JP7078228B2 - 検体の一段階のキャピラリ等電集束及び移動 - Google Patents
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Description
本出願は、35U.S.C. §119(e)の下で、2016年9月23日に出願された米国仮特許出願第62/399,267号に対する優先権を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金番号R01GM096767の下で政府援助によりなされた。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
Hjerten及びZhu(J. Chomatogr. 1985、346、265)により初めて示されたキャピラリ等電集束法(cIEF)は、タンパク質及びペプチド分析のための強力な方法であることが証明されている。cIEFは、典型的には、二段階プロセスとして行われ、集束(分離)段階の後に移動段階が続く。集束中、タンパク質又はペプチドは、その等電点(pI)に基づいて分離される。分離キャピラリ内で集束されたバンドを画像化するために、光学的検出が使用され得る。
自動化された化学的移動のためのサンドイッチ注入法に基づくキャピラリ等電集束(cIEF)システムが、本明細書において説明される。このシステムは、質量分析計(例えばイオントラップ又は飛行時間型質量分析計)への動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーインターフェースに結合された。ナノエレクトロスプレーエミッタは、酸性シース電解質を使用した。自動化された集束及び移動を実現するために、まず水酸化アンモニウムのプラグがキャピラリ内に注入され、続いて混合試料及び両性電解質のセクションが注入された。集束中、NH3H2Oセクションは、カソード電解質として機能した。集束が進行するにつれて、NH3H2Oセクションが、酸性シース緩衝液によってより低いpHの緩衝液まで滴定された。水酸化アンモニウムが酸性シース流動電解質により消費されると、化学的移動が自動的に開始し、次いで電解質は移動溶液として機能した。本開示において、NH3H2Oセクション及び試料の長さが最適化された。長さ1メートルのキャピラリにおいて、NH3H2Oセクションの比較的短いプラグ(3cm)は、急速な泳動及び妥当な分離分解能の両方をもたらした。自動化CIEF-MSシステムは、ミオグロビン及びシトクロムCに対して、3回の分離で8.5%のベースピーク強度相対標準偏差、及び0.6%以下の泳動時間相対標準偏差を生じた。
(a)アノード端及びカソード端を有する分離キャピラリで分離を行うステップであって、分離キャピラリのカソード端は、質量分析計における動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーエミッタに連結されている、ステップと;
(b)分離キャピラリのアノード端に、まずある長さのカソード電解質溶液を、次に両性電解質及び検体を含む混合物を部分的に充填するステップと;
(c)ナノエレクトロスプレーエミッタに、酸性シース電解質溶液及びアノード電解質溶液を供給するステップであって、アノード電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出することによりナノエレクトロスプレーエミッタ内に供給される、ステップと;
(d)分離キャピラリのアノード及びカソード端に電圧を印加するステップと;
(e)検体の等電集束、及びそれに付随する分離キャピラリのカソード端に向けた検体の化学的移動を誘発するステップと;
(f)ナノエレクトロスプレーを形成するステップであって、酸性シース電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出する混合物を包み込む、ステップと
を含み、カソード電解質溶液及びアノード電解質溶液によりpH勾配が確立されて、検体の等電集束を誘発し、酸性シース電解質溶液によってより低いpHにカソード電解質溶液が滴定されるにつれて、検体は化学的に移動され、次いで酸性シース電解質溶液により質量分析計に向けて動電学的にポンピングされ、それによって、電圧が印加された際にナノエレクトロスプレーを形成する、方法を提供する。
キャピラリ等電集束法において、検体は、集束段階中に分離される。検出及び単離されるには、検体は、検出点を通過して移動しなければならない。この分離プロセスは、集束段階に従う。キャピラリ電気泳動機器における検出点は、分離キャピラリの出口端部に向けて配置される。タンパク質又はペプチド混合物が、cIEFプロセスにおいてそのpIに従って分類されたら、個々の検体ゾーンは、検出点の前にキャピラリに沿って最低pIから最高pIまで分布する。したがって、検体ゾーンは、キャピラリ出口に向かって移動し、検出点を通過しなければならない(Agilent Technologies primer、5991-1660EN、T. Kristlらによる、Principles and Application of Capillary Isoelectric Focusing 2014を参照されたい)。この目的のために確立された手法が、化学的移動である。実際には、これは面倒な手動の二段階プロセスであった。
