CN115541686B - 乳制品鉴别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种乳制品鉴别方法，具体涉及一种鉴别乳制品中乳成分来源的方法，更具体而言，涉及一种基于等电聚焦电泳技术对乳制品中的乳清来源进行鉴别的方法。与现有技术相比，本发明利用（毛细管）等电聚焦分析乳制品中的乳清来源，根据不同物种蛋白间的等电点差异，可灵敏的分辨出羊乳清产品中是否掺入牛乳清，反之亦然。通过乳清蛋白判定乳清来源的方法，不受羊乳清生产工艺过程中使用牛来源凝乳酶的干扰，有效解决了检测假阳性高的问题。同时，本发明提供的鉴定方法操作简单，检测效率高且成本较低，可规模化应用于实际生产及分析中。

Description

乳制品鉴别方法
技术领域
本发明属于检测或测量领域，涉及一种利用电泳原理的等电聚焦分析方法的应用，更具体而言，本发明涉及一种鉴别乳制品中乳成分来源的方法，更具体而言，涉及一种基于等电聚焦电泳技术对乳制品中的乳清来源进行鉴别的方法。
背景技术
开发与母乳成分更为接近的乳粉一直是婴幼儿配方乳粉研究领域的热点问题。母乳中的乳清蛋白与酪蛋白的含量比约为8比2，而在牛奶和羊奶中，乳清蛋白与酪蛋白的含量比约为2比8。
因此，在使用牛奶或者羊奶生产婴幼儿配方乳粉时，会额外加入乳清粉来调节蛋白比例。由于羊乳清的价格比牛乳清高，因此会有出现在羊乳清中掺入牛乳清以降低成本的行为，或者生产企业意外的使用了错误的原料，而该行为可能引起商业道德、食品安全甚至法律合规方面的问题。尤其地，这样的行为也可能与标识单一动物来源蛋白的（婴幼儿）配方乳粉产品中要求单一动物来源蛋白的原则相违背。因此需要开发一种鉴别方法用于判断乳制品（例如配方乳粉）中的乳清来源。
目前已有的鉴别方法有以下三种：
①《羊乳及其制品中牛和羊（山羊和绵羊）源性成分定性检测方法 （实时荧光PCR法和毛细管凝胶电泳法）》 团体标准，该方法通过酪蛋白来确定是否有羊奶掺杂牛奶，但是无法判别羊乳清蛋白中是否掺有牛乳清；
②SN/T 2980-2011动物产品中牛、山羊和绵羊源性成分三重实时荧光PCR检测方法，该方法通过不同来源的DNA片段特异性进行判别，但是由于在羊乳清的工业生产过程中往往使用牛来源的凝乳酶进行生产，导致该方法样品假阳性概率高，不能对产品真实性进行判断；
③蛋白组学的方法，该方法主要利用蛋白质组学对产品中酶解后的肽段进行序列分析，通过与数据库比对，判断肽段的来源，从而判断是否有掺假行为，该方法成本极高，推广困难，只能作为高端实验室的实验方法，而不适合于规模化分析检测。
另外，等电点（isoelectric point，pI）是蛋白质的最重要的理化性质之一，每一种蛋白质都有其特定的pI，其能反应蛋白质的空间结构、均一性以及功能性结构的变化，准确测定蛋白质的pI值在蛋白基础研究、蛋白质药物以及食品功能蛋白表征方面有着重要意义。毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing，cIEF）是等电聚焦技术中的一种，是一种根据蛋白质等电点不同而进行蛋白分离的技术，是蛋白质等两性分子分析最有力的工具之一。例如，
引用文献1利用等电聚焦电泳技术进行肉类品质品鉴，可以鉴别肉类品质的好坏，精确区分肉类的来源是属于放血屠宰还是溺亡或病死等非放血屠宰的家畜(禽)；
引用文献2利用毛细管等电聚焦方法快速测定蛋白混合物（例如复合抗体药物）中的各组分含量。
然而目前，利用等电聚焦技术判断或鉴定乳制品中的涉及乳清的可能来源的问题或方法尚未有过公开报道。
引用文献：
引用文献1：CN109916988A；
引用文献2：CN104764787A。
发明内容
发明要解决的问题
基于以上现有技术中存在的，例如无法便利的检测乳清蛋白的可能来源，或者难以准确判断羊乳清蛋白中是否掺有牛乳清、乳清来源判断假阳性高以及检测成本高等问题，本发明旨在提供一种乳制品中乳成分、尤其是乳清成分来源的鉴定方法，根据乳清蛋白（尤其是其中的乳白蛋白）美拉德反应产物的特性，利用（毛细管）等电聚焦分析法便利地判断乳制品中乳清成分的来源，尤其地，适合用来判断羊乳制品中是否掺有牛乳清成分。
