JP2015516078A - 試料成分の分析方法 - Google Patents

Abstract

キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）を高分解能質量分析法にオンラインで接続するための方法およびシステムであって、極性有機溶媒と有機酸とを含むシースフロー緩衝液が（ｃＩＥＦ）用の固定化液とエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）用のイオン化液の両方として使用される方法およびシステムを本明細書に記載する。【選択図】図１

Description

組換えタンパク質は、治療手段としてますます重要になりつつある。組換えタンパク質は、例えば、目的のタンパク質を産生する特定のヒト遺伝子配列を発現するように遺伝子操作されている、ヒト以外の哺乳動物宿主細胞株などの細胞株を使用して製造することができる。細胞培養物中で標的タンパク質を産生した後、既知のプロセスによりそれを高レベルの純度に精製することができる。しかし、除去された細胞培養物中には、宿主細胞株により産生された極微量の混入タンパク質（宿主細胞由来タンパク質、またはＨＣＰと称される）が存在し得る。

ＨＣＰは、製品の品質および安全性に影響を及ぼすおそれがある。そのため、これらのリスクを軽減するために治療用製品中に存在するＨＣＰのキャラクタリゼーションを行うことが重要である。二次元ゲル電気泳動などの現在のＨＣＰキャラクタリゼーション法は、大きな労力を要し、煩雑な傾向があるため、これらのＨＣＰキャラクタリゼーション法の使用、特に、商業生産時の使用は限られれる可能性がある。

電気泳動は、電界中での引き合いまたは反発によるイオンの運動または移動を指し、イオンによりその移動度に差がある。キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）は、試料成分の等電点（ｐＩ）の差に基づく高分解能分離法であり、アミノ酸、ペプチドおよび医薬品などの両性物質の分離に使用するのに好適である。ｃＩＥＦでは、タンパク質は、電界の影響を受けて、両性担体（ＣＡ）により形成されるｐＨ勾配中を移動する。正電荷を持つ両性電解質は陰極に向かって移動し、負電荷を持つものは陽極に向かって移動する。その結果、ｐＨはキャピラリーの陰極端に向かって高くなり、陽極端に向かって低くなる。両性電解質がそれ自体のｐＩに到達し、もはや電荷を持たなくなると、移動が停止し、安定なｐＨ勾配が形成される。両性の被検物質（ａｎａｌｙｔｅ）は最終的にその正味電荷がゼロとなるｐＨの位置に達し、従って、移動を止め、ｐＩによる被検物質のフォーカシングまたは分離が行われることになる。ｃＩＥＦは、ＵＶ吸光度、レーザー誘起蛍光法および質量分析法（ＭＳ）を含む幾つかの検出法と接続されてきた。

質量分析法（ＭＳ）は、化合物をイオン化して電荷を持つ分子または分子フラグメントを生成した後、分析器で電磁場を使用してそれらの質量電荷比によりそれらを分離する分析法である。次いで、分離されたイオンを検出し、解析することができる。

大気圧イオン化（ＡＰＩ）源を使用して、試料分子を大気圧でイオン化した後、イオンを質量分析計に輸送することができる。ＡＰＩは、ポリマーやペプチドなどの熱的に不安定な試料のイオン化に好適である。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）はＡＰＩの応用であり、低揮発性または不揮発性であるポリマーやペプチドなどの熱的に不安定で高分子量の化合物のＭＳに使用されることが多い。

しかし、生物試料、とりわけタンパク質消化物用にｃＩＥＦをＥＳＩ−ＭＳとオンラインで接続することは困難であった。従って、生物試料用のｃＩＥＦとＥＳＩ−ＭＳとの改善されたオンライン接続が必要とされている。

試料中の１種以上の成分の同定分析を行う方法を本明細書に記載する。一実施形態では、試料には生体分子の不均一混合物が含まれる。別の実施形態では、試料には、組換えタンパク質が除去された細胞培養物が含まれる。より具体的な実施形態では、１種以上の成分には宿主細胞由来タンパク質が含まれる。一実施形態では、試料には、組換えモノクローナル抗体が除去された細胞培養物が含まれ、１種以上の試料成分には宿主細胞由来タンパク質が含まれる。より詳細な実施形態では、本発明は、除去された細胞培養試料中の宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）成分の同定方法を提供する。

一実施形態では、本方法は、（ａ）試料中の１種以上の成分をキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）により分離する工程と；（ｂ）分離された成分を分離チャンバからイオン化装置にシースフロー液を使用して輸送する工程と；（ｃ）試料成分をイオン化する工程と；（ｄ）試料中の１種以上の成分を質量分析法（ＭＳ）により同定分析する工程とを含む。一実施形態では、イオン化装置にはエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）装置が含まれる。

本発明の方法では、シースフロー液は、分離チャンバ用の泳動液（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）とイオン化装置用のイオン化液の両方の役割を果たす。より詳細な実施形態では、シースフロー緩衝液は、極性有機溶媒約３０％〜約５０％および有機酸約０．０１％〜０．１％を含む。極性有機溶媒は、極性プロトン性溶媒であっても、または極性非プロトン性溶媒であってもよい。一実施形態では、極性プロトン性溶媒には、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせなどの脂肪族アルコールが含まれる。別の実施形態では、極性非プロトン性溶媒にはアセトニトリルが含まれる。一実施形態では、有機酸は、ギ酸、酢酸、エタン酸、プロパン酸、安息香酸、およびこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、有機酸のｐＫａは約４．０〜５．０である。より詳細な実施形態では、シースフロー液は、脂肪族アルコール約３０％〜約５０％およびギ酸約０．０１％〜０．１％を含む。一実施形態では、シースフロー液は、メタノール約３０％〜約５０％およびギ酸約０．０１％〜０．１％を含む。

一実施形態では、分離する工程は、（ａ）一定容量の試料と両性電解質緩衝液とを分離チャンバに導入する工程であって、分離チャンバがキャピラリーを含む工程と；（ｂ）試料と両性電解質緩衝液を分離キャピラリー内で約５０ｋＶ以下のフォーカシング電圧を印加してフォーカシングする工程とを含む。より詳細な実施形態では、フォーカシング電圧は約５ｋＶ〜約５０ｋＶである。一実施形態では、試料は、約３００Ｖ／ｃｍ〜約６００Ｖ／ｃｍの印加電界を印加してフォーカシングされる。より詳細な実施形態では、印加電界は約３００Ｖ／ｃｍ〜約４００Ｖ／ｃｍである。

一実施形態では、試料は、約５０ｋＶ以下の泳動電圧を印加して、イオン化装置に輸送される。より詳細な実施形態では、泳動電圧は約５ｋＶ〜約５０ｋＶである。一実施形態では、試料は、約３００Ｖ／ｃｍ〜約６００Ｖ／ｃｍの印加電界を印加してイオン化装置に輸送される。より詳細な実施形態では、試料は、約３００Ｖ／ｃｍ〜約３５０Ｖ／ｃｍの印加電界を印加してイオン化装置に輸送される。

別の実施形態では、試料は、流体力学的注入によりイオン化装置に輸送される。一実施形態では、流体力学的注入は、分離チャンバの入口でシリンジを使用して約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの圧力を加えることを含む。別の実施形態では、流体力学的注入は、分離チャンバの出口で約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの真空引きを行うことを含む。

一実施形態では、分離チャンバは、一定容量を有するキャピラリーであり、導入される試料の容量は、キャピラリーの容量以下である。一実施形態では、試料の容量は、キャピラリーの容量の約２５％〜約１００％である。別の実施形態では、導入される試料の容量は約１μＬ〜２５μＬである。一実施形態では、試料は、１種以上の両性試料成分をそれぞれ約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ含む。

一実施形態では、分離チャンバは、フューズドシリカ（ＳｉＯ_２）キャピラリーであるキャピラリーである。一実施形態では、キャピラリーはポリマーコーティングを備える。より詳細な実施形態では、ポリマーコーティングは、ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）、メチルセルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、およびこれらの組み合わせから選択される。

一実施形態では、両性電解質には、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）、Ｂｉｏｌｙｔｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）、Ｓｅｒｖａｌｙｔ（商標）、およびこれらの組み合わせから選択される両性担体（ＣＡ）が含まれる。一実施形態では、両性電解質には、約０．１％〜約１０％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）が含まれる。一実施形態では、両性電解質には、狭いｐＨ範囲の両性担体が含まれる。一実施形態では、両性電解質には、広いｐＨ範囲の両性担体が含まれる。一実施形態では、両性電解質には、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（１−３）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（５−８）、およびＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（３−１０）から選択されるＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）が含まれる。一実施形態では、両性電解質には、約２％〜約８％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（３−１０）溶液が含まれる。別の実施形態では、両性電解質は、アミノ酸などの、酸性官能基と塩基性基の両方を含有する低分子量分子の混合物である。

一実施形態では、本方法はまた、試料を分離キャピラリーに導入する前に、試料中の１種以上の成分を消化する工程も含む。一実施形態では、試料中の１種以上の成分は、例えば、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびこれらの組み合わせを含むタンパク質分解酵素で消化される。一実施形態では、試料中の１種以上の成分はトリプシンで消化される。一実施形態では、タンパク質分解酵素は固体担体上に固定化されている。より具体的な実施形態では、トリプシンは、固体担体上に固定化されている。一実施形態では、固体担体は、ポリマー粒子、ガラス、膜、ゲルビーズ、ゾルゲル担体、多孔質シリコンマトリックス、多孔質モノリシック材料、磁性材料、およびこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、試料中の１種以上の成分は、（例えば、固定化トリプシンにより）約２５℃〜約４０℃の温度で、または約３０℃〜約４０℃の温度で消化される。一実施形態では、試料中の１種以上の成分は、試料をタンパク質分解酵素と共に約１時間〜約２０時間インキュベートすることにより消化される。一実施形態では、試料中の１種以上の成分は、試料をタンパク質分解酵素（例えば、固定化トリプシン）と共に約３０秒〜約３０分間インキュベートすることにより消化される。一実施形態では、試料中の１種以上の成分は、試料をタンパク質分解酵素と共に約５時間〜約１５時間インキュベートすることにより消化される。一実施形態では、試料中の１種以上の成分は、試料をタンパク質分解酵素と共に約１２時間以上インキュベートすることにより消化される。

一実施形態では、試料は、消化後に水で希釈され、両性担体と混合されて、分離チャンバに導入される。一実施形態では、試料は、水対試料の比が約２：１〜１：２となるように水で希釈される。

一実施形態では、１種以上の成分にはタンパク質が含まれ、本方法は、試料を分離チャンバに導入する前に試料中のタンパク質を変性させる工程を含む。一実施形態では、試料中のタンパク質を変性させる工程には熱変性が含まれる。一実施形態では、試料中のタンパク質を変性させる工程には、試料溶液をノニオン性界面活性剤と共にインキュベートすることが含まれる。一実施形態では、試料中のタンパク質を変性させる工程には、試料を塩基と混合してｐＨ約８〜約１０の塩基性溶液を形成し、溶液中のタンパク質を約５分間以上、または約５分間〜約６０分間インキュベートすることが含まれる。一実施形態では、試料中のタンパク質を変性させる工程には、試料を酸と共にインキュベートしてｐＨ約２〜約３の酸性溶液を形成し、溶液中のタンパク質を約５分間以上または約５分間〜約６０分間インキュベートすることが含まれる。一実施形態では、熱変性には、試料を約６０℃〜約８０℃の高温で約５分間以上、または約５分間〜約６０分間インキュベートすることが含まれる。一実施形態では、試料中のタンパク質を変性させる工程には、試料を、炭酸水素アンモニウムを含む変性液と共にインキュベートすることが含まれる。一実施形態では、変性液は尿素をさらに含む。一実施形態では、変性液は、メタノールまたはアセトニトリル（ＡＣＮ）などの有機溶媒をさらに含む。一実施形態では、試料中のタンパク質を変性させる工程には、試料を、メタノールまたはアセトニトリルなどの有機溶媒を含む変性液と共に約３０分間インキュベートすることが含まれる。

一実施形態では、本方法は、試料を還元液および／またはアルキル化液と共にインキュベートする工程をさらに含む。一実施形態では、還元液は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、およびこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、アルキル化液には、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、β−メルカプトエタノール、またはこれらの組み合わせが含まれる。

本発明はまた、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）と質量分析法（ＭＳ）をインターフェイスするためのシステムも提供する。本システムは、（ａ）液体試料中の１種以上の成分の分離およびフォーカシングを行うための分離チャンバを有するｃＩＥＦ装置と；（ｂ）試料と両性担体とを収容する分離チャンバにわたって（across）電位を印加し、電位により試料中の１種以上の成分の分離およびフォーカシングを行う電圧電源装置と；（ｃ）分離およびフォーカシングされた１種以上の成分をｃＩＥＦ装置の分離チャンバから、溶液をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）装置に供給するように構成されたエミッタに直接輸送するためのシースフロー液と；（ｄ）試料の被検物質を分析するためのＭＳ装置と；を備える。

一実施形態では、シースフロー液は、極性有機溶媒約３０％〜約５０％および有機酸約０．０１％〜０．１％を含む。一実施形態では、極性有機溶媒は、極性プロトン性溶媒および極性非プロトン性溶媒から選択される。一実施形態では、極性プロトン性溶媒には脂肪族アルコールが含まれる。一実施形態では、脂肪族アルコールは、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、極性非プロトン性溶媒にはアセトニトリルが含まれる。一実施形態では、有機酸は、ギ酸、酢酸、エタン酸、プロパン酸、安息香酸、およびこれらの組み合わせから選択される。一実施形態では、有機酸のｐＫａは約４．０〜５．０である。より詳細な実施形態では、シースフロー液は、メタノール約３０％〜約５０％およびギ酸約０．０１％〜０．１％を含む。

