリコフォームは、いずれの実行でもタンデムＭＳに基づいてのみ同定された。＊＊タンデムＭＳデータを有さないグリコフォームについては、ピークは、他の実行において同定された前駆体質量および保持時間に基づいて決定された（Ｐｅｐｔｉｄｅ１＿Ｃｏｎｔｒｏｌと標識された列に示されている））。図２０は、ＩＧＧ４分子におけるすべてのグリコフォームのピーク面積を提供する（＊この表中のグリコフォームは、いずれの実行でもタンデムＭＳに基づいてのみ同定された。＊＊タンデムＭＳデータを有さないグリコフォームについては、ピークは、他の実行において同定された前駆体質量および保持時間に基づいて決定された（Ｐｅｐｔｉｄｅ２Ｃｏｎｔｒｏｌと標識された列に示されている）。＊＊＊対照実行においてＬＬＯＱ未満の存在量を有するグリコフォームの倍率変化は、過大評価された数を与える（括弧内に示されている））。図２１は、評価されたｍＡｂにおけるすべてのグリコフォームのピーク面積を提供する。すべてのグリコフォームの相対分布は、グリシンの存在下で同じままであった。図２２は、１ｍＭグリシンの存在下での荷電状態シフトによる断片化能力の増強を示している。糖ペプチドの主要な荷電状態は＋２から＋３にシフトし、後者は容易に断片化する傾向がある。ＶＥＧＦＴＲＡＰに対するグリシン（１ｍＭ）の添加によるシグナルブーストが観察された。グリシンは、ＶＥＧＦＴＲＡＰにおいてペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）およびグリコフォームの数を増加させた（図２３参照）。

実施例３：グリシン添加剤を用いたＥＳＩ－ＭＳシグナルブースト：配列変異体分析
本実施例は、ＴＦＡ中のグリシンが配列変異体の数を増加させる能力を実証するものである。Ｂｙｏｌｏｇｉｃ検証後にＴＦＡ＋グリシンを使用した場合に同定された配列変異体の数をＦＡと比較して図２４に示す。

実施例４：グリシン添加剤を用いたＥＳＩ－ＭＳシグナルブースト：グリカン分析
糖タンパク質から放出されると、Ｎ－グリカンは、しばしばＭＳ応答も増強する種々の蛍光タグで標識することができる。標識または還元Ｎ－グリカンは、塩、例えばギ酸アンモニウムを含有する移動相を用いたＨＩＬＩＣによって分析することができる。移動相中１ｍＭのグリシンは、ヒト血清由来のＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンのＭＳシグナルをブースト（３～５０倍超）することが見出された（図２５および図２６Ａ～２６Ｃを参照されたい）。グリシンは、高マンノースおよび大きな酸性Ｎ－グリカンに対してより強い効果を有した（＞１０倍）。グリシンを含まないギ酸アンモニウム移動相を使用して、ＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンのＭＳプロファイルは、グリカン定量のために広く使用されるＦＬＲプロファイルといくらかの差異を示した（図２７および図２８Ａ～２８Ｃを参照されたい）。ＭＳおよびＦＬＲプロファイルを比較することによって、高マンノースおよび３つのシアル酸を有する大きなＮ－グリカンは、比較的低いＭＳシグナルを有したが、バイセクティングＮ－グリカンは、比較的高いＭＳシグナルを有した。移動相にグリシンを添加することによって、ＭＳシグナルは、より高くなるだけでなく、ＦＬＲとより同等であった（図２７および図２８Ａ～Ｃを参照）。図２９は、対照およびグリシン含有条件における、ＦＬＲピーク面積（対数スケール）に対するＰＲＯＣＡ標識ＥＩＣピーク面積を有する血清Ｎ－グリカンの散布図を示している。対照条件に対するものと比較してグリシン条件に対する線形回帰のより小さいＲ二乗値により、グリシンがＭＳシグナルを使用したＮ－グリカン定量の精度を改善できることが実証される。ＰＲＯＣＡ標識Ｎ－グリカンに対するグリシンによる強いシグナルブースト効果もまた、０．１％ＦＡ（３～３８倍）を含有する移動相を使用して観察することができる（図３０Ａ～３０Ｃ参照）。グリシンはまた、ギ酸アンモニウム移動相を使用して、ＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識Ｎ－グリカンおよび小型還元Ｎ－グリカンに対して中等度のシグナルブースト効果（１～３倍）を示した（図３１Ａ～３１Ｃおよび図３２を参照）。より大きな還元型Ｎ－グリカンに対する阻害効果が観察された（図３２）。ＭＳピーク面積およびＦＬＲピーク面積に基づく大きなＲａｐｉＦｌｕｏｒ標識Ｎ－グリカンの相対レベルは、対照条件下のものと比較して、グリシン条件を使用したものより同等であった（図３２）。図３３は、Ｎ－グリカンの分析のための例示的なＬＣ－ＦＬＲ－ＭＳ条件を提供する。

Ｎ－グリカンとは異なり、放出酵素の欠如、ならびに放出有効性および化学的放出によるＯ－グリカン還元末端分解に課題があるため、満足なＯ－グリカン放出方法は存在していない。図３４は、Ｏ－グリカン調製ならびにＬＣ－ＭＳおよび蛍光（ＦＬＲ）検出による分析のための例示的な方法を提供する。

図３５は、カラム上のウシ顎下腺ムチン（ＢＳＭ）２μｇからのＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカン、蛍光および最適化還元的アミノ化の結果を示している。図３６は、ＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカンＦＬおよびＭＳＴＩＣプロファイルがほぼ同等であることを実証している。ＢＳＭから放出されたＰＲＯＣＡ標識Ｏ－グリカンをＨＩＬＩＣ上で実行した（カラム上で２μｇに等しい）。低いＭＳバックグラウンドが観察された。移動相中１ｍＭのグリシンは、ビーズから精製されたＰＲＯＣＡ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対する効果をブーストすることが見出された（カラム上２μｇ、図３７Ａ～Ｂ）。図３７Ａ～３７Ｂは、移動相中にグリシンを含む場合および含まない場合のＯ－グリカンＦＬＲおよびＭＳピーク強度を比較した結果を提供する。ＦＬＲと比較して、ＰＲＯＣＡシグナルは、グリカンサイズの増加とともに有意に低下する。グリシンは、この効果を補償し、ＭＳシグナルをＦＬＲ強度とより同等にした（図３７Ａ～３７Ｂ）。グリシンは、小さい（１～２個の糖環）Ｏ－グリカンに対して中程度のブースト効果（１～３倍）を有した（図３８Ａ～３８Ｃを参照）。グリシンは、ＰＲＯＣＡで標識されたより大きいおよび／または酸性グリカンに対して強いブースト効果（３～３５倍超）を有した（図３８Ａを参照）。この効果は、２つのシアル酸を有するものに対して強力であった（＞３５倍）。グリシンは、２ＡＢ標識ＢＳＭＯ－グリカンに対して中程度のブースト効果（＜３倍）を有することが観察された（図３８Ｂ参照）。小さな還元Ｏ－グリカンのＭＳシグナルは、グリシンによって最大１２倍ブーストされ得る（図３８Ｃを参照）。しかしながら、より大きな還元Ｏ－グリカンに対する阻害効果が観察された。図３９は、ＰＲＯＣＡ標識または還元Ｏ－グリカンの分析のための例示的なＬＣ－ＦＬＲ－ＭＳ条件を提供する。図４０は、一価のグリカンがグリシンの非存在下で不十分なＭＳ２を提供することを示している。図４１は、グリシンでブーストされた試料からの二重荷電イオンが大幅に増強されたＭＳ２情報を提供することを示している。