用于解决问题的方案
本发明发现，可以通过以下的技术方案来解决上述技术问题：
[1]. 本发明首先提供了一种乳制品中乳成分、尤其是乳清成分来源的鉴定方法，其包括如下步骤：
提取的步骤，以提取所述乳制品中的乳清蛋白，从而得到含有乳清蛋白的成分（A）；
等电聚焦分析的步骤，对所述成分（A）进行等电聚焦，并在所述等电聚焦后检测光吸收数据，
所述检测光吸收数据包括检测：
i. 是否存在等电点（pI）在4.69~4.79光吸收信号和/或检测该信号的强度；或者
ii. 是否存在等电点（pI）在4.82±0.02或在pI=4.93±0.02光吸收信号和/或检测该信号的强度。
[2]. 根据[1]所述的鉴定方法，其中，所述提取的步骤中去除酪蛋白以得到所述成分（A）。
[3]. 根据[2]所述的鉴定方法，其中，所述成分（A）为包括乳清蛋白的水分散体系，并且，所述成分（A）中还去除了油脂和/或盐。
[4]. 根据[1]~[3]任一项所述的鉴定方法，其中，所述提取的步骤中采用等电点沉淀法、膜过滤法、吸附分离法中的一种或多种的联用。
[5]. 根据[1]～[3]任一项所述的鉴定方法，其中，所述等电聚焦分析前，还包括对所述成分（A）进行加热的步骤。
[6]. 根据[1]～[3]任一项所述的鉴定方法，其中，所述等电聚焦分析的步骤中，使用毛细管等电聚焦仪器进行分析，所述毛细管等电聚焦仪器中的毛细管内壁经过改性处理。
[7]. 根据[1]～[3]任一项所述的鉴定方法，其中，将所述等电聚焦在两性电解质以及任选的凝胶性成分、助溶剂、阳极稳定剂、阴极稳定剂中的一种或多种的存在下进行。
[8]. 根据[1]～[3]任一项所述的鉴定方法，其中，所述光吸收数据为紫外光吸收数据。
[9]. 进一步，本发明也提供了一种鉴别方法，所述方法用于：
鉴别源自于羊乳的产品中是否混入了源自于牛乳的成分；或
鉴别源自于牛乳的产品中是否混入了源自于羊乳的成分，
所述鉴别方法包括以上根据[1]～[8]任一项所述的鉴定方法。
[10]. 羊和/或牛的α-乳白蛋白及其酸性电荷异构体在鉴定乳制品中乳成分来源中的应用，所述鉴定的方法包括根据[1]～[8]任一项所述的鉴定方法。
发明的效果
通过以上技术方案的实施，与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：
（1）本发明利用（毛细管）等电聚焦分析乳制品中的乳清来源，根据不同物种蛋白间的等电点差异，可灵敏的分辨出羊乳清产品中是否掺入牛乳清，反之亦然。
（2）本发明提供的方法通过乳清蛋白判定乳清来源，不受羊乳清生产工艺过程中使用牛来源凝乳酶的干扰，有效解决了检测假阳性高的问题。
（3）本发明提供的鉴定方法操作简单，检测效率高且成本较低，可规模化应用于实际生产及分析中。
附图说明
图1：缓冲液盘的设置示意图。
图2：天然牛α-Lac的毛细管等电聚焦图谱，其中横坐标为时间单位Minutes，纵坐标为吸光度单位AU。
图3：天然牛β-Lg的毛细管等电聚焦图谱，其中横坐标为时间单位Minutes，纵坐标为吸光度单位AU。
图4：牛提取乳清蛋白的毛细管等电聚焦图谱，其中横坐标为时间单位Minutes，纵坐标为吸光度单位AU。
图5：羊浓缩乳清蛋白粉的毛细管等电聚焦图谱，其中横坐标为时间单位Minutes，纵坐标为吸光度单位AU。
图6：掺牛乳清的羊乳清粉的毛细管等电聚焦图谱，其中横坐标为时间单位Minutes，纵坐标为吸光度单位AU。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方式、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方式、实施例也包含在本发明的技术范围中。
除非另有说明，本发明术语具有如下含义。
在本发明中，使用“数值A~数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。
在本发明中，使用“以上”或“以下”表示的数值范围是指包含本数的数值范围。