一実施形態では、ｃＩＥＦ装置は、陽極と、陰極と、陽極液槽と、陰極液槽とを備える。一実施形態では、陽極液槽は、リン酸、ギ酸、アスパラギン酸、またはこれらの組み合わせなどの酸を含む陽極液を収容する。一実施形態では、陰極液槽は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、またはこれらの組み合わせなどの塩基を含む陰極液を収容する。

一実施形態では、本システムは、分離チャンバの一端をエミッタに接続するように構成されたインターフェイス接続デバイスを備える。一実施形態では、シースフロー液を陽極液槽および／または陰極液槽に導入して、フォーカシングされた試料成分を泳動させる。一実施形態では、分離チャンバには陽極端を有するキャピラリーが含まれ、試料中の１種以上の成分をフォーカシングした後、キャピラリーの陽極端をエミッタの導入端に挿入し、シースフロー液を陰極液槽に導入して、フォーカシングされた成分を泳動させる。別の実施形態では、分離チャンバには陰極端を有するキャピラリーが含まれ、試料中の１種以上の成分をフォーカシングした後、キャピラリーの陰極端をエミッタの導入端に挿入し、シースフロー液を陽極液槽に導入して、フォーカシングされた成分を泳動させる。

この概要は、本願の教示の幾つかの概要であり、本発明の対象を排他的にまたは網羅的に論じるものではない。他の詳細は、詳細な説明および添付の特許請求の範囲に記載されている。以下の詳細な説明を読解し、その一部を構成する図面を見ると、当業者には他の態様が明らかとなるが、それらはいずれも限定的な意味に解釈すべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲およびそれらの法的な均等物により定義される。

組み合わせられたｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳシステムのフローチャートである。 ｃＩＥＦの概略図である。 ＥＳＩの概略図である。 ＭＳの概略図である。 （ａ）メタノール５０％および酢酸０．０５％；（ｂ）メタノール５０％およびギ酸０．０５％；ならびに（ｃ）メタノール５０％およびギ酸０．１％；の異なるシースフロー緩衝液を用いたｃＩＥＦ中の泳動に関する電流プロファイルを示すグラフである。 ＨＣＰ試料から同定されたペプチドのｐＩの計算値対観測された移動時間を示すプロットである。ペプチドのｐＩ値はＴＰＰを用いて算出し、移動時間は抽出されたペプチドスペクトルから得た。

本発明は様々な変更および代替の形態が可能であり、その特定のものを例および図面として示してきたが、それらについて以下で詳細に説明する。しかし、本発明は記載する特定の実施形態に限定されるものではないことを理解されたい。逆に、本発明は、本発明の精神および範囲に入る他の変更形態、均等物、および代替形態に及ぶものとする。

試料中の１種以上の成分の同定分析を行うための新規なシステムについて本明細書に記載する。一実施形態では、本システムは、試料中のタンパク質、例えば、除去された細胞培養試料中に保持されている残留宿主細胞由来タンパク質を検出するように構成されている。特に、本システムは、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）とエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と質量分析法（ＭＳ）とを組み合わせるオンライン分析同定プロセスを使用して試料中の成分の同定分析を行う。組み合わせられたｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳシステムの概要を記載するフローチャートを図１に示す。簡潔には、目的の１種以上の被検物質（本明細書では試料成分とも称される）、例えば、ＨＣＰと、他の１種以上の成分とを含有し得る試料溶液１５の混合物を含む「フォーカシング液」１０を調製する。フォーカシング液１０を、分離するためにｃＩＥＦ装置１００に導入する。ｃＩＥＦ１００で試料成分を分離した後、分離された成分を含有するイオン化液２０を、イオン化するためにＥＳＩ装置２００に導入する。次いで、イオン化された成分３０をＭＳ３００で分析することができる。

本明細書に記載のオンラインプロセスは、組み合わせられたｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳプロセスの全分析時間を大幅に短縮することができる、一方で、通常のプロセスでは１０時間超かかる可能性がある（試料調製、消化、分離および検出を含む）が、本明細書に記載の組み合わせられたプロセスは、全プロセスの完了時間を約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、または約２時間未満に短縮することができる。別の利点は、ｃＩＥＦが試料を１０倍超濃縮できることである。本明細書に記載の本発明によれば、シースフロー液は、ｃＩＥＦ用の化学泳動液とＥＳＩ用のイオン化液の両方の役割を果たす。

キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）の概要
本明細書で使用する場合、「電気泳動」という用語は、電界の影響を受けたイオンの移動（引き合いまたは反発）を指す。最も簡単な電気泳動分離は、イオンの電荷／サイズに基づく。

キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）は、試料中の両性成分が等電点（ｐＩ）の差に基づいて分離される電気泳動法である。電界の影響を受けて、分離チャンバ内、例えば、キャピラリー内で、一連の双性イオン（両性電解質とも称される）によりｐＨ勾配が形成される。試料中の両性試料成分（被検物質と称することもできる）は、ｐＨ勾配中の、それらのｐＨがそれらのｐＩと等しくなる（即ち、正電荷と負電荷が相殺してゼロになるため、分子が正味電荷を持たない）点に到達するまで電界中を移動する。この点で、両性成分は移動を止め、フォーカシングされる。フォーカシング後、泳動工程は、フォーカシングされた被検物質を、分析するために分離チャンバから排出させる。一般的に、ｐＩの差が０．０５ｐＨ単位未満の被検物質をｃＩＥＦで分解することができる。

ペプチド、アミノ酸、核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、無機イオン、有機塩基、有機酸、および細胞全体を含む多くの種類の化合物をｃＩＥＦで分離することができるが、これらに限定されるものではない。本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、鎖状に連結した２種以上のアミノ酸を含む化合物を指し、鎖中では、各アミノ酸のカルボキシル基が隣接するアミノ酸のアミノ基に結合している。ペプチドの例としては、オリゴペプチド（即ち、通常２〜１０個のアミノ酸残基を含有する、連続的な非分岐ペプチド）、ポリペプチド（即ち、通常１０個超のアミノ酸残基を含有する、連続的な非分岐ペプチド）および特異的な空間的立体配座に折り畳まれた１個以上のポリペプチド鎖を含み得る高分子タンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。「一次構造」という用語は、タンパク質中のポリペプチド鎖のアミノ酸配列を指す。「二次構造」という用語は、例えば、αへリックスおよびβシートを含む非常に規則的な部分的構造を指す。「三次構造」は、単一のタンパク質分子の三次元構造を指し、「四次構造」は、幾つかのタンパク質サブユニットの集合体を指す。

ペプチド上に存在するアミノ酸残基は、分子に両性特性を付与することができ、これにより分子が正電荷と負電荷の両方を含有するようになる。ペプチドの正味電荷は、ペンダントの官能基と周囲環境のｐＨに依存する。一般的に、ペプチドは、それらのｐＩより低いｐＨで正電荷を持ち、それらのｐＩより高いｐＨで負電荷を持つ。そのため、電気泳動中、個々のペプチドは、ｐＨがそれらのｐＩに等しい領域に向かって移動する。従って、ｃＩＥＦは、複雑なタンパク質混合物、例えば、除去された細胞培養培地中のＨＣＰの分析および／またはキャラクタリゼーションに有用である。ｃＩＥＦはまた、産生物の処理の監視、製剤の試験および組換えにより産生されたタンパク質の品質管理の実施に使用することもできる。ｃＩＥＦはまた、複雑なタンパク質混合物の予備分画に使用することもできる。

ｃＩＥＦ装置
ｃＩＥＦ用に設置された基本的な装置を図２に概略的に示し、それは分離チャンバ１２０と、２つの緩衝液槽１３１、１３２と、２つの電極１４１、１４２と、電源装置１５０とを備える。分離チャンバ１２０は、通常、入口１２１と出口１２２との間に延びる、直径（Ｄ）を有するルーメンを画定する内壁１２５を有する細長いキャピラリーである。一実施形態では、分離チャンバ１２０の入口１２１は第１の緩衝液槽１３１と流体連通し、分離チャンバの出口１２２は第２の緩衝液槽１３２と流体連通している。

一実施形態では、分離チャンバ１２０は、長さ約５ｃｍ以上、約１０ｃｍ以上、約１５ｃｍ以上、約２０ｃｍ以上、約２５ｃｍ以上、約３０ｃｍ以上、約３５ｃｍ以上、約４０ｃｍ以上、約４５ｃｍ以上、約５０ｃｍ以上、且つ約５５ｃｍ以下、約６０ｃｍ以下、約６５ｃｍ以下、約７０ｃｍ以下、約７５ｃｍ以下、約８０ｃｍ以下、約８５ｃｍ以下、約９０ｃｍ以下、約９５ｃｍ以下、または約１００ｃｍ以下、ならびに内径約１０μｍ以上、約１５μｍ以上、約２０μｍ以上、約２５μｍ以上、約３０μｍ以上、約３５μｍ以上、約４０μｍ以上、約４５μｍ以上、または約５０μｍ以上、且つ約５０μｍ以下、約７５μｍ以下、約１００μｍ以下、約１２５μｍ以下、および約１５０μｍ以下のガラスキャピラリーである。一実施形態では、分離チャンバ１２０はフューズドシリカキャピラリーである。別の実施形態では、分離チャンバ１２０は、Ｔｅｆｌｏｎ（商標）またはホウケイ酸ガラスから構築されている。別の実施形態では、分離チャンバは、周知の微細加工技術を使用して形成された平面状構造の流路であってもよい。この場合、デバイスは、ガラス、フューズドシリカ、またはポリジメチルシラン（ＰＤＭＳ）などのポリマーから製造されてもよい。フューズドシリカは、広い電磁スペクトル領域にわたって透明であり、高い熱コンダクタンスを有するため、場合により、フューズドシリカが好ましいことがある。フューズドシリカはまた、直径数マイクロメートルのキャピラリーに製造することも容易である。

幾つかの実施形態では、分離チャンバ１２０の内壁１２５に裸のシリカ材料を使用する。他の実施形態では、分離チャンバ１２０の内壁１２５のシラン基を、中性または親水性の置換基と共有結合させて電気浸透流（ＥＯＦ）を低減することができるおよび／または内壁１２５への被検物質の吸着を防止することができる。中性コーティングの例としては、直鎖ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、トリメチルクロロシランおよびジビニルベンゼンコーティングが挙げられるが、これらに限定されるものではない。親水性コーティングの例としては、アクリルアミド（ＡＡ）、ジメチルアクリルアミド（ＤＭＡ）、Ｎ−アクリロイルアミノエチルエタノール（ＡＡＥＥ）、またはＮ−アクリロイルアミノプロパノール（ＡＡＰ）が挙げられる。別の実施形態では、動的コーティングを使用して電気浸透流を低減することができる。「動的コーティング」という用語は、分離チャンバの内壁にしっかりと付着し、電気浸透流（ＥＯＦ）の方向を効果的に逆転させる添加剤を分離液中に含むことを意味する。動的コーティング添加剤の例としては、界面活性剤接着剤ポリマーが挙げられる。界面活性剤としては、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）などのカチオン性界面活性剤；ＣＨＡＰＳ、カプリリルスルホベタイン、ラウリルスルホベタイン、またはパルミチルスルホペタインなどの双性イオン性界面活性剤；ならびにｔｗｅｅｎ ２０、ＮＰ ４０、またはＴｒｉｔｏｎ Ｘなどの非イオン性界面活性剤を挙げることができる。他の動的コーティング添加剤としては、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ポリエチレンオキサイド（ＰＥＯ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリ（ビニルアルコール）、またはポリ（ジメチルアクリルアミド）のような親水性ポリマーなどのポリマー添加剤が挙げられる。動的コーティング添加剤は、フォーカシング液に約０．１％ｗ／ｖ〜約１．０％ｗ／ｖ、または約０．１％ｗ／ｖ以上、約０．２％ｗ／ｖ以上、約０．３％ｗ／ｖ以上、約０．４％ｗ／ｖ以上、および約０．５％ｗ／ｖ以上、且つ約０．６％ｗ／ｖ以下、約０．７％ｗ／ｖ以下、約０．８％ｗ／ｖ以下、約０．９％ｗ／ｖ以下、または約１．０％ｗ／ｖ以下の濃度で含まれてもよい。

ｃＩＥＦ中、分離チャンバ１２０内部には、両性担体（ＣＡ）を含む分離液が存在するため、ｐＨ勾配が形成される。「両性担体」（ＣＡ）という用語は、様々な両性成分を含有する溶液を指す。本明細書で使用する場合、「両性成分」という用語は、酸または塩基の両方として作用し得る物質を指す。両性電解質ｐＨ勾配の分解能は、溶液中の両性電解質種の数に影響される。一般的に、両性電解質の数が多いほど、分離チャンバ１２０内の隣接する位置間のｐＨ差が小さくなるため、比較的多くの両性電解質を使用するとｐＨ勾配が滑らかになる。市販のＣＡには９００を超える両性成分を含有し得るものがある。