実施例５：トリフルオロ酢酸含有移動相中のグリシン添加剤を用いた、イオン対形成親水性相互作用クロマトグラフィー質量分析による生物製剤の部位特異的グリコシル化プロファイリングの促進
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＦｃドメイン融合タンパク質などの多くのバイオ治療薬は、１つまたは複数のグリコシル化部位に不均一なグリカン内容物を含有する。部位特異的グリカンプロファイル特徴付けは、薬物開発の異なる段階の間にこれらの分子の質をモニタリングするために重要であった。逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）に対する直交分離法としてのイオン対形成親水性相互作用クロマトグラフィー（ＩＰ－ＨＩＬＩＣ）は、個々のグリコフォーム間のより良好な分離、ならびに非グリコシル化ペプチドからの糖ペプチドの同定を達成することができる。しかしながら、質量分析検出に結合されたオンラインＩＰ－ＨＩＬＩＣは、イオン対形成剤として概して使用されるトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に起因して、エレクトロスプレーイオン化中の質量分析シグナルが抑制される可能性がある。この実施例では、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳの最適化された条件が報告されており、この条件では、グリシンがＴＦＡ含有移動相に添加されて、イオン対形成剤のイオン抑制効果を排除することによって糖ペプチドのＭＳ検出感度をおよそ５０倍まで増強する一方で、依然として優れた分離能力を保持する。増強された検出感度で、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ４ｍＡｂならびにＦｃドメイン融合タンパク質（５つのＮ－グリコシル化部位を含有）についての部位特異的Ｎ結合型グリカンの数の増加を同定することができ、ＲＰＬＣ質量分析（ＲＰＬＣ－ＭＳ）を用いた従来の方法と比較して、同等の定量的結果を達成できることが実証される。ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用して、ＬＣ－ＭＳ分析の前に濃縮することなく、ｍＡｂ上の低レベルのＯ－グリコシル化および非コンセンサスＮ－グリコシル化を同定することができることも実証される。

Ｉ．序論
グリコシル化は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＦｃドメイン（断片結晶化ドメイン）融合タンパク質を含むバイオ治療薬の重要な質属性である。保存されたアスパラギン－２９７部位でのＦｃドメイングリコシル化プロファイルは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などのエフェクター機能と強く関連しており、これは腫瘍学療法における薬物有効性に影響を及ぼし得る。ＦｃＮ－グリコシル化は、標的との相互作用に直接関与しないが、ｍＡｂのＦａｂ（抗原結合断片）領域またはＦｃ－ドメイン融合タンパク質の機能ドメインに位置することが多い非標準部位でのＮ－またはＯ－結合グリカンは、標的への結合親和性に悪影響を及ぼし得る。バイオ治療薬におけるグリコシル化はまた、薬物動態および薬力学プロファイルならびに電荷不均一性、安定性、および免疫原性などの他の分子特性と相関する。ｍＡｂまたはＦｃドメイン融合タンパク質のグリコシル化は、異なるタンパク質発現系、製造プロセス、およびタンパク質配列において多様なプロファイルを示すことが多いため、部位特異的グリカンプロファイルの包括的な特徴付けには、一連の極めて重要な作業が含まれており、これには、異なる試料ロット間でのグリカンプロファイルの比較可能性の実証、または生物製剤の非臨床開発中のグリコシル化関連問題の根本原因の調査が含まれる。

Ｎ結合型グリコシル化プロファイリングは、エキソグリコシダーゼ処理を介してタンパク質からグリカンを連続的に放出させ、還元された末端を蛍光試薬で標識し、放出されたグリカン混合物を蛍光および質量分析検出と組み合わせた親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ－ＦＬＲ－ＭＳ）を使用して分析することによって行うことができるが、タンパク質が複数のグリコシル化部位を含む場合、部位特異的グリコシル化に関する情報を提供することができない。代わりに、インタクトな糖ペプチドの直接分析により、Ｎ結合型グリカンおよびＯ結合型グリカンの両方についての部位特異的グリコシル化プロフィールを明らかにすることができる。糖ペプチド同定の典型的なワークフローでは、タンパク質をプロテアーゼで消化し、質量分析と組み合わせた逆相クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）を用いて分析する。これは、タンパク質アミノ酸配列を確認し、翻訳後およびグリコシル化を含む化学修飾の際に部位特異的定量を提供するための生物製剤の特徴付けに使用されるアプローチである（「ペプチドマッピング」と称されることが多い）。個々のグリカンの相対存在量は、対応する糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）のピーク面積に基づいて定量化することができる。しかしながら、ＲＰＬＣベースの糖ペプチド分離は、グリカン組成物が疎水性の差異にほとんど寄与しないので、主にアミノ酸配列に依存しており、これにより、（１）同じアミノ酸配列を有するペプチドからのグリコフォームは、その保持時間が互いに近いピークのクラスターとして溶出され、（２）糖ペプチドは、それらのペプチド配列が同様の疎水性を有する場合、他の非グリコシル化ペプチドから十分に区別され得ない。例えば、非定型Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化部位からの低存在量糖ペプチドのＭＳシグナルは、ＭＳ検出ダイナミックレンジおよびカラムローディング能力の制限により、他の糖ペプチドまたは非グリコシル化ペプチドからの共溶出高存在量干渉種の存在下で大きく抑制され得る。