在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。
在本发明中，使用“任选”或“任选地”表示某些物质、组分、执行步骤、施加条件等因素使用或者不使用。
本发明中，使用“D”表示分子量的单位“Dalton”，即“道尔顿”。
本发明中，使用“Lac”表示乳白蛋白，使用“Lg”表示乳球蛋白。
在本发明中，如没有特殊说明，所使用的“常温”通常指的23±2℃时的温度。
在本发明中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。
本发明中，使用“乳白蛋白”与“α-乳白蛋白”具有实质相同的含义。
本说明书中，术语“约”或“基本上”、“实质上”可以表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因前述测试装置或方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值与理论模型或理论数据的标准偏差在3%、优选为2%、更优选为1%范围以内。
在本发明中，所提及的“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素（例如，特征、结构、性质和/或特性）包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。
另外，除非另有定义，本发明所用的其他的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同含义。
本发明首要的提供了一种乳制品中乳成分、尤其是乳清的可能来源的鉴定方法，本发明的鉴定方法主要包括：提取的步骤，以提取所述乳制品中的乳清蛋白；以及等电聚焦分析的步骤，针对含有上述乳清蛋白的样品进行等电聚焦，并在所述等电聚焦后检测光吸收数据。
本发明主要是基于如下见解而得到：
不同物种表达的相同的蛋白质，由于其基因序列不同，蛋白质氨基酸组成也不一致。进一步，源自于牛与源自于羊的乳清蛋白中的α-乳白蛋白等电点不同（羊α-乳白蛋白pI=4.93±0.02，牛α-乳白蛋白pI=4.85～4.87）。
通常乳制品（例如乳粉）的加工会出于杀菌、分散、浓缩、造粒等原因而经历一次或多次的热经历。在这些热经历中，天然α-乳白蛋白经过加工后会发生美拉德反应，此时，α-乳白蛋白表面的赖氨酸被乳糖屏蔽，α-乳白蛋白会分裂出酸性电荷异构体，例如，会出现新的源自于羊的α-乳白蛋白酸性电荷异构体，其pI通常为4.82±0.02，新的源自于牛的α-乳白蛋白酸性电荷异构体，其pI通常为4.69～4.79。因此，若羊乳清中掺入牛乳清，（毛细管）等电聚焦电泳则会在pI=4.69~4.79之间，优选pI=4.70～4.77区域产生新的特异性峰，反之若牛乳清中掺入羊乳清，（毛细管）等电聚焦电泳则会在pI=4.82±0.02或pI=4.93±0.02区域产生新的特异性峰，因此，检测两个等电点之一的特异性峰出现的情况即可。
此外，经由大量实验，在测定了乳中全部类型蛋白的等电点后，已经发现只有酪蛋白（β-酪蛋白）的存在会在pI=4.75±0.02区域产生干扰，因此通过前处理沉淀残留酪蛋白，通过等电聚焦实验，可准确的识别出羊乳清中是否掺入牛乳清。
乳制品
本发明所针对的乳制品，原则上没有特别限制，从鉴定方法适用的普遍性角度考虑，本发明的乳制品可以为乳粉制品、液体乳制品或乳清制品。
对于乳粉制品，主要可以为婴幼儿配方奶粉、成人奶粉、针对特定人群如老年人群体的奶粉等。对于液体乳制品，主要可以为液体的牛乳或羊乳等。对于乳清制品，其主要可以为粉末状或固体状的乳清蛋白粉、液态的乳清蛋白等。
对于除了上述乳粉制品或乳清制品以外的其他的乳制品，在一些具体的实施方案中，所述乳制品还可以包括使用了乳清蛋白的奶酪（例如干酪）、酸奶、冷饮（例如冰激凌）、蛋白型功能性饮料等。
提取的步骤
进一步，对于上述的乳制品，在进行本发明的鉴定前，从提高检测准确性以及检测的便利性角度考虑，需要首先进行提取步骤的处理，以对乳清成分进行提取、分离或富集从而得到含有乳清蛋白的成分（A）。
