CN115280151A - 使用氨基酸增强质谱分析中的信号 - Google Patents

Abstract

公开了一种增强质谱信号的方法。所述方法可以包含在允许样品组分与基材结合的条件下使样品与分离柱接触；向所述分离柱施加第一流动梯度，其中所述第一流动相梯度包括三氟乙酸(TFA)和小分子添加剂(例如，氨基酸)或甲酸(FA)和小分子添加剂(例如，氨基酸)；向所述分离柱施加第二流动梯度，其中所述第二流动相梯度包括含TFA的乙腈(ACN)和小分子添加剂(例如，氨基酸)或含甲酸(FA)的ACN和小分子添加剂(例如，氨基酸)；以及对洗脱后的样品组分进行质谱分析。

Description

使用氨基酸增强质谱分析中的信号

对序列表的参考

本申请通过引用并入以计算机可读形式作为文件10675WO01-Sequence.txt提交的序列表，其创建于2021年1月7日并含有18,878个字节。

技术领域

本发明涉及质谱分析，并且涉及通过使用氨基酸如甘氨酸或经修饰的氨基酸来增强质谱信号的方法。

背景技术

液相色谱-质谱法(LC-MS)用于表征生物分子，包含肽和蛋白质治疗剂。尽管LC-MS是一种表征重组蛋白和翻译后修饰和蛋白质修饰(如二硫键、糖基化和磷酸化)的强大技术，但已发现分离和灵敏度不足。例如，糖基化可以通过分析抗体胰蛋白酶消化产生的糖肽在肽水平上进行表征。然而，具有异质糖型的糖肽通常无法通过传统上用于肽图分析的反相液相色谱法(RPLC)很好地分离。此外，在线质谱(MS)诱导的糖肽中糖链的源内片段化会产生截短的糖型伪影，这会损害使用MS对不同糖型的相对丰度的准确定量。

发明内容

在一个方面，本发明提供了一种增强质谱信号的方法，所述方法包括：在允许样品组分与基材结合的条件下使样品与分离柱接触；向所述分离柱施加第一流动相梯度，其中所述第一流动相梯度包括三氟乙酸(TFA)和小分子添加剂(例如，氨基酸)、甲酸(FA)和小分子添加剂(例如，氨基酸)或甲酸铵和小分子添加剂(例如，氨基酸)；向所述分离柱施加第二流动相梯度，其中所述第二流动相梯度包括含TFA的乙腈(ACN)和小分子添加剂(例如，氨基酸)、含甲酸(FA)的乙腈(ACN)和小分子添加剂(例如，氨基酸)或含甲酸铵的水和乙腈(ACN)和小分子添加剂(例如，氨基酸)；以及对洗脱后的样品组分进行质谱分析。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述小分子添加剂是甘氨酸。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述小分子添加剂是甘氨酸并且浓度介于约1mM到约2mM甘氨酸之间。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述甘氨酸浓度为约1mM。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述甘氨酸浓度为约2mM。

在一些实施例中，所述第二流动相中的所述小分子添加剂是甘氨酸。

在一些实施例中，所述第二流动相中的所述小分子添加剂是甘氨酸并且浓度介于约1mM到约2mM甘氨酸之间。

在一些实施例中，所述第二流动相中的所述甘氨酸浓度为约1mM。

在一些实施例中，所述第二流动相中的所述甘氨酸浓度为约2mM。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述TFA浓度为H₂O中的约0.05％到0.1％TFA，或所述第一流动相中的所述FA浓度为约0.1％FA。

在一些实施例中，所述第二流动相中的所述TFA浓度包括80％ACN和20％H₂O中的约0.05％TFA，或80％ACN和20％H₂O中的约0.1％TFA。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述甲酸铵浓度为50mM，pH为4.4

在一些实施例中，所述第二流动相包括15％含50mM甲酸铵，pH 4.4的H₂O和85％ACN。

在一些实施例中，所述样品包括肽、核苷酸或聚糖。

在一些实施例中，所述肽是糖肽。

在一些实施例中，所述糖肽获自单克隆抗体。

在一些实施例中，所述单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。

在一些实施例中，所述方法进一步包括在使样品与分离柱在允许样品组分与基材结合的条件下接触之前制备所述样品。

在一些实施例中，制备所述样品包括：在允许样品变性和还原的条件下使样品与变性和还原溶液接触；在允许样品烷基化的条件下使变性和还原后的样品与烷基化溶液接触；在允许样品消化的条件下使烷基化样品与消化溶液接触；以及在停止样品消化的条件下使消化后的样品与淬灭溶液接触。

在一些实施例中，制备所述样品包括：使用酶或化学反应从样品中释放聚糖；用荧光标记对释放的聚糖进行标记或使用还原剂对释放的聚糖进行还原。

在一些实施例中，所述样品是单克隆抗体并且所述消化溶液包括蛋白酶。

在一些实施例中，所述蛋白酶包括胰蛋白酶。

在一些实施例中，所述分离柱是液相色谱(LC)分离柱。

在一些实施例中，LC分离柱包括亲水相互作用(HILIC)液相色谱柱。

在一些实施例中，对洗脱后的样品组分进行质谱分析包括应用电喷雾电离以从所述洗脱后的样品组分产生带电离子并测量所产生的带电离子。

在一些实施例中，所述方法增强了质谱信号，如通过高电荷态物质(例如，z≥3)中的平均约5到14倍和/或约2到1000倍增加所指示的。

在一些实施例中，所述光谱信号在高电荷态物质中增加了约14倍和/或增加了约1000倍。

在一些实施例中，所述样品含有糖肽或聚糖，并且在所述洗脱后的样品组分上获得的所述质谱信号相对于在不存在所述小分子添加剂的情况下在对照样品上获得的质谱信号增强了2倍到50倍。在一些情况下，所述糖肽是含有O-聚糖的糖肽。在一些情况下，所述糖肽是含有N-聚糖的糖肽。在一些情况下，所述聚糖是O-聚糖。在一些情况下，所述聚糖是N-聚糖。在一些情况下，所述O-聚糖或所述N-聚糖连接到标记物，任选地普鲁卡因酰胺、2-氨基苯甲酰胺或RapiFluor。在任何这些实施例中，所述小分子添加剂可以是甘氨酸。

在各个实施例中，上文或本文所讨论的实施例的特征或组分中的任何特征或组分可以组合，并且此类组合涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的任何特定值可以与上文或本文所讨论的另一个相关值组合以列举具有表示范围的上端和下端的值的范围，并且该范围和落入该范围内的所有值都涵盖在本公开的范围内。上文或本文所讨论的值中的每一个都可以用1％、5％、10％或20％的变化表示。例如，10mM的浓度可表示为10mM±0.1mM(1％变化)、10mM±0.5mM(5％变化)、10mM±1mM(10％变化)或10mM±2mM(20％变化)。通过阅读随后的具体实施方式，其它实施例将变得显而易见。

附图说明

图1A和1B示出了不同浓度的甘氨酸对MS加强的影响和不同样品上样量对MS加强的影响。

图1C示出了NISTmAb的重链(SEQ ID NO:1)和轻链(SEQ ID NO:2)。

图2提供了甘氨酸衍生物的化学结构。

图3示出了试剂(2mM)对NISTmAb胰蛋白酶肽的平均MS1加强倍数。

图4示出了在将甘氨酸添加到TFA缓冲液后肽的色谱分离的最小变化。

图5示出了TFA缓冲液中2mM甘氨酸的加强重现性，其中上样0.25μg NISTmAb。图5中示出了以下肽：ALEWLADIWWDDK(SEQ ID NO:3)、ALPAPIEK(SEQ ID NO:4)、DIQMTQSPSTLSASVGDR(SEQ ID NO:34)、DMIFNFYFDVWGQGTTVTVSSASTK(SEQ ID NO:5)、DSTYSLSSTLTLSK(SEQ ID NO:6)、DTLMISR(SEQ ID NO:7)、EPQVYTLPPSR(SEQ ID NO:8)、ESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTAGMSVGWIR(SEQ ID NO:9)、FNWYVDGVEVHNAK(SEQ ID NO:10)、FSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTK(SEQ ID NO:11)、GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(SEQ ID NO:12)、GPSVFPLAPSSK(SEQ ID NO:13)、HYNPSLK(SEQID NO:14)、LASGVPSR(SEQ ID NO:15)、LLIYDTSK(SEQ ID NO:16)、NQVSLTCLVK(SEQ ID NO:17)、NQVVLK(SEQ ID NO:18)、QVTLR(SEQ ID NO:19)、SGTASVVCLLNNFYPR(SEQ ID NO:20)、SLSLSPG(SEQ ID NO:21)、STSGGTAALGCLVK(SEQ ID NO:22)、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(SEQ ID NO:23)、TPEVTCVVVDVSHEDPEVK(SEQ ID NO:24)、TTPPVLDSDGSFFLYSK(SEQ ID NO:25)、TVAAPSVFIFPPSDEQLK(SEQ ID NO:26)、VDNALQSGNSQESVTEQDSK(SEQ ID NO:27)、VGYMHWYQQKPGK(SEQ ID NO:28)、VTITCSASSR(SEQ ID NO:29)、VTNMDPADTATYYCAR(SEQ IDNO:30)、VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:31)、VYACEVTHQGLSSPVTK(SEQ ID NO:32)和WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(SEQ ID NO:33)。

图6示出了在存在甘氨酸的情况下使用TFA对照和TFA观察到的信噪比，其中上样2.5μgNISTmAb消化物。

图7、8A和8B示出了存在甘氨酸时的电荷态转变。图7中示出了以下肽：ALEWLADIWWDDK(SEQ ID NO:3)、ALPAPIEK(SEQ ID NO:4)、DIQMTQSPSTLSASVGDR(SEQ IDNO:34)、DMIFNFYFDVWGQGTTVTVSSASTK(SEQ ID NO:5)、DSTYSLSSTLTLSK(SEQ ID NO:6)、DTLMISR(SEQ ID NO:7)、EPQVYTLPPSR(SEQ ID NO:8)、ESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTAGMSVGWIR(SEQ ID NO:9)、FNWYVDGVEVHNAK(SEQ ID NO:10)、FSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTK(SEQ ID NO:11)、GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(SEQ ID NO:12)、GPSVFPLAPSSK(SEQ ID NO:13)、HYNPSLK(SEQ ID NO:14)、LASGVPSR(SEQ ID NO:15)、LLIYDTSK(SEQ ID NO:16)、NQVSLTCLVK(SEQ ID NO:17)、NQVVLK(SEQ ID NO:18)、QVTLR(SEQ ID NO:19)、SGTASVVCLLNNFYPR(SEQ ID NO:20)、SLSLSPG(SEQ ID NO:21)、STSGGTAALGCLVK(SEQ ID NO:22)、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(SEQ ID NO:23)、TPEVTCVVVDVSHEDPEVK(SEQ ID NO:24)、TTPPVLDSDGSFFLYSK(SEQ ID NO:25)、TVAAPSVFIFPPSDEQLK(SEQ ID NO:26)、VDNALQSGNSQESVTEQDSK(SEQ ID NO:27)、VGYMHWYQQKPGK(SEQ ID NO:28)、VTITCSASSR(SEQ ID NO:29)、VTNMDPADTATYYCAR(SEQ IDNO:30)、VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:31)、VYACEVTHQGLSSPVTK(SEQ ID NO:32)和WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(SEQ ID NO:33)。使用具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的肽进行的研究显示在图8A中，并且使用具有SEQ ID NO:18的残基的肽进行的研究显示在图8B中。

图9示出了在存在和不存在2mM甘氨酸(TFA缓冲液，上样0.25μg NISTmAb)的情况下的PTM％定量。

图10示出了与TFA对照相比，TFA或FA或单独的FA在存在甘氨酸的情况下的加强倍数。图10中示出了具有以下残基的肽：ALEWLADIWWDDK(SEQ ID NO:3)、ALPAPIEK(SEQ IDNO:4)、DIQMTQSPSTLSASVGDR(SEQ ID NO:34)、DMIFNFYFDVWGQGTTVTVSSASTK(SEQ ID NO:5)、DSTYSLSSTLTLSK(SEQ ID NO:6)、DTLMISR(SEQ ID NO:7)、EPQVYTLPPSR(SEQ ID NO:8)、ESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTAGMSVGWIR(SEQ ID NO:9)、FNWYVDGVEVHNAK(SEQ ID NO:10)、FSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCFQGSGYPFTFGGGTK(SEQ ID NO:11)、GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK(SEQ ID NO:12)、GPSVFPLAPSSK(SEQ ID NO:13)、HYNPSLK(SEQID NO:14)、LASGVPSR(SEQ ID NO:15)、LLIYDTSK(SEQ ID NO:16)、NQVSLTCLVK(SEQ ID NO:17)、NQVVLK(SEQ ID NO:18)、QVTLR(SEQ ID NO:19)、SGTASVVCLLNNFYPR(SEQ ID NO:20)、SLSLSPG(SEQ ID NO:21)、STSGGTAALGCLVK(SEQ ID NO:22)、THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPK(SEQ ID NO:23)、TPEVTCVVVDVSHEDPEVK(SEQ ID NO:24)、TTPPVLDSDGSFFLYSK(SEQ ID NO:25)、TVAAPSVFIFPPSDEQLK(SEQ ID NO:26)、VDNALQSGNSQESVTEQDSK(SEQ ID NO:27)、VGYMHWYQQKPGK(SEQ ID NO:28)、VTITCSASSR(SEQ ID NO:29)、VTNMDPADTATYYCAR(SEQ IDNO:30)、VVSVLTVLHQDWLNGK(SEQ ID NO:31)、VYACEVTHQGLSSPVTK(SEQ ID NO:32)和WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK(SEQ ID NO:33)。