ＲＰＬＣとは対照的に、ＨＩＬＩＣは、異なる組成および構造異性体のグリカンの効果的な分離を実施する。質量分析と組み合わせたＨＩＬＩＣは、単一のバイオ治療薬から放出されたＮ－グリカンを分析するために、または異なる種類の複雑な試料中のグリコマイクス分析のために使用されてきた。穏やかな酸性条件下で実施されたＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用するインタクトな糖ペプチド分析もまた、抗体および他の糖タンパク質について報告されており、これは、グリカン異性体を含む異なるグリコフォームについて優れた分離を示した。糖ペプチドは、酸性環境（ｐＨおよそ２）および強いイオン対特性（ＴＦＡアニオン）を提供する０．１％ＴＦＡを添加してＨＩＬＩＣ移動相を単に変更することによって、非グリコシル化ペプチドからより良好に分離することができる。この条件下で、ペプチド全体の荷電基を中和することができ、非グリコシル化ペプチドの親水性が非常に低下するが、グリカンは、ヒドロキシル基などの非荷電極性部分に富んでいるので、糖ペプチドはあまり影響を受けない。イオン対形成ＨＩＬＩＣ（ＩＰ－ＨＩＬＩＣ）分離は、多数のグリコプロテオミクス研究におけるオフライン糖ペプチド濃縮のための標準技術となっているが、イオン対形成剤ＴＦＡによって引き起こされる有害なシグナル抑制のため、糖ペプチド同定のためにＩＰ－ＨＩＬＩＣをＭＳ検出と直接組み合わせることは稀であり、これは、同じ濃度のギ酸と比較してＭＳシグナルの５～１０倍の減少を引き起こす可能性がある。したがって、望ましくないイオン抑制を回復することは、ＴＦＡを伴うＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳアプローチにおける適用範囲を拡張するために重要である。

ＴＦＡ関連ＭＳシグナル抑制を軽減するための多くの努力が過去数十年にわたって行われおり、これは、ポストカラム「固定溶液」の導入から、ＴＦＡを他の「より弱いイオン対形成」剤で置換することにまで及んでいる。ＴＦＡ含有移動相にグリシンを直接添加することによって、予備相Ｃ１８カラムを用いたｍＡｂのペプチドマッピングにおけるシグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）についておよそ１桁の有意な改善をもたらす方法が発見された。グリシン添加剤がカラムの前に導入されたが、Ｃ１８カラム上でのペプチド分離の性能に影響を与えなかった。本実施例では、この解決策をＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳに適用することもでき、これにより、モノクローナル抗体またはＦｃドメイン融合タンパク質の不偏な部位特異的グリコシル化プロファイリングのための高感度で持続可能なプラットフォームを構築することができることが実証される。また、このプラットフォームが、ＬＣ－ＭＳ分析の前に余分なオフライン濃縮を行うことなく、ｍＡｂのＦａｂ領域における極めて低存在量のＯ結合型および非コンセンサスＮ結合型グリコシル化を同定する可能性を選択的に高めることができるユニークな例も開示される。

ＩＩ．材料および実験
化学物質および材料
４種のＩｇＧ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４）、ＩｇＧ１モノクローナル抗体（ｍＡｂ５）およびＦｃドメイン融合タンパク質（ｆＰ１）は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）で製造された。超高純度グリシン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒブランド）、トリフルオロ酢酸（配列決定グレード）、ギ酸（配列決定グレード）およびアセトニトリル（ＬＣ－ＭＳグレード）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から購入した。ギ酸アンモニウム（９９％）は、ＡｃｒｏｓＯｒｇａｎｉｃｓ（商標）から購入した。ＰＮＧａｓｅＦは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）から購入した。ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ（商標）迅速脱グリコシル化キットは、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から購入した。Ｍｉｌｌｉ－ＱＳｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）によって超純水を生成した。他のすべての化学物質は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。

トリプシン消化
タンパク質消化物を調製するために、モノクローナル抗体を、５ｍＭ酢酸および５ｍＭトリス（２－カルボキシエチルホスフィン塩酸塩）を含有する溶液中で、８０℃で１０分間加熱することによって変性および還元した。次いで、各試料を、１５ｍＭヨードアセトアミドを含有する１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）中で中和し、続いて、１：２０（ｗ／ｗ）の酵素対担体比で、３７℃、暗所で２時間、トリプシン消化した。Ｆｃドメイン融合タンパク質については、タンパク質を、８Ｍのグアニジン－ＨＣｌおよび５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、８０℃で１０分間加熱することによって還元および変性し、続いて１５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化した。試料を、ＮＡＰ－５Ｓｅｐｈａｄｅｘ５－２５カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０に緩衝液交換し、次いで、モノクローナル抗体と同じ消化条件下で消化した。消化されたペプチドを、販売者提供のプロトコールに従って、Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）を通してさらに浄化した。試料を真空下で乾燥させ、８０％ＡＣＮ（ＨＩＬＩＣ－ＭＳ用）または水（ＲＰＬＣ－ＭＳ用）中に再構成した。

糖ペプチドのＬＣ－ＭＳ分析
すべてのＬＣ－ＭＳ実験は、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ－ＥｘａｃｔｉｖｅＰｌｕｓＨｙｂｒｉｄＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に連結されたＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＩ－ＣｌａｓｓＳｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実施した。アルカリ付加物の形成を最小限に抑えるために、すべての試料を注射用に作製されたポリプロピレンバイアルに移し、移動相溶液を調製し、ポリエチレンボトルに保存し、ＬＣラインを事前に完全に洗浄した。移動相Ａ（ＭＰＡ）は、１００％水（ｖ／ｖ）、０．１％ＴＦＡまたはＦＡ（ｖ／ｖ）および１ｍＭグリシンを含有する純粋な水相である。移動相Ｂ（ＭＰＢ）は、８０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、２０％水（ｖ／ｖ）、０．１％ＴＦＡまたはＦＡ（ｖ／ｖ）および１ｍＭグリシンから構成された。グリシンを含まないバージョンのＭＰＡおよびＭＰＢも、グリシンを添加する代わりに等量の水を用いて全く同じレシピを使用して作製した。

グリシン含有バージョンとグリシン非含有バージョンとの間で移動相を切り替えた後の第１の試料注入の前に、ＬＣシステムを少なくとも１時間調整し、質の管理の目的のために、７６．０７ｍ／ｚにおけるプロトン化グリシンのＭＳピークの強度をモニタリングした（スキャン範囲５０～７５０ｍ／ｚ）。グリシンを含まない移動相および含む移動相について、それぞれ１ｅ^６および１ｅ^９で安定なＭＳシグナルが正規化強度に達すると予想された。

ＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析のために、６μｇ（または注釈が付けられている場合はより多量）の脱塩トリプシン消化ペプチドを、ＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣグリカンＢＥＨアミドカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）上にロードした。０．２ｍＬ／分の９９．９％ＭＰＢでフローを開始し、ＭＰＢの割合が９０％から６２．５％に減少したときにグリカン含有ペプチドを溶出し、分離した。ＲＰＬＣ－ＭＳ分析のために、試料をＷａｔｅｒｓＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＢＥＨＣ１８カラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）上にロードした。ＲＰＬＣ－ＭＳ分析のための移動相の設定は、ＨＩＬＩＣ－ＭＳと完全に同一であるが、反対に、９９．９％ＭＰＡで流動が開始し、ペプチドは、ＭＰＢの割合が０．１％から４０％に増加したときに溶出した。全ＭＳスキャンを、グリシンシグナルを回避するために５００～２０００ｍ／ｚで収集した（分解能＝７０，０００、ＡＧＣ標的＝１ｅ^６、最大ＩＴ＝１００ｍｓ、シースガス＝４０、補助ガス＝１０、掃引ガス＝０、スプレー電圧＝３．８ｋＶ、キャピラリー温度＝３５０℃、補助ガスヒーター温度＝２５０℃、Ｓ－レンズＲＦレベル＝５０）。５つの最も豊富な前駆体を、データ依存ＭＳ２スキャンのために選択し、ここで、ＮＣＥ＝２７、分解能＝１７，５００、ＡＧＣ標的＝５ｅ^５、最大ＩＴ＝２５０ｍｓに設定した。