在一些具体的实施方案中，所述富集可以为在需要时将乳清蛋白从所述乳制品中分离。可以列举包括，通过分离酪蛋白的方法从上述的乳粉制品、液体乳制品中分离出乳清蛋白。
对于从乳制品中分离酪蛋白的方法，本发明没有特别的限制，在一些具体的实施方案中，可以通过等电点沉积、膜过滤、吸附分离法（阳离子树脂交换）中的一种或它们的联用的方式去除酪蛋白以得到含有乳清蛋白的成分（A）。对于所述的分离酪蛋白，主要是分离其中的β酪蛋白。在一些优选的实施方案中，所述分离酪蛋白的过程中至少将90%（质量）以上、更优选为95%（质量）以上的β酪蛋白分离去除，典型的实施方案中，分离酪蛋白的过程中β酪蛋白实质上被全部分离去除。
在另外一些具体的实施方案中，上述分离过程除了分离所述酪蛋白以外，还可以根据任意的需要分离其他可能存在的成分，例如可能存在的乳糖、脂肪或盐等，对于这些成分的分离方法，本发明没有特别限定，可以依据本领域现有的分离方法进行。
进一步，对于本发明的上述含有乳清蛋白的成分（A），从后续检测提高精确性的角度考虑，可以在得到所述成分（A）后对其进行加热，对于加热的温度和时间没有特别限制，但通常可以为在30～60℃、优选为40～50℃的条件下加热10～60min，优选为加热20～40min，以提高美拉德反应的进行程度，从而使得标志性物质在相应的聚集处的特征峰更为明显。
在本发明一些具体的实施方案中，对于最终得到的含有乳清蛋白的成分（A）为一种乳清蛋白的水分散体系。
进一步，对于成分（A），其中的乳清蛋白主要成分包括α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、乳铁蛋白以及它们的美拉德反应异构体或变体等。
等电聚焦分析的步骤
在得到上述的成分（A）之后，本发明通过对其进行等电聚焦的方法进行分析以鉴定出其中所含的特征性成分或它们的相对大小。
等电聚焦分析的原理在于通过在一个由电场而形成的pH值梯度的检测区域中将具有不同pI的蛋白组分进行聚集（聚焦），进而通过对各个聚焦位置的光吸收信息进行处理，从而对对应的成分或其相对含量进行分析。
本发明对于等电聚焦分析所使用的设备和辅助材料原则上没有特别限制，可以从本领域现有的设备和辅助材料中进行合理选择。
对于检测设备，在本发明一些具体的实施方案中，本发明可以使用毛细管等电聚焦分析仪。所述毛细管等电聚焦分析中，将被分析的成分放置于具有电场的细管中。对于所述细管的尺寸，可以选用本领域通常规格的细管，可以列举的细管的内径为30～300μm，优选为40～200μm；有效长度为10～40cm，优选为15～25cm。另外，在一些优选的实施方案中，为了防止蛋白成分在细管内部进行粘连或吸附，可以在使用前，对细管内壁进行改性处理。对于改性处理的方法，没有特别限制，典型地，可以使用涂层涂覆。
对于毛细管等电聚焦分析仪，可以通过商购而获得，并且，可以列举的仪器包括Beckman PA 800 Plus（贝克曼公司）等。
进一步，对于可以使用的辅助材料，通常在进行等电聚焦测试时，可以与成分（A）一起混合而形成待测试体系，从而能够提高测试的精确度，尤其是可以得到较好的电场稳定性以及pH值稳定而有效的梯度分布。对于这样的辅助材料，可以包括两性电解质以及任选的凝胶性成分、助溶剂成分、阳极稳定剂、阴极稳定剂以及内标物等中的一种或多种。
对于两性电解质，可以作为载体而使用，其为是两性分子，能够在电泳中能达到一个平衡位置。通常需要具有良好的电导、（水）溶解性和缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。其良好的导电性有利于保持均匀的电场，足够的缓冲能力能够确保测试中形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它可能存在的电解质改变pH梯度，另外，从有利于最终测试的数据分析便利的角度考虑，这样的两性电解质具有较低的光吸收，尤其是紫外吸收特性以及较高的化学稳定性和化学惰性。
对于本发明具体可以使用的两性电解质，可以包括：AESlyte、Pharmalyte、Servalyt系列中的两种或多种电荷/酸碱性性质不同的物质，典型的可以使用PharmalytepH 3～10的两性电解质。