图11示出了用2mM甘氨酸对单个氨基酸的加强倍数。

图12示出了商业甘氨酸调配物中迹线钠对TTPPVLDSDGSFFLYSK(SEQ ID NO:25)肽的影响。

图13提供了使用PRM和全扫描对STSGGTAALGCLVK(SEQ ID NO:22)肽进行定量之间的比较。

图14说明了基于HILIC的液相色谱法相对于用于9残基肽的糖肽分析的反相的一些优点。

图15说明了在添加甘氨酸的缓冲液中观察到的MS1和MS2的信号加强。

图16说明2mM甘氨酸阻止结合。

图17是通过基于IP-HILIC的LC进行糖肽分析的示例性样品制备工作流程示意图。

图18示出了脱盐的效果，其中用SepPak 30小柱进行脱盐消除了升高的基线(见箭头)。

图19和20提供了说明甘氨酸对峰面积影响的表。

图21A和21B示出了评估的mAb中所有糖型的峰面积。

图22示出了在存在9残基肽的1mM甘氨酸的情况下通过电荷态转变增强的片段化能力。

图23显示甘氨酸增加了VEGF TRAP中肽谱匹配(PSM)和糖型的数量。

图24说明了在Byologic验证后与FA相比，当使用TFA+甘氨酸时鉴定的序列变体的数量。

图25说明了在甲酸铵流动相中甘氨酸对PROCA标记的血清N-聚糖的加强作用。示出的是来自人血清的PROCA标记的N-聚糖的质谱(MS)提取离子色谱(EIC)和荧光(FLR)色谱图迹线，其使用含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相通过HILIC进行分析。

图26A、26B和26C说明了甲酸铵流动相中PROCA标记的N-聚糖的总MS信号。图26A和26C示出了通过在甲酸铵流动相中加入1mM甘氨酸，PROCA标记的血清N-聚糖的MS信号增强倍数。图26B示出了PROCA标记的血清N-聚糖在含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相中的MS EIC峰面积。

图27说明，与对照流动相相比，含有甘氨酸的流动相的质谱图更类似于FLR色谱图。示出的是来自人血清的PROCA标记的N-聚糖的重叠质量EIC和FLR色谱图迹线，其使用含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相通过HILIC进行分析。

图28A、28B和28C说明了在甲酸铵流动相中添加和不添加甘氨酸的情况下PROCA标记的血清N-聚糖MS峰强度的比较。示出的是基于FLR或MS EIC峰面积相对于FA2G2的水平归一化的PROCA标记的N-聚糖的相对水平，其使用含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相通过HILIC进行分析。

图29说明，PROCA标记的聚糖的MS峰面积与具有甘氨酸的甲酸铵流动相中的FLR峰面积更成比例。示出的是血清N-聚糖EIC峰面积对比FLR峰面积(对数标度)的散点图，用于使用不含(对照)和含(甘氨酸)1mM甘氨酸添加剂的甲酸铵流动相进行分析。示出了每个条件的线性回归的方程和R平方值。与对照条件相比，甘氨酸条件的R平方值较小，这表明PROCA标记的N-聚糖可以通过在流动相中添加甘氨酸的MS更准确地量化。

图30A、30B和30C说明了甲酸流动相中的甘氨酸对PROCA标记的N-聚糖的MS信号加强。图30A和图30C示出了通过HILIC分析的通过在0.1％FA流动相中包含1mM甘氨酸，PROCA标记的血清N-聚糖的MS信号增强倍数。图30B示出了PROCA标记的血清N-聚糖在0.1％FA流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相中的MS EIC峰面积。

图31A、31B和31C说明了在甲酸铵流动相中添加和不添加甘氨酸的情况下RapiFluor标记的血浆N-聚糖MS峰强度的比较。示出的是基于FLR或MS EIC峰面积相对于FA2G2的水平归一化的RapiFluor标记的N-聚糖的相对水平，其使用含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相通过HILIC进行分析。图31A还示出了甘氨酸添加剂对PROCA标记的血清N-聚糖的MS信号增强和电荷态转变倍数。

图32说明了在甲酸铵流动相中添加和不添加甘氨酸的情况下还原后的血清N-聚糖MS峰强度的比较。所描绘的表示出了MS信号变化和还原后的血清N-聚糖的平均电荷态，其使用含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相通过HILIC进行分析。

图33说明了用于分析标记或还原后的N-聚糖的LC-FLR-MS条件。

图34示出了通过LC-MS和FLR检测进行O-聚糖制备和分析的示例性方法。

图35示出了来自牛颌下粘蛋白(BSM)的柱上2μg PROCA标记的O-聚糖、荧光和优化的还原胺化。

图36表明PROCA标记的O-聚糖FL和MS TIC谱具有高度可比性。

图37A和37B示出了在甲酸铵流动相中添加和不添加甘氨酸的情况下PROCA-标记的牛颌下粘蛋白(BSM)O-聚糖MS峰强度的比较。图37A示出了来自BSM的PROCA标记的O-聚糖的MS EIC和FLR色谱图迹线，其使用含有甲酸铵的流动相(对照)和具有额外1mM甘氨酸(甘氨酸)的相同流动相通过HILIC进行分析。图37B示出了在流动相中添加和不添加甘氨酸的情况下O-聚糖FLR和MS峰强度(相对于HexNAc1NeuAc1进行归一化)的比较。

图38A、38B和38C说明了在没有或有各种标记的情况下甘氨酸对BSM O-聚糖的加强作用。图38A示出了甘氨酸对PROCA标记的BSM O-聚糖的加强作用。图38B示出了甘氨酸对2AB标记的BSM O-聚糖的加强作用。图38C示出了甘氨酸对还原后的BSM O-聚糖的加强作用。

图39示出了用于分析标记或还原后的O-聚糖的示例性LC-FLR-MS条件。

图40和41说明了甘氨酸对MS2确认O-聚糖结构的影响，当使用珠子纯化时，O-聚糖结构具有非常低的水平。

图42A示出了在存在甘氨酸添加剂和没有甘氨酸的情况下在优化的IP-HILIC条件下典型IgG4的TIC谱。

图42B示出了使用含有1mM甘氨酸的流动相和对照条件进行IP-HILIC-MS分析的mAb1胰蛋白酶消化物的UV色谱图迹线。

图42C-1、42C-2和42C-3示出了在IP-HILIC-MS中使用不同长度的线性梯度分离异构体(左)和多种糖型(右)之间的比较。

图42D和42E示出了来自IgG4的糖肽的串联质谱的实例。示出了糖肽的所有PSM内评分最高的光谱。

图42F示出了使用IP-HILIC-MS分析的mAb2的糖肽的EIC峰。纸盒使用聚糖的统一符号命名法(SNFG)表示聚糖结构：正方形，N-乙酰氨基葡萄糖；三角形，岩藻糖；圆，甘露糖；圆圈，半乳糖；菱形，N-乙酰神经氨酸。

图42G示出了在pH 5.5下使用HILIC-FLR-MS分析的来自mAb2的释放聚糖的EIC峰。

图42H-1和42H-2示出了使用80分钟梯度的来自IgG4的胰蛋白酶肽的RPLC-MS。所有糖型都在一个聚类中洗脱(右图)；IP-HILIC-MS中的有效糖型分离排除了从源内片段化产生的人工糖型(左图)。

图43A和43B示出了基于IP-HILIC-MS在有和没有甘氨酸的情况下在Fc糖基化位点N297处量化的所有mAb1糖型，如图35A所示的绝对EIC峰面积和图35B中每种单独聚糖的相对丰度。

图43C示出了来自mAb1(IgG4)的单个糖型的测量的EIC峰面积和相对定量的表。

图43D-1、43D-2和43D-3示出了mAb5(IgG1)的糖肽分析–TIC色谱图；使用IP-HILIC-MS分析的最丰富的10种糖型的洗脱曲线；使用RPLC-MS分析的最丰富的10种糖型的洗脱曲线；每种糖型的甘氨酸辅助ESI信号加强；和每种已鉴定糖型的相对百分比。

图43E示出了来自mAb5(IgG1)的单个糖型的测量的EIC峰面积和相对定量的表。^*当对照样品中糖型的峰面积因检测不良而降低时，变化倍数会显著增加。

图43F和43G示出了来自fP1的胰蛋白酶肽的串联质谱实例，其使用含有0.1％TFA(图35G)或0.1％TFA+1mM甘氨酸作为信号加强剂的流动相通过IP-HILIC-MS进行分析(图35F)。两种光谱都具有该糖肽在所有PSM内排名最高的评分。

图44A和44B示出了Fc结构域融合蛋白fP1的糖肽鉴定在不同分离方法(使用TFA的IP-HILIC、使用FA的HILIC以及使用TFA的RPLC)之间的比较。所有实验均使用1mM甘氨酸，以消除MS检测过程中离子抑制的影响。图36A示出了完整的位点特异性糖基化图。图36B示出了不同方法中鉴定的糖肽的汇总数量。

图44C示出了不同含糖苷肽的基于甘氨酸的信号变化倍数。

图44D示出了通过使用TFA的IP-HILIC-MS(上图)、使用FA的HILIC-MS(中图)和使用TFA的RPLC-MS(底图)分析的消化后的fP1的氧鎓离子提取(黄色迹线)和TIC(其它迹线)谱。

图45A示出了来自fP1的7种含糖位点的肽中四种代表性糖型的EIC峰。肽序列上的颜色表示可能有助于亲水性的氨基酸，其显示为含有羟基、酰胺或伯胺基的极性残基(橙色)和含有胍基(红色)和糖基化天冬酰胺(蓝色)的强极性残基。

图45B和45C示出了在非规范N-糖基化位点处的糖肽和在mAb3中鉴定的空置肽的串联质谱。

图45D示出了使用IP-HILIC-MS分析的mAb3的非规范位点处低丰度N-糖基化的相对百分比。

图45E和45F示出了在mAb4中鉴定的O-连接糖肽和空置肽的串联质谱。

图46A、46B、46C和46D示出了低丰度非规范N-糖基化肽的EIC和在(A)(C)甘氨酸的RPLC-MS和(B)(D)4.5μg进样的IP-HILIC-MS下采集的mAb3的基峰色谱图(BPC)。MS峰强度已使用最高峰进行归一化。峰号1-4分别代表N91处的Man5、Man6、Man7和N163处的FA2G2。

图46E示出了mAb4中鉴定的O-连接糖肽的MS1提取。

具体实施方式

在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应当理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求书限制。任何实施例或实施例的特征可以彼此组合，并且此类组合明确地涵盖在本发明的范围内。

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本文所使用的，当用于提及具体所列举的数值时，术语“约”意指数值可以与所引用的值相差不超过1％。例如，如本文所使用的，表述“约100”包含99和101以及其之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

尽管在本发明的实践或测试中可以使用类似于或等同于本文所述的方法和材料的任何方法和材料，但现在描述了优选的方法和材料。本说明书中提及的所有专利、申请和非专利出版物均通过引用整体并入本文。

本文使用的缩写

ACN：乙腈

ESI-MS：电喷雾电离质谱法

FA：甲酸

FLR：荧光检测

HC：重链

HESI：加热电喷雾电离

HILIC：亲水相互作用液相色谱法

IP-HILIC：离子配对亲水相互作用色谱法

IgG：免疫球蛋白G

LC：轻链

LC-MS：液相色谱-质谱法

mAb：单克隆抗体

MPA：流动相A

MPB：流动相B

MS：质谱法

MW：分子量

PROCA：普鲁卡因酰胺

2-AB：2-氨基苯甲酰胺

PTM：翻译后修饰

RPLC：反相液相色谱法

RPLC-MS/MS：反相液相色谱串联质谱法

SPE：固相提取

TFA：三氟乙酸

UV：紫外线

定义

如本文所使用的，术语“抗体”旨在指免疫球蛋白分子，其包括四个多肽链，通过二硫键互连的两个重(H)链和两个轻(L)链(即，“全抗体分子”)，以及其多聚体(例如，IgM)或其抗原结合片段。每个重链包括重链可变区(“HCVR”或“V_H”)和重链恒定区(包括结构域C_H1、C_H2和C_H3)。在各个实施例中，重链可以是IgG同种型。在一些情况下，重链选自IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在一些实施例中，重链是同种型IgG1或IgG4，任选地包含同种型IgG1/IgG2或IgG4/IgG2的嵌合铰链区。每个轻链包括轻链可变区(“LCVR”或“V_L”)和轻链恒定区(C_L)。V_H区和V_L区可以被进一步细分成被称作互补决定区(CDR)的高变区，其间散布着更保守的被称作构架区(FR)的区。每个V_H和V_L由按以下顺序从氨基末端到羧基末端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。术语“抗体”包含提及任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包含通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体分子，如从经转染以表达抗体的宿主细胞中分离的抗体。关于抗体结构的综述，参见Lefranc等人,“免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域和Ig超家族V样结构域的IMGT唯一编号(IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variabledomains and Ig superfamily V-like domains)”,27(1)《发育与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》55-77(2003)；和M.Potter,“免疫球蛋白多样性的结构相关性(Structural correlates of immunoglobulin diversity)”,2(1)《免疫学研究调查(Surv.Immunol.Res.)》27-42(1983)。