糖ペプチド同定のためのデータ処理
ＰｒｏｔｅｉｎＭｅｔｒｉｃｓｓｕｉｔｅのＢｙｏｎｉｃソフトウェアを使用して、タンパク質配列および１３２個のヒトＮ結合型グリカンまたは７０個の一般的なＯ結合型グリカンを含有するビルトイングリカンデータベースに対して生ファイルを検索することによって、糖ペプチド同定を行った。非コンセンサスＮ－グリカン検索のために、同じＮ－グリコシル化データベースをカスタマイズして、販売者提供の技術ノートに従って部位制限を排除した。１％ＦＤＲに対してフィルタリングすることにより、ユニークな糖ペプチドの予備リストを生成した。次いで、自動特徴抽出およびピーク積分によるフルスキャンベースの最終ＩＤ検証および定量化のために、前駆体のリストならびにスペクトルライブラリとしての元の検索結果を、ＳｋｙｌｉｎｅＤａｉｌｙソフトウェア（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＷＡ）にインポートした。

誘導体化グリカンのＨＩＬＩＣＬＣ－ＭＳ分析
放出されたＮ結合型グリカン分析のための試料を調製するために、タンパク質を、０．１％ＲａｐｉＧｅｓｔ（商標）ＳＦ（Ｗａｔｅｒｓ）および４．２ｍＭトリス（２－カルボキシエチルホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）を含有する溶液中で、８０℃で１０分間加熱することによって変性および還元した。次いで、各試料を、１：５（ｗ／ｗ）の酵素対担体比でのＰＮＧａｓｅＦの添加および４５℃で２５分間のインキュベーションによって脱グリコシル化して、オリゴ糖を放出させ、続いて、４５℃で２５分間のインキュベーションによるＲａｐｉＦｌｕｏｒ（商標）－ＭＳ試薬（Ｗａｔｅｒｓ）蛍光タグによる放出されたグリカンの誘導体化を行った。誘導体化した試料を、２５％Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミドおよび５３％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を含有する最終溶液中に希釈した。

Ｑ－ＥｘａｃｔｉｖｅＰｌｕｓＨｙｂｒｉｄＱｕａｄｒｕｐｏｌｅ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に連結されたＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣＩ－ＣｌａｓｓＳｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して、データ取得を実行した。１μｇの放出され誘導体化されたグリカンを、ＡｃｑｕｉｔｙＵＰＬＣグリカンＢＥＨアミドカラム（１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ）上にロードした。移動相Ａは、水中に５０ｍＭギ酸アンモニウムを含有する純粋な水相であり、ｐＨ＝４．４である。移動相Ｂは純粋な有機相（１００％アセトニトリル）である。勾配は、２５％移動相Ａから開始し、続いて、すべての誘導体化グリカンを溶出するために、移動相Ａの割合を３２．２％まで増加させた。ＭＳパラメータを、フルスキャンｍ／ｚ範囲＝６５０～２０００、ＡＣＧ標的＝１ｅ^６、最大ＩＴ＝１００ｍｓ、分解能＝７０，０００、ソース温度＝３５０℃、スプレー電圧＝４．０ｋＶ、補助ガスヒーター温度＝２５０℃、Ｓ－レンズＲＦレベル＝５０に設定した。５つの最も豊富な前駆体を、データ依存ＭＳ２スキャンのために選択し、ここで、ＡＣＧ標的＝１ｅ^５、最大ＩＴ＝２５０ｍｓ、段階的ＮＣＥ＝１３、２０、分解能＝１７，５００であった。

グリカンの単糖類組成は、各グリカンについて測定された実験質量に基づいて割り当てられた。グリカンの構造は、ＵｎｉＣａｒｂＫＢデータベース中のグリカン構造によって予測される理論的断片化パターンに対するＭＳ／ＭＳ断片化スペクトルの一致に基づいて割り当てられた。

ＩＩＩ．結果および考察
モノクローナル抗体のグリコフォームの同定および相対的定量化。

ＩｇＧ４分子のトリプシン消化は、可変グリカンを有する保存されたＮ－グリコシル化部位（

（配列番号４５）、Ｎ２９７と称される）を、約５０個の非グリコシル化ペプチドとともに含有するペプチドを生成する。移動相（ｐＨ＝２．０）中の１ｍＭのグリシンの存在は、図４２Ａに示されるように、ピーク幅および保持時間を含むＩＰ－ＨＩＬＩＣの溶出プロファイルに影響を及ぼすことなく、ＩｇＧ４消化物（ｍＡｂ１）の全体的なＭＳシグナルを有意に回復させる。グリシンを含む場合および含まない場合のＴＦＡ移動相から得られたＵＶクロマトグラムも同一である（図４２Ｂ）。これらの２つの条件のいずれかから観察すると、溶出プロファイル全体を、それぞれ非グリコシル化ペプチドおよび糖ペプチドからのピークを含む２つの離れた領域に分割することができる。ＨＩＬＩＣカラム上の異なる糖ペプチドは、非グリコシル化ペプチドと比較してはるかに良好に分離されることも注目される。例えば、ｍＡｂ１の非グリコシル化ペプチド領域（１～１３分）は、第１の１１分間は解像された特徴を示さず、１０分～１３．５分の間に限られた数のピークしか示さないが（図４２Ａ）、糖ペプチド領域（１８～２５分）におけるすべてのピークは、グリカン間の親水性の差のために十分に解像されている。