对于所述两性电解质的用量，没有特别限制，在本发明一些具体的实施方案中，其用量可以为所述待测试体系的3~6%（质量），优选4.8%（质量）。
对于所述凝胶性成分，在本发明一些具体的实施方案中，可以为水溶性高分子，例如聚乙二醇类、多糖类等，优选地，可以为聚乙二醇、甲基纤维素(MC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)或葡聚糖中的一种或多种，更优选为甲基纤维素。对于所述凝胶性成分的用量，没有特别限制，在本发明一些具体的实施方案中，其在所述待测试体系的浓度可以为0.1~0.3g/mL；优选为0.2~0.3g/mL；例如可以约为0.2g/mL、0.21g/mL、0.22g/mL、0.23g/mL、0.24g/mL、0.25g/mL、0.26g/mL、0.27g/mL、0.28g/mL、0.29g/mL、0.3g/mL等。
对于所述助溶剂成分，在本发明一些具体的实施方案中，可以使用尿素、甲酰胺、多元醇（包括甘油、乙二醇、丙二醇等）以及中性表面活性剂中的一种或多种，优选地，可以为尿素。对于助溶剂成分的用量，没有特别限制，在本发明一些具体的实施方案中，其在所述待测试体系中的浓度可以为1~3mmol/L；优选为2~3mmol/L；例如可以约为2mmol/L、2.1mmol/L、2.2mmol/L、2.3mmol/L、2.4mmol/L、2.5mmol/L、2.6mmol/L、2.7mmol/L、2.8mmol/L、2.9mmol/L、3mmol/L等。
对于阳极稳定剂、阴极稳定剂，本发明没有特别限制，在一些优选的实施方案中，对于阳极稳定剂可以使用亚氨基二乙酸，对于阴极稳定剂，可以使用精氨酸。更进一步地，所述亚氨基二乙酸在所述待测试体系中的浓度为1~2mmol/L；优选为1.3~2mmol/L；例如可以约为1.3mmol/L、1.4mmol/L、1.5mmol/L、1.6mmol/L、1.7mmol/L、1.8mmol/L、1.9mmol/L、2.0mmol/L等。所述精氨酸在所述待测试体系中的浓度为35~45mmol/L；优选为32~43mmol/L；例如可以约为32mmol/L、33mmol/L、34mmol/L、35mmol/L、36mmol/L、37mmol/L、38mmol/L、39mmol/L、40mmol/L、41mmol/L、42mmol/L、43mmol/L等。
对于内标物，没有特别限制，其可以为各种已知pI的化合物或多肽类小分子等电点标记物，这些标记物的pI的范围可以为2.0～7.0，优选3.0～5.0，例如可以为2 .85、3.21、3 .59、4.1、4 .22、4 .65、5 .12、5.5、5 .85、6 .14、6 .61。在本发明一些优选的实施方案中，可以组合使用不同pI的两种或以上的多种内标物。在一些具体的实施方案中，当使用多种内标物时，其中一种等电点标记物的等电点高于所有待分析蛋白，另一种等电点标记物的等电点低于所有待分析蛋白，例如可以同时包含pI值为3.21和pI值为5.5的等电点标记物，也可以同时包含pI值为4.1和pI值为5.5的等电点标记物。另外，对于这些标记物，可以通过商购获得，例如AB SCIEX公司提供的小分子等电点标记物或蛋白等电点标记物。
进一步，使用以上检测设备进行等电聚焦时，将包含所述（A）成分的所述待测试体系置于或者输送入电场区域（如上文所述细管内），所述电场区域可以由在所述电场区域两端布置的正极和负极通过施加电压来形成。对于所述正极和负极之间的电压，从检测效率的角度考虑通常可以为高压电压以下，在一些优选的实施方案中可以为15～32kV，更优选为20V～30kV。在该电场的作用下，电场区域内所述待测试体系中的两性电解质分别向不同的方向迁移以在所述电场区域内形成pH值的分布，进一步，待测体系中的蛋白质成分（如果有内标物，也包括这些内标物）在稳定的pH值场中逐渐在各自的等电点附近聚集。
对于等电聚焦的其他操作条件，原则上没有特别限定，例如所述等电聚焦操作可以在不超过40℃，优选在10℃～室温条件下进行，等电聚焦时间为10~35min。