ＣＡは、広くても（即ち、多数のｐＨ単位を包含しても）または狭くても（即ち、少数のｐＨ単位しか包含しなくても）よい。本明細書で使用する場合、「広い」という用語は、約４ｐＨ単位以上、約５ｐＨ単位以上、約６ｐＨ単位以上、且つ約７ｐＨ単位以下、または約８ｐＨ単位以下を包含するＣＡを指す。本明細書で使用する場合、「狭い」という用語は、約４ｐＨ単位未満、約３ｐＨ単位未満、約２ｐＨ単位未満、約１ｐＨ単位未満、または約０．５ｐＨ単位未満を包含するＣＡを指す。一般的に、両性電解質組成物は、所望のｐＩ分離範囲に基づいて選択される。通常、ｐＩ値が未知の試料には広いＣＡが選択される。しかし、類似のｐＩ値を有するタンパク質の高い分解能が必要な状況では、範囲の狭いＣＡ混合物の使用が望ましいことがある。

一般的に、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｂｉｏ−ｌｙｔｅ（商標）（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｓｅｒｖａｌｙｔ（商標）（Ｂｉｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）およびＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）の４種の市販のＣＡがある。

Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）は、広いｐＨ範囲（約３〜約１０）および様々な狭いｐＨ範囲（約２．５〜約５；約４〜約６．５；約５〜約８；約８〜約１０．５；約４．２〜約４．９；約４．５〜約５．４；約５〜約６；および約６．７〜約７．７）で入手可能な、ｃＩＥＦ用の両性電解質緩衝液である。場合により、特にｃＩＥＦを使用するとき、バックグラウンドＵＶ吸収が低いＣＡを使用することが望ましいことがある。従って、その全ｐＨ勾配にわたりバックグラウンドＵＶ吸収が低いため、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）が望ましい可能性がある。

Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ（商標）は、広いｐＨ範囲（約３．５〜約９．５）および様々な狭い範囲（約３〜約５；約４〜約６；約５〜約７；約５〜約８；約６〜約８；約７〜約９；および約８〜約１０）で入手可能なｃＩＥＦ用の両性電解質緩衝液である。

Ｓｅｒｖａｌｙｔ（商標）両性担体は、双性イオン性を有する低分子量分子である。それらは、４００〜１０００ダルトンの平均分子量分布を有する合成由来種の混合物であり、狭いｐＨ範囲（約２〜約４；約３〜約４；約３〜約５；約３〜約６；約４〜約５；約４〜約６；約４〜約７；約５〜約６；約５〜約７；約５〜約８；約６〜約７；約６〜約８；約６〜約９；約７〜約９；および約９〜約１１）と広いｐＨ範囲（約２〜約９；約２〜約１１；約３〜約７；約３〜約１０；約４〜約９；約５〜約９）を含む様々なｐＨ範囲で販売されている。

Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）は、低分子量の様々なポリアミノ酸−ポリカルボン酸を含み、３．５〜１０のｐＨ範囲にわたる両性電解質緩衝液である。しかし、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）の製造は、２００７年に中止された。

一実施形態では、分離液は、ＣＡを約０．１％〜約１０％、ＣＡを約０．１％〜１．０％、またはＣＡを約０．２％〜０．８％含む。他の実施形態では、分離液は、ＣＡを約１％〜１０％、またはＣＡを約２％〜約８％含む。本明細書で使用する場合、１００％は、ＣＡの原液を指す。より具体的な実施形態では、分離液は、ＣＡを約０．１％以上、約０．２％以上、約０．３％以上、約０．４％以上、且つ約０．５％以下、約０．６％以下、約０．７％以下、および約０．８％以下、約０．９％以下、または約１％以下含む。別の実施形態では、分離液は、ＣＡを約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、且つ約５％以下、約６％以下、約７％以下、約８％以下、約９％以下、および約１０％以下含む。一実施形態では、ＣＡは、脱イオン水、炭酸水素アンモニウム、酢酸アンモニウム、または他の緩衝液などの不活性希釈剤で希釈される。

陽極１４１の近位にある槽１３１内の緩衝液は、ｐＨが低く（即ち、酸であり）、本明細書では「陽極緩衝液」と称される。一般的には、陽極緩衝液のｐＨは、約７未満、約６．５未満、約６未満、約５．５未満、約５未満、約４．５未満、約４未満、約３．５未満、約３未満、約２．５未満、または約２未満である。陰極１４２の近位にある槽１３２内の緩衝液は、ｐＨが高く（即ち、塩基であり）、本明細書では「陰極緩衝液」と称される。一般的には、陰極緩衝液のｐＨは、約７超、約７．５超、約８超、約８．５超、約９超、約９．５超、約１０超、約１０．５超、約１１超、約１１．５超、または約１２超である。

好適な陽極緩衝液の例としては、ギ酸、リン酸、アスパラギン酸、またはこれらの組み合わせが挙げられる。一実施形態では、陽極緩衝液は、酸を約５０ｍＭ〜５００ｍＭ、一般的には、酸を約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１５０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、または約２５０ｍＭ以上、且つ約２５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下含む。より詳細な実施形態では、陽極緩衝液は、リン酸を約５０ｍＭ〜５００ｍＭ、一般的には、リン酸を約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１５０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、または約２５０ｍＭ以上、且つ約２５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下含む。一実施形態では、陽極緩衝液は、イミノ二酢酸などの陽極安定剤を含むことができる。一実施形態では、陽極緩衝液は、安定剤、例えば、イミノ二酢酸を約５０ｍＭ〜５００ｍＭ含み、一般的には、安定剤、例えば、イミノ二酢酸を約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１５０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、または約２５０ｍＭ以上、且つ約２５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下含む。

好適な陰極緩衝液の例としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸ナトリウム、リシン、炭酸カリウム、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態では、陰極緩衝液は、塩基を約５０ｍＭ〜５００ｍＭ、一般的には、塩基を約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１５０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、または約２５０ｍＭ以上、且つ約２５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下含む。一実施形態では、陰極緩衝液は、水酸化ナトリウムを約５０ｍＭ〜５００ｍＭ、一般的には、水酸化ナトリウムを約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１５０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、または約２５０ｍＭ以上、且つ約２５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下含む。より具体的な実施形態では、陽極緩衝液は、酸を約０．０１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、または酸を約０．０１％ｖ／ｖ以上、約０．０５％ｖ／ｖ以上、約０．１％ｖ／ｖ以上、約０．５％ｖ／ｖ以上、且つ約０．５％ｖ／ｖ以下、約１％ｖ／ｖ以下、約５％ｖ／ｖ以下含む。一実施形態では、陰極緩衝液は、塩基を約０．０１％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、または約０．０１％ｖ／ｖ以上、約０．０５％ｖ／ｖ以上、約０．１％ｖ／ｖ以上、約０．５％ｖ／ｖ以上、且つ約０．５％ｖ／ｖ以下、約１％ｖ／ｖ以下、約５％ｖ／ｖ以下含む。幾つかの実施形態では、陰極緩衝液は、陰極安定剤、例えば、アルギニンを含む。一実施形態では、陽極緩衝液は、アルギニンなどの安定剤を約１００ｍＭ〜５００ｍＭ含み、一般的には、アルギニンなどの安定剤を約５０ｍＭ以上、約１００ｍＭ以上、約１５０ｍＭ以上、約２００ｍＭ以上、または約２５０ｍＭ以上、且つ約２５０ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約３５０ｍＭ以下、約４００ｍＭ以下、約４５０ｍＭ以下、または約５００ｍＭ以下含む。ｃＩＥＦの操作中、陽極と陰極と１４１、１４２の間の分離チャンバ内にｐＨ勾配が形成される。

任意の好適な電源装置をｃＩＥＦに使用することができる。一般的には、電圧約１ｋＶ〜約５０ｋＶの高電圧ｄｃ電源装置、例えば、電圧約１ｋＶ以上、約５ｋＶ以上、約１０ｋＶ以上、約１５ｋＶ以上、約２０ｋＶ以上、および約２５ｋＶ以上および／または約２０ｋＶ以下、約２５ｋＶ以下、約３０ｋＶ以下、約３５ｋＶ以下、約４０ｋＶ以下、約４５ｋＶ以下、または約５０ｋＶ以下の電源装置を使用する。発生する電界は、一般的には、約３００Ｖ／ｃｍ以上、約３２５Ｖ／ｃｍ以上、約３５０Ｖ／ｃｍ以上、約３７５Ｖ／ｃｍ以上、且つ約４００Ｖ／ｃｍ以下、約４２５Ｖ／ｃｍ以下、約４５０Ｖ／ｃｍ以下、約４７５Ｖ／ｃｍ以下、約５００Ｖ／ｃｍ以下、約５２５Ｖ／ｃｍ以下、約５５０Ｖ／ｃｍ以下、約５７５Ｖ／ｃｍ以下、または約６００Ｖ／ｃｍ以下である。

一実施形態では、ｃＩＥＦ装置は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｐ／ＡＣＥ ＭＤＱ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｔｅｒｔｏｎ，ＣＡ）である。

一般的に、ｃＩＥＦは、
１．試料調製；
２．分離チャンバへの試料の導入；
３．印加電圧を印加した分離チャンバ内での試料のフォーカシング；
４．フォーカシングされた試料の分離チャンバからの泳動；および
５．フォーカシングおよび泳動された試料の検出および分析；
の５段階に細分することができる。

ｃＩＥＦプロセスを開発するとき、例えば、陽極緩衝液および陰極緩衝液の組成、分離チャンバの寸法および材料、両性担体、フォーカシング時間および電圧、泳動方法、試料濃度、ならびに他の添加剤の含有または除外を含む、幾つかのパラメータを変えてプロセス性能を改善することができる。

試料の調製
本明細書に記載のシステムおよび方法は、試料中の成分、例えば、除去された細胞培養培地中の宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）などの試料中のタンパク質の検出に使用することができる。本明細書で使用する場合、「除去された」細胞培養培地という用語は、目的の組換えタンパク質を除去した後の、精製プロセスからの細胞培養培地の素通り画分を指す。一実施形態では、試料は、組換えモノクローナル抗体細胞培養からの除去された細胞培養培地である。

タンパク質精製は、簡単な一段階の沈殿法から大規模な製造プロセスまで様々である。所望のレベルの純度を有する産生物を得るために２つ以上の精製工程を使用することが多い。多くの精製スキームには、何らかの形態のクロマトグラフィーが含まれる。異なる選択性を有する異なるクロマトグラフィー法で、生体分子の精製に強力な組み合わせを形成することができる。多くの精製プロトコルは、所望のレベルの産生物純度を達成するために２つ工程以上を必要とする。一般的には、精製プロトコルは、（１）標的産生物の単離および濃縮を行う捕捉段階；（２）バルク不純物の大部分を除去する中間精製；および（３）極微量の不純物を除去する最終精製（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）；の３つの段階を有する。細胞培養物から組換えタンパク質を精製した後、除去された（素通り）画分のＨＣＰを分析することができる。

タンパク質変性
それらの天然の形態では、タンパク質は様々な形状に折り畳まれており、コンパクトなものもあれば、細長いものもある。篩い分け媒体を通る天然タンパク質の移動速度は、従って、分子量の正確な測定というよりは、むしろそれらの相対的なコンパクトさの反映である。本明細書で使用する場合、「タンパク質変性」は、タンパク質分子の二次構造、三次構造または四次構造を変化させるタンパク質の構造中の任意の非共有結合的変化を指す。タンパク質を変性させると、移動度に対する構造の影響が無くなり、真の電荷／質量比に基づく分離が可能となる。変性により、多量体タンパク質中のサブユニットも分離され、大きく複雑な凝集体の分析が可能となる。さらに、大部分の天然タンパク質は、タンパク質分解酵素の作用に対する耐性がある。タンパク質変性により、タンパク質の構造が変化し、適切な基をタンパク質分解酵素に暴露させることができ、従って、タンパク質分解が増加する。従って、電気泳動の前にタンパク質分子を変性させることが多い。

タンパク質を変性させる多くの方法が知られており、それを本発明のシステムおよび方法に関して使用することができる。一般的な変性剤の一例には、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）もしくはデオキシコール酸ナトリウム（ＳＤＣ）のようなアニオン性界面活性剤、または、ＮＰ４０、ＴＷＥＥＮ ２０、もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｘのようなノニオン性界面活性剤などの洗剤がある。一般的には、タンパク質溶液を、界面活性剤濃度約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、一般的には、約０．１ｍＭ以上、約０．２ｍＭ以上、約０．３ｍＭ以上、約０．４ｍＭ以上、約０．５ｍＭ以上、約０．６ｍＭ以上、約０．７ｍＭ以上、約０．８ｍＭ以上、約０．９ｍＭ以上、または約１．０ｍＭ以上、且つ約１ｍＭ以下、約５ｍＭ以下、約１０ｍＭ以下、約１５ｍＭ以下、約２０ｍＭ以下、約２５ｍＭ以下、または約５０ｍＭ以下の界面活性剤と共にインキュベートすることによりタンパク質を変性させることができる。熱変性は、タンパク質を変性させる別の既知の方法である。一般的には、タンパク質を約５０℃以上、約５５℃以上、約６０℃以上、約６５℃以上、約７０℃以上、且つ約７５℃以下、約８０℃以下、約８５℃以下、および約９０℃の温度で、約１分間以上、約５分間以上、約１０分間以上、約１５分間以上、且つ約３０分間以下、約４５分間以下、または約６０分間以下、インキュベートすることによりタンパク質を変性させることができる。被験タンパク質および加熱の強さに応じて、熱変性は可逆的となることもあれば、または可逆的とならないこともある。試料溶液を酸と混合してｐＨ約２〜約３の酸溶液を形成することにより、試料中のタンパク質を変性させることもできる。好適な酸の例としては、グアニジン塩酸塩が挙げられるが、これに限定されるものではない。別の実施形態では、試料溶液を塩基と混合してｐＨ約８〜約１０の塩基溶液を形成することにより、試料中のタンパク質を変性させることができる。好適な塩基の例としては尿素が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに別の実施形態では、試料溶液を、２Ｍ〜５Ｍの濃度のＮａＣｌまたはＬｉＣｌなどの高い塩濃度を有する溶液と混合することにより、試料溶液中のタンパク質を変性させることができる。一実施形態では、塩は、等電点泳動を行う前にタンパク質から除去される（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより）。