术语抗体还涵盖“双特异性抗体”，所述双特异性抗体包含可以与多于一个不同表位结合的异四聚体免疫球蛋白。包含单个重链和单个轻链和六个CDR的双特异性抗体的一半与一个抗原或表位结合，并且另一半抗体与不同的抗原或表位结合。在一些情况下，双特异性抗体可以结合相同的抗原，但是在不同的表位或非重叠的表位处。在一些情况下，两半的双特异性抗体具有相同的轻链，同时保持双重特异性。双特异性抗体一般描述于美国专利申请出版物第2010/0331527号中(2010年12月30日)。

术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指保留与抗原特异性地结合的能力的一个或多个抗体片段。术语抗体的“抗原结合部分”中涵盖的结合片段的实例包含：(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区处由二硫桥连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然(Nature)》241:544-546)；(vi)分离的CDR；以及(vii)由Fv片段的两个结构域VL和VH组成的scFv，所述两个结构域通过合成接头连接以形成单个蛋白质链，其中所述VL区和VH区域配对以形成单价分子。其它形式的单链抗体，如双抗体也涵盖在术语“抗体”下(参见例如，Holliger等人(1993)90PNAS U.S.A.6444-6448；和Poljak等人(1994)2《结构(Structure)》1121-1123)。

此外，抗体及其抗原结合片段可以使用本领域公知的标准重组DNA技术获得(参见Sambrook等人，1989)。用于在转基因小鼠中产生人抗体的方法也是本领域已知的。例如，使用

技术(参见例如，US 6,596,541，再生元制药公司(RegeneronPharmaceuticals)，

)或用于产生单克隆抗体的任何其它已知方法，初步分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对所需抗原的高亲和力嵌合抗体。

技术涉及具有基因组的转基因小鼠的产生，所述基因组包括可操作地连接到内源性小鼠恒定区基因座的人重链可变区和人轻链可变区，使得小鼠响应于抗原性刺激而产生包括人可变区和小鼠恒定区的抗体。对抗体的重链可变区和轻链可变区进行编码的DNA被分离，并且可操作连接到对人重链恒定区和人轻链恒定区进行编码的DNA。然后DNA在能够表达完全人抗体的细胞中表达

术语“人抗体”旨在包含具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人mAb可以包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR中，特别是在CDR3中。然而，如本文所使用的，术语“人抗体”不旨在包含其中衍生自另一种哺乳动物物种(例如，小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人FR序列上的mAb。所述术语包含在非人哺乳动物或非人哺乳动物细胞中重组产生的抗体。所述术语不旨在包含从人类受试者中分离或产生的抗体。

如本文所使用的，术语“糖肽/糖蛋白”是经修饰的肽/蛋白质，在它们合成期间或之后，具有共价键合的碳水化合物或聚糖。在某些实施例中，糖肽获自单克隆抗体，例如获自单克隆抗体的蛋白酶消化物。

如本文所使用的，术语“聚糖”是包括一个或多个糖单元的化合物，其通常包含葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、岩藻糖(Fuc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和N-乙酰神经氨酸(NeuNAc)(Frank Kjeldsen等人《分析化学(Anal.Chem.)》2003,75,2355-2361)。糖蛋白(如单克隆抗体)中的聚糖部分是鉴定其功能或细胞位置的重要特征。例如，特定的单克隆抗体被特定的聚糖部分修饰。

术语“亲水相互作用色谱法”或HILIC旨在包含采用亲水固定相和疏水有机流动相的工艺，其中亲水化合物的保留时间比疏水化合物长。在某些实施例中，所述工艺使用与水混溶的溶剂流动相。

如本文所使用的，术语“样品”是指分子混合物，其包括至少一种分析物分子，例如糖肽，如从单克隆抗体获得的糖肽，根据本发明的方法对其进行操纵，包含例如分离、分析、提取、浓缩或分析。

如本文所使用的，术语“分析(analysis或analyzing)”可互换使用，并且是指分隔、检测、分离、纯化、溶解、检测和/或表征所关注的分子(例如，糖蛋白)的各种方法中的任何一种方法。实例包含但不限于固相提取、固相微提取、电泳、质谱法(例如，ESI-MS、SPEHILIC或MALDI-MS)、液相色谱法(例如，高效液相色谱法，例如，反相、正相或尺寸排阻、离子对液相色谱法)、液-液提取(例如，加速流体提取、超临界流体提取、微波辅助提取、膜提取、索氏提取)、沉淀、澄清、电化学检测、染色、元素分析、埃德蒙降解(Edmund degradation)、核磁共振、红外分析、流动注射分析、毛细管电色谱法、紫外检测及其组合。

如本文所使用的，术语“分析”是指各种分析方法中的任何一种，这些方法组合使用以提供样品中糖肽的含量、组成或特征比。

“电喷雾电离质谱法”或“ESI-MS”是质谱法中使用的技术，以使用电喷雾产生离子，其中向液体施加高电压以产生气溶胶。例如，在电喷雾中，离子是由溶液中的蛋白质产生的，这使得脆弱的分子可以完整地电离，从而可以保持非共价相互作用。电喷雾电离是将液相色谱法与质谱法(LC-MS)相结合的首选离子源。分析可以在线进行，通过将从LC柱洗脱的液体直接送入电喷雾，或离线进行，通过收集稍后在经典纳米电喷雾-质谱设置中分析的级分。LC-MS可用于表征蛋白质，包含量化生物标志物、分析序列变体以及鉴定和量化糖肽。

如本文所使用的，“接触”包含将溶液或固相中的至少两种物质聚集在一起。

一般说明

因此，需要具有提高的灵敏度的蛋白质表征方法。所公开的发明满足了这种需要。

本文公开了一种基于LC-MS的蛋白质表征的新方法，其增加了质谱检测灵敏度。这种新方法基于本文报道的研究，其中发明人令人惊讶地发现，与不存在小分子添加剂(例如，氨基酸或经修饰的氨基酸)时产生的信号相比，在液相色谱法期间在流动相溶液中包含此类小分子添加剂导致质谱信号显著加强。发明人还发现，当添加到流动相缓冲液中时，此类添加剂，例如氨基酸(例如，甘氨酸)的存在不影响肽和聚糖在LC柱上的保留和色谱分离度。此外，添加剂(例如，如甘氨酸等氨基酸)对肽和聚糖的信号加强、电荷态转变和PTM定量的影响是可重现的。此外，据发现，与IP-HILIC-LC-MS方法中的常规TFA缓冲液相比，TFA和甘氨酸缓冲液可提高蛋白质定量中的定量下限(LLOQ)、在不影响相对定量的情况下更可靠地鉴定糖肽，并且与经常用于序列变体分析的FA缓冲液相比，鉴定更多序列变体，同时生成互补信息。因此，所公开的发现通过提高质谱检测灵敏度在基于LC-MS的蛋白质表征方面具有非常广泛的应用。在一些实施例中，所公开的方法可用于生物标志物定量、序列变体分析和/或通过LC-MS进行的肽(如糖肽)和/或聚糖鉴定和定量。

在一些实施例中，所述方法包含在允许样品组分与基材结合的条件下使样品与分离柱接触；向所述分离柱施加流动梯度，其中所述流动梯度缓冲液包括小分子添加剂(例如，氨基酸)和TFA、FA、甲酸铵或和/或ACN；以及对洗脱后的样品组分进行质谱分析。

使用的流动相可以包含具有和不具有离子配对试剂的缓冲液，例如，乙腈和水。离子配对试剂包含甲酸盐、乙酸盐、TFA和盐。可以在色谱法运行过程中使用缓冲液的梯度，例如，如果使用两种缓冲液，则第一缓冲液的浓度或百分比可以降低，而第二缓冲液的浓度或百分比增加。例如，在色谱法运行过程中，第一缓冲液的百分比可以从约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％降低到约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％。作为另一个实例，在同一运行过程中，第二缓冲液的百分比可以从约0％、约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％或约40％增加到约100％、约99％、约95％、约90％、约85％、约80％、约75％、约70％、约65％、约60％、约50％、约45％或约40％。任选地，第一和第二缓冲液的浓度或百分比可以在色谱法运行结束时返回到它们的起始值。例如，第一缓冲液的百分比可以从85％到63％到59％到10％到85％分五步变化；而第二缓冲液的百分比在相同步骤中从15％到37％到41％到90％到15％变化。百分比可以作为线性梯度或以非线性(例如，逐步)方式逐渐变化。例如，梯度可以是多相的，例如双相、三相等。在一些实施例中，本文所述的方法使用降低的乙腈缓冲液梯度，这对应于不使用离子配对试剂时的流动相极性的增加。

在一些实施例中，向分离柱施加流动梯度包含：向所述分离柱施加第一流动梯度缓冲液，其中所述第一流动相缓冲液包含TFA和小分子添加剂(例如，氨基酸)、FA和小分子添加剂(例如，氨基酸)或甲酸铵和小分子添加剂(例如，氨基酸)；以及向所述分离柱施加第二流动梯度，其中所述第二流动相缓冲液包括含TFA的ACN和小分子添加剂(例如，氨基酸)、含FA的ACN和小分子添加剂(例如，氨基酸)或含甲酸铵的水/ACN和小分子添加剂。

在各个实施例中，所述小分子添加剂选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、N-乙酰基甘氨酸、甲硫氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸或N-甲基甘氨酸。在一些情况下，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸。在一些实施例中，所述氨基酸是丙氨酸。在一些实施例中，所述氨基酸是丝氨酸。在一些实施例中，所述氨基酸是缬氨酸。在一些实施例中，所述第一流动相缓冲液中的所述氨基酸是甘氨酸。在一些实施例中，所述第二流动相缓冲液中的所述氨基酸是甘氨酸。在一些实施例中，所述第一和第二流动相缓冲液中的所述氨基酸是甘氨酸。在一些实施例中，所述第一和/或第二流动相缓冲液中的小分子添加剂(例如，氨基酸)是小分子(例如，经修饰的氨基酸)或上文或本文中鉴定的其它氨基酸中的一者。

流动相缓冲液中的小分子添加剂(例如，氨基酸)的浓度为约0.5mM到约5mM，如介于约0.5mM到约3mM、约1mM和约2mM之间，包含0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.1mM、2.2mM、2.3mM、2.4mM、2.5mM、2.6mM、2.7mM、2.8mM、2.9mM、3.0mM、3.1mM、3.2mM、3.3mM、3.4mM、3.5mM、3.6mM、3.7mM、3.8mM、3.9mM、4.0mM、4.1mM、4.2mM、4.3mM、4.4mM、4.5mM、4.6mM、4.7mM、4.8mM、4.9mM或5.0mM。在一些实施例中，所述小分子添加剂(例如，氨基酸)小于5mM。在一些实施例中，所述小分子添加剂是浓度小于5mM的甘氨酸。在一些实施例中，所述第一流动相缓冲液中的所述氨基酸是甘氨酸并且浓度介于约1到约2mM甘氨酸之间。在一些实施例中，所述第二流动相缓冲液中的所述氨基酸是甘氨酸并且浓度介于约1到约2mM甘氨酸之间。在一些实施例中，所述第一流动相缓冲液中的所述甘氨酸浓度为约1mM。在一些实施例中，所述第一流动相缓冲液中的所述甘氨酸浓度为约2mM。在一些实施例中，所述第二流动相缓冲液中的所述氨基酸是甘氨酸并且浓度介于约1到约2mM甘氨酸之间。在一些实施例中，所述第二流动相缓冲液中的所述甘氨酸浓度为约1mM。在一些实施例中，所述第二流动相缓冲液中的所述甘氨酸浓度为约2mM。在一些实施例中，所述第一和第二流动相缓冲液中的氨基酸是甘氨酸并且浓度介于约1到约2mM甘氨酸之间。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述TFA浓度为H₂O中的约0.03％到0.15％TFA，如约0.03％到0.1％，或所述FA浓度为H₂O中的约0.05％到约0.15％，如约0.1％FA。在一些实施例中，所述TFA浓度为H₂O中的约0.05％到约0.1％TFA，或所述第一流动相中的所述FA浓度为约0.1％FA。例如，所述TFA浓度为H₂O中的约0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％。在一些实施例中，所述第二流动相中的所述TFA浓度包括80％ACN和20％H₂O中的约0.05％TFA，或80％ACN和20％H₂O中的约0.1％TFA。在一些实施例中，所述第二流动相中ACN的浓度为约60％到100％，如介于80％和100％之间，包含60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

在一些实施例中，所述第一流动相中的所述甲酸铵浓度为H₂O中的50mM。在一些实施例中，所述第二流动相是15％H₂O中的50mM和85％ACN。

在一些实施例中，所述样品包括肽、核苷酸或聚糖。例如，所述样品可以包含糖肽，如从单克隆抗体获得的糖肽。在一些实施例中，所述单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。

在一些实施例中，所述方法包含在使样品与分离柱在允许样品组分与基材结合的条件下接触之前制备所述样品。在一些实施例中，样品制备包含在允许样品变性和还原的条件下使样品与变性和还原溶液接触；在允许样品烷基化的条件下使变性和还原后的样品与烷基化溶液接触；在允许样品消化的条件下使烷基化样品与消化溶液接触；以及在停止样品消化的条件下使消化后的样品与淬灭溶液接触。