此外，在本发明一些优选的实施方案中，在进行上述等电聚焦处理后可以进一步通过化学迁移液的使用而改变阳极中阳离子的浓度（升高pH），从而促使电场区域内的pH值梯度快速迁移，有利于异构体物质之间的有效分离。
检测光吸收数据
本发明中，在对成分（A）中的目标蛋白成分完成上述等电聚焦处理后，不同电荷性能的蛋白质在其对应的等电点处聚焦，进而，可以采用光源电场区域的检测器对光吸收数据进行检测。
在一些具体的实施方案中，所述光源为紫外光光源，可以列举的紫外光的波长可以为240～380nm，优选为250～300nm，典型地可以使用波长为约280nm的紫外光源。对于检测该光吸收数据的具体方式，没有特别限定，可以在电场区域（例如上述的细管）设置有透光性结构，以使得检测光束能够穿过所有出现了聚焦的位置。
对于上述光吸收数据，在一些具体的实施方案中，包括所述成分（A）的光吸收数据，也包括内标物的光吸收数据。
对于光吸收数据，可以通过光吸收强度图谱进行表征，出现紫外吸收峰表示该位置出现了物质的聚焦。
鉴定分析
在得到上述光吸收数据之后，可以通过对该数据的分析以确定成分（A）中是否含有源自于牛乳（乳清）或源自于羊乳（乳清）的成分。
具体而言，由于美拉德反应的影响，α-乳白蛋白会分裂出酸性电荷异构体，例如，在该现象中，会出现：
新的源自于羊的α-乳白蛋白酸性电荷异构体，其pI通常为4.82±0.02；和/或
新的源自于牛的α-乳白蛋白酸性电荷异构体，其pI通常为4.75±0.02。
因此，可以通过分析检测数据中上述pI对应的位置处是否出现光吸收峰而确定成分（A）中是否存在源自于牛乳（乳清）或源自于羊乳（乳清）的成分。具体而言，若羊乳清中掺入牛乳清，（毛细管）等电聚焦电泳则会在pI=4.69~4.79之间，优选pI=4.70～4.77之间对应的区域产生新的特异性峰，反之，若牛乳清中掺入羊乳清（毛细管）等电聚焦电泳则会在pI=4.82±0.02或pI=4.93±0.02对应的区域产生新的特异性峰。
例如，在一些优选的实施方案中，当鉴别羊乳制品中是否掺杂了牛乳成分时，如果检测羊乳制品的等电点图谱中，在pI值为4.7附近处（即pI=4.69~4.79之间处，优选pI=4.70～4.77之间处）的峰面积占pI值为4.9附近处（即pI=4.93±0.02之间处）的峰面积大于1%时，可以判定所述成分（A）中含有牛乳清成分。
进一步，本发明也提供一种用于乳制品，尤其是乳粉、乳清制品的鉴别方法，所述方法可用于：鉴别源自于羊乳的产品中是否混入了源自于牛乳的成分；或鉴别源自于牛乳的产品中是否混入了源自于羊乳的成分。
更进一步，本发明还提供羊和/或牛的α-乳白蛋白及其酸性电荷异构体在鉴定乳制品中乳成分来源中的应用，所述鉴定的方法包括上述利用等电聚焦分析乳制品中乳成分来源的鉴定方法。
实施例
以下将通过具体的毛细管等电聚焦分析实例对本发明做出进一步的说明。
1 试剂和材料
1.1 试剂
精氨酸：Sigma-Aldrich A5006；尿素：Sigma-Aldrich U0631；亚氨基二乙酸；两性电解质：Pharmalyte 3-10 carrier ampholytes CE Healthcare 17-0456-01；氨水；乙酸；磷酸（85wt%），Sigma-Aldrich；氢氧化钠（1M）：Sigma-Aldrich 72082。
1.2 试剂配制
占位剂。
阳极液（200 mM磷酸）：在干净的50 mL的容量瓶中加入30 mL去离子水，加入685 μL 85wt%的磷酸，加入去离子水定容至50 mL，震动使其充分混合后转入50 mL塑料瓶中，贴上标签并注明时间，室温下可储存30天。
阴极液（300 mM氢氧化钠）：在干净的50 mL的容量瓶中加入30 mL去离子水，加入15 mL 1 M的氢氧化钠，加入去离子水定容至50 mL，震动使其充分混合后转入50 mL塑料瓶中，贴上标签并注明时间，室温下可储存30天。
化学迁移液（100 mM NH3•H2O溶液）。