同様のクロマトグラフィープロファイルが、別のＩｇＧ４分子（ｍＡｂ２）について観察される。図４２Ｃ１～４２Ｃ３に示すように、糖ペプチド領域のピーク分解能は、線形勾配（移動相Ｂの９２％から７３％）を延長することで独立して改善できる。グリシンの存在下で回復したＳ／Ｎはまた、タンデム質量スペクトル（図４２Ｄおよび４２Ｅに例示される）の質を確実にし、放出されたグリカン分析などの他のアッセイを参照することなく、糖ペプチドを確実に割り当てることを可能にする。図４２Ｆに示されるように、最適化された勾配で取得されたデータからのｍＡｂ１の最も豊富な１８個のグリコフォームの抽出されたイオンクロマトグラムは、４０分以内に均一に分布している。異なるグリカン組成物を表す各ＥＩＣピークは、高度に予測可能な溶出時間を有する。例えば、追加のガラクトース（Ｇａｌ）は、そのグリカン組成にかかわらず、溶出時間の７分の増加を常に引き起こした。それは、任意の数の分岐Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を有するフコシル化コア構造または非フコシル化コア構造であり得る。異なる組成を有するグリカンの十分に分解された分離に加えて、Ｇａｌが１，３または１，６結合のいずれかを介して分岐ＧｌｃＮＡｃ（例えば、ＦＡ２Ｇ１、Ａ２Ｇ１）と結合していることに起因する構造異性体についても、ベースライン分離が観察された。注目すべきことに、インタクトな糖ペプチドから観察された溶出プロファイルは、２つのシアル酸含有グリカンＦＡ２Ｇ２Ｓ１およびＦＡ２Ｇ１Ｓ１を除いて、ほぼ中性のｐＨ下で同じＨＩＬＩＣカラムを使用して得られた放出されたグリカンの溶出プロファイルと非常に一致しており（図４２Ｇ）、これらの相対溶出時間は、ＴＦＡの存在下でのカルボキシル酸基のプロトン化に起因する可能性が最も高い。

ＩＰ－ＨＩＬＩＣにおける広い溶出時間範囲とは対照的に、ＲＰＬＣ－ＭＳデータセットからの同じ糖ペプチドのＥＩＣピークは、勾配の線形範囲全体が８０分であっても、１．５分ウィンドウ内でのみ溶出する（図４２Ｈ１～４２Ｈ２）。現行の最新技術の質量分析計における高い走査速度および感度のために、ピーク分離におけるかかる欠陥があっても、糖ペプチド同定のために依然として使用することができるが、分離を改善されことで、共溶出ペプチドのダイナミックレンジを低減し、より正確なピーク積分を達成することに関して常に利点が得られる。加えて、インソース断片化中に生成される人工糖ペプチドは、それらが生成されるより大きいグリコフォームと同じ保持時間を有するため、ＩＰ－ＨＩＬＩＣでは保持時間が異なるため、同じ既存の糖ペプチドを容易に除外することができるが、ＲＰＬＣでは不適切な分離のために困難であり得る（図４２Ｈ１～４２Ｈ２）。

グリシンのＳ／Ｎ増強のレベルは、異なるペプチド配列または異なるペプチド対グリシンモル比について変動し得る。所与の配列（ＥＥＱＦＮＳＴＹＲ；配列番号４５）について、すべての糖ペプチドは、２つの条件下でのｍＡｂ１の個々のグリコフォームについてのＥＩＣピーク面積をプロットする優れた線形性（Ｒ^２＝０．９９８）によって示されるように、グリカン組成および個々のグリコフォームの相対存在量に依存しない同様のＳ／Ｎの改善を示す（図４３Ａ）。シグナルブーストにおける一貫性は、図４３Ｂおよび４３Ｃに示されるように、２つの条件下で定量化された異なるグリコフォームについてほぼ同等の割合レベルをもたらす。この結果は、ＴＦＡが主にＴＦＡアニオンと一級アミンとの間でイオン対形成を形成することによってシグナルを抑制することを示唆しており、これは糖鎖ではなくアミノ酸においてのみ見出すことができる。

ＩｇＧ４中の糖ペプチドについての平均Ｓ／Ｎブーストは、図４３Ａにおけるプロットの切片から決定され、およそ１９．４倍である。ＩｇＧ１由来の糖ペプチドも分析され、ペプチド配列（

；配列番号３５）中の単一アミノ酸置換にかかわらず、クロマトグラフィープロファイルならびにＳ／Ｎブーストに関して同様の特徴が観察される。結果を図４３Ｄ１～４３Ｄ３および４３Ｅに要約する。

複数のグリコシル化部位を含有するＦｃドメイン融合タンパク質の部位特異的Ｎ－グリコシル化プロファイルの特徴付け

融合タンパク質ｆＰ１は、ｍＡｂ由来のＮ２９７に相当する１つの保存されたＦｃグリコシル化部位（部位１）および機能ドメインに位置する４つのさらなる部位（部位２～４）を含む５つのＮ－グリコシル化部位を含む。消化されたペプチドのＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ分析について、グリシンの存在下での増強されたシグナル対ノイズ比は、ＭＳ２スペクトルにおける断片イオンの収率に依存する糖ペプチド同定の改善のために、極めて重要である（タンデム質量スペクトルの例については図４３Ｆおよび４３Ｇを参照されたい）。グリシン添加剤がｆＰ１についての部位特異的糖ペプチドの同定をどのように改善するかを体系的に評価するために、図４４Ａ（上の２つのパネル）に示すように、２つの条件実行からの検索結果を組み合わせ、比較的ストリンジェントなパラメータ（スコア＞１５０、｜ＬｏｇＰｒｏｂ｜＞２、＃ＰＳＭ≧２）を使用してフィルタリングし、高信頼度ＰＳＭおよび同定された糖ペプチドの両方の数がグリシン添加剤で改善されることが示された。グリコシル化プロファイルは、各部位で異なることが観察され、これはまた、ＥＩＣピーク面積を用いた相対的定量化によって検証される（表５）。

ｍＡｂと同様に、シグナルブーストは、同じグリコシル化部位からのすべてのグリコフォームについて高度に一貫しており（図４４Ｃ）、グリシン添加剤を含む場合および含まない場合の定量化された個々のグリコフォームの相対割合が同等となる（表５）。異なるグリコサイトを含有する糖ペプチドについて、シグナルブーストが２倍（部位５）～５０倍（部位２）の範囲で変動することも注目に値する。これは、ＴＦＡベースのシグナル抑制またはグリシンベースのＴＦＡ緩和のレベルが、異なるペプチド配列について大きく変動することを示している。

十分なシグナル対ノイズ比に加えて、十分なＬＣ分離もまた、高度にグリコシル化されたタンパク質における部位特異的グリコシル化同定に有利である。すべての糖ペプチドピークは、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ分離によって非グリコシル化ペプチドから十分に区別することができ、糖ペプチドからのＭＳ２スペクトルにおけるオキソニウムシグネチャーイオンのＥＩＣピークによって明らかにされる（図４４Ｄ）。これらの糖ペプチドが互いにどのように分離するかを調べるために、４つの代表的なグリコフォーム（ＦＡ２Ｇ１、ＦＡ２Ｇ２、ＦＡ２Ｇ２Ｓ１およびＦＡ２Ｇ２Ｓ２）のＥＩＣピークを、図４５Ａに示す７つのピーク「エンベロープ」として、７つすべてのグリコサイト含有ペプチドについて抽出する。１つのエンベロープ内の溶出プロファイルは、グリコフォームの溶出順序および各ピーク間の保持時間差を含めて、他のエンベロープ内のものとほぼ同等である。そして、糖ペプチドの２つのエンベロープ間の保持時間差は、アミノ酸配列と相関するのみである。これはおそらく、ＨＩＬＩＣにおけるペプチド保持の予測のための複数のモデルにおいて示唆されるように、極性残基の頻度に起因している。記述的には、部位４のペプチドの配列（