在一些实施例中，制备所述样品包括：使用酶或化学反应从样品中释放聚糖；用荧光标记对释放的聚糖进行标记或使用还原剂对释放的聚糖进行还原。

在一些实施例中，N-聚糖可以使用PNGase F从糖蛋白中释放。在一些实施例中，O-聚糖通过碱性化学品从糖蛋白中释放。释放的N-聚糖可以与RapiFluor荧光标记反应。释放的N-聚糖和O-聚糖可以被硼氢化钠还原，或者可以通过与乙酸和氰基硼氢化钠一起温育而连接到PROCA或2-AB。

在一些实施例中，所述样品是单克隆抗体并且所述消化溶液包括一种或多种蛋白酶，如胰蛋白酶。在一些实例中，所述方法用于表征/分析糖肽，如从单克隆抗体(如已经用一种或多种蛋白酶消化的抗体)获得的糖肽。在一些实施例中，可以在使所得样品与基材接触之前通过还原、酶降解、变性或片段化来处理和制备所述样品中的抗体。例如，这些方法可用于通过片段和肽级LC-MS(如HILIC-MS分析)来表征蛋白质的糖基化，例如单克隆抗体(mAb)治疗剂。在某些实施例中，任何中间步骤的样品可以被浓缩、稀释、脱盐等。

糖肽获自糖基化蛋白质，如单克隆抗体。糖基化单克隆抗体可以通过还原、酶消化、变性、片段化、化学切割及其组合来制备。本文公开的方法适用于任何抗体同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。还原是将二硫键还原为3维蛋白质(如单克隆抗体)中的两个硫醇。还原可以通过热变性、添加表面活性剂或在存在还原剂(例如TCEP-HCl)的情况下添加变性剂(例如盐酸胍，6M)来进行。酶促降解是用蛋白酶消化蛋白质，例如胰蛋白酶或无色杆菌蛋白酶I(Lys-C)。此外，糖蛋白可以通过热或化学品或其组合来变性。片段化涉及使用物理、生物或化学方法切割单个或多亚基蛋白质(如单克隆抗体)的蛋白质部分。

在一些实施例中，所述分离柱是液相色谱(LC)分离柱。液相色谱法，包含HPLC，可用于分析结构，如肽，包含糖肽。各种形式的液相色谱法可用于研究这些结构，包含阴离子交换色谱法、反相HPLC、尺寸排阻色谱、高效阴离子交换色谱法和正相(NP)色谱法，包含NP-HPLC(参见例如，Alpert等人,《色谱杂志A(J.Chromatogr.A)》676:191-202(1994))。亲水相互作用色谱法(HILIC)是NP-HPLC的一种变体，其可以使用部分水性流动相进行，从而允许肽、碳水化合物、核酸和许多蛋白质的正相分离。HILIC的洗脱顺序是极性最小到极性最大，这与反相HPLC中的洗脱顺序相反。HPLC可以在例如来自Waters(例如Waters 2695AllianceHPLC系统)、Agilent、Perkin Elmer、Gilson等的HPLC系统上进行。

NP-HPLC，优选地HILIC，是一种特别有用的HPLC形式，可用于本文所述的方法中。NP-HPLC根据分析物与固定相(例如，基材)之间的极性相互作用分离分析物。极性分析物与极性固定相结合并被极性固定相保留。吸附强度随着分析物极性的增加而增加，并且极性分析物和极性固定相(相对于流动相)之间的相互作用增加了洗脱时间。在流动相中使用极性更强的溶剂会缩短分析物的保留时间，而疏水性更强的溶剂往往会增加保留时间。

各种类型的基材可以与NP-HPLC一起使用，例如用于柱色谱法，包含二氧化硅、氨基、酰胺、纤维素、环糊精和聚苯乙烯基材。有用的基材的实例，例如可用于柱色谱法，包含：聚磺基天冬酰胺(例如，来自PolyLC)、磺基甜菜碱基材，例如

-HILIC(例如，来自SeQuant)、

HS(例如，来自Applied Biosystems)、

S(例如，来自AppliedBiosystems)、聚羟乙基天冬酰胺(例如，来自PolyLC)、Zorbax 300SCX(例如，来自Agilent)、

(例如，来自PolyLC)、Amide-80(例如，来自Tosohaas)、TSK

Amide-80(例如，来自Tosohaas)、聚羟乙基A(例如，来自PolyLC)、Glyco-Sep-N(例如，来自Oxford GlycoSciences)和Atlantis HILIC(例如，来自Waters)。在一些实施例中，所公开的方法包含利用以下官能团中的一个或多个的柱：氨基甲酰基、磺丙基、磺乙基(例如，聚(2-磺乙基天冬酰胺))、羟乙基(例如，聚(2-羟乙基天冬酰胺))和芳香族磺酸基团。

柱温可在整个色谱法运行期间保持在恒定温度，例如，使用商业柱加热器。在一些实施例中，将柱保持在介于约18℃到约70℃之间的温度，例如，约30℃到约60℃、约40℃到约50℃，例如，约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃或约70℃。在一些实施例中，柱温为约40℃。

流动相的流速可以介于约0毫升/分钟到约100毫升/分钟之间。对于分析建议，流速通常在0毫升/分钟到10毫升/分钟的范围内，对于制备型HPLC，可以使用超过100毫升/分钟的流速。例如，流速可以是约0.5毫升/分钟、约1毫升/分钟、约1.5毫升/分钟、约2毫升/分钟、约2.5毫升/分钟、约3毫升/分钟、约3.5毫升/分钟、约4毫升/分钟、约4.5毫升/分钟或约5毫升/分钟。替换具有相同填料、相同长度但直径更小的色谱柱需要降低流速，以保持与使用更宽直径的色谱柱时相同的保留时间和峰分离度。在一些实施例中，在4.6×100mm、5μm柱中使用相当于约1毫升/分钟的流速。

在一些实施例中，运行时间可以介于约15到约240分钟之间，例如，约20到约70分钟、约30到约60分钟、约40到约90分钟、约50分钟到约100分钟、约60到约120分钟、约50到约80分钟。

NP-HPLC可以调整为在纳米级上进行，例如，使用内径为约75μm的柱(参见例如，Wuhrer等人,《分析化学》76:833-838(2004)；Wuhrer等人,《国际质谱杂志(Internat.J.Mass.Spec.)》232:51-57(2004))。

在某些实施例中，分离柱是亲水相互作用(HILIC)分离柱并且分子(如糖肽)随后从HILIC分离柱洗脱，例如使用流动相梯度来分离糖肽的单个种类，从而纯化和/或分离样品中的糖肽。在某些实施例中，从HILIC洗脱的糖肽被分离成一个或多个级分。这些级分可用于后续分析，如MS分析。在某些实施例中，所述方法包含鉴定存在于一种或多种级分中的分子，如糖肽和/或聚糖。在某些实施例中，聚糖是N-聚糖或O-聚糖。在一些实施例中，所述方法进一步包括检测糖肽，例如使用来自糖肽的肽部分的UV信号。这可以针对样品的级分进行，并允许选择特定级分进行进一步分析，例如质谱(MS)分析。在一些实施例中，所述方法包括使用来自与聚糖连接的荧光标记的FLR信号检测聚糖。

在一些实施例中，对洗脱后的样品组分进行质谱分析包含应用电喷雾电离以从所述洗脱后的样品组分产生带电离子并测量所产生的带电离子。

在质谱分析生物分子的应用中，分子从液相或固相转移到气相和真空相。由于许多生物分子既大又脆弱(蛋白质就是一个典型的例子)，将它们转移到真空相的两种最有效的方法是基质辅助激光解吸电离(MALDI)或电喷雾电离(ESI)。一般来说，ESI更敏感，而MALDI更快。值得注意的是，一些肽在MALDI模式下的电离效果比ESI更好，反之亦然(《基因组技术(Genome Technology)》,220年6月,第52页)。ESI是通过将样品与挥发性酸和有机溶剂混合并通过带高压电的导电针注入样品来进行的。从针头喷洒(或喷出)的带电液滴直接进入质谱仪，并在飞入时被热和真空干燥。液滴干燥后，剩余的带电分子由电磁透镜引导进入质量检测器并进行质量分析。在一个实施例中，洗脱后的样品直接从毛细管沉积到电喷雾喷嘴中，例如，毛细管用作样品进样器。在另一个实施例中，毛细管本身用作提取装置和电喷雾喷嘴。在一些实施例中，所述方法增强了质谱信号，如通过高电荷态物质(例如，z≥3)中的平均约2到27倍(如5到14倍)和/或约2到1000倍增加所指示的。在一些实施例中，在甘氨酸1mM下，当样品上样量为10ug时，变化倍数约为5。在一些实施例中，所述光谱信号在高电荷态物质中增加了约14倍和/或增加了约1000倍。经考虑的是，甘氨酸加强倍数可取决于样品上样量和甘氨酸浓度。例如，对于不同的样品上样量，较高的甘氨酸浓度比较低的甘氨酸浓度产生更高的加强，并且所述加强整体上随着样品上样量的减少而增加。在某个点以下，可以观察到加强倍数与上样量的显著变化(<10％)(如图1A、1B和2所示)。

在一些实施例中，使用其它电离模式，例如涡轮喷雾电离质谱法、纳喷雾电离质谱法、热喷雾电离质谱法、声波喷雾电离质谱法、SELDI-MS和MALDI-MS。一般来说，这些方法的一个优点是它们允许“及时”纯化样品并将其直接引入电离环境。需要注意的是，各种电离和检测模式都会对所使用的解吸溶液的性质产生各自的限制，并且重要的是解吸溶液与两者兼容。例如，许多应用中的样品基质必须具有低离子强度，或位于特定的pH范围内等。在ESI中，样品中的盐可通过降低电离或堵塞喷嘴来阻止检测。这个问题通过以低盐和/或使用挥发性盐的形式呈现分析物来解决。

在一些实施例中，通过洗涤(例如预洗涤步骤)准备基材以用于添加样品。在一些实施例中，在与糖肽样品接触之前洗涤基材。在各个实施例中，使基材与含有生物分子(如糖肽)的样品接触以进行富集。关于样品溶液，其将包含溶解在溶剂中的生物分子，如糖肽，生物分子(如糖肽)在该溶剂中是可溶的，并且生物分子(如糖肽)将在该溶剂中与基材结合。优选地，结合是强的，从而导致生物分子的大部分(如大部分，包含大于50％的生物分子，如大于50％的糖肽)结合。在一些情况下，基本上所有(大于95％的)生物分子(如糖肽)将被结合。在各个实施例中，溶剂是水溶液，其通常含有缓冲剂、盐和/或表面活性剂以溶解和稳定生物分子，如糖肽。在一些实施例中，生物分子样品，如糖肽样品，是具有低于约6.5(如低于约6.5、6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.5或3.0)的低pH的溶液。

在一个具体实施例中，一种增强质谱信号的方法包含对单克隆抗体进行变性和还原。例如，单克隆抗体可以在存在TCEP-HCl的情况下用乙酸(如5mM乙酸)变性和还原，并加热足够长的时间以发生变性和还原，如80℃，持续10分钟。在变性和还原后，样品被烷基化。在一些实例中，样品首先被稀释然后烷基化。例如，可将样品用含有8M尿素的100mM Tris-HCl(pH 7.5)稀释，然后在室温下在黑暗中用碘乙酰胺烷基化30分钟。烷基化后，进一步稀释样品以降低尿素浓度，如用100mM Tri-HCl(pH 7.5)稀释以将尿素浓度降低至1M以下。然后用蛋白酶消化样品。例如，将样品在37℃下以1:20(w/w)的酶与底物比率用胰蛋白酶处理4小时。在所需时间，停止消化，如用TFA(例如10％TFA)淬灭样品。然后对消化后的样品进行在线LC-MS分析。例如，胰蛋白酶消化(还原/烷基化)样品以足够的浓度(例如，0.25μg)上样，并且流动相梯度A(MP-A)包含具有1到2mM甘氨酸的含TFA的H₂O，如具有2mM甘氨酸的含TFA的H₂O，然后是流动相梯度B：具有1到2mM甘氨酸的含TFA的ACN，如具有2mM甘氨酸的含0.05％TFA的80％ACN和20％H₂O。

实例

提出以下实例，以向本领域的普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的方法的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人认为是其发明的范围。已经努力确保关于所使用的数字(例如，量，温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份数，分子量是平均分子量，温度是摄氏度，室温是约25℃，并且压力为大气压或接近大气压。

实例1：用甘氨酸添加剂加强ESI-MS信号的新方法

NISTmAb的胰蛋白酶消化物：在存在5mM TCEP-HCl的情况下，在80℃下在5mM乙酸中使100μg NISTmAb变性和还原，持续10分钟。在变性和还原后，将样品用含有8M尿素的100mM Tris-HCl(pH 7.5)稀释，并在室温下在黑暗中用碘乙酰胺烷基化30分钟。烷基化后，将样品进一步用100mM Tri-HCl(pH 7.5)稀释，以将尿素浓度降至1M以下。将样品在37℃下以1:20(w/w)的酶与底物比率与胰蛋白酶一起温育，持续4小时。通过添加10％TFA以停止胰蛋白酶消化来淬灭消化后的样品，然后进行在线LC-MS分析。将NISTmAb胰蛋白酶消化物(还原/烷基化)以0.05-10μg的不同量上样，MP-A：含0.05％TFA，0.0625–5mM甘氨酸的H₂O，MP-B：含0.05％TFA，0.0625–5mM甘氨酸的80％ACN和20％H₂O，其中柱为ACQUITY UPLC PeptideBEH C18，