乙酸溶液（350 mM）：在干净的50 mL的容量瓶中加入30 mL去离子水，加入1.0 mL冰醋酸，加入去离子水定容至50 mL，震动使其充分混合后转入50 mL塑料瓶中，贴上标签并注明时间，室温下可储存30天。
阴极稳定液（500 mM精氨酸）：分析天平秤取0.87 g精氨酸，转移至10 mL容量瓶中，加入8mL去离子水，充分混合并震动使固体完全溶解，去离子水定容至10 mL，将溶液转移至10 mL塑料锥形管中，贴上标签并注明时间，室温下可储存30天。
阳极稳定液（200 mM亚氨基二乙酸）：分析天平秤取0.27 g亚氨基二乙酸，转移至10 mL容量瓶中，加入8 mL去离子水，充分混合并震动使固体完全溶解，去离子水定容至10mL，将溶液转移至10 mL塑料锥形管中，贴上标签并注明时间，室温下可储存30天。
尿素溶液（6 M尿素）：秤取18 g尿素转移至50 mL塑料锥形管中，加入30 mL 去离子水，震动最少15分钟使其充分溶解，用5 μm滤膜过滤，滤液收集到新的50 mL塑料锥形瓶中。贴上标签并注明时间，溶液可在4℃冰箱储存30天。
甲基纤维素溶液（1wt%）：将 15 mL 超纯水加热至约80℃，边搅拌边缓慢加入0.4g甲基纤维素粉末至热水中，并持续搅拌5分钟，将溶液从加热器中取出，加入冰水至终体积40 mL，然后混匀；冷却溶液至-20℃，每30分钟混合一次直至冰冻，将混合物于4-8℃下储存过夜。
尿素-胶溶液：秤取1.80 g 尿素转移至10 mL容量瓶中，加入6 mL 1wt%甲基纤维素溶液中，加入超纯水至终体积约9 mL，混合至尿素完全溶解后加入超纯水至终体积为10mL，4-8℃下储存过夜。
1.3 材料
pI 标记物：
pI 4.1：Trp-Asp-Asp-Arg；
pI 5.5：Trp-Glu-His；
pI 3.21：AES 100202。
涂层毛细管：Agilent SIL-FC。
 2 仪器配置
毛细管等电聚焦分析仪器型号：PA800 Plus；
检测器：UV（280nm）；
毛细管：Agilent  SIL-FC；50 μm内径；
毛细管有效长度/总长：20 cm / 30.2 cm；
窗口狭缝：2 # （200 μm × 100 μm）；
最大电流：20 μA；
毛细管温度：20℃；
样品温度：10℃。
预平衡方法：
表1：
分离方法：
表2：
缓冲液盘的设置：
如图1；其中，1为水；2为阴极液（300 mM氢氧化钠）；3为尿素溶液（6 M尿素）；4为尿素-胶溶液；5为乙酸溶液；6为废液；7为阳极液（200 mM 磷酸）；8为化学迁移液（100 mMNH3•H2O溶液）。
 3 样品处理方法
称取奶粉1 g，加入40℃温水30 mL，漩涡震荡5 min；若是液体奶则称取约30 g，用50%（v/v）乙酸溶液准确调整pH至4.5，定容至50 mL，摇匀，滤纸过滤，滤液经截留分子量3000K的超滤管超滤，上层浓缩液保留。
取浓缩液10 μL，加入：200 μL尿素-胶溶液、12.0 μL 3-10两性电解质、20.0 μL阴极稳定剂、2.0 μL阳极稳定剂和每个pI标准品2.0 μL（pI 3.21和pI 5.5，或者pI 4.1和pI5.5）。漩涡混匀后上机分析。
 4 数据处理方式
使用已知pI marker的电泳迁移时间为横坐标，已知等电点为纵坐标，绘制曲线。根据曲线计算未知蛋白的等电点。
 5 判定方式
当含有羊乳清蛋白的样品pI=4.7附近峰面积占pI=4.9附近峰面积超过1%时，判定其有牛乳清成分带入。
 6 实验结果
本实施例使用的奶粉样品的毛细管等电聚焦分析结果显示pI=4.7峰面积占pI=4.9峰面积的51%，证明该样品中有牛乳清成分带入。
 应用例：乳制品的毛细管等电聚焦分析
1 试剂和材料
同实施例。
2 仪器配置
同实施例。
3 样品处理
天然牛α-乳白蛋白（牛α-Lac）：Sigma公司，货号为L6010。
天然牛β-乳球蛋白（牛β-Lg）：Sigma公司，货号为L3908。
牛提取乳清蛋白：阿拉公司。
羊浓缩乳清蛋白粉：飞鹤乳业。
掺牛乳清的羊乳清粉：某市售品牌的羊乳清粉。