配列番号３６）は、１０個の総アミノ酸のうち５個の極性残基を有し、５０％の出現頻度を与える。同じグリコサイトをカバーするが、さらなるＮ末端リジン残基を含む別のペプチドの配列（部位４^ｂとして示される）は、極性残基のわずかに高い割合（５４．４％）を有しているため、部位４^ｂにおける糖ペプチドのエンベロープは、部位４^ａより遅く溶出する。そして、部位４^ｂの溶出時間は、部位５の糖ペプチドエンベロープと同一である。これは、これらのペプチドの両方が、アミノ酸の異なる組み合わせにもかかわらず、５４．４％の極性残基を含むためである。５０％のみの極性残基を有する部位３のエンベロープは、おそらくペプチド配列中のＣ末端アルギニン（リジンの代わりに）の存在に起因して、最後の２つのエンベロープよりも遅く溶出する。ここで、グアニジノ基は、全体的な極性に対してより大きな寄与を有し得る。同じ傾向は、ペプチド配列がＣ末端アルギニンを含み、高い極性残基頻度を有する他の３つのエンベロープすべてについても観察される。Ｆｃドメイン糖ペプチド（部位１）は、すべての極性残基からなるペプチド配列によって決定される極めて高い親水性のために、最後に溶出する。このペプチド中の２つの酸性アミノ酸（Ｇｌｕ）は中和されたカルボン酸形態のままであるが、それらは依然として固定相の中性アミド基に強力に結合することができる。要約すると、糖ペプチドは、グリカン構造およびアミノ酸配列の両方に基づいて分離され得、そして１つのグリコサイト由来の２つのグリコフォームピーク間の空間は、他のグリコサイト由来のピークで満たされる。したがって、ｆＰ１中の糖ペプチドの大部分は、広範囲の溶出時間にわたって均一に分布させることができ、これにより、データ依存的取得中にＭＳ２スキャンのために前駆体を効果的に選択することが可能になる。

ＴＦＡを使用するＩＰ－ＨＩＬＩＣ分離において観察されるかかる特徴は、ギ酸などの強いイオン対形成特性を有さないより弱い酸を使用する場合に再現されない可能性がある。第一に、ＨＩＬＩＣ／ＦＡベースの分離は、糖ペプチドからの非グリコシル化ペプチドの不完全な分離をもたらし得、同じ抽出された代表的ピークは、イオン対形成試薬の欠如に起因する異なる糖ペプチドの不均一な親水性を示す他の早期溶出亜集団を示した（図４４Ｄ）。ＨＩＬＩＣ／ＴＦＡ分離と比較して、ＨＩＬＩＣ／ＦＡのＬＣ性能におけるこの欠陥は、図４４Ａの第３のパネルおよび図４４Ｂのベングラフに示されるように、糖ペプチドのより少ない同定をもたらすが、グリシンの添加は、平均で約５倍のシグナルブーストを依然として達成することができ、同定された糖ペプチドは、ＴＦＡデータセットと比較してより多い数のＰＳＭを有する。ＦＡ含有移動相におけるＨＩＬＩＣ性能は、ＨＩＬＩＣ／ＦＡをグリシン添加剤と組み合わせた場合に糖ペプチド同定をさらに改善し得る他のＨＩＬＩＣ固定材料を使用して得ることができる。Ｃ１８カラムを使用するＲＰＬＣ／ＴＦＡは、複数の部位から糖ペプチドを分離する直交分解能力を保持する。複数の部位からの糖ペプチドは、異なるクラスターとして互いに十分に分離されている（図３６Ｄ）。それらは他の非グリコシル化ペプチドから完全には単離されないが、これらの糖ペプチドクラスターにおいて溶出されるこの単一糖タンパク質ｆＰ１中の非グリコシル化ペプチドがほとんど存在しないため、ＲＰＬＣ－ＭＳによる糖ペプチドの同定は、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法と同等のままである（図４４Ａ、最後の２つのパネルおよび図４４Ｂ）。

ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを用いたモノクローナル抗体における低存在量のＯ－グリコシル化および非標準Ｎ－グリコシル化の発見。

ＩＰ－ＨＩＬＩＣは、ｆＰ１における複数のグリコサイトからの糖ペプチドを特徴付ける能力を示すので、ｍＡｂについての非標準グリコサイトからの糖ペプチドを同定する可能性も有するはずである。低存在量糖ペプチドの検出能を向上させるために試料注入量をわずかに増加させ、したがって高品質のタンデム質量スペクトルを得た。薬物開発の初期段階からのｍＡｂ３の研究において、誤って切断されたＮ２９７含有糖ペプチド（例えば、ＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲ；配列番号４４）、ならびにＶＬドメインに位置するＮ９１およびＣＨ１ドメインに位置するＮ１６３の非標準グリコサイトを含有する糖ペプチド（図４５Ｂおよび４５Ｃにおけるタンデム質量スペクトルの例を参照されたい）を含む、異なるアミノ酸配列を有する複数の低存在量糖ペプチドが確実に同定されている。フコシル化二分岐複合体構造を有するグリカンによって主に占有される標準ＦｃＮ２９７部位とは異なり、３つの高マンノース型グリカンが軽鎖Ｎ９１において同定され、１つのグリカンＦＡ２Ｇ２のみが重鎖Ｎ１６３において同定されており、両方の部位がそれぞれ０．４％および０．０７％という低いグリカン占有率を有する。大量の試料注入により、これらの低存在量糖ペプチドを同定できる可能性が得られるが、それらのシグナル飽和に起因して、非グリコシル化ペプチドの存在量が過小評価される可能性がある。試料注入量が低くなると、各個々のグリカンについて、（おそらくより正確な）占有レベルが低く定量化される（図４５Ｄ）。別の研究において、最も頻繁に生じる哺乳動物Ｏ結合型グリカンデータベース（図４５Ｅおよび４５Ｆにおけるタンデム質量スペクトルの例を参照されたい）に対して検索する場合、低存在量ムチン型Ｏ結合型グリカンＨｅｘＮＡｃ（１）Ｈｅｘ（１）ＮｅｕＡｃ（２）が、二重特異性抗体ｍＡｂ４についての１つのアームにおけるＶＨドメインにおいて同定されるが、このＯ結合型糖ペプチドのレベルは、０．０５％未満であると定量化される。Ｆａｂ領域上のこれらの稀なグリカンの存在はまた、ネイティブ質量分析と組み合わせた強陽イオン交換クロマトグラフィーを使用してインタクトなタンパク質レベルで確認され、Ｆａｂ領域上の他のグリカンは発見されない。