ジスルフィド結合もタンパク質分解を妨げ得るため、既知の還元およびアルキル化プロセスを使用して、試料中のタンパク質の完全な変性を補助することもできる。「還元」という用語はジスルフィド結合の還元を指し、変性されたタンパク質をジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンクロライド（ＴＣＥＰ）、またはトリブチルホスフィン（ＴＢＰ）［他？］などの還元剤と共にインキュベートすることにより達成することができる。一般的には、還元剤を約０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、一般的には、還元剤を約０．１ｍＭ以上、約０．２ｍＭ以上、約０．３ｍＭ以上、約０．４ｍＭ以上、または約０．５ｍＭ以上、且つ還元剤を約１ｍＭ以下、約５ｍＭ以下、または約１０ｍＭ以下含有する溶液中でタンパク質試料をインキュベートすることにより、タンパク質を還元する。アルキル化は、チオールのアルキル化を指し、変性されたタンパク質をエチルマレイミド（ＮＥＭ）ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）、４−ビニルピリジン、またはヨード酢酸（ＩＡＡ）メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）などのアルキル化剤と共にインキュベートすることにより達成することができる。一般的には、タンパク質試料は、アルキル化剤を約１０ｍＭ〜５００ｍＭ、一般的には、アルキル化剤を約１０ｍＭ以上、約２０ｍＭ以上、約３０ｍＭ以上、約４０ｍＭ以上、または約５０ｍＭ以上、且つアルキル化剤を約１００ｍＭ以下、約２００ｍＭ以下、約３００ｍＭ以下、約４００以下、または約５００ｍＭ以下含有する溶液中でインキュベートされる。

消化
場合により、電気泳動の前に、試料中のタンパク質を消化することが望ましいことがある。多くのタンパク質消化方法が知られており、例えば、タンパク質分解が挙げられる。「タンパク質分解」という用語は、例えば、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよびこれらの組み合わせを含む、プロテアーゼ（またはタンパク質分解酵素）と称される酵素によるタンパク質の消化を指す。セリンプロテアーゼの例としては、トリプシンおよびキモトリプシンが挙げられる。システインプロテアーゼの例としては、パパインが挙げられる。他のプロテアーゼとしては、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｇｌｕ−ＣおよびＡｓｐ−Ｎが挙げられる。より具体的な実施形態では、試料中のタンパク質はトリプシンにより消化される。一実施形態では、タンパク質分解酵素は固体担体上に固定化されている。別の実施形態では、トリプシンは固体担体上に固定化されている。有利には、固定化トリプシンを極微量（低ｎＭまたはｎｇ）のタンパク質の消化に使用することができる。固体担体の例としては、ポリマー粒子、ガラス、膜、ゲルビーズ、ゾルゲル担体、多孔質シリコンマトリックス、多孔質モノリシック材料および磁性材料が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一般的には、タンパク質は、タンパク質含有試料溶液をプロテアーゼと共に、プロテアーゼ対タンパク質比約１：５以上、約１：１０以上、約１：１５以上、約１：２０以上、約１：２５以上、約１：３０以上、且つ約１：４０以下、約１：５０以下、約１：７５以下、または約１：１００以下でインキュベートすることにより消化される。固定化トリプシンでは、比はそれより高くてもよく、例えば１：１００より高くてもよい。一実施形態では、試料溶液をタンパク質分解酵素と共に約５時間〜２０時間、または約５時間以上、約１０時間以上、約１１時間以上、約１２時間以上、約１３時間以上、約１４時間以上、約１５時間以上、且つ約１５時間以下、もしくは約２０時間以下インキュベートする。一般的には、消化は、約２５℃以上、約３０℃以上、約３５℃以上、且つ約４０℃以下、約４５℃以下、または約５０℃以下の温度で行われる。

フォーカシング液の調製
「フォーカシング液」という用語は、本明細書で使用する場合、ｃＩＥＦ分離チャンバに導入される試料含有溶液を指す。フォーカシング液は、試料溶液と、例えば、両性担体（ＣＡ）、蒸留水もしくは脱イオン水などの不活性希釈剤、または他の添加剤を含む他の１種以上の成分との混合物を含むことができる。一実施形態では、試料溶液には除去された細胞培養培地が含まれる。

両性担体（ＣＡ）
一実施形態では、フォーカシング液は両性担体（ＣＡ）を含む。前述のように、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、Ｂｉｏ−ｌｙｔｅ（商標）（Ｂｉｏ Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、Ｓｅｒｖａｌｙｔ（商標）（Ｂｉｏｐｈｏｒｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）、およびＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡの４種の市販のＣＡがある。一般的に、フォーカシング液は、ＣＡを約０．１％〜約１０％含む。一実施形態では、フォーカシング液は、ＣＡを約０．１％以上、約０．２％以上、約０．３％以上、約０．４％以上、約０．５％以上、且つ約０．６％以下、約０．７％以下、約０．８％以下、約０．９％以下、または約１．０％以下含む。他の実施形態では、フォーカシング液は、ＣＡを約１％以上、約２％以上、約３％以上、約４％以上、約５％以上、且つ約６％以下、約７％以下、約８％以下、約９％以下、または約１０％以下含む。他の実施形態では、フォーカシング液は両性担体を含まない。

塩濃度
フォーカシング液を分離チャンバに導入する前に調節され得る別のパラメータには、イオン強度がある。「イオン強度」という用語は、溶液中のイオンの濃度を指す。ｃＩＥＦでは、例えば、約１００ｍＭ未満、約７５ｍＭ未満、約５０ｍＭ未満、約４０ｍＭ未満、約３０ｍＭ未満、約２０ｍＭ未満の低いイオン強度を有することが望ましいことがある。一般的に、塩濃度が上昇するにつれ、フォーカシング中にタンパク質の沈殿が生じるリスクが高くなる。例えば、試料溶液のイオン強度は、例えば、希釈、透析、ゲル濾過、限外濾過、および固相抽出（ＳＰＥ）（例えば、Ｚｉｐｔｉｐ（商標））を含む既知の脱塩プロセスにより調整することができる。

試料の希釈
一般的に、ｃＩＥＦを使用して十分な感度、フォーカシング、および泳動を達成するために、タンパク質当たり約０．１μｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約０．５μｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約１μｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約５μｇ／ｍＬ、タンパク質当たり約１０μｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約５０μｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約０．１ｍｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約０．５ｍｇ／ｍＬ以上、タンパク質当たり約１ｍｇ／ｍｌ以上、タンパク質当たり約５ｍｇ／ｍｌ以上、且つタンパク質当たり約１０ｍｇ／ｍｌ以下の最終濃度が望ましい。

望ましいタンパク質濃度を得るために、試料溶液１５を希釈剤と混合してフォーカシング液１０を形成した後、それを分離チャンバ１２０に導入することができる。一実施形態では、希釈剤は両性担体溶液であり、フォーカシング液は、１種以上の試料成分を含有する試料溶液と両性担体溶液を、例えば、試料溶液対両性担体溶液の比約５：１〜約１：５、約２：１〜約１：２、または約１．５：１〜約１：１．５、または約１：１で混合することにより調製される。別の実施形態では、試料溶液対両性担体の比は、約１００：１〜約１：１、または約６０：１〜約１：１、または約１００：１〜約１０：１であってもよい。別の実施形態では、フォーカシング液は、１種以上の被検成分を含有する試料溶液を脱イオン水などの不活性希釈剤と、試料溶液対希釈剤の比約５：１〜約１：５、約２：１〜約１：２、約１．５：１５〜約１：１．５、または約１：１で混合することにより調製される。

一実施形態では、タンパク質溶液は、ｃＩＥＦの前に、例えば、凍結乾燥法により濃縮される。

他の添加剤
ｃＩＥＦの完了時に、試料の成分は分離チャンバ内の狭いゾーンにフォーカシングされ、数百倍濃縮される。タンパク質をそれらのｐＩ点（正味電荷ゼロ）に高濃度で閉じ込めることにより、沈殿および／または凝集が生じる可能性が高くなり得る。従って、例えば、尿素、糖類、およびノニオン性または双性イオン性界面活性剤を含む、沈殿および／または凝集を低減する１種以上の添加剤をフォーカシング液中に含むことが望ましい場合がある。

一実施形態では、タンパク質の溶解性を改善するためにフォーカシング液中に尿素が含まれる。より具体的な実施形態では、尿素はフォーカシング液中に約０．１Ｍ〜約２０Ｍ、または約０．１Ｍ以上、約０．５Ｍ以上、約１Ｍ以上、且つ約５Ｍ以下、約１０Ｍ以下、約１５Ｍ以下、もしくは約２０Ｍ以下の濃度で含まれる。

試料添加
通常、フォーカシング液１０を分離チャンバ１２０に導入する前に、１種以上の前処理用洗浄液でチャンバ１２０の準備を行う。チャンバ１２０が共有結合性ポリマーコーティングを備える一実施形態では、フォーカシング液を導入する前に、分離チャンバ１２０を溶媒、例えば、極性有機溶媒などの有機溶媒５〜１０容量で洗浄する。「極性有機溶媒」という用語は、極性プロトン性溶媒と極性非プロトン性溶媒の両方を含む。本明細書で使用する場合、「極性プロトン性溶媒」という用語は、解離性水素を有する溶媒、例えば、酸素原子に結合した水素原子を含むアルコールを指す。「極性非プロトン性溶媒」という用語は、酸性水素を含有しない溶媒を指す。好適なアルコールの例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせなどの脂肪族アルコールが挙げられる。分離チャンバ１２０がコーティングされていない別の実施形態では、分離チャンバ１２０を、例えば、リン酸、ギ酸、アスパラギン酸もしくはこれらの組み合わせなどの陽極緩衝液；または、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、またはこれらの組み合わせなどの陰極緩衝液１０〜１５容量で洗浄することができる。必要に応じて、分離チャンバ１２０を、脱イオン水１０〜１５容量および／または分離液５〜１０容量で洗浄することができる。一般的には、分離チャンバ１２０の入口１２１で圧力を加えることにより、例えば、シリンジポンプを約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの圧力で使用することにより、または、分離チャンバ１２２の出口１２２で減圧することにより、例えば、約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの圧力で真空引きを行うことにより、前処理用流体を分離チャンバ内に流通させる。前処理用洗浄液の流量は、一般的には、約１μＬ／分以上、または約２μＬ／分以上、且つ約３μＬ／分以下、約４μＬ／分以下、または約５μＬ／分以下である。

分離チャンバ１２０の準備が整うと、フォーカシング液１０を導入することができる。２つの一般的に使用されている注入法には、流体力学的注入と動電学的注入が含まれる。流体力学的注入は、分離チャンバ１２０の両端間に約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの圧力差を印加することにより、即ち、入口１２１でシリンジまたは出口１２２で真空を使用することにより達成される。動電学的注入は、陽極緩衝液槽または陰極緩衝液槽１３１、１３２の一方の代わりに、フォーカシング液１０を収容する槽を一時的に使用し、一定時間、電圧の電源を入れることにより行われる。一実施形態では、通常、約１ｋＶ〜約５０ｋＶの電圧、例えば、約１ｋＶ以上、約５ｋＶ以上、約１０ｋＶ以上、約１５ｋＶ以上、約２０ｋＶ以上、および約２５ｋＶ以上、および／または約２０ｋＶ以下、約２５ｋＶ以下、約３０ｋＶ以下、約３５ｋＶ以下、約４０ｋＶ以下、約４５ｋＶ以下、または約５０ｋＶ以下の電圧を印加することにより、フォーカシング液１０を導入する。フォーカシング電圧は、一般的には、約３００Ｖ／ｃｍ以上、約３２５Ｖ／ｃｍ以上、約３５０Ｖ／ｃｍ以上、約３７５Ｖ／ｃｍ以上、且つ約４００Ｖ／ｃｍ以下、約４２５Ｖ／ｃｍ以下、約４５０Ｖ／ｃｍ以下、約４７５Ｖ／ｃｍ以下、約５００Ｖ／ｃｍ以下、約５５０Ｖ／ｃｍ以下、または約６００Ｖ／ｃｍ以下である。動電学的注入中、電圧は、一般的には、約１分間〜約３０分間、例えば、約１分間以上、約５分間以上、約１０分間以上、約１５分間以上、且つ約１０分間以下、約１５分間以下、約２０分間以下、約２５分間以下、または約３０分間以下印加される。注入圧力、注入電圧および／または注入時間を制御することにより、特定の導入試料量を制御することができる。

一実施形態では、分離チャンバ１２０に導入する前に、フォーカシング液１０を分離液と混合する。代替の実施形態では、分離チャンバ１２０にまず分離液を充填した後、フォーカシング液１０を分離チャンバ１２０に導入する。さらに別の実施形態では、分離チャンバ１２０に分離液を部分的に充填した後、フォーカシング液１０を注入し、その後、分離チャンバ１２０の残部に分離液を充填する。