以下の定義は、本明細書及び特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために含まれる。本明細書において使用される場合、列挙された用語は、以下の意味を有する。本明細書において使用される全ての他の用語及び語句は、当業者により理解されているようなその通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Hawley’s Condensed Chemical Dictionary 第14版、R.J. Lewis著、John Wiley&Sons、New York、N.Y.、2001等の専門用語辞典を参照することにより得ることができる。
様々な実施形態において、一段階のキャピラリ等電集束(cIEF)及び化学的移動のための方法が開示され、方法は、
(a)アノード端及びカソード端を有する分離キャピラリで分離を行うステップであって、分離キャピラリのカソード端は、質量分析計における動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーエミッタに連結されている、ステップと;
(b)分離キャピラリのアノード端に、まずある長さのカソード電解質溶液を、次に両性電解質及び検体を含む混合物を部分的に充填するステップと;
(c)ナノエレクトロスプレーエミッタに、酸性シース電解質溶液及びアノード電解質溶液を供給するステップであって、アノード電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出することによりナノエレクトロスプレーエミッタ内に供給される、ステップと;
(d)分離キャピラリのアノード及びカソード端に電圧を印加するステップと;
(e)検体の等電集束、及びそれに付随する分離キャピラリのカソード端に向けた検体の化学的移動を誘発するステップと;
(f)ナノエレクトロスプレーを形成するステップであって、酸性シース電解質溶液は、分離キャピラリのカソード端から流出する混合物を包み込む、ステップと
を含み、カソード電解質溶液及びアノード電解質溶液によりpH勾配が確立されて、検体の等電集束を誘発し、酸性シース電解質溶液によってより低いpHにカソード電解質溶液が滴定されるにつれて、検体は化学的に移動され、次いで酸性シース電解質溶液により質量分析計に向けて動電学的にポンピングされ、それによって、電圧が印加された際にナノエレクトロスプレーを形成する。上記要素(a)~(f)の1つ又は複数は、様々な実施形態において、任意選択で方法から省略されてもよい。
(実験計画)
動電学的に付勢されるシース流動ナノスプレーに基づく自動化cIEF-MSは、集束及び移動を自動化するためにサンドイッチ注入法を使用した。図1に示されるように、キャピラリのカソード端は、cIEF-MSプロセス全体にわたりエレクトロスプレーエミッタに保持され、アノード端キャピラリは、PrinCEオートサンプラに固定された。手順の第1段階において、NH3H2Oのプラグをキャピラリ内に注入し、続いて試料及び両性電解質の混合物のプラグを注入した。次いで、キャピラリのアノード端を、cIEFのアノード電解質(0.1%ギ酸)のバイアル内に配置した。高電圧の印加により集束が開始され、NH3H2OプラグはcIEFのカソード電解質として機能した。集束後、アノード電解質とNH3H2Oセクションとの間でpH勾配が確立された。NH3H2Oの量は制限されているため、このセクションは、酸性シース電解質によって、より低いpH値に滴定される。NH3H2Oプラグの消費後に、化学的移動が自動的に開始した。
シトクロムC及びミオグロビンの混合物を使用して、タンパク質分離に対する異なる長さのNH3H2Oプラグの効果を調査した。図2は、同じ試料プラグ長さ(60cm)及び異なるNH3H2Oプラグ長さ(1cm、3cm、5cm、及び10cm)でのcIEF-MSにより生成された、シトクロムC及びミオグロビンのベースピーク電気泳動図を示す。長さ10cmのNH3H2Oプラグでは、構成成分は80分後に泳動し、分離は低い分解能を有し、信号強度は低かった。一方、長さ5cm、3cm、及び1cmのNH3H2Oプラグ長さで生成された電気泳動図は、同様の分離分解能をもたらし、泳動時間は、NH3H2Oプラグ長さに比例して減少した。長さ3cmのNH3H2Oプラグは、最高の信号強度を生成した。許容される泳動時間、良好な分離分解能、及び高い信号強度に起因して、長さ3cmのNH3H2Oプラグ長がその後の実験に選択された。