これらの稀なグリカンは、ＲＰＬＣ－ＭＳを使用して独立して発見することはできないが、低存在量の非標準Ｎ－グリカンまたはＯ－グリカンを同定するためにＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳを使用することの利点を統計的に実証するのに十分な症例はまだ存在していない。代わりに、低存在量糖ペプチドに関する調査では、潜在的な干渉からの影響に関する見込みが得られる可能性がある。非常に低い存在量の（糖）ペプチドの検出は、非常に豊富な共溶出干渉の存在下で、特にオービトラップ型質量分析計におけるデータ依存ベースの取得のために、通常困難である。なぜなら、Ｃトラップは、非常に豊富なイオンによって迅速に充填されることができ、低豊富なイオンは、短縮された注入時間内に十分に蓄積されない可能性があり、識別のためにタンデムＭＳ２をトリガするための閾値を上回る信号を生成しない可能性があるからである。ＨＩＬＩＣおよびＲＰＬＣの両方が干渉シグナルを完全に除去することができない場合であっても、干渉の主な原因および影響のレベルは異なる可能性がある。ＲＰＬＣ－ＭＳについては、非グリコシル化ペプチドは勾配全体にわたって広く分布しており、潜在的に任意の低存在量糖ペプチドに対する干渉の原因となり得るが（図４６Ａ）、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳについては、おそらく非グリコシル化ペプチドからの干渉は存在せず、その集団全体がＴＦＡのイオン対に起因して初期溶出時間に圧縮されており、干渉の唯一の源は高存在量のカノニカルＦｃ糖ペプチドからである（図４６Ｂ）。（１）Ｆｃ糖ペプチドの数は非グリコシル化ペプチドの数よりもはるかに少なく、（２）Ｆｃ糖ペプチドの強度は通常、ｍＡｂから消化されたすべてのペプチドの中で最も低いことから、このＦｃ糖ペプチド干渉は、低存在量糖ペプチド同定のためのＲＰＬＣ－ＭＳにおける非グリコシル化干渉と比較して、より低い負の効果を有するはずであると仮定される。実際、ｍＡｂ３（相対存在量＞１０％）中のＦＡ２、ＦＡ２Ｇ１およびＦＡ２Ｇ２などの主要な２つまたは３つのグリコフォームのみが真の干渉として同定され得るが、残りのＦｃグリコフォームは、存在量が少ないため、懸念は最小限となる。

図４６Ｃに示されるように、ＲＰＬＣにおける代表的な６分ウィンドウ（６７～７３分）のうち、合計２．７分は、高存在量ペプチド（６７．５～６８分、６９～７０分、７０．４～７０．６分、および７１～７２分）からのＭＳシグナルを有し、任意の低存在量糖ペプチドと共溶出する高いリスクを生じる。ＨＣＮ９１における３つの高マンノースグリコフォームのクラスター全体が、２５０倍の強度のピーク（６９．０～６９．４分）で共溶出されることが観察される。この状況は、８０分クロマトグラム全体のどこにおいても生じ得る。ＩＰ－ＨＩＬＩＣでは、Ｆｃ糖ペプチドと部分的に共溶出するＮ９１由来の２つの糖ペプチド（Ｍａｎ６およびＭａｎ７）が存在するが、Ｆｃ糖ペプチドからの干渉の強度は、それぞれわずか５０倍および８倍である。１０分の糖ペプチド溶出領域全体（１２～２２分）のうち、１分（３つの主要なグリコフォームについてのピーク幅の合計）のみが強い干渉ピークを有しており、これは、領域の９０％が、バックグラウンドノイズおよび他の低存在量糖ペプチドのみが観察される「谷」領域（図４６Ｂにおける１２．５～１６．５分）を含む、低存在量糖ペプチドについて重度の干渉を有し得ないことを意味する。

同様に、ｍＡｂ４のＶＨドメイン上のＯ結合糖ペプチドもまた、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳにおいて同じ領域で溶出されており、対照的に、ＥＩＣピークは、おそらく二重特異性ｍＡｂに対する非グリコシル化ペプチドの数の増加に起因して、ＲＰＬＣ－ＭＳデータセットから抽出することができない（図４６Ｅ）。Ｏ－グリカンは、通常、Ｎ－グリカンと比較してより少ない単糖単位を含有するので、Ｏ－糖ペプチドは、親水性が低く、Ｎ－糖ペプチドよりも早く溶出する可能性が高い。ｍＡｂ由来の任意の他のＯ－糖ペプチドもまた、非グリコシル化ペプチドまたはＦｃグリコシル化ペプチドのいずれかからの最小の干渉シグナルを有する「谷」領域において溶出されると仮定される。

この干渉の低減により、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳは低存在量の糖ペプチド同定のためのユニークなアプローチとなり、本出願におけるイオン対形成試薬としてのＴＦＡとシグナルブースト試薬としてのグリシンの代替不可能な役割が強調されることとなった。このアプローチは、第２の次元の糖ペプチド濃縮を必要とすることなく、初期段階の生物薬剤発見の間の稀なグリコシル化の迅速なスクリーニングのためのアプローチとして使用することができる。性能は、細長い勾配を使用することによってさらに最適化することができる。加えて、予測不可能な分子依存性の重要な質属性（ＣＱＡ）の大部分は、ＦｃドメインではなくＦａｂドメインに位置し得るので、ＦｃドメインならびにＦｃＮ－糖ペプチド干渉の完全な除去によって単離されたＦａｂ領域に焦点を当て、検出感度がさらに改善された。

本研究では、グリシンをＴＦＡ含有移動相に添加して、ペプチド分離のＬＣ性能に悪影響を及ぼすことなく、ＴＦＡベースのＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳにおける感度不足を有意に解決することができることが実証された。本方法は、通常のフローポンプに基づいており、優れた安定性および堅牢性を示し、無数の異なるタイプのバイオ治療薬およびグリコシル化された機能性タンパク質のための部位特異的グリコシル化プロファイリングを可能にする。ｍＡｂについて、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳにより、放出されたグリカン分析と比較して、インタクトな糖ペプチドレベルで偏りのないグリカンプロファイルが生成されており、このことは、このアプローチが、標準的なタンパク質特徴付けにおける放出されたグリカンアッセイの補足または代用となり得ることを示唆している。加えて、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳは、糖ペプチド定量化のためのＭＲＭまたはＰＲＭベースの方法と互換性があり得、糖ペプチドの広い溶出時間範囲のために、比較的少数の前駆体が同時にスケジュールされる必要がある。これらの標的化または非標的化ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法は、多属性モニタリングワークフローまたは高スループット分析プラットフォームに円滑に移植することができ、これは、生物製剤産業のための分析科学の進歩に有望である。