フォーカシングチャンバ１２０に収容される試料混合物が均一になるように、十分量のフォーカシング液１０をフォーカシングチャンバ１２０に添加すべきである。一実施形態では、分離チャンバ１２０の内面１２５によって画定される容量以下の容量のフォーカシング液１０を分離チャンバ１２０に注入する。一実施形態では、分離チャンバの容量の約２５％〜約１００％、特に、分離チャンバの容量の約２５％以上、約３０％以上、約３５％以上、約４０％以上、約４５％以上、または約５０％以上、且つ約５０％以下、約７５％以下、約８０％以下、約８５％以下、約９０％以下、約９５％以下、または約１００％以下の容量のフォーカシング液１０を分離チャンバ１２０に注入する。一般的に、分離チャンバ１２０に導入されるフォーカシング液の容量は、チャンバの寸法により変わることになる。しかし、一般的に、約０．５μｌ以上または約１μｌ以上、約２μｌ以上、約３μｌ以上、約４μｌ以上、約５μｌ以上、約６μｌ以上、約７μｌ以上、約８μｌ以上、約９μｌ以上、または約１０μｌ以上、且つ、分離チャンバの寸法に応じて、約２μｌ以下、約３μｌ以下、約４μｌ以下、約５μｌ以下、約１０μｌ以下、約１５μｌ以下、約２０μｌ以下、または約２５μｌ以下の容量のフォーカシング液を分離チャンバ１２０に注入する。

フォーカシング
フォーカシング液１０を調製し、分離チャンバ１２０に導入した後、分離チャンバ１２０の第１の端部１２１を第１の緩衝液槽１３１（陽極緩衝液または陰極緩衝液のいずれかを収容する）に、および分離チャンバ１２０の第２の端部１２２を第２の緩衝液槽１３２（第１の緩衝液槽に使用されなかった陽極緩衝液または陰極緩衝液のいずれかを収容する）に接続した後、電界を印加することにより、フォーカシングを開始することができる。本明細書で使用する場合、「接続する」という用語は、分離チャンバ１２０の端部１２１、１２２が、各槽１３１、１３２と流体連通していることを意味する。「流体連通」という用語は、分離チャンバ１２０の端部１２１、１２２と、隣接する槽１３１、１３２との間を流体が自由に通過できることを意味する。一実施形態では、分離チャンバ１２０の各端部１２１、１２２を隣接する槽１３１、１３２内に存在する溶液に浸漬することにより、分離チャンバ１２０が第１の緩衝液槽１３１と第２の緩衝液槽１３２に接続される。

電界の影響を受けて、水素イオンは、陽極液を収容する槽から陰極液を収容する槽に向かって移動し始め、陰極液からの水酸化物イオンは逆方向に動き始め、両性担体によりｐＨ勾配が生じることになる。通常、約１ｋＶ〜約５０ｋＶのフォーカシング電圧、例えば、約１ｋＶ以上、約５ｋＶ以上、約１０ｋＶ以上、約１５ｋＶ以上、約２０ｋＶ以上、および約２５ｋＶ以上、および／または約２０ｋＶ以下、約２５ｋＶ以下、約３０ｋＶ以下、約３５ｋＶ以下、約４０ｋＶ以下、約４５ｋＶ以下、または約５０ｋＶ以下のフォーカシング電圧を使用する。フォーカシング電圧は、一般的には、約３００Ｖ／ｃｍ以上、約３２５Ｖ／ｃｍ以上、約３５０Ｖ／ｃｍ以上、約３７５Ｖ／ｃｍ以上、且つ約４００Ｖ／ｃｍ以下、約４２５Ｖ／ｃｍ以下、約４５０Ｖ／ｃｍ以下、約４７５Ｖ／ｃｍ以下、約５００Ｖ／ｃｍ以下、約５５０Ｖ／ｃｍ以下、または約６００Ｖ／ｃｍ以下である。

試料成分がフォーカシングされるまで、即ち、試料成分がそれらの各等電点および移動停止に対応するｐＨに達し、各成分がその等電点のｐＨに位置する狭いバンドに分離されるまでフォーカシング電圧を印加する。正味電荷が中性となる領域に各被検物質が移動すると、バンドの位置は一定になり、もはや経時的な変化が起こらなくなる。場合により、試料成分がフォーカシングされると、電圧低下が検出されることがある。

多くの要因がフォーカシング時間に影響を及ぼし得る。例えば、フォーカシング時間は、試料中の塩の濃度の影響を受ける可能性がある。塩の存在によりｐＨ勾配が狭くなる傾向があるため、一般的には、塩濃度が比較的高いと、フォーカシングプロセスが速くなる。あるいは、ＣＡの濃度が比較的高いと、または電圧が変化すると、フォーカシング速度が遅くなることがある。一般的には、フォーカシング時間は、約１分〜約１２０分、例えば、約１分間以上、約５分間以上、約１０分間以上、約１５分間以上、約２０分間以上、約２５分間以上、約３０分間以上、且つ約４０分間以下、約４５分間以下、約５０分間以下、約５５分間以下、約６０分間以下、約９０分間以下、および１２０分間以下の範囲である。比較的低い電圧から開始し、時間の経過と共に電圧を高くする、電圧勾配を使用することができる。

ｐＩは温度に依存し得るため、ｃＩＥＦ中の温度制御が重要な場合がある。一実施形態では、フォーカシングは、約０℃以上、約５℃以上、約１０℃以上、約１５℃以上、約２０℃以上、且つ２５℃以下、約３０℃以下、約３５℃以下、または約４０℃以下の温度で行われる。

泳動
試料溶液の成分をフォーカシングさせた後、それらを分離チャンバ１２０から泳動流出させる。一般的には、泳動は、流体力学的にまたは化学的に達成することができる。流体力学的泳動は、フォーカシングされたタンパク質を泳動させるために、圧力または減圧（一般的には、約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉ）のいずれかを使用する。化学的泳動は、陽極緩衝液または陰極緩衝液の化学組成を変化させ、その結果、ｐＨ勾配のシフトを生じさせて、フォーカシングされた試料成分を移動させることにより行われる。１つの一般的な化学的泳動法には、塩化ナトリウムなどの中性塩を陽極緩衝液および／または陰極緩衝液に添加することが含まれる。ナトリウムイオンは陽極側の泳動で非プロトンカチオンの役割を果たし、塩化物イオンは陰極側の泳動で非ヒドロキシルアニオンとして機能する。他の既知の化学的泳動プロセスでは、陽極緩衝液の代わりに陰極緩衝液を使用する（またはその逆も同様である）。泳動の方向（陽極または陰極のいずれか）は、被検成分の特性に応じて、例えば、被検物質の酸性特性により選択することができる。陰極泳動では、陰極緩衝液の代わりに、別のアニオンを含有する溶液を使用する。陽極泳動では、陽極緩衝液の代わりに、別のカチオンを含有する溶液を使用する。

本明細書に記載の新規な方法およびシステムでは、泳動緩衝液は、シースフロー緩衝液である。ｃＩＥＦ用の泳動緩衝液がＥＳＩに使用されるイオン化緩衝液とは別の溶液である従来のｃＥＩＦ−ＥＳＩ接続とは対照的に、ｃＩＥＦ用の泳動緩衝液とＥＳＩ用のイオン化緩衝液の両方の機能を果たす、兼用の「シースフロー緩衝液」を使用する。本明細書で使用する場合、「シースフロー緩衝液」という用語は、極性有機溶媒と有機酸とを含む溶液を指す。一般的には、シースフロー緩衝液は、極性有機溶媒を約２５％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、一般的には、極性有機溶媒を約２５％ｖ／ｖ以上、約３０％ｖ／ｖ以上、約３５％ｖ／ｖ以上、約４０％ｖ／ｖ以上、約４５％ｖ／ｖ以上、または約５０％ｖ／ｖ以上、且つ約５０％ｖ／ｖ以下、約５５％ｖ／ｖ以下、約６０％ｖ／ｖ以下、約６５％ｖ／ｖ以下、約７０％ｖ／ｖ以下、または約７５％ｖ／ｖ以下含む。本明細書で使用する場合、「極性有機溶媒」という用語は、極性プロトン性溶媒と極性非プロトン性溶媒の両方を含む。「極性プロトン性溶媒」という用語は、解離性水素を有する溶媒、例えば、酸素原子に結合した水素原子を含むアルコールを指す。「極性非プロトン性溶媒」という用語は、酸性水素を含有しない溶媒を指す。好適な極性プロトン性溶媒の例としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせを含む脂肪族アルコールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適な極性非プロトン性溶媒の例としては、アセトニトリルが挙げられる。一般的には、シースフロー緩衝液はまた、有機酸を約０．０１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、一般的には、有機酸約を０．０１％ｖ／ｖ以上、約０．０５％ｖ／ｖ以上、または約０．１％ｖ／ｖ以上、且つ約０．１％ｖ／ｖ以下、約０．５％ｖ／ｖ以下、または約１．０％ｖ／ｖ以下含む。一実施形態では、有機酸はカルボン酸である。カルボン酸は、１個以上のカルボキシル基を含み、一般式Ｒ−ＣＯＯＨを有する有機酸である。一実施形態では、Ｒ−はアルカンである。一実施形態では、カルボン酸のｐＫａは約３．５〜５．０である。好適なカルボン酸の例としては、ギ酸（ＨＣＯ_２Ｈ、ｐＫａ３．７５）、酢酸（ＣＨ_３ＣＯＯＨ、ｐＫａ４．７６）、エタン酸（ＣＨ_３ＣＯ_２Ｈ、ｐＫａ４．７）、およびプロパン酸（ＣＨ_３ＣＨ_２ＣＯ_２Ｈ、ｐＫａ４．９）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

一実施形態では、シースフロー緩衝液は、脂肪族アルコールを約２５％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、一般的には、脂肪族アルコールを約２５％ｖ／ｖ以上、約３０％ｖ／ｖ以上、約３５％ｖ／ｖ以上、約４０％ｖ／ｖ以上、約４５％ｖ／ｖ以上、または約５０％ｖ／ｖ以上、且つ約５０％ｖ／ｖ以下、約５５％ｖ／ｖ以下、約６０％ｖ／ｖ以下、約６５％ｖ／ｖ以下、約７０％ｖ／ｖ以下、または約７５％ｖ／ｖ以下含む。一実施形態では、シースフロー緩衝液は、メタノールを約２５％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、一般的には、メタノールを約２５％ｖ／ｖ以上、約３０％ｖ／ｖ以上、約３５％ｖ／ｖ以上、約４０％ｖ／ｖ以上、約４５％ｖ／ｖ以上、または約５０％ｖ／ｖ以上、且つ約５０％ｖ／ｖ以下、約５５％ｖ／ｖ以下、約６０％ｖ／ｖ以下、約６５％ｖ／ｖ以下、約７０％ｖ／ｖ以下、または約７５％ｖ／ｖ以下含む。別の実施形態では、シースフロー緩衝液は、アセトニトリルを約２５％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、一般的には、アセトニトリルを２５％ｖ／ｖ以上、約３０％ｖ／ｖ以上、約３５％ｖ／ｖ以上、約４０％ｖ／ｖ以上、約４５％ｖ／ｖ以上、または約５０％ｖ／ｖ以上、且つ約５０％ｖ／ｖ以下、約５５％ｖ／ｖ以下、約６０％ｖ／ｖ以下、約６５％ｖ／ｖ以下、約７０％ｖ／ｖ以下、または約７５％ｖ／ｖ以下含む。他の実施形態では、シースフロー緩衝液はまた、カルボン酸を約０．０１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、一般的には、カルボン酸を約０．０１％ｖ／ｖ以上、約０．０５％ｖ／ｖ以上、または約０．１％ｖ／ｖ以上、且つ約０．１％ｖ／ｖ以下、約０．５％ｖ／ｖ以下、または約１．０％ｖ／ｖ以下含む。より詳細な実施形態では、シースフロー緩衝液は、ギ酸を約０．０１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、一般的には、ギ酸を約０．０１％ｖ／ｖ以上、約０．０５％ｖ／ｖ以上、または約０．１％ｖ／ｖ以上、且つ約０．１％ｖ／ｖ以下、約０．５％ｖ／ｖ以下、または約１．０％ｖ／ｖ以下含む。より詳細な実施形態では、シースフロー緩衝液は、メタノールを約２５％ｖ／ｖ〜約７５％ｖ／ｖ、一般的には、メタノールを約２５％ｖ／ｖ以上、約３０％ｖ／ｖ以上、約３５％ｖ／ｖ以上、約４０％ｖ／ｖ以上、約４５％ｖ／ｖ以上、または約５０％ｖ／ｖ以上、且つ約５０％ｖ／ｖ以下、約５５％ｖ／ｖ以下、約６０％ｖ／ｖ以下、約６５％ｖ／ｖ以下、約７０％ｖ／ｖ以下、または約７５％ｖ／ｖ以下、およびギ酸を約０．０１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖ、一般的には、ギ酸を約０．０１％ｖ／ｖ以上、約０．０５％ｖ／ｖ以上、または約０．１％ｖ／ｖ以上、且つ約０．１％ｖ／ｖ以下、約０．５％ｖ／ｖ以下、または約１．０％ｖ／ｖ以下含む。

本明細書に記載の新規なシステムでは、ｃＩＥＦ分離チャンバ１２０の出口端１２２をエレクトロスプレーイオン化装置のエミッタ２１０の導入端２１１にオンラインで接続し、シースフロー緩衝液を使用して分離チャンバ１２０からエミッタ２１０への分離された試料成分の化学的泳動を達成する。本明細書で使用する場合、「接続」という用語は、ｃＩＥＦ分離チャンバの出口端１２２がエミッタ２１０と流体連通していることを意味する。一実施形態では、分離チャンバの出口端１２２をエミッタ２１０の入口端２１０に導入することにより、分離チャンバ１２０の出口端１２２をエミッタ２１０に接続する。