1.7μm，2.1mm x 150mm(Waters)，并且LC条件为0.25毫升/分钟，柱温为40℃。

为了研究不同的小分子试剂对MS加强的影响(如图3所示)，将NISTmAb胰蛋白酶消化物(还原/烷基化)以0.25μg的浓度上样，MP-A：含0.05％TFA的H₂O，MP-B：含0.045％TFA的ACN，其中柱为ACQUITY UPLC Peptide BEH C18，

1.7μm，2.1mm x 150mm(Waters)，并且LC条件为0.25毫升/分钟，柱温为40℃，使用注射泵以10微升/分钟的速度递送50:50H₂O/ACN中的125mM不同小分子溶液以与来自LC柱的洗脱液混合，并且最终小分子浓度为约5mM。

表1提供了在不同时间点的％A和％B。

表1

时间(分钟)	％A	％B
			0	99.9	0.1
5	99.9	0.1
			47	65.0	35.0
48	0.1	99.9
			54	0.1	99.9
55	99.9	0.1
			60	99.9	0.1

图1A和1B说明了不同浓度的甘氨酸对MS加强的影响和不同样品上样量对MS加强的影响。图1A和1B是通过将甘氨酸直接添加到TFA流动相瓶中(MPA：含0.05％TFA的水和甘氨酸；MPB：含0.05％TFA的80％ACN和20％水和甘氨酸)而不是通过柱后注射泵配置生成的。在图1A中，说明了甘氨酸加强对样品上样量的明显依赖性。对于较高的上样量需要较高的甘氨酸浓度才能获得与针对较低上样量的较低甘氨酸浓度相同的加强

图1B显示增加样品上样量总体上降低了甘氨酸对肽响应的加强能力。对于不同的样品上样量，2mM的甘氨酸表现出比1mM更高的加强作用。此外，随着样品上样量的减少，加强倍数的增加趋势逐渐放缓。在甘氨酸浓度分别为1和2mM的情况下，当样品上样量低于0.2和0.5μg时，观察到随着上样量的增加，加强倍数的变化最小(<10％)。

尽管随着样品上样量的增加观察到降低的加强倍数，但即使在较高加强倍数的情况下，较高上样量下的质谱响应(即，肽的EIC峰面积)仍然高于较低上样量

图2提供了基于其侧链的不同化学性质的十种氨基酸的化学结构，包含丙氨酸和缬氨酸(疏水侧链)、丝氨酸(亲水侧链)、脯氨酸(环状侧链)、甲硫氨酸(含硫侧链)、谷氨酰胺(含酰胺侧链)、谷氨酸(酸性侧链)、赖氨酸和精氨酸(碱性侧链)和组氨酸(芳香族侧链)，以及通过在氨基(例如，N,N-二甲基甘氨酸、N-乙酰甘氨酸、N-甲基甘氨酸和丙酸)、侧链(例如，3,3,3-三氟-DL-丙氨酸)或羧基(例如，乙胺)上修饰甘氨酸或向甘氨酸插入额外的碳原子以延长氨基和羧基之间的距离而衍生的几种甘氨酸变体(例如，β-丙氨酸和γ-氨基丁酸)。图3是说明不同小分子试剂(2mM)对NISTmAb胰蛋白酶肽的平均MS1加强倍数的图。如图3所示，甘氨酸显示出最高的平均加强。甘氨酸也是分子量最低的分子。图4是一条迹线，其说明了在将甘氨酸添加到TFA缓冲液后肽的色谱分离的最小变化。研究条件是上样2.5μgNISTmAb胰蛋白酶消化物(还原/烷基化)；MP-A：含0.05％TFA的H₂O，具有或不具有2mM甘氨酸，MP-B：含0.05％TFA的80％ACN和20％H₂O，具有或不具有2mM甘氨酸，柱为Acquity UPLCPeptide BEH C18，130A，1.7μm，2.1mm x 150mm(Waters)，LC条件为0.25毫升/分钟，柱温为40℃。注意，由于2mM甘氨酸在100％ACN中的溶解度问题，MP-B已从含0.05％TFA的ACN的常规条件更改为含0.05％TFA的80％ACN和20％H₂O。下表2示出了在UV色谱图(参见图4)中跨整个LC梯度选择的8个代表性肽峰(P1-P8)的UPLC性能指标，其显示两种流动相系统的UPLC性能指标具有高度可比性，保留时间差异<0.06分钟，峰宽％差异<1.4％并且峰面积％差异<1.9％。峰宽–通过在50％峰高处绘制切线获得的峰底的对应宽度；表3提供了在不同时间点的％A和％B。

表2

表3

时间(分钟)	％A	％B
			0	99.9	0.1
5	99.9	0.1
			47	50.0	50.0
48	0.1	99.9
			54	0.1	99.9
55	99.9	0.1
			60	99.9	0.1

图5是条形图，其说明了TFA缓冲液中2mM甘氨酸的加强重现性，其中上样0.25μgNISTmAb，每种样品重复10次。观察到肽依赖性响应加强，并且不同胰蛋白酶肽的加强倍数在2-27倍的宽范围内，平均为约13.2倍。大多数肽表现出至少5倍的响应加强，超过一半的肽表现出甚至超过10倍的响应加强。所有肽的平均加强为13.2倍，并且％相对标准偏差(RSD)小于5％。图6是总离子电流(TIC)绘图，其说明了在存在甘氨酸的情况下使用TFA对照和TFA观察到的信噪比，其中上样2.5μg NISTmAb。选择了跨整个LC梯度具有不同保留时间的十种代表性胰蛋白酶肽，以比较它们在有和没有甘氨酸添加剂的TFA流动相之间的总离子色谱图中的信噪比。对于这十种胰蛋白酶肽，甘氨酸添加剂确实加强了信噪比。与肽依赖性响应加强类似，选定的肽也显示出不同的信噪比加强，器范围很广，可达一个数量级以上。甘氨酸添加剂加强了胰蛋白酶肽的质谱响应，但没有观察到电喷雾电离过程中由周围环境产生的小分子污染物引起的背景噪声的加强。这种加强特征可以提高胰蛋白酶肽的信噪比，同时加强绝对响应。

表4

图7、8A和8B条形图说明了存在甘氨酸时的电荷态转变。所有肽的％RSD均小于0.4％；10次重复。平均电荷态转变是肽依赖性的，并且观察到向上转变和向下转变。图9是条形图，其说明了在存在和不存在2mM甘氨酸(TFA缓冲液，上样0.25μg NISTmAb)的情况下的PTM％定量，10次重复。图10是条形图，其说明了与TFA对照相比，TFA或FA或单独的FA在存在甘氨酸的情况下的加强倍数，3次重复。如图10所示，与在2mM甘氨酸下观察到的FA的12.3倍加强或FA的6.1倍加强相比，在存在2mM甘氨酸的情况下TFA导致13.2倍加强。

图11是说明了用2mM甘氨酸对单个氨基酸的加强倍数的图(柱：Discovery HS F5-3，15cm x 2.1mm，3μm(Supelco)；每种氨基酸上样1nmol)。图12说明了商业甘氨酸调配物中迹线钠的影响。

评估了使用甘氨酸添加剂对蛋白质定量的ESI-MS信号加强。图13提供了使用PRM和全扫描对STSGGTAALGCLVK肽(SEQ ID NO:22)进行定量之间的比较。对于具有甘氨酸流动相的TFA和FA，观察到跨越三个数量级的相同响应线性范围，回归斜率与TFA和FA对照流动相相似，这表明甘氨酸添加剂在广泛的蛋白质浓度下具有一致的响应加强。由于甘氨酸添加剂在TFA和FA流动相中的响应加强，与TFA和FA对照流动相相比，响应线性范围也达到了较低的蛋白质浓度。此特征可能会为考虑以甘氨酸为基础的流动相作为替代方案提供机会，以提高灵敏度以量化复杂基质中的低丰度蛋白质。

实例2：用甘氨酸添加剂加强ESI-MS信号：基于IP-HILIC-MS的糖肽鉴定和定量

图14说明了基于HILIC的液相色谱法相对于用于糖肽分析的反相的优点。通过常规进行的还原或非还原肽图分析方法制备肽。如图14所示，在HILIC中获得了更好的糖肽分离，而在反相中观察到糖肽的聚集。例如，IP-HILIC与反相相比，异构体(如G1F)的分离增加。此外，HILIC柱上的糖肽洗脱顺序与肽上附着的糖链大小相关，从而可以轻松地将大聚糖的源内片段化所产生的伪影与真实峰区分开来(非重叠的不同洗脱时间)。

图15说明了在添加甘氨酸的缓冲液中观察到MS1和MS2的信号加强。样品是胰蛋白酶消化的合并VEGF捕集器IND批次，柱：Waters BEH-Amide，并且流动相：A：0.1％TFA，和B：80％ACN+0.1％TFA。图16说明了高浓度的甘氨酸阻止了结合。

图17提供了通过基于HILIC的LC进行糖肽分析的示例性样品制备工作流程示意图。图18说明了脱盐的效果，其中用SepPak 30小柱进行脱盐消除了升高的基线(见箭头)。用流动相B(0.1％TFA/80％乙腈)洗脱肽，无需脱盐后的干燥步骤，从而节省时间并提高工艺效率。研究还表明，与玻璃瓶相比，在流动相期间使用聚乙烯溶剂容器(如来自Belart的聚乙烯瓶)可以减少金属加合物。在流动相期间，与玻璃瓶相比，使用塑料瓶时观察到2.7倍的强度加强和1.7倍的强度加强。据信，塑料瓶减少了钠引起的异质性，因此加强了MS信号。此外，在60％异丙醇中浸泡过夜的溶剂瓶可去除可浸出的杂质/硬化剂。图19和20提供了说明甘氨酸的作用的表。图19显示，甘氨酸在IGG1中将所有糖型的峰面积增加了20倍(^*此表中的糖型仅在任一运行中基于串联MS进行鉴定；^**对于没有串联MS数据的糖型，因此峰是根据在其它运行中确定的前体质量和保留时间确定的(显示在标有Peptide 1_Control的列中)。图20提供了IGG4分子中所有糖型的峰面积(*此表中的糖型仅在任一运行中基于串联MS进行鉴定；^**对于没有串联MS数据的糖型，峰是根据在其它运行中确定的前体质量和保留时间确定的(显示在标有Peptide 2Control的列中；^***在对照运行中丰度低于LLOQ的糖型将给出高估的数字(显示在括号中)。图21A提供了评估的mAb中所有糖型的峰面积。在存在甘氨酸的情况下，所有糖型的相对分布保持不变。图22说明了在存在1mM甘氨酸的情况下通过电荷态转变增强的片段化能力。糖肽的主要电荷态从+2转变为+3，后者容易发生片段化。观察到添加甘氨酸(1mM)对VEGF TRAP的信号加强。甘氨酸增加了VEGF TRAP中肽谱匹配(PSM)和糖型的数量(参见图23)。

实例3：用甘氨酸添加剂加强ESI-MS信号：序列变体分析

该实例证明了TFA中甘氨酸增加序列变体数量的能力。图24说明了在Byologic验证后与FA相比，当使用TFA+甘氨酸时鉴定的序列变体的数量。

实例4：用甘氨酸添加剂加强ESI-MS信号：聚糖分析

N-聚糖从糖蛋白释放后，可以用各种荧光标签进行标记，这些荧光标签通常也增强MS响应。标记或还原后的N-聚糖可以使用含有盐(例如甲酸铵)的流动相通过HILIC进行分析。据发现，流动相中的1mM甘氨酸可加强人血清中PROCA标记的N-聚糖的MS信号(3倍到50倍以上)(参见图25和图26A-26C)。甘氨酸对高甘露糖和大的酸性N-聚糖具有更强的作用(>10倍)。使用不含甘氨酸的甲酸铵流动相，PROCA标记的N-聚糖的MS谱与广泛用于聚糖定量的FLR谱显示出一些差异(参见图27和图28A-28C)。通过比较MS和FLR谱，具有三种唾液酸的高甘露糖和大的N-聚糖具有相对较低的MS信号，而二等分N-聚糖具有相对较高的MS信号。通过在流动相中添加甘氨酸，MS信号不仅更高，而且与FLR相比更具可比性(参见图27和图28A-C)。图29示出了在对照和含甘氨酸条件下，血清N-聚糖的PROCA标记EIC峰面积对比FLR峰面积(对数标度)的散点图。与对照条件相比，甘氨酸条件的线性回归R平方值较小，这表明甘氨酸可以提高使用MS信号进行N-聚糖定量的准确性。使用含有0.1％FA(3-38倍)的流动相也可以观察到甘氨酸对PROCA标记的N-聚糖的强烈信号加强作用(参见图30A-30C)。使用甲酸铵流动相时，甘氨酸对RapiFluor标记的N-聚糖和还原后的小N-聚糖也显示出中等的信号加强作用(1-3倍)(参见图31A-31C和图32)。观察到对还原后的较大N-聚糖的抑制作用(图32)。与对照条件相比，基于MS峰面积和FLR峰面积的RapiFluor标记的大N-聚糖的相对水平在甘氨酸条件下更具可比性(图32)。图33提供了用于分析N-聚糖的示例性LC-FLR-MS条件。