グリシン添加剤は、ＭＳシグナルをブーストし、全体的な部位特異的グリコシル化同定を増加させるために、弱イオン対形成を伴うＲＰＬＣ－ＭＳまたはＨＩＬＩＣ－ＭＳにおいて使用することができる。Ｆｃドメイン融合タンパク質に関する開示された結果から、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ法が、複数のグリコシル化部位からのグリコシル化プロファイルのマッピングに関して、ＲＰＬＣ－ＭＳ法と（同じシグナル強度で）ほぼ同等となり得ることが実証される。現在の最先端の質量分析計の高速走査速度および高ダイナミックレンジから、非グリコシル化ペプチドからの干渉は、ＲＰＬＣ－ＭＳにおいて十分に許容することができる。しかしながら、ｍＡｂ中の非標準部位などの低占有グリコサイトに関しては、ＩＰ－ＨＩＬＩＣは、依然として、追加の濃縮ステップが含まれない場合であっても、それらの検出能を改善する利点を示している。また、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳは、非グリコシル化ペプチドバックグラウンドを多量に含有する試料に適用される場合、ＲＰＬＣ－ＭＳよりもはるかに良好に機能すると仮定することも妥当である。線形勾配をＩＰ－ＨＩＬＩＣにおける糖ペプチド溶出領域において選択的に伸長して、ＲＰＬＣ－ＭＳにおいてはほとんど実現され得なかった糖ペプチド分離を効率的に増加させることができる。したがって、ヒト血清中などのグリコプロテオームスケールでの迅速かつ容易なグリコフォームスクリーニングのための標的化または非標的化方法を、ＩＰ－ＨＩＬＩＣ－ＭＳ（ＵＰＬＣ）プラットフォームを用いて実施することができる。中性ＨＩＬＩＣ固定相材料（アミド）以外に、双性イオン材料などの他の荷電固定相を評価し得ることが本研究で報告されている。

本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載および添付の図から当業者には明らかであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims

質量スペクトルシグナルを増強する方法であって、
試料成分が担体に結合することを可能にする条件下で、試料を分離カラムに接触させることと、
第１の移動相勾配を前記分離カラムに適用することであって、前記第１の移動相勾配は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および小分子添加剤またはギ酸（ＦＡ）および小分子添加剤を含む、適用することと、
第２の移動相勾配を前記分離カラムに適用することであって、前記第２の移動相勾配は、アセトニトリル（ＡＣＮ）中のＴＦＡおよび小分子添加剤またはＡＣＮ中のＦＡおよび小分子添加剤を含む、適用することと、
溶出した試料成分に対して質量分析を行うことと、を含む、方法。
前記第１の移動相中の前記小分子添加剤は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、またはＮ－メチルグリシンから選択される、請求項１に記載の方法。
前記第１の移動相中の前記小分子添加剤は、グリシン、アラニン、セリン、またはバリンから選択される、請求項２に記載の方法。
前記第１の移動相中の前記小分子添加剤は、グリシンである、請求項３に記載の方法。
前記小分子添加剤の濃度は、約１ｍＭ～約２ｍＭである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
グリシン濃度は、約１ｍＭである、請求項４に記載の方法。
グリシン濃度は、約２ｍＭである、請求項４に記載の方法。
前記第２の移動相中の前記小分子添加剤は、グリシン、アラニン、セリン、バリン、Ｎ－アセチルグリシン、メチオニン、β－アラニン、アスパラギン酸、またはＮ－メチルグリシンから選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の移動相中の前記小分子添加剤は、グリシン、アラニン、セリン、またはバリンから選択される、請求項８に記載の方法。
前記第２の移動相中の前記小分子添加剤は、グリシンである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
前記小分子添加剤の濃度は、約１ｍＭ～約２ｍＭである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
グリシン濃度は、約１ｍＭである、請求項１０に記載の方法。
グリシン濃度は、約２ｍＭである、請求項１０に記載の方法。
前記第１の移動相中のＴＦＡ濃度は、Ｈ_２Ｏ中の約０．０５％～０．１％ＴＦＡであり、または前記第１の移動相中のＦＡ濃度は、約０．１％ＦＡである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
前記第２の移動相中のＴＦＡ濃度は、８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の約０．０５％ＴＦＡまたは８０％ＡＣＮおよび２０％Ｈ_２Ｏ中の約０．１％ＴＦＡを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
前記試料は、ペプチドまたはヌクレオチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
前記ペプチドは、糖ペプチドである、請求項１６に記載の方法。
前記糖ペプチドは、モノクローナル抗体から取得される、請求項１７に記載の方法。
前記モノクローナル抗体は、アイソタイプＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、または混合アイソタイプのものである、請求項１８に記載の方法。
試料成分が前記担体に結合することを可能にする条件下で前記試料を分離カラムに接触させる前に、前記試料を調製することをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
前記試料を調製することは、
試料の変性および還元を可能にする条件下で、試料を変性および還元溶液と接触させることと、
試料のアルキル化を可能にする条件下で、変性および還元された試料をアルキル化溶液と接触させることと、
試料の消化を可能にする条件下で、アルキル化された試料を消化溶液と接触させることと、
試料の消化を停止させる条件下で、消化された試料をクエンチ溶液と接触させることと、を含む、請求項２０に記載の方法。
前記試料は、モノクローナル抗体であり、前記消化溶液は、プロテアーゼを含む、請求項２１に記載の方法。
前記プロテアーゼは、トリプシンを含む、請求項２２に記載の方法。
前記分離カラムは、液体クロマトグラフィーカラムである、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
前記液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離カラムは、親水性相互作用（ＨＩＬＩＣ）液体クロマトグラフィーカラムを含む、請求項２４に記載の方法。
溶出した試料成分に対して質量分析を行うことは、エレクトロスプレーイオン化を適用して前記溶出した試料成分から荷電イオンを生成することと、前記生成された荷電イオンを測定することと、を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
前記方法は、高荷電状態種（ｚ≧３）において、平均で約５～１４倍および／またはおよそ約２～１０００倍の増加によって示される、前記質量スペクトルシグナルを増強する、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
前記スペクトルシグナルは、高荷電状態種において、およそ１４倍および／またはおよそ１０００倍の増加、増加する、請求項２７に記載の方法。
前記溶出した試料成分について取得された前記質量スペクトルシグナルは、前記小分子添加剤の非存在下で対照試料について取得される質量スペクトルシグナルに対して２倍～５０倍増強される、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
前記糖ペプチドは、Ｏ－グリカン含有糖ペプチドである、請求項２９に記載の方法。
前記糖ペプチドは、Ｎ－グリカン含有糖ペプチドである、請求項２９に記載の方法。
Ｏ－グリカンまたはＮ－グリカンは、標識に連結されている、請求項３０または３１に記載の方法。
前記標識は、プロカインアミドである、請求項３２に記載の方法。
前記小分子添加剤は、グリシンである、請求項２９～３３のいずれか一項に記載の方法。