分離チャンバ１２０からの溶出液をイオン化液と混合する従来のｃＥＩＦ−ＥＳＩ接続とは対照的に、シースフロー緩衝液（前述の）を本発明の方法の泳動液として使用する。低流量のシースフローにより、有利には、従来の技術と比較して試料の希釈が低減する。

被検成分がフォーカシングされた状態を維持し、泳動工程の結果として拡散しないように、泳動中、適切な印加電圧を維持することが重要な場合がある。泳動の開始時に、電流は最初、フォーカシングの終了時に観測されるものと類似の低い値に、例えば、約１μＡ〜約１０μＡ、または約１μＡ以上、約２μＡ以上、約３μＡ以上、約４μＡ以上、約５μＡ以上、且つ約６μＡ以下、約７μＡ以下、約８μＡ以下、約９μＡ以下、もしくは約１０μＡ以下にとどまる。泳動が進行するにつれ、塩イオンがキャピラリーに入るため、電流は徐々に上昇し始める。塩イオンがカラム全体に存在する泳動の後半に、泳動の完了を示す急激な電流の上昇が起こり、例えば、約１０μＡ〜約２０μＡの増加が観測され得る。一実施形態では、フォーカシングされる被検物質は、泳動中、それらの相対的位置を維持する。

泳動中、電圧は、一般的には、約１ｋＶ〜約５０ｋＶ、例えば、約１ｋＶ以上、約５ｋＶ以上、約１０ｋＶ以上、約１５ｋＶ以上、約２０ｋＶ以上、および約２５ｋＶ以上、および／または約２０ｋＶ以下、約２５ｋＶ以下、約３０ｋＶ以下、約３５ｋＶ以下、約４０ｋＶ以下、約４５ｋＶ以下、または約５０ｋＶ以下に保たれる。電界は、一般的には、約３００Ｖ／ｃｍ以上、約３２５Ｖ／ｃｍ以上、約３５０Ｖ／ｃｍ以上、約３７５Ｖ／ｃｍ以上、且つ約４００Ｖ／ｃｍ以下、約４２５Ｖ／ｃｍ以下、約４５０Ｖ／ｃｍ以下、約４７５Ｖ／ｃｍ以下、約５００Ｖ／ｃｍ以下、約５５０Ｖ／ｃｍ以下、または約６００Ｖ／ｃｍ以下に保たれる。泳動にかかる時間は、一般的には、約１分〜約３０分、例えば、約１分間以上、約５分間以上、約１０分間以上、または約１５分間以上、且つ約２０分間以下、約２０分間以下、約２５分間以下、または約３０分間以下である。

エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）
ｃＥＩＦとＥＳＩの接続は、オンラインまたはオフラインで行うことができる。オンライン接続では、分離チャンバ１２０から泳動される溶液は、例えば、同軸シースフローインターフェイス、シースレスインターフェイスまたは液相接続部インターフェイスを使用して、エレクトロスプレーエミッタ２１０に直接供給される。オフライン接続法には、例えば、後で分析される分離チャンバ１２０から溶出する画分の回収が含まれる。

通常のｃＥＩＦ−ＥＳＩ接続では、分離チャンバからの溶出液を揮発性有機溶媒と混合してイオン化液２０を形成した後、それをエレクトロスプレーエミッタ２１０に導入する。図３を参照されたい。イオン化液の形成に使用される典型的な揮発性有機溶媒の例としては、メタノールおよびアセトニトリルが挙げられる。イオン化液はまた、例えば、Ｈ^＋、Ｎａ^＋、またはＫ^＋などのイオン化剤も含むことができる。

前述のように、分離チャンバ１２０からの溶出液をイオン化液と混合する従来のｃＥＩＦ−ＥＳＩ接続とは対照的に、同じシースフロー緩衝液をｃＥＩＦ用の泳動液とＥＳＩ用のイオン化液の両方として使用することができる。

図３に示すように、エレクトロスプレーエミッタ２１０は、通常、入口２１１と出口２１２とを有する細長い容器であり、出口２１２は直径の小さい孔２１３（即ち、約１μｍ〜約１０μｍ、約１μｍ〜約５μｍ、または約２μｍ〜約３μｍの孔）を有する。電源装置２５０は、エレクトロスプレーエミッタ２１０と対向電極２２０との間に電位を発生させる（通常、約１ｋＶ〜約１０ｋＶ、約２ｋＶ〜約６ｋＶ、または約３ｋＶ〜約４ｋＶ）を印加する。エミッタ２１０の電荷に対する同じ極性の表面電荷を有するイオン化液２０中のイオン間の反発が、エミッタ２１０の出口２１２へのイオンの移動を引き起こし、円錐を形成する（テイラーコーン２１４と称される）。反発力がイオン化液２０の表面張力より大きくなると、微細なエアゾールスプレーがエミッタ２１０の出口２１２から対向電極２２０に向かって放出される。液滴がエミッタ出口２１２と対向電極２２０との間の空間を横切る時、溶媒が蒸発する。通常、イオン化／蒸発プロセスは大気圧で行われる。

イオン化液はエミッタ２１０に、０．００１μｌ／分以上、約０．００５μｌ／分以上、約０．０１μｌ／分以上、約０．０５μｌ／分以上、約０．１μｌ／分以上、約０．５μｌ／分以上、且つ約０．１μｌ／分以下、約０．５μｌ／分以下、約１μｌ／分以下、約５μｌ／分以下、約１０μｌ／分以下、約５０μｌ／分以下、および約１００μｌ／分以下の流量で導入される。

エレクトロスプレー電圧は、約１ｋｖ〜約１０ｋｖであってもよい。キャピラリー出口とエミッタ先端との間の距離は、約１ｍｍ〜約２ｍｍであってもよい。エミッエター端部とＭＳ入口との間の距離は、約１ｍｍ〜約１０ｍｍであってもよい。エミッタのサイズは約２μｍ〜約２０μｍであってもよい。

試料溶液の成分をｃＩＥＦで分離した後、それらを質量分析法（ＭＳ）で分析することができる。ｃＩＥＦは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）をインターフェイスとして使用してＭＳに接続することができる。ペプチドおよび他のポリマーなどの熱的に不安定で高分子量の化合物をイオン化するために、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用することが多い。本明細書に記載の本発明は、ＣＩＥＦをＥＳＩ−ＭＳとオンラインで接続するシステムを提供する。

質量分析法
図４は、質量分析計３５０の基本的な構成要素を示すブロック図である。イオン源２００（前述のＥＳＩ）は、中性の試料分子がイオン化される場所である。質量分析器３００内で、イオンは印加電界を使用して加速され、それらの質量電荷比（ｍ／ｚ）により空間的にまたは時間的に分離される。

イオンを分離した後、それらを検出器４００で検出し、信号を解析するためにデータシステム６００に送信する。検出は、電荷または運動量に基づいて行うことができる。比較的古い装置では写真乾板を使用して各質量電荷比でのイオン存在量を測定した。現在使用されている大部分の検出器は、光電子倍増管と類似のコレクタを使用してイオン信号を増幅する。これらの増幅検出器としては、電子倍増管、チャンネルトロンおよびマルチチャンネルプレートが挙げられる。検出器は、その速度、ダイナミックレンジ、ゲイン、および幾何学的形態に関して選択される。単一のイオンを検出するのに十分な感度を有する検出器もある。例えば、宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の存在を判定するために、データベース検索によりデータ解析を行うことができる。

質量分析計は、通常、イオンが質量分析器３００内の他の分子と衝突する可能性を低減するように低い圧力を維持するための真空装置５００も有する。衝突によりイオンの反応、中性化、散乱、またはフラグメンテーションが起こる可能性があり、これは質量スペクトルに干渉するおそれがある。衝突を最小限に抑えるために、実験は、高真空条件で、通常は装置の幾何学的形態に応じて１０^−２〜１０^−５Ｐａ（１０^−４〜１０^−７ｔｏｒｒ）で行われる。

質量分析器の選択は、分解能、質量範囲、走査速度、および検出限界に依存する。各分析器は、非常に異なる操作特性を有し、装置の選択は重要なトレードオフを伴い、連続的であってもまたはパルス状であってもよい。一般的には、（１）磁場を使用し、それらの運動量に応じてイオンを分離する磁場偏向および二重収束型装置；（２）四重極電界を使用し、単一のｍ／ｚ値のイオンだけイオン源から検出器に通過させる透過四重極型；（３）四重極電界を使用して全てのｍ／ｚ値のイオンを蓄積した後、それらをｍ／ｚ値毎に順次不安定化させて質量スペクトルを得る四重極イオントラップ型；（４）フィールドフリー領域を通過する飛行時間に応じて、異なるｍ／ｚ値の加速されたイオンの分離を達成する飛行時間型（ＴＯＦ）質量分析計；および（５）磁性イオントラップに蓄積される異なるｍ／ｚ値のイオンに対応する一連の共鳴周波数のフーリエ変換を行うフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型（ＦＴＩＣＲ）質量分析計（ＦＴＭＳと称されることもある）；の５つの異なるタイプの質量分析計がある。本発明のシステムに関して、これらのタイプの質量分析計のいずれを使用してもよい。

ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ−ｖｅｌｏｓは、約３００℃のキャピラリー温度を含むことができる。ＭＳ１ Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析器は、分解能６０，０００であってもよい。ＭＳ１ Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析器のパラメータは、約３９５ｍ／ｚ〜約１８００ｍ／ｚの走査範囲を含むことができる。１２の最も強度の高いピークをＭＳ２（イオントラップ）に使用することができる。ＭＳ１ Ｏｒｂｉｔｒａｐ分析器のパラメータは、正規化された衝突を３５％含み得る。

本明細書で使用する場合、「約」という用語は、例えば、本発明の記載に使用される、組成物中の成分の量、濃度、容量、プロセス温度、工程所要時間、収量、流量、圧力、およびこれらの範囲を修飾するのに使用される。「約」という用語は、例えば、化合物、組成物、濃縮物、または使用製剤の製造に使用される通常の測定および操作手順により；これらの手順における不注意による過失により；本方法の実施に使用される出発物質または成分の製造、供給元、または純度の差異、および他の類似の考慮事項により；生じ得る数量のばらつきを意味する。「約」という用語はまた、特定の初期濃度を有する製剤または混合物の経年変化により異なる量、および特定の初期濃度を有する製剤または混合物の混合もしくは処理により異なる量も包含する。「約」という用語により修飾されている場合、本明細書に添付される特許請求の範囲は、このような均等物も含むものとする。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、特記しない限り、複数の指示対象を含む。「または」という用語は、概して、特記しない限り「および／または」を含む意味で使用されることにも留意されたい。

本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、「構成される」という句は、特定の作業を行うように、または特定の構成を採用するように構築または構成されているシステム、装置、または他の構造を表すことにも留意されたい。「構成される」という句は、「配置される」、「配置および構成される」、「構築および配置される」、「構築される」、ならびに「製造および配置される」等の、他の類似の句と互換的に使用することができる。

本明細書中の刊行物および特許出願は全て、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示す。刊行物および特許出願は全て、個々の刊行物または特許出願がそれぞれ参照により明確且つ個々に示されるのと同程度まで、参照により本明細書に援用される。

本願は、本発明の対象の改造または変形を包含するものとする。上記の説明は、説明を目的とし、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本明細書に記載の設計特徴のいずれか１つ以上を任意の特定の構成と任意の組み合わせで使用し得ることが容易に分かるはずである。成形プロセスの使用に関して、製造費用を実質的に増加させることなく、このような設計特徴を組み込むことができる。その組み合わせの数は記載できないほど多く、本発明は、本明細書に記載の任意の特定の例示的な組み合わせにより、またはそれらに限定されるものではない。本発明の対象の範囲は、添付の特許請求の範囲を参照し、このような特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲と共に決定されるべきである。

特記しない限り、試薬は全てＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。

実施例１：試料調製
ＢＳＡ消化物の調製
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）消化物（０．１ｍｇ／ｍＬ）を使用して、ｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムの再現性を評価した。ＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解し、９０℃で１０分間変性させた後、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（８ｍＭ）を用いて６５℃で１時間還元し、ヨード酢酸（ＩＡＡ）（２０ｍＭ）を用いて室温で３０分間暗所にてアルキル化することにより、標準的な還元およびアルキル化プロセスを行った。タンパク質を１２時間３７℃でトリプシンと共に、トリプシン：タンパク質比１：３０（ｗ／ｗ）でインキュベートすることにより消化を行った。カルボキシル官能化磁性マイクロスフェア（ＢｉｏＭａｇ（登録商標）Ｐｌｕｓ ｃａｒｂｏｘｙｌ、平均直径約１．５μｍ）は、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｉｓｈｅｒｓ，ＩＮ，ＵＳＡ）から購入し、カルボキシル官能化磁性マイクロスフェアの活性化およびトリプシンの固定化は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ ２０１１，１２１８，２００７−２０１１により記載されているように行った。

３種タンパク質混合物の調製
３種タンパク質混合物もｃＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳシステムの性能の評価に使用した。３種タンパク質混合物は、濃度が５０倍の範囲となるように調製し、７μＭ ＢＳＡ（０．５ｍｇ／ｍＬ）、０．７μＭチトクロームｃ（０．００９５ｍｇ／ｍＬ）、および１４０ｎＭミオグロビン（０．００２５ｍｇ／ｍＬ）を含有した。タンパク質混合物を１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ｐＨ８．０）に溶解し、９０℃で１０分間変性させた後、前述のようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いて標準的な還元およびアルキル化プロセスを行った。固定化トリプシンによる消化では、タンパク質溶液３０μＬをトリプシン固体化ビーズ２００μｇと共に３７℃で１０分間インキュベートした。消化物をＴｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍａｒｉｅｔｔａ，ＯＨ，ＵＳＡ）製のＮａｎｏ Ｐｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍにより脱イオン化した水で１：１希釈し、使用するために−２０℃で保存した。