与N-聚糖不同，由于缺乏释放酶以及释放功效和O-聚糖通过化学释放减少末端分解的挑战，因此没有令人满意的O-聚糖释放方法。图34提供了通过LC-MS和荧光(FLR)检测进行O-聚糖制备和分析的示例性方法。

图35说明了来自牛颌下粘蛋白(BSM)的柱上2μg PROCA标记的O-聚糖、荧光和优化的还原胺化的结果。图36表明PROCA标记的O-聚糖FL和MS TIC谱具有高度可比性。从BSM释放的PROCA标记的O-聚糖在HILIC上运行(等于柱上2μg)。观察到低MS背景。据发现，流动相中1mM的甘氨酸可加强对从珠子中纯化的PROCA标记的BSM O-聚糖的作用(柱上2μg，图37A-B)。图37A-37B提供了比较流动相中含有和不含甘氨酸的情况下O-聚糖FLR和MS峰强度的结果。与FLR相比，PROCA信号随着聚糖大小的增加而显著下降。甘氨酸补偿了这种效应并使MS信号与FLR强度更具可比性(图37A-37B)。甘氨酸对小(1-2个糖环)的O-聚糖具有中等加强作用(1-3倍)(参见图38A-38C)。甘氨酸对用PROCA标记的较大和/或酸性聚糖具有很强的加强作用(3倍到35倍以上)(参见图38A)。对于携带两种唾液酸的聚糖来说，作用很明显(>35倍)。观察到甘氨酸对2AB标记的BSM O-聚糖具有适度的加强作用(<3倍)(参见图38B)。甘氨酸可将还原后的小O-聚糖的MS信号加强12倍(参见图38C)。然而，观察到对还原后的较大O-聚糖的抑制作用。图39通过了用于分析PROCA标记或还原后的O-聚糖的示例性LC-FLR-MS条件。图40说明在不存在甘氨酸的情况下，单电荷聚糖提供了较差的MS2。图41说明来自甘氨酸加强样品的双电荷离子可提供大大增强的MS2信息。

实例5：含三氟乙酸的流动相中的甘氨酸添加剂有助于通过离子配对亲水相互作用色谱质谱法对生物制药进行位点特异性糖基化分析

许多生物治疗剂，如单克隆抗体(mAb)和Fc结构域融合蛋白，在一个或多个糖基化位点含有异质聚糖含量。位点特异性聚糖谱表征对于在药物开发的不同阶段监测这些分子的质量至关重要。离子配对亲水相互作用色谱法(IP-HILIC)作为反相液相色谱法(RPLC)的正交分离方法，可以更好地分离单个糖型以及从非糖基化肽中鉴定糖肽。然而，由于三氟乙酸(TFA)通常用作离子配对试剂，与质谱检测相结合的在线IP-HILIC可能会在电喷雾电离过程中受到质谱信号抑制的影响。在本实例中，报道了IP-HILIC-MS的优化条件，其中在含有TFA的流动相中添加甘氨酸，通过消除离子配对试剂的离子抑制作用，将糖肽的MS检测灵敏度提高约50倍，同时仍保持出色的分离能力。事实证明，通过提高检测灵敏度，IP-HILIC-MS可以鉴定更多数量的IgG1和IgG4 mAb的位点特异性N-连接聚糖以及Fc结构域融合蛋白(含有五个N-糖基化位点)并且与使用RPLC质谱法的传统方法相比(RPLC-MS)，获得可比较的定量结果。还证明了IP-HILIC-MS可用于鉴定mAb上的低水平O-糖基化和非一致N-糖基化，而无需在LC-MS分析之前进行任何富集。

I.介绍。

糖基化是包含单克隆抗体(mAb)和Fc结构域(片段结晶结构域)融合蛋白在内的生物治疗剂的关键质量属性。保守的天冬酰胺-297位点处的Fc结构域糖基化谱与效应器功能密切相关，如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，所述效应器功能可能会影响肿瘤疗法中的药物疗效。尽管Fc N-糖基化不直接参与与靶标的相互作用，但N-连接聚糖或O-连接聚糖位于非规范位点，所述非规范位点通常定位在mAb的Fab(抗原结合片段)区域，或者Fc结构域融合蛋白的功能结构域可能对与靶标的结合亲和力产生负面影响。生物治疗剂中的糖基化还与药代动力学和药效学特征以及其它分子性质(如电荷异质性、稳定性和免疫原性)相关。由于mAb或Fc结构域融合蛋白的糖基化通常在不同的蛋白质表达系统、制造过程和蛋白质序列中表现出多种特征，因此对位点特异性聚糖谱的全面表征包含一系列关键任务，包含展示不同样品批次之间的聚糖谱可比性，或调查在生物制药非临床开发过程中糖基化相关问题的根本原因。

N-连接糖基化分析可以通过以下方式进行：通过外切糖苷酶处理从蛋白质按顺序地释放聚糖，用荧光试剂标记还原后的末端，并使用与荧光和质谱检测相结合的亲水相互作用色谱法(HILIC-FLR-MS)分析释放的聚糖混合物，然而，如果蛋白质含有多个糖基化位点，则它无法提供有关位点特异性糖基化的信息。相反，对完整糖肽的直接分析可以揭示N-连接聚糖和O-连接聚糖的位点特异性糖基化谱。在糖肽鉴定的典型工作流程中，将蛋白质用蛋白酶消化，并使用与质谱法相结合的反相色谱法(RPLC)进行分析。它是一种用于表征生物制药的方法，以确认蛋白质氨基酸序列并在进行翻译后和化学修饰(包含糖基化)时提供位点特异性定量(通常被称为“肽图分析”)。可以根据对应糖肽的提取离子色谱图(EIC)的峰面积来量化单个聚糖的相对丰度。然而，基于RPLC的糖肽分离主要依赖于氨基酸序列，因为聚糖组合物对疏水性差异的贡献很小，这可能导致以下情况：(1)来自具有相同氨基酸序列的肽的糖型被洗脱为保留时间彼此接近的峰的聚类；(2)如果糖肽与其它非糖基化肽的肽序列具有相似的疏水性，则二者可能无法很好地区分。例如，由于MS检测动态范围和柱上样量的限制，在存在来自其它糖肽或非糖基化肽的共洗脱高丰度干扰物质的情况下，来自非规范N-连接糖基化位点或O-连接糖基化位点的低丰度糖肽的MS信号可能被显著抑制。

与RPLC相比，HILIC实现了对不同组合物和结构性异构体的聚糖的有效分离。与质谱法相结合的HILIC已用于分析不同类型复杂样品中单一生物治疗剂或糖组学分析中释放的N-聚糖。还报道了在温和酸性条件下使用HILIC-MS对抗体和其它糖蛋白进行的完整糖肽分析，其对包含聚糖异构体在内的不同糖型表现出出色的分离。只需通过添加0.1％TFA来改变HILIC流动相，从而提供酸性环境(pH为约2)和强离子配对性质(TFA阴离子)，即可更好地将糖肽与非糖基化肽分离。在这种情况下，肽上的带电基团可以被中和，从而大大降低了非糖基化肽的亲水性，而糖肽受到的影响较小，因为聚糖富含不带电荷的极性部分，如羟基。尽管离子配对HILIC(IP-HILIC)分离已成为众多糖蛋白组学研究中离线糖肽富集的标准技术，由于离子配对试剂TFA会导致不利的信号抑制，因此很少将IP-HILIC与MS检测直接结合用于糖肽鉴定，与相同浓度下的甲酸相比，这可能导致MS信号降低5到10倍。因此，恢复不需要的离子抑制是扩展涉及TFA的IP-HILIC-MS方法的应用范围的关键。

在过去的几十年中，人们做出了许多努力来减轻与TFA相关的MS信号抑制，范围从引入柱后“固定溶液”到用其它“较弱的离子配对”药剂代替TFA。通过将甘氨酸直接添加到含TFA的流动相中发现了一种方法，当使用反相C18柱对mAb进行肽图分析时，所述方法导致信噪比(S/N)显著提高了大约1个数量级。尽管甘氨酸添加剂是在柱之前引入的，但它不会影响C18柱上肽分离的性能。在本实例中，证明该解决方案也可应用于IP-HILIC-MS，其允许构建一个高度灵敏且可持续的平台，用于单克隆抗体或Fc结构域融合蛋白的无偏位点特异性糖基化分析。还公开了一个独特的实例，该平台可以选择性地增强鉴定mAb Fab区域中极低丰度的O-连接和非一致N-连接糖基化的可能性，而无需在LC-MS分析之前进行额外的离线富集

II.材料和实验

化学品和材料

在再生元公司(纽约州塔里敦(Tarrytown,NY))生产了四种IgG4单克隆抗体(mAb1、mAb2、mAb3、mAb4)、一种IgG1单克隆抗体(mAb5)和一种Fc结构域融合蛋白(fP1)。超纯甘氨酸(J.T.Baker品牌)、三氟乙酸(测序级)、甲酸(测序级)和乙腈(LC-MS级)购自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))。甲酸铵(99％)购自Acros OrganicsTM。PNGase F购自新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)(马萨诸塞州伊普斯威奇(Ipswich,MA))。GlycoWorksTM快速去糖基化试剂盒购自Waters(马萨诸塞州米尔福德(Milford,MA))。超纯水由Milli-Q System(马萨诸塞州伯灵顿的密理博公司(Millipore,Burlington,MA))生成。除非另有说明，否则所有其它化学品均购自西格玛奥德里奇公司(密苏里州圣路易斯(St.Louis,MO))。

胰蛋白酶消化

为了制备蛋白质消化物，在含有5mM乙酸和5mM三(2-羧乙基膦盐酸盐)的溶液中通过在80℃下加热10分钟使单克隆抗体变性和还原。然后将每个样品在含有15mM碘乙酰胺的100mM Tris缓冲液(pH 8.0)中中和，然后在37℃下在黑暗中以1:20(w/w)的酶与底物比率进行胰蛋白酶消化，持续2小时。对于Fc结构域融合蛋白，在存在8M盐酸胍和5mM二硫苏糖醇的情况下，通过在80℃下加热10分钟，然后用15mM碘乙酰胺进行烷基化，使蛋白质还原和变性。使用NAP-5Sephadex 5-25柱(伊利诺伊州芝加哥的通用电气医疗集团(GE Healthcare,Chicago,IL))将样品缓冲液交换为100mM Tris，pH 8.0，然后在与单克隆抗体相同的消化条件下消化。按照供应商提供的方案，通过Sep-Pak C18小柱(Waters)进一步清理消化后的肽。将样品在真空下干燥并重新溶解在80％ACN(用于HILIC-MS)或水(用于RPLC-MS)中。

糖肽的LC-MS分析

所有LC-MS实验均使用与配备有加热电喷雾电离(HESI)源(赛默飞世尔科技公司)的Q-Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪耦接的Acquity UPLC I-Class系统(Waters)进行。为了尽量减少碱加合物的形成，将所有样品转移到注射用聚丙烯小瓶中，制备流动相溶液并储存在聚乙烯瓶中，并提前彻底清洁LC管线。流动相A(MPA)是含有100％水(v/v)、0.1％TFA或FA(v/v)和1mM甘氨酸的纯水相。流动相B(MPB)由80％乙腈(v/v)、20％水(v/v)、0.1％TFA或FA(v/v)和1mM甘氨酸构成。不含甘氨酸的MPA和MPB版本也使用完全相同的配方和等量的水制成，而不是添加甘氨酸。

在加入甘氨酸和不含甘氨酸的版本之间切换流动相后第一次进样之前，将LC系统调节至少1小时，并监测质子化甘氨酸在76.07m/z处的MS峰强度(扫描范围为50-750m/z)用于质量控制目的，对于不含甘氨酸和含甘氨酸的流动相，稳定的MS信号预计将分别在1e⁶和1e⁹达到归一化强度。

对于HILIC-MS分析，将6μg(或更多量，如果有注释)脱盐的胰蛋白酶消化肽上样到Waters Acquity UPLC Glycan BEH Amide柱(

1.7μm，2.1mm×150mm)上。以0.2毫升/分钟的99.9％MPB开始流动，当MPB的百分比从90％降至62.5％时，含聚糖的肽被洗脱和分离。对于RPLC-MS分析，将样品上样到Waters Acquity UPLC BEH C18柱(

1.7μm，2.1mm×150mm)上。RPLC-MS分析的流动相设置与HILIC-MS完全相同，但相反的是，流动从99.9％MPA开始，当MPB百分比从0.1％增加到40％时，肽被洗脱。从500到2000m/z收集全MS扫描以避免甘氨酸信号，分离度＝70,000，AGC目标＝1e⁶，最大IT＝100ms，鞘气＝40，辅助气＝10，吹扫气＝0，喷雾电压＝3.8kV，毛细管温度＝350℃，辅助气体加热器温度＝250℃，S-透镜RF等级＝50。选择了五种最丰富的前体进行数据相关的MS2扫描，其中NCE设置为27，分离度＝17,500，AGC目标＝5e⁵，最大IT＝250ms。

用于糖肽鉴定的数据处理

使用蛋白质度量套件中的Byonic软件通过针对蛋白质序列和含有132个人类N-连接聚糖或70个常见的O-连接聚糖的内置聚糖数据库搜索原始文件来进行糖肽鉴定。对于非共识N-聚糖搜索，定制了相同的N-糖基化数据库，以消除供应商提供的技术说明后的位点限制。通过针对1％FDR进行过滤生成独特糖肽的初步列表。然后将前体列表以及作为光谱库的原始搜索结果导入Skyline Daily软件(华盛顿州华盛顿大学)，通过自动特征提取和峰积分进行基于全扫描的最终ID验证和定量。