シトクロムC(pI10)、ミオグロビン(pI7)、ベータ-ラクトグロブリン(pI5.1)、及び炭酸脱水酵素(pI5.4)の混合物を使用して、タンパク質分離に対する試料プラグ長さの効果を調査した。図3は、3cmのNH3H2Oプラグ長さ並びに異なる試料プラグ長さ(50cm、60cm、及び80cm)でのcIEF-MSによる、4つのタンパク質のベースピーク電気泳動図を示す。より長い試料プラグは、より長い泳動時間及びより良好な分離分解能をもたらす傾向がある。我々はまた、より低いpI(5.1)値を有するベータ-ラクトグロブリンが、若干より高いpI値(5.4)を有する炭酸脱水酵素より速く泳動することに気付いた。このシフトは、ゾーン電気泳動の構成成分の分離を増大させる比較的長い化学的移動によりもたらされ得る。ベータ-ラクトグロブリンの分子量は18kDaであり、これは、炭酸脱水酵素の分子量(29kDa)よりはるかに小さい。より小さい分子量及び同様のpI値に起因して、ベータ-ラクトグロブリンは、おそらくはより小さいサイズ対電荷比を有し、炭酸脱水酵素より速く移動し、これによってこれらの2つのタンパク質の泳動順序が切り替わり得る。この混合モード分離は、cIEFにおけるこの形態の化学的移動の限界である。
シトクロムC及びミオグロビンの分離により、自動化cIEF-MSの再現性を調査した。図4は、自動化CIEF-MSによるシトクロムC及びミオグロビンの3回の分離のベースピーク電気泳動図を示す。ベースピーク強度のRSDは、8.5%である。泳動時間のRSDは、シトクロムCに対して0.3%、及びミオグロビンに対して0.6%である。これらの結果は、この自動化されたcIEF-MSの優れた再現性を十分に示している。
実験の項
(略語)
APS、過硫酸アンモニウム;cIEF、キャピラリ等電集束;DTT、ジチオスレイトール;FA、ギ酸;IAA、ヨードアセトアミド;LPA、直鎖ポリアクリルアミド;MS、質量分析。
アクリルアミド、過硫酸アンモニウム、ウシ心臓由来シトクロムc、ウマ骨格筋由来ミオグロビン、牛乳由来ベータ-ラクトグロブリン、ウシ赤血球由来炭酸脱水酵素、尿素、重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)、ジチオスレイトール(DTT)、ヨードアセトアミド(IAA)、及び3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートは、Sigma-Aldrich(St. Louis、MO)から購入した。ギ酸(FA)は、Fisher Scientific(Pittsburgh、PA)から購入した。メタノール及び水は、Honeywell Burdick&Jackson(Wicklow、アイルランド)から購入した。両性電解質(ファーマライト3-10)は、GE Healthcare(Piscataway、NJ、米国)から購入した。コーティングされていない溶融シリカキャピラリ(内径50μm/外径365μm)は、Polymicro Technologies(Phoenix、AZ)から購入した。
我々は、LPAコーティングキャピラリの調製のための単純で再現性のある方法を報告した(Zhuら、Talanta 2016、146、839)。2μL/分の流速でシリンジポンプを使用することにより、キャピラリを1M塩酸で30分間、水で10分間、1M水酸化ナトリウムで30分間、水で10分間洗浄し、最後にメタノールで30分間洗い流した。次いで、キャピラリを、窒素流下で、室温で4時間乾燥させた。次に、メタノール中50%(v/v)の3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートをキャピラリに10分間流して洗浄した。キャピラリの両端を封止し、充填されたキャピラリを室温で24時間インキュベートした。次いで、キャピラリをメタノールで20分間濯ぎ、窒素下で乾燥させた。40mgのアクリルアミドを1mLの水に溶解し、2μLの5%(w/v)過硫酸アンモニウム(APS)を500μLのアクリルアミド溶液に添加した。混合物を30秒間ボルテックスし、窒素を使用して5分間脱気した。次いで、混合物を長さ100cmの前処理されたキャピラリ内に真空により導入した。両端を封止し、キャピラリを50℃の水浴中で30分間インキュベートした。次いで、キャピラリを水で洗浄して過剰な試薬を除去し、使用まで室温で保存した。長さ約1mmのキャピラリの遠位端の外側を、HFで90分間エッチングし、エッチングされた部分の外径を約70μmまで低減したが、HFエッチングの詳細なプロトコルは、Sunら(Angew Chem Int Ed Engl. 2013、52、13661)により説明されている。
2mM酢酸アンモニウム(約pH6)緩衝液中に溶解したシトクロムc(0.05mg/mL、pI10)、ミオグロビン(0.15mg/mL、pI7)、ベータ-ラクトグロブリン(0.4mg/mL、pI5.1)及び炭酸脱水酵素(0.15mg/mL、pI5.4)を含有する標準タンパク質の混合物を、ダイナミックpHジャンクションに基づくCZE-MS/MS分析のために調製した。タンパク質の同じ混合物を、cIEF分析のためにxx g/mLの両性電解質と混合した。
上述のように調製されたポリアクリルアミドコーティングキャピラリ(内径50μm、長さ50cm)を、cIEF分離に使用した。PrinCEオートサンプラ(Prince Technologies B.V.、オランダ)を自動注入及び分離電圧制御に使用した。第三世代の動電学的に付勢されるシース流動CE-MSナノスプレーインターフェースを使用して、分離をLTQ-XL(Thermo Fisher Scientific)質量分析計に結合した。600~2000m/zにわたり完全MS走査が取得された。