除去された組換えヒトＩｇＧ細胞培養培地
組換えヒトＩｇＧは、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃにより、既知の細胞培養プロセスを使用して調製された。次いで、ＮＡｂ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびｐｒｏｔｅｉｎ Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）スピンカラムを使用して、組換えヒトＩｇＧを被検試料から除去した。簡潔に言えば、ｐｒｏｔｅｉｎ Ａスピンカラムを１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で平衡化させた。ＩｇＧ試料をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈して、カラムに添加した。逆転させることにより穏やかに混合して室温で１０分間インキュベートした後、素通り画分を回収し、平衡化させたｐｒｏｔｅｉｎ Ｌスピンカラムに直ぐに添加した。ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌカラムのインキュベートおよび混合を前述のように行った。ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌの素通り画分（除去された培養培地）を回収し、後で使用するために−８０℃で保存した。

ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ／Ｌカラムから得られた素通り画分（０．０４５ｍｇ／ｍＬ、５００μＬ）（前述の）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ濃縮機で乾燥した。乾燥した試料を、１Ｍ尿素を含む１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＮＨ_４ＨＣＯ_３）１００μＬに溶解し、９０℃で１０分間変性させた後、前述のようにジチオトレイトール（ＤＴＴ）およびヨード酢酸（ＩＡＡ）を用いて標準的な還元およびアルキル化プロセスを行った。変性したタンパク質５０μＬを固定化トリプシン磁性ビーズ４００μｇと共に３７℃で１０分間インキュベートすることにより消化を行った。消化物は、後で使用するために−２０℃で保存した。

実施例２：ｃＩＥＦ
この実施例に使用した装置は、Ｗｏｊｃｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１０，２４，２５５４−２５６０により記載されているキャピラリー電気泳動システムに基づいた。市販の直鎖ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）コーティングキャピラリー（内径５０μｍ、外形１５０μｍ、長さ５０ｃｍ、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｈｏｅｎｉｘ，ＡＺ）をｃＩＥＦ分離に使用した。キャピラリーの陽極端をギ酸（０．１％、ｐＨ２．５）に入れ、陰極端を０．３％水酸化アンモニウム（ｐＨ１１）に入れた。０．４％Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（３−１０）溶液（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で調製した試料をキャピラリーに充填したが、これは、その溶液をキャピラリーに２ｐｓｉで３分間通液することにより行った。この実験に使用した注入容量は、キャピラリー容量と等しかった。フォーカシング電圧を３６０Ｖ／ｃｍで１０分間印加した。

実施例３：ＥＳＩ
フォーカシング後、キャピラリーの陰極端をエレクトロスプレーインターフェイスのエミッタに挿入し（Ｗｏｊｃｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２０１０，２４，２５５４−２５６０）、シースフロー緩衝液がｃＩＥＦ用の化学的泳動液とエレクトロスプレーイオン化用のイオン化緩衝液の両方として使用されるように、シースフロー緩衝液を用いて化学的泳動を行った。メタノール５０％および０．０５％酢酸；メタノール５０％およびギ酸０．０５％；メタノール５０％およびギ酸０．１％；の３種のシースフロー緩衝液について調べた。ギ酸（ＦＡ）はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）から購入した。泳動中、電界を３３０Ｖ／ｃｍに保った。

図５は、３種のシースフロー緩衝液の電流プロファイルを表す。曲線ａは、シースフローに酢酸０．０５％を使用するｃＩＥＦの化学的泳動を示す。曲線ｂおよび曲線ｃは、それぞれ、ギ酸０．０５％およびギ酸０．１％をシースフロー緩衝液として使用したものである。メタノール５０％および酢酸０．０５％を用いた化学的泳動中、電流は低く、あまり変化しなかった。

対照的に、メタノール５０％とギ酸０．０５％、およびメタノール５０％とギ酸０．１％を用いた化学的泳動中、電流は増加した。ギ酸を０．１％用いた場合は、ギ酸を０．０５％用いた場合よりも迅速に電流が増加した。ギ酸の濃度が高い方が、泳動速度が速くなり、分離ウィンドウが狭くなるように見受けられる。分離中に蓄積され得るタンデム質量スペクトルの数が限定され得るため、場合により、短い分離ウィンドウは望ましくないことがある。分離ウィンドウを広くし、ペプチド数およびタンパク質シーケンスカバー率を増加させるために、次の実験では、メタノール５０％とギ酸０．０５％をシースフローとして使用した。

実施例４：データ取得および処理
質量分析実験は全て、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｖｅｌｏｓ装置（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器で３９５〜１９００ｍ／ｚの範囲にわたり分解能６０，０００（４００ｍ／ｚ）でＭＳフルスキャンを取得した。電荷状態≧２を有する１２の最も強度の高いピークを配列決定に選択し、正規化された衝突エネルギー３５％、活性化ｑ＝０．２５、活性化時間１０マイクロ秒、およびマイクロスキャン１でイオントラップ内でフラグメント化した。４５秒のウィンドウ内で２回以上フラグメンテーションに選択されたピークは、追加の４５秒では選択から除外した。

標準タンパク質試料では、生ファイルのデータベース検索は、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．２で、ＳＥＱＵＥＳＴ検索エンジンを用いてｉｐｉ．ｂｏｖｉｎ．Ｖ３．６８．ｆａｓｔａ（ＢＳＡおよびチトクロームｃ用）、ｅｑｕｉｎｅ．ｆａｓｔａ（ミオグロビン用）に対して行った。信頼度値で「高」として同定されたペプチドは、正の同定（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）と見なされた。

ＨＣＰ試料では、生ファイルをまずｍｇｆファイルに転送した。ｍｇｆファイルのデータベース検索は、ＭＡＳＣＯＴ検索エンジンを用いてＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｒｏｄｅｎｔに対して行った。Ｔｒａｎｓ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ＴＰＰ）４．４を使用して、ペプチド確率とタンパク質確率の両方とも０．９より高くなるようにデータベース検索結果をフィルタリングした。

ペプチド（２５±４）は高信頼度で同定され、３回繰り返し分析でのシーケンスカバー率は４４±６％となった。３つの実験でのペプチド強度も解析した。表１（下記）は、３回繰り返し実験で得られたスペクトルから抽出された５種類のペプチドのピーク強度を表す。ピーク強度の相対的標準偏差は３％〜８％の範囲であった。

表２（下記）は、３種のタンパク質の同定されたペプチドの数およびシーケンスカバー率を表す。分析により、５０倍過剰のＢＳＡの存在下で希釈ミオグロビン試料由来の１種以上のペプチドが一貫して同定された。

除去された抗体試料中の５３種のペプチドをタンデム質量分析法により同定した。これらのペプチドに関して、観測された移動時間と予測された等電点との間には単調であるが非直線的な関係がある（図６参照）。ｐＩ対１／（移動時間−オフセット）のプロットは、１１分のオフセットでは直線的である（ｒ＝０．９７）。このオフセットは、両性電解質がキャピラリーから流出し始めるのに必要な時間を反映する。逆の関係は正の化学的泳動を反映する。

Ｍａｓｃｏｔを用いてデータベース検索し、Ｔｒａｎｓ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ＴＰＰ，Ｖ４．４）を用いてフィルタリングした後、３回繰り返しＣＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ実験後、ペプチドレベルとタンパク質レベルの両方について０．９より高い確率で３７種のＨＣＰタンパク質を同定した。試料調製、消化およびＣＩＥＦ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を含む全分析時間は約４時間である。

Claims (133)