衍生聚糖的HILIC LC-MS分析

为了制备用于释放的N-连接聚糖分析的样品，将蛋白质在含有0.1％RapiGestTMSF(Waters)和4.2mM Tris(2-羧乙基膦盐酸盐(TCEP-HCl)的溶液中通过在80℃下加热10分钟进行变性和还原。然后通过以1:5(w/w)的酶与底物比率添加PNGase F对每个样品进行去糖基化，并在45℃下孵育25分钟以释放寡糖，然后通过在45℃下孵育25分钟，用RapiFluor^TM-MS Reagent(Waters)荧光标签对释放的聚糖进行衍生化。将衍生化样品在含有25％N,N-二甲基甲酰胺和53％乙腈(v/v)的最终溶液中稀释。

使用与Q-Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap质谱仪(赛默飞世尔科技公司)耦接的Acquity UPLC I-Class系统(Waters)执行数据采集。将1μg释放和衍生化的聚糖上样到Acquity UPLC Glycan BEH Amide柱(130A°，1.7μm，2.1mm×150mm)(Waters)上。流动相A是纯水相，在水中含有50mM甲酸铵，pH＝4.4。流动相B是纯有机相(100％乙腈)。梯度从25％的流动相A开始，然后将流动相A的百分比增加到32.2％，以洗脱所有衍生的聚糖。MS参数设置如下：全扫描m/z范围＝650-2000，ACG目标＝1e⁶，最大IT＝100ms，分离度＝70,000，源温度＝350℃，喷雾电压＝4.0kV，辅助气体加热器温度＝250℃，S-透镜RF等级＝50。选择了五种最丰富的前体进行数据相关的MS2扫描，其中ACG目标＝1e⁵，最大IT＝250ms，步进NCE＝13、20，分离度＝17,500。

基于对每种聚糖测量的实验质量分配聚糖的单糖组成；根据MS/MS片段化光谱与UniCarbKB数据库中多糖结构预测的理论片段化模式的匹配，分配多糖结构。

III.结果与讨论

单克隆抗体的糖型的鉴定和相对定量。

IgG4分子的胰蛋白酶消化产生含有具有可变聚糖的保守N-糖基化位点(EEQFNSTYR(SEQ ID NO:45)，被称为N297)的肽以及约50个非糖基化肽。流动相中存在1mM甘氨酸(pH＝2.0)可显著恢复IgG4消化物(mAb1)的整体MS信号，而不会影响IP-HILIC的洗脱曲线，包含峰宽和保留时间，如图42A所示。从含有和不含甘氨酸的TFA流动相获得的UV色谱图也相同(图42B)。从这两种条件中的任何一种观察，整个洗脱曲线可以分为两个较远的区域，分别含有来自非糖基化肽和糖肽的峰。还需要注意的是，与非糖基化肽相比，HILIC柱上的不同糖肽的分离效果要好得多。例如，mAb1的非糖基化肽区域(1-13分钟)在前11分钟内没有表现出任何分离的特征，并且仅在10分钟到13.5分钟之间显示有限数量的峰(图42A)，而由于聚糖之间的亲水性差异，糖肽区域中的所有峰(18-25分钟)都得到了很好的分离。

对于另一种IgG4分子(mAb2)，观察到类似的色谱图谱。如图42C1-42C3所示，通过延长线性梯度(流动相B的92％至73％)，可以单独提高糖肽区域中的峰分离度。在存在甘氨酸的情况下恢复的S/N还确保了串联质谱的质量(如图42D和42E中所例示的)，从而可以自信地分配糖肽，而无需参考其它分析，如释放的聚糖分析。从使用优化梯度采集的数据中提取的最丰富的18种mAb1糖型的离子色谱图在40分钟内均匀分布，如图42F所示。每个代表不同聚糖组成的EIC峰都有一个高度可预测的洗脱时间。例如，额外的半乳糖(Gal)总是导致洗脱时间增加7分钟，无论其聚糖组成如何。它可以是具有任意数量的支链N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)的岩藻糖基化核心结构，或非岩藻糖基化核心结构。除了具有不同组成的聚糖的良好分离外，由于Gal通过1,3或1,6键与支链GlcNAc(例如FA2G1、A2G1)连接，还观察到结构异构体的基线分离。值得注意的是，从完整糖肽中观察到的洗脱曲线与使用相同HILIC柱在近中性pH下获得的释放聚糖的洗脱曲线高度一致(图42G)，除了两个含唾液酸的聚糖FA2G2S1和FA2G1S1，其相对洗脱时间受到轻微影响，很可能是由于在存在TFA的情况下羧酸基团的质子化。

与IP-HILIC中的宽洗脱时间范围相比，来自RPLC-MS数据集的相同糖肽的EIC峰仅在1.5分钟窗口内洗脱，即使梯度的整个线性范围为80分钟(图42H1-42H2)。尽管由于目前最先进的质谱仪具有高扫描率和灵敏度，因此这种峰分离缺陷仍可用于糖肽鉴定，但在降低共洗脱肽的动态范围和实现更准确的峰积分方面，改进的分离始终具有优势。此外，由于保留时间不同，使用IP-HILIC可以很容易地从相同的预先存在的糖肽中排除在源内片段化过程中生成的人工糖肽，其保留时间与生成它们的较大糖型的保留时间相同，而这对于RPLC来说可能具有挑战性，因为它的分离不充分(图42H1-42H2)。

甘氨酸的S/N增强水平可能因不同的肽序列或不同的肽与甘氨酸摩尔比而变化。对于给定的序列(EEQFNSTYR；SEQ ID NO:45)，所有糖肽都表现出相似的S/N改善，这与聚糖组成和单个糖型的相对丰度无关，这通过绘制两种条件下mAb1的单个糖型的EIC峰面积的出色线性(R²＝0.998)来说明(图43A)。信号加强的一致性导致在两种条件下量化的不同糖型的百分比水平高度可比，如图43B和43C所示。这一结果表明，TFA主要通过在TFA阴离子和伯胺之间形成离子配对来抑制信号，所述伯胺只能在氨基酸中找到而不是在糖链中找到。

从图43A中的绘图的截距确定，IgG4中糖肽的平均S/N加强约为19.4倍。还分析了来自IgG1的糖肽，并且在色谱图谱和S/N加强方面观察到了类似的特征，无论肽序列中的单个氨基酸取代(EEQYNSTYR；SEQ ID NO:35)。结果总结在图43D1-43D3和43E中。

表征含有多个糖基化位点的Fc结构域融合蛋白的位点特异性N-糖基化谱

融合蛋白fP1含有五个N-糖基化位点，包含一个与来自mAb的N297等价的保守Fc糖基化位点(位点1)和四个定位在功能结构域中的额外位点(位点2-4)。对于消化肽的IP-HILIC-MS分析，在存在甘氨酸的情况下提高信噪比对于改进糖肽鉴定至关重要，这依赖于MS2光谱中碎片离子的产率(参见图43F和43G的串联质谱实例)。为了系统地评估甘氨酸添加剂如何提高fP1位点特异性糖肽的鉴定，将两个条件运行的搜索结果合并，并使用相对严格的参数(评分>150，|LogProb|>2，#PSM≥2)进行过滤，如图44A(顶部两个图片)所示，这表明高置信度PSM和鉴定的糖肽的数量均通过甘氨酸添加剂得到改善。观察到每个位点的糖基化谱不同，这也通过使用EIC峰面积的相对定量来验证(表5)。

表5.在Fc结构域融合蛋白fP1的每个糖位点上测量的EIC峰面积和单个糖型的相对定量。

与mAb类似，信号加强对于来自相同糖基化位点的所有糖型高度一致(图44C)，从而导致在使用和不使用甘氨酸添加剂的情况下量化的单个糖型的可比较的相对百分比(表5)。同样值得注意的是，对于含有不同糖位点的糖肽，信号加强会有所不同，范围从2倍(在位点5)到50倍(在位点2)。这表明基于TFA的信号抑制或基于甘氨酸的TFA缓解水平对于不同的肽序列有很大差异。

除了足够的信噪比之外，足够的LC分离对于高度糖基化蛋白质中的位点特异性糖基化鉴定也是有利的。通过IP-HILIC分离可以很好地区分所有糖肽峰与非糖基化肽，这由糖肽的MS2光谱中的氧鎓特征离子的EIC峰揭示(图44D)。为检查这些糖肽如何彼此分离，提取了所有七种含糖位点肽的四种代表性糖型(FA2G1、FA2G2、FA2G2S1和FA2G2S2)的EIC峰，如图45A中所示的七个峰“包络”。一个包络内的洗脱曲线与其它包络内的洗脱曲线具有高度可比性，包含糖型的洗脱顺序和每个峰之间的保留时间差异。并且糖肽的两个包络之间的保留时间差异仅与氨基酸序列相关，这可能归因于极性残基的频率，正如在预测HILIC中肽保留的几个模型中所建议的那样。描述性地，位点4的肽序列(XXXXXNXTXK，SEQ ID NO:36)在10个总氨基酸中具有五个极性残基，出现频率为50％。覆盖相同糖位点但含有额外N末端赖氨酸残基(被称为位点4^b)的另一个肽的序列具有略高百分比的极性残基(54.4％)，因此位点4^b的糖肽包络的洗脱时间晚于位点4^a。并且位点4^b的洗脱时间与位点5的糖肽包络相同，因为尽管氨基酸组合不同，但这两种肽都含有54.4％的极性残基。仅有50％极性残基的位点3的包络比最后两个包络洗脱得晚，这可能是由于肽序列中存在C末端精氨酸(而不是赖氨酸)，其中胍基可能对整体的贡献更大极性。对于所有其它三个包络也观察到相同的趋势，其肽序列含有C末端精氨酸并具有高极性残基频率。Fc结构域糖肽(位点1)在末端洗脱，因为由所有极性残基组成的肽序列决定了极高的亲水性。尽管该肽中的两个酸性氨基酸(Glu)保持为中和的羧酸形式，但它们仍然可以与固定相的中性酰胺基团牢固结合。总之，糖肽可以根据聚糖结构和氨基酸序列进行分离；并且来自一个糖位点的两个糖型峰之间的空间被来自其它糖位点的峰填充。因此，fP1中的大多数糖肽可以在很宽的洗脱时间范围内均匀分布，这允许在数据相关采集期间有效地选择前体用于MS2扫描。

在使用TFA的IP-HILIC分离中观察到的此类特征在使用没有强离子配对性质的较弱酸(如甲酸)时可能无法重现。首先，基于HILIC/FA的分离可能导致非糖基化肽与糖肽的分离不完全；并且相同提取的代表性峰显示其它早期洗脱的亚群，这表明由于缺乏离子配对试剂而导致不同糖肽的异质亲水性(图44D)。与HILIC/TFA分离相比，HILIC/FA的这种LC性能缺陷导致糖肽的鉴定较少，如图44A的第三个图片和图44B中的维恩图(Venn graph)所示，但与TFA数据集相比，添加甘氨酸仍可实现平均约5倍的信号加强，并且已鉴定的糖肽具有更高数量的PSM。使用其它HILIC固定材料可能会获得含FA的流动相中的HILIC性能，当将HILIC/FA与甘氨酸添加剂组合时，这可以进一步改善糖肽的鉴定。使用C18柱的RPLC/TFA具有正交分离能力，以从多个位点分离糖肽。来自多个位点的糖肽作为不同的聚类很好地相互分离(图36D)。尽管它们没有与其它非糖基化肽完全分离，但在这种单一糖蛋白fP1中很少有非糖基化肽在这些糖肽聚类中被洗脱，因此通过RPLC-MS对糖肽的鉴定仍与IP-HILIC-MS方法具有可比性(图44A的最后两个图片和图44B)。

使用IP-HILIC-MS发现单克隆抗体中的低丰度O-糖基化和非规范N-糖基化。

由于IP-HILIC示出了表征来自fP1中多个糖位点的糖肽的能力，因此它还应该具有从mAb的非规范糖位点中鉴定糖肽的潜力。稍微增加进样量以提高低丰度糖肽的检测能力，从而获得高质量的串联质谱。在药物开发早期对mAb3的研究中，有把握地鉴定了几种具有不同氨基酸序列的低丰度糖肽，包含含有错切N297的糖肽(如TKPREEQFNSTYR；SEQ IDNO:44)以及含有定位在VL结构域的N91和定位在CH1结构域的N163的非规范糖位点的糖肽(参见图45B和45C中的串联质谱实例)。与主要由具有岩藻糖基化双触角复合结构的聚糖占用的规范Fc N297位点不同，在轻链N91上鉴定出三个高甘露糖型聚糖，在重链N163上仅鉴定出一个聚糖FA2G2，并且两个位点的聚糖占用率分别低至0.4％和0.07％。尽管大的进样量可能会获得鉴定这些低丰度糖肽的可能性，但由于信号饱和，可能会低估非糖基化肽的丰度。较低的进样量可以量化每种单独聚糖的较低(并且可能更准确)占用水平(图45D)。在另一项研究中，当搜索最常出现的哺乳动物O-连接聚糖数据库时，针对双特异性抗体mAb4在一个臂的VH结构域鉴定了低丰度粘蛋白型O-连接聚糖HexNAc(1)Hex(1)NeuAc(2)(参见图45E和45F中的串联质谱实例)，尽管这种O-连接糖肽的水平被量化为小于0.05％。Fab区域上这些稀有聚糖的存在也使用与天然质谱法相结合的强阳离子交换色谱法在完整蛋白质水平上得到证实，并且没有发现Fa区域上的其它聚糖。