Claims (22)
- 一段階のキャピラリ等電集束(cIEF)及び化学的移動のための方法であって、
(a)アノード端及びカソード端を有する分離キャピラリで分離を行うステップであって、前記分離キャピラリの前記カソード端は、質量分析計における動電学的にポンピングされたナノエレクトロスプレーエミッタに連結されている、ステップと;
(b)前記分離キャピラリの前記アノード端に、まずある長さのアルカリ溶液を、次に両性電解質及び検体を含む混合物を部分的に充填するステップと;
(c)前記ナノエレクトロスプレーエミッタに、酸性シース電解質溶液及びアノード電解質溶液を供給するステップであって、前記アノード電解質溶液は、C 1 ~C 8 カルボン酸を含む、ステップと;
(d)前記分離キャピラリの前記アノード端及び前記カソード端に電圧を印加するステップと;
(e)前記検体の等電集束、及びそれに付随する前記分離キャピラリの前記カソード端に向けた前記検体の化学的移動を誘発するステップと;
(f)ナノエレクトロスプレーを形成するステップであって、前記酸性シース電解質溶液は、前記分離キャピラリの前記カソード端から流出する前記混合物を包み込む、ステップと
を含み、前記アルカリ溶液及び前記アノード電解質溶液によりpH勾配が確立されて、前記検体の等電集束を誘発し、前記酸性シース電解質溶液によってより低いpHに前記アルカリ溶液が滴定されるにつれて、前記検体は化学的に移動され、次いで前記酸性シース電解質溶液により前記質量分析計に向けて動電学的にポンピングされ、それによって、電圧が印加された際にナノエレクトロスプレーを形成する、方法。 - 前記アルカリ溶液が、最初の充填後に、少なくとも1cmの前記分離キャピラリ内の長さを有し、前記分離キャピラリの内径が、300μm未満である、請求項1に記載の方法。
- 前記アルカリ溶液が、水酸化アンモニウムを含む、請求項2に記載の方法。
- 両性電解質及び検体を含む前記混合物が、最初の充填後に、少なくとも1cmの前記分離キャピラリ内の長さを有する、請求項2に記載の方法。
- 前記アノード電解質溶液が、ギ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記両性電解質が、pH単位当たりの緩衝能力、直線pH勾配、及び両性電解質にわたる均一な導電性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記両性電解質のpH単位当たりの前記緩衝能力が、pH3~10、pH3~6、pH5~8、又はpH7~10の範囲である、請求項6に記載の方法。
- 前記酸性シース電解質溶液が、化学的移動剤である、請求項1に記載の方法。
- 前記酸性シース電解質溶液が、ギ酸を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記酸性シース電解質溶液が、アルコール又はアセトニトリルをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 等電集束及び化学的移動のために印加される前記電圧が、50V/cm~500V/cmの範囲である、請求項1に記載の方法。
- 等電集束の後に、前記分離キャピラリの手動による物理的操作なしに化学的移動が自動的に続く、請求項1に記載の方法。
- 前記分離キャピラリが、ポリマーでコーティングされた内側表面を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリマーが、直鎖ポリアクリルアミド(LPA)を含む、請求項13に記載の方法。
- 前記分離キャピラリが、少なくとも10cmの長さを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記分離キャピラリの前記カソード端の先端の外径が、前記分離キャピラリの残りの外径に対して低減されている、請求項1に記載の方法。
- 前記分離キャピラリの前記カソード端の先端の外径が、前記分離キャピラリの内径より20%~50%大きい、請求項16に記載の方法。
- 前記検体が、タンパク質、又は薬物-タンパク質複合体を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記質量分析計により検出されたタンパク質、又は薬物-タンパク質複合体の電気泳動図のピークが、分解される、請求項18に記載の方法。
- 前記電気泳動図が、再現可能である、請求項19に記載の方法。
- 一段階のキャピラリ等電集束(cIEF)及び化学的移動のためのキットであって、(a)アルカリ溶液と、(b)アノード電解質溶液と、(c)酸性シース電解質溶液と、(d)両性電解質と、(e)請求項1に記載の方法に従って使用するための説明書とを備えるキット。
- 前記アルカリ溶液が、水酸化アンモニウムを含む、請求項21に記載のキット。
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