1. 試料中の１種以上の成分の同定分析を行う方法であって、
   ａ．キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）により前記試料中の１種以上の成分を分離する工程であって、前記試料と両性電解質緩衝液を分離チャンバに導入し、印加電圧を印加してフォーカシングする工程と；
   ｂ．極性有機溶媒約３０％〜約５０％および有機酸約０．０１％〜０．１％を含むシースフロー液を使用して、前記分離された成分を前記分離チャンバからイオン化装置に輸送する工程と；
   ｃ．前記試料成分をイオン化する工程と；
   ｄ．質量分析法（ＭＳ）により前記試料中の１種以上の成分の同定分析を行う工程と；
   を含む方法。
2. 前記シースフロー液が、前記分離チャンバ用の泳動液と前記イオン化装置用のイオン化液の両方の役割を果たす、請求項１に記載の方法。
3. 前記極性有機溶媒が、極性プロトン性溶媒および極性非プロトン性溶媒から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 前記極性プロトン性溶媒が、脂肪族アルコールを含む、請求項３に記載の方法。
5. 前記脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記極性非プロトン性溶媒がアセトニトリルを含む、請求項３に記載の方法。
7. 前記有機酸が、ギ酸、酢酸、エタン酸、プロパン酸、安息香酸、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
8. 前記有機酸のｐＫａが約４．０〜５．０である、請求項１に記載の方法。
9. 前記脂肪族アルコールがメタノールであり、前記有機酸がギ酸である、請求項５に記載の方法。
10. 分離する工程が：
    ａ．一定容量の前記試料と両性電解質緩衝液とを前記分離チャンバに導入する工程であって、前記分離チャンバがキャピラリーを含む工程と；
    ｂ．前記試料と両性電解質緩衝液を前記分離キャピラリー内で約５０ｋＶ以下のフォーカシング電圧を印加してフォーカシングする工程と；
    を含む、請求項１に記載の方法。
11. 前記フォーカシング電圧が約５ｋＶ〜約３０ｋＶである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記試料が、約３００Ｖ／ｃｍ〜約６００Ｖ／ｃｍの印加電界を印加してフォーカシングされる、請求項１０に記載の方法。
13. 前記印加電界が約３００Ｖ／ｃｍ〜約４００Ｖ／ｃｍである、請求項１０に記載の方法。
14. 前記試料が、約５０ｋＶ以下の泳動電圧を印加して前記イオン化装置に輸送される、請求項１に記載の方法。
15. 前記泳動電圧が約１ｋＶ〜約５０ｋＶである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記試料が、約３００Ｖ／ｃｍ〜約６００Ｖ／ｃｍの印加電界を印加して前記イオン化装置に輸送される、請求項１に記載の方法。
17. 前記試料が、約３００Ｖ／ｃｍ〜約３５０Ｖ／ｃｍの印加電界を印加して前記イオン化装置に輸送される、請求項１に記載の方法。
18. 前記試料が、流体力学的注入により前記イオン化装置に輸送される、請求項１に記載の方法。
19. 流体力学的注入が、前記分離チャンバの入口でシリンジを使用して約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの圧力を加えることを含む、請求項１８に記載の方法。
20. 流体力学的注入が、前記分離チャンバの出口で約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの真空引きを行うことを含む、請求項１８に記載の方法。
21. 前記分離キャピラリーが一定容量を有し、前記導入される試料の容量が前記キャピラリーの容量以下である、請求項１０に記載の方法。
22. 前記試料の容量が、前記キャピラリーの容量の約２５％〜約１００％である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記導入される試料の容量が約１μＬ〜２５μＬである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記試料が、１種以上の両性試料成分をそれぞれ約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ含む、請求項１０に記載の方法。
25. 前記分離キャピラリーが、フューズドシリカ（ＳｉＯ_２）キャピラリーを含む、請求項１０に記載の方法。
26. 前記キャピラリーが、ポリマーコーティングを備える、請求項２５に記載の方法。
27. 前記ポリマーコーティングが、ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）、メチルセルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項２６に記載の方法。
28. 前記両性電解質が、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）、Ｂｉｏｌｙｔｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）、Ｓｅｒｖａｌｙｔ（商標）、およびこれらの組み合わせから選択される両性担体（ＣＡ）を含む、請求項１０に記載の方法。
29. 前記両性電解質が、約１％〜約１０％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）を含む、請求項２８に記載の方法。
30. 前記両性電解質が、狭いｐＨ範囲の両性担体を含む、請求項２８に記載の方法。
31. 前記両性電解質が、広いｐＨ範囲の両性担体を含む、請求項２８に記載の方法。
32. 前記両性電解質が、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（１−３）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（５−８）、およびＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（３−１０）から選択されるＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）を含む、請求項２８に記載の方法。
33. 前記両性電解質が、約２％〜約８％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（３−１０）溶液を含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記試料を前記分離キャピラリーに導入する前に、前記試料中の１種以上の成分を消化する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
35. 前記試料中の１種以上の成分が、タンパク質分解酵素で消化される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記タンパク質分解酵素が、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項３５に記載の方法。
37. 前記試料中の１種以上の成分がトリプシンで消化される、請求項３５に記載の方法。
38. 前記トリプシンが固体担体上に固定化されている、請求項３７に記載の方法。
39. 前記固体担体が、ポリマー粒子、ガラス、膜、ゲルビーズ、ゾルゲル担体、多孔質シリコンマトリックス、多孔質モノリシック材料、磁性材料、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記試料中の１種以上の成分が、約３５℃〜約４０℃の温度で消化される、請求項３５に記載の方法。
41. 前記試料中の１種以上の成分が、前記試料を前記タンパク質分解酵素と共に約５時間〜約２０時間インキュベートすることにより消化される、請求項３５に記載の方法。
42. 前記試料中の１種以上の成分が、前記試料を前記タンパク質分解酵素と共に約１０時間〜約１５時間インキュベートすることにより消化される、請求項３５に記載の方法。
43. 前記試料中の１種以上の成分が、前記試料を前記タンパク質分解酵素と共に少なくとも約１２時間インキュベートすることにより消化される、請求項３４に記載の方法。
44. 前記試料が、消化後に水で希釈され、両性担体と混合されて、前記分離チャンバに導入される、請求項３４に記載の方法。
45. 前記試料が、水で、水対試料の比約２：１〜１：２で希釈される、請求項３５に記載の方法。
46. イオン化装置が、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）装置を含む、請求項１に記載の方法。
47. 前記試料が、生体分子の不均一混合物を含む、請求項１に記載の方法。
48. 前記試料が、組換えタンパク質除去細胞培養物を含む、請求項１に記載の方法。
49. １種以上の成分が、宿主細胞由来タンパク質を含む、請求項４８に記載の方法。
50. 前記試料が、組換えモノクローナル抗体除去細胞培養物を含む、請求項１に記載の方法。
51. １種以上の成分が、宿主細胞由来タンパク質を含む、請求項５０に記載の方法。
52. １種以上の成分がタンパク質を含み、前記方法が前記分離チャンバに試料を導入する前に前記試料中のタンパク質を変性させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
53. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、熱変性を含む、請求項５２に記載の方法。
54. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料溶液をノニオン性界面活性剤と共にインキュベートすることを含む、請求項５２に記載の方法。
55. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料を塩基と混合してｐＨ約８〜約１０の塩基性溶液を形成することを含む、請求項５０に記載の方法。
56. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料を酸と共にインキュベートして、ｐＨ約２〜約３の酸性溶液を形成することを含む、請求項５２に記載の方法。
57. 熱変性が、前記試料を約６０℃〜約８０℃の高温で少なくとも約５分間インキュベートすることを含む、請求項５３に記載の方法。
58. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料を、炭酸水素アンモニウムを含む変性液と共にインキュベートすることを含む、請求項５２に記載の方法。
59. 前記変性液が尿素をさらに含む、請求項５８に記載の方法。
60. 前記試料を還元液およびアルキル化液と共にインキュベートする工程をさらに含む、請求項５２に記載の方法。
61. 前記還元液が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、およびこれらの組み合わせを含む溶液から選択される、請求項６０に記載の方法。
62. 前記アルキル化液が、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、β−メルカプトエタノール、またはこれらの組み合わせを含む、請求項６０に記載の方法。
63. キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）と質量分析法（ＭＳ）をインターフェイスするシステムであって：
    ａ．液体試料中の１種以上の成分の分離およびフォーカシングを行うための分離チャンバを備えるｃＩＥＦ装置と；
    ｂ．前記分離チャンバにわたって電位を印加するための電圧電源装置であって、前記分離チャンバが試料と両性担体とを収容し、前記電位で前記試料中の１種以上の成分を分離およびフォーカシングする電圧電源装置と；
    ｃ．分離およびフォーカシングされた１種以上の成分を、前記ｃＩＥＦ装置の分離チャンバから、前記溶液をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）装置に供給するように構成されたエミッタに直接輸送するためのシースフロー液であって、極性有機溶媒約３０％〜約５０％および有機酸約０．０１％〜０．１％を含むシースフロー液と；
    ｄ．試料被検物質を分析するためのＭＳ装置と；
    を備えるシステム。
64. 前記極性有機溶媒が、極性プロトン性溶媒および極性非プロトン性溶媒から選択される、請求項６３に記載のシステム。
65. 前記極性プロトン性溶媒が、脂肪族アルコールを含む、請求項６４に記載のシステム。
66. 前記脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項６５に記載のシステム。
67. 前記極性非プロトン性溶媒がアセトニトリルを含む、請求項６４に記載のシステム。
68. 前記有機酸が、ギ酸、酢酸、エタン酸、プロパン酸、安息香酸、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項６３に記載のシステム。
69. 前記有機酸のｐＫａが約４．０〜５．０である、請求項６３に記載のシステム。
70. 前記脂肪族アルコールがメタノールであり、前記有機酸がギ酸である、請求項６５に記載のシステム。
71. 前記ｃＩＥＦ装置が、陽極と、陰極と、陽極液槽と、陰極液槽とを備える、請求項６３に記載のシステム。
72. 前記陽極液槽が、酸を含む陽極液を収容する、請求項７１に記載のシステム。
73. 前記陽極液が、リン酸、ギ酸、アスパラギン酸、またはこれらの組み合わせを含む、請求項７２に記載のシステム。
74. 前記陰極液槽が、塩基を含む陰極液を収容する、請求項７１に記載のシステム。
75. 前記塩基が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項７４に記載のシステム。
76. 前記シースフロー液を前記陽極液槽および／または前記陰極液槽に導入して、前記フォーカシングされた試料成分を泳動させることを含む、請求項７１に記載のシステム。
77. 前記分離チャンバの一端を前記エミッタに接続するように構成されたインターフェイス接続デバイスを備える、請求項７１に記載のシステム。
78. 前記分離チャンバが陽極端を有するキャピラリーを備え、前記試料中の１種以上の成分のフォーカシングを行った後、前記キャピラリーの陽極端を前記エミッタの導入端に挿入して、前記フォーカシングされた成分を泳動させる、請求項７７に記載のシステム。
79. 前記シースフロー液が前記陰極液槽に導入される、請求項７８に記載のシステム。
80. 前記分離チャンバが陰極端を有するキャピラリーを備え、前記試料中の１種以上の成分のフォーカシングを行った後、前記キャピラリーの陰極端を前記エミッタの導入端に挿入して、前記フォーカシングされた成分を泳動させる、請求項７７に記載のシステム。
81. 前記シースフロー液が前記陽極液槽に導入される、請求項８０に記載のシステム。
82. 除去された細胞培養試料中の宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）成分を同定する方法であって、
    ａ．前記試料中の１種以上のＨＣＰ成分をキャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）により分離する工程であって、前記試料と両性電解質緩衝液が、入口端と出口端とを有するフューズドシリカキャピラリーを含む分離チャンバに導入され、前記１種以上のＨＣＰ成分が印加電圧を印加してフォーカシングされる工程と；
    ｂ．前記分離チャンバの出口端をエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）装置の入口端に接続する工程と；
    ｃ．前記分離されたＨＣＰ成分を前記分離チャンバから前記ＥＳＩ装置のエミッタに、極性有機溶媒約３０％〜約５０％および有機酸約０．０１％〜０．１％を含むシースフロー液を前記分離チャンバの入口端に導入することにより輸送する工程であって、前記シースフロー液が前記分離チャンバ用の泳動液と前記イオン化装置用のイオン化液の両方の役割を果たす工程と；
    ｄ．前記試料成分をイオン化する工程と；
    ｅ．質量分析法（ＭＳ）により前記試料中の１種以上の成分の同定分析を行う工程と；
    を含む方法。
83. 前記極性有機溶媒が、極性プロトン性溶媒および極性非プロトン性溶媒から選択される、請求項８２に記載の方法。
84. 前記極性プロトン性溶媒が、脂肪族アルコールを含む、請求項８２に記載の方法。
85. 前記脂肪族アルコールが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、イソプロピルアルコール、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項８４に記載の方法。
86. 前記極性非プロトン性溶媒がアセトニトリルを含む、請求項８３に記載の方法。
87. 前記有機酸が、ギ酸、酢酸、エタン酸、プロパン酸、安息香酸、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項８２に記載の方法。
88. 前記有機酸のｐＫａが約４．０〜５．０である、請求項８２に記載の方法。
89. 前記脂肪族アルコールがメタノールであり、前記有機酸がギ酸である、請求項８４に記載の方法。
90. 分離する工程が、前記試料と両性電解質緩衝液を前記分離キャピラリー内で約５０ｋＶ以下のフォーカシング電圧を印加してフォーカシングすることを含む、請求項８２に記載の方法。
91. 前記フォーカシング電圧が約５ｋＶ〜約３０ｋＶである、請求項９０に記載の方法。
92. 前記試料が、約３００Ｖ／ｃｍ〜約６００Ｖ／ｃｍの印加電界を印加してフォーカシングされる、請求項８２に記載の方法。
93. 前記印加電界が約３００Ｖ／ｃｍ〜約４００Ｖ／ｃｍである、請求項９２に記載の方法。
94. 前記試料が、約５０ｋＶ以下の泳動電圧を印加して前記イオン化装置に輸送される、請求項８２に記載の方法。
95. 前記泳動電圧が約５ｋＶ〜約４０ｋＶである、請求項９４に記載の方法。
96. 前記試料が、約３００Ｖ／ｃｍ〜約６００Ｖ／ｃｍの印加電界を印加して前記イオン化装置に輸送される、請求項８２に記載の方法。
97. 前記印加電界が約３００Ｖ／ｃｍ〜約３５０Ｖ／ｃｍである、請求項９６に記載の方法。
98. 前記試料が、流体力学的注入により前記イオン化装置に輸送される、請求項８２に記載の方法。
99. 流体力学的注入が、前記分離チャンバの入口でシリンジを使用して約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの圧力を加えることを含む、請求項９８に記載の方法。
100. 流体力学的注入が、前記分離チャンバの出口で約０．５ｐｓｉ〜約５０ｐｓｉの真空引きを行うことを含む、請求項９８に記載の方法。
101. 前記分離キャピラリーが一定容量を有し、前記導入される試料の容量が前記キャピラリーの容量以下である、請求項８２に記載の方法。
102. 前記試料の容量が、前記キャピラリーの容量の約２５％〜約１００％である、請求項１０１に記載の方法。
103. 前記導入される試料の容量が約１μＬ〜２５μＬである、請求項１０２に記載の方法。
104. 前記試料が、１種以上の両性試料成分をそれぞれ約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ含む、請求項８２に記載の方法。
105. 前記キャピラリーがポリマーコーティングを備える、請求項８２に記載の方法。
106. 前記ポリマーコーティングが、ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）、メチルセルロース、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１０５に記載の方法。
107. 前記両性電解質が、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）、Ｂｉｏｌｙｔｅ（商標）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）、Ｓｅｒｖａｌｙｔ（商標）、およびこれらの組み合わせから選択される両性担体（ＣＡ）を含む、請求項８２に記載の方法。
108. 前記両性電解質が、約１％〜約１０％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）を含む、請求項１０７に記載の方法。
109. 前記両性電解質が、狭いｐＨ範囲の両性担体を含む、請求項１０８に記載の方法。
110. 前記両性電解質が、広いｐＨ範囲の両性担体を含む、請求項１０８に記載の方法。
111. 前記両性電解質が、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（１−３）、Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（５−８）、およびＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（３−１０）から選択されるＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）を含む、請求項１０８に記載の方法。
112. 前記両性電解質が、約２％〜約８％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅ（商標）（３−１０）溶液を含む、請求項１１１に記載の方法。
113. 前記試料を前記分離キャピラリーに導入する前に、前記試料中の１種以上の成分を消化する工程をさらに含む、請求項８２に記載の方法。
114. 前記試料中の１種以上の成分がトリプシンで消化される、請求項１１３に記載の方法。
115. 前記トリプシンが固体担体上に固定化されている、請求項１１４に記載の方法。
116. 前記固体担体が、ポリマー粒子、ガラス、膜、ゲルビーズ、ゾルゲル担体、多孔質シリコンマトリックス、多孔質モノリシック材料、磁性材料、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１１５に記載の方法。
117. 前記試料中の１種以上の成分が、約３５℃〜約４０℃の温度で消化される、請求項１１３に記載の方法。
118. 前記試料中の１種以上の成分が、前記試料をタンパク質分解酵素と共に約５時間〜約２０時間インキュベートすることにより消化される、請求項１１３に記載の方法。
119. 前記試料中の１種以上の成分が、前記試料をタンパク質分解酵素と共に約１０時間〜約１５時間インキュベートすることにより消化される、請求項１１３に記載の方法。
120. 前記試料中の１種以上の成分が、前記試料をタンパク質分解酵素と共に少なくとも約１２時間インキュベートすることにより消化される、請求項１１３に記載の方法。
121. 前記試料が、消化後に水で希釈され、両性担体と混合されて、前記分離チャンバに導入される、請求項１１３に記載の方法。
122. 前記試料が、水対試料の比約２：１〜１：２で希釈される、請求項１２１に記載の方法。
123. １種以上の成分がタンパク質を含み、前記方法が前記分離チャンバに試料を導入する前に、前記試料中のタンパク質を変性させる工程を含む、請求項８２に記載の方法。
124. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、熱変性を含む、請求項１２３に記載の方法。
125. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料溶液をノニオン性界面活性剤と共にインキュベートすることを含む、請求項１２３に記載の方法。
126. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料を塩基と混合してｐＨ約８〜約１０の塩基性溶液を形成することを含む、請求項１２３に記載の方法。
127. 試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料を酸と共にインキュベートしてｐＨ約２〜約３の酸性溶液を形成することを含む、請求項１２３に記載の方法。
128. 熱変性が、前記試料を約６０℃〜約８０℃の高温で少なくとも約５分間インキュベートすることを含む、請求項１２４に記載の方法。
129. 前記試料中のタンパク質を変性させる工程が、前記試料を、炭酸水素アンモニウムを含む変性液と共にインキュベートすることを含む、請求項１２３に記載の方法。
130. 前記変性液が尿素をさらに含む、請求項１２９に記載の方法。
131. 前記試料を還元液およびアルキル化液と共にインキュベートすることをさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
132. 前記還元液が、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリブチルホスフィン（ＴＢＰ）、およびこれらの組み合わせを含む溶液から選択される、請求項１３１に記載の方法。
133. 前記アルキル化液が、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、メチルメタンチオスルホネート（ＭＭＴＳ）、β−メルカプトエタノール、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１３１に記載の方法。

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