尽管这些稀有聚糖不能使用RPLC-MS独立发现，但仍然没有足够的案例来统计证明使用IP-HILIC-MS鉴定低丰度非规范N-聚糖或O-聚糖的优势。相反，对低丰度糖肽的研究可能会提供有关潜在干扰影响的前景。在存在高丰度共洗脱干扰的情况下，检测极低丰度(糖)肽通常具有挑战性，特别是对于Orbitrap型质谱仪中基于数据的采集而言，因为C-trap可以被高丰度离子快速填满，而低丰度离子可能无法在较短的进样时间内充分积累，并且可能不会产生超过阈值的信号来触发串联MS2进行鉴定。尽管HILIC和RPLC都不能完全消除干扰信号，但干扰的主要来源和影响程度可能不同。对于RPLC-MS，非糖基化肽跨整个梯度广泛分布，并且可能是任何低丰度糖肽干扰的原因(图46A)，而对于IP-HILIC-MS，据说没有来自非糖基化肽的干扰，由于TFA的离子配对，整个群体被压缩到早期洗脱时间，并且唯一的干扰源来自高度丰富的规范Fc糖肽(图46B)。据推测，对于低丰度糖肽鉴定，与RPLC-MS中的非糖基化干扰相比，这种Fc糖肽干扰应该具有较低的负面影响，因为(1)Fc糖肽的数量远少于非糖基化肽的数量，并且(2)Fc糖肽的强度通常是从mAb消化的所有肽中最低的。事实上，只有mAb3中主要的两种或三种糖型，如FA2、FA2G1和FA2G2(相对丰度>10％)，可能被确定为真正的干扰，而其余的Fc糖型由于其丰度较低而几乎不受关注。

如图46C所示，在RPLC中的代表性6分钟窗口(67-73分钟)之外，总共2.7分钟具有来自高丰度肽的MS信号(67.5-68分钟、69-70分钟、70.4-70.6分钟和71-72分钟)，从而产生与任何低丰度糖肽共洗脱的高风险。观察到，HC N91处的三个高甘露糖糖型的整个聚类以250倍强的峰共洗脱(69.0-69.4分钟)。这种情况可能发生在整个80分钟色谱图中的任何地方。在IP-HILIC中，虽然来自N91的两种糖肽(Man6和Man7)与Fc糖肽部分共洗脱，但来自Fc糖肽的干扰强度分别仅为50倍和8倍。在整个10分钟的糖肽洗脱区域(12-22分钟)中，只有一分钟(三种主要糖型的峰宽之和)具有强干扰峰，这意味着90％的区域可能对低丰度糖肽没有严重干扰，包含“谷”区(图46B中12.5-16.5分钟)，在该区域中仅观察到背景噪声和其它低丰度糖肽。

类似地，mAb4的VH结构域上的O-连接糖肽也在IP-HILIC-MS中的相同区域中洗脱，相反，由于双特异性mAb的非糖基化肽数量不断增加，未能从RPLC-MS数据集中提取EIC峰(图46E)。由于与N-聚糖相比，O-聚糖通常含有较少的单糖单元，因此O-糖肽的亲水性较低，并且可能比N-糖肽更早洗脱。据推测，来自mAb的任何其它O-糖肽也在“谷”区洗脱，其中来自非糖基化肽或Fc-糖基化肽的干扰信号最小。

这种降低的干扰水平使IP-HILIC-MS成为一种用于低丰度糖肽鉴定的独特方法，这也突出了TFA作为离子配对试剂以及甘氨酸作为信号加强试剂在该应用中的不可替代作用。这种方法可用作在早期生物制药发现过程中快速筛选稀有糖基化而无需第二维的糖肽富集的方法。通过使用延长的梯度可以进一步优化性能。此外，由于大多数不可预测的分子依赖性关键质量属性(CQA)可能定位在Fab结构域而不是Fc结构域，因此通过完全去除Fc结构域以及Fc N-糖肽干扰，重点关注分离的Fab区域，从而进一步提高检测灵敏度。

在该研究中，证明了可以将甘氨酸添加到含有TFA的流动相中，以显著解决基于TFA的IP-HILIC-MS的灵敏度缺陷，而不会对肽分离的LC性能产生不利影响。该方法基于常规流量泵，并且具有出色的稳定性和稳健性，从而允许对无数不同类型的生物治疗剂和糖基化功能蛋白进行位点特异性糖基化分析。对于mAb，与释放的聚糖分析相比，IP-HILIC-MS在完整糖肽水平下生成无偏差的聚糖谱，这表明该方法可能成为标准蛋白质表征中释放聚糖测定的补充或替代。此外，IP-HILIC-MS可能与基于MRM或PRM的糖肽定量方法兼容，由于糖肽的洗脱时间范围较宽，因此需要同时安排相对较少数量的前体。这些靶向或非靶向IP-HILIC-MS方法可以顺利移植到多属性监测工作流程或高通量分析平台中，这有望推动生物制药行业的分析科学。

甘氨酸添加剂可用于具有弱离子配对的RPLC-MS或HILIC-MS，以加强MS信号和增加整体位点特异性糖基化鉴定。关于Fc结构域融合蛋白的公开结果表明，在从多个糖基化位点绘制糖基化谱方面，IP-HILIC-MS方法可以与RPLC-MS方法(具有相同的信号强度)进行激烈竞争。由于当前最先进的质谱仪的快速扫描速率和高动态范围，非糖基化肽的干扰在RPLC-MS中可以很好地耐受。然而，对于低占用糖位点，如mAb中的非规范位点，即使不涉及额外的富集步骤，IP-HILIC在提高其可检测性方面仍然显示出优势。也有理由假设IP-HILIC-MS在应用于含有大量非糖基化肽背景的样品时会比RPLC-MS工作得更好；并且线性梯度可以在IP-HILIC中的糖肽洗脱区域中选择性地延长，以有效增加糖肽分离，这在RPLC-MS中很难实现。因此，可以使用IP-HILIC-MS(UPLC)平台实现在糖蛋白组规模(如人血清)中快速简便地筛选糖型的靶向或非靶向方法。除了本研究报道的中性HILIC固定相材料(酰胺)外，还可以评估其它带电固定相，如两性离子材料。

本发明的范围不受本文描述的具体实施例的限制。事实上，除了本文所述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中变得显而易见。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 瑞泽恩制药公司

<120> 使用氨基酸增强质谱分析中的信号

<130> 10675WO01

<150> 62/958,366

<151> 2020-01-08

<150> 63/053,836

<151> 2020-07-20

<160> 45

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAb重链

<400> 1

Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala

20 25 30

Gly Met Ser Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Lys Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Lys

450

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAb轻链

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽，重链

<400> 3

Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 4

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

1 5

<210> 5

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 5

Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

1 5 10 15

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 6

Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 7

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 8

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

1 5 10

<210> 9

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 9

Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr

1 5 10 15

Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala Gly Met Ser Val Gly

20 25 30

Trp Ile Arg

35

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 10

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 11

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly

20 25 30

Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

35 40

<210> 12

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 12

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

1 5 10 15

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

20

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 13

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 14

His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

1 5

<210> 15

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 15

Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg

1 5

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 16

Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Lys

1 5

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 17

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

1 5 10

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 18

Asn Gln Val Val Leu Lys

1 5

<210> 19

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 19

Gln Val Thr Leu Arg

1 5

<210> 20

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 20

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 21

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 21

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5

<210> 22

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 22

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

1 5 10

<210> 23

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 23

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

1 5 10 15

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25

<210> 24

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 24

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

1 5 10 15

Glu Val Lys

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 25

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

1 5 10 15

Lys

<210> 26

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 26

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys

<210> 27

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 27

Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu

1 5 10 15

Gln Asp Ser Lys

20

<210> 28

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 28

Val Gly Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 29

Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg

1 5 10

<210> 30

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 30

Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

1 5 10 15

<210> 31

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 31

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

1 5 10 15

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 32

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

1 5 10 15

Lys

<210> 33

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 33

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

1 5 10 15

His Asn His Tyr Thr Gln Lys

20

<210> 34

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> NISTmAB的肽

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽序列

<400> 35

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 36

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Thr Xaa Lys

1 5 10

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 37

Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Thr Xaa Lys

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(10)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 38

Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Thr Xaa Xaa Xaa Lys

1 5 10

<210> 39

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 39

Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Thr Xaa Arg

1 5

<210> 40

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 40

Asn Xaa Thr Xaa Xaa Arg

1 5

<210> 41

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(6)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 41

Lys Asn Xaa Thr Xaa Xaa Arg

1 5

<210> 42

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(36)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 42

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asn Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa Xaa Xaa Lys

35

<210> 43

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(7)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(34)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<400> 43

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5 10 15

Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa

20 25 30

Xaa Xaa

<210> 44

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<400> 44

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

1 5 10

<210> 45

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 合成肽

<400> 45

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

1 5

Claims (34)

1.一种增强质谱信号的方法，其包括：

在允许样品组分与基材结合的条件下使样品与分离柱接触；

对所述分离柱施加第一流动相梯度，其中所述第一流动相梯度包括三氟乙酸(TFA)和小分子添加剂或甲酸(FA)和小分子添加剂；

向所述分离柱施加第二流动相梯度，其中所述第二流动相梯度包括含TFA的乙腈(ACN)和小分子添加剂或含FA的ACN和小分子添加剂；以及

对洗脱后的样品组分进行质谱分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一流动相中的所述小分子添加剂选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、N-乙酰基甘氨酸、甲硫氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸或N-甲基甘氨酸。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一流动相中的所述小分子添加剂选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一流动相中的所述小分子添加剂是甘氨酸。

5.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中所述小分子添加剂浓度介于约1mM和约2mM之间。

6.根据权利要求4所述的方法，其中甘氨酸浓度为约1mM。

7.根据权利要求4所述的方法，其中甘氨酸浓度为约2mM。

8.根据权利要求1到7中任一项所述的方法，其中所述第二流动相中的所述小分子添加剂选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、N-乙酰基甘氨酸、甲硫氨酸、β-丙氨酸、天冬氨酸或N-甲基甘氨酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二流动相中的所述小分子添加剂选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或缬氨酸。

10.根据权利要求1到9中任一项所述的方法，其中所述第二流动相中的所述小分子添加剂是甘氨酸。

11.根据权利要求8到10中任一项所述的方法，其中所述小分子添加剂浓度介于约1mM和约2mM之间。

12.根据权利要求10所述的方法，其中甘氨酸浓度为约1mM。

13.根据权利要求10所述的方法，其中甘氨酸浓度为约2mM。

14.根据权利要求1到13中任一项所述的方法，其中所述第一流动相中的所述TFA浓度为H₂O中的约0.05％到0.1％TFA，或所述第一流动相中的所述FA浓度为约0.1％FA。

15.根据权利要求1到14中任一项所述的方法，其中所述第二流动相中的所述TFA浓度包括80％ACN和20％H₂O中的约0.05％TFA，或80％ACN和20％H₂O中的约0.1％TFA。

16.根据权利要求1到15中任一项所述的方法，其中所述样品包括肽或核苷酸。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肽是糖肽。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述糖肽获自单克隆抗体。

19.根据权利要求18所述的方法，其中所述单克隆抗体是同种型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或混合同种型。

20.根据权利要求1到19中任一项所述的方法，其进一步包括在使样品与分离柱在允许样品组分与基材结合的条件下接触之前制备所述样品。

21.根据权利要求20所述的方法，其中制备所述样品包括：

在允许样品变性和还原的条件下使样品与变性和还原溶液接触；

在允许样品烷基化的条件下使变性和还原后的样品与烷基化溶液接触；

在允许样品消化的条件下使烷基化样品与消化溶液接触；以及

在停止样品消化的条件下使消化后的样品与淬灭溶液接触。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述样品是单克隆抗体并且所述消化溶液包括蛋白酶。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述蛋白酶包括胰蛋白酶。

24.根据权利要求1到23中任一项所述的方法，其中所述分离柱是液相色谱柱。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述液相色谱(LC)分离柱包括亲水相互作用(HILIC)液相色谱柱。

26.根据权利要求1到25中任一项所述的方法，其中对洗脱后的样品组分进行质谱分析包括应用电喷雾电离以从所述洗脱后的样品组分产生带电离子并测量所产生的带电离子。

27.根据权利要求1到26中任一项所述的方法，其中所述方法增强了质谱信号，如通过高电荷态物质中的平均约5到14倍和/或约2到1000倍(例如，z≥3)增加所指示的。

28.根据权利要求27所述的方法，其中所述光谱信号在高电荷态物质中增加了约14倍和/或增加了约1000倍。

29.根据权利要求17到19中任一项所述的方法，其中在所述洗脱后的样品组分上获得的所述质谱信号相对于在不存在所述小分子添加剂的情况下在对照样品上获得的质谱信号增强了2倍到50倍。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述糖肽是含有O-聚糖的糖肽。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述糖肽是含有N-聚糖的糖肽。

32.根据权利要求30或31所述的方法，其中O-聚糖或N-聚糖与标记连接。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述标记是普鲁卡因酰胺。

34.根据权利要求29到33中任一项所述的方法，其中所述小分子添加剂是甘氨酸。

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