分别取上述样品各1 g，加入40℃温水30 mL，漩涡震荡5 min；若是液体则称取约30 g，用50%（v/v）乙酸溶液准确调整pH至4.5，定容至50 mL，摇匀，滤纸过滤，滤液经截留分子量3000K的超滤管超滤，上层浓缩液保留。在浓缩液中加入：200 μL尿素-胶溶液、12.0 μL3-10两性电解质、20.0 μL阴极稳定剂、2.0 μL阳极稳定剂和每个pI标准品2.0 μL（pI 3.21和pI 5.5，或者pI 4.1和pI 5.5）。漩涡混匀后上机分析。
4 分析结果
天然牛α-Lac的毛细管等电聚焦图谱如图2所示，可见其等电点约为4.85。天然牛β-Lg的毛细管等电聚焦图谱如图3所示，可见牛β-LgA等电点约为4.92，牛β-LgB等电点约为5.01。
牛提取乳清蛋白的毛细管等电聚焦图谱如图4所示，可见牛α-Lac发生美拉德反应后有明显的酸型变异体，牛α-Lac酸型变异体的等电点约为4.77。羊浓缩乳清蛋白粉的毛细管等电聚焦图谱如图5所示，可见羊α-Lac发生美拉德反应后也有明显的酸型变异体，且与牛不同，羊α-Lac酸型变异体的等电点约为4.84。
掺牛乳清的羊乳清粉的毛细管等电聚焦图谱如图6所示，可以发现其中有明显的牛α-Lac酸型变异体，其显示等电点约为4.71。可见，本发明提供的毛细管等电聚焦图分析方法可以有效鉴别掺入羊乳清中的牛乳清成分。
产业上的可利用性
本发明提供的用于鉴别羊乳清产品中掺杂牛乳清的方法可以在工业中使用。

Claims (9)

1.一种乳制品中乳成分来源的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取的步骤，以提取所述乳制品中的乳清蛋白，从而得到含有乳清蛋白的成分（A）；
等电聚焦分析的步骤，对所述成分（A）进行等电聚焦，并在所述等电聚焦后检测光吸收数据，
所述检测光吸收数据包括检测：
i. 是否存在等电点pI在4.69~4.79光吸收信号和/或检测该信号的强度；或者
ii. 是否存在等电点pI在4.82±0.02或在4.93±0.02光吸收信号和/或检测该信号的强度；
所述等电聚焦分析前，还包括对所述成分（A）进行加热的步骤，所述加热的温度为30～60℃。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述提取的步骤中去除酪蛋白以得到所述成分（A）。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述成分（A）为包括乳清蛋白的水分散体系，并且，任选地，所述成分（A）中还去除了油脂和/或盐。
4.根据权利要求1～3任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述提取的步骤中采用等电点沉淀法、膜过滤法、吸附分离法中的一种或多种的联用。
5.根据权利要求1～3任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述等电聚焦分析的步骤中，使用毛细管等电聚焦仪器进行分析，所述毛细管等电聚焦仪器中的毛细管内壁经过改性处理。
6.根据权利要求1～3任一项所述的鉴定方法，其特征在于，将所述等电聚焦在两性电解质以及任选的凝胶性成分、助溶剂、阳极稳定剂、阴极稳定剂中的一种或多种的存在下进行。
7.根据权利要求1～3任一项所述的鉴定方法，其特征在于，所述光吸收数据为紫外光吸收数据。
8. 一种鉴别方法，所述方法用于：
鉴别源自于羊乳的产品中是否混入了源自于牛乳的成分；或
鉴别源自于牛乳的产品中是否混入了源自于羊乳的成分，
所述鉴别方法包括根据权利要求1～7任一项所述的鉴定方法。
9.羊和/或牛的α-乳白蛋白及其酸性电荷异构体在鉴定乳制品中乳成分来源中的应用，所述鉴定的方法包括根据权利要求1～7任一项所述的鉴定方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101613408B (zh) * 2009-08-06 2013-06-05 浙江贝因美科工贸股份有限公司 乳清蛋白的分离和测定方法
WO2013067529A1 (en) * 2011-11-04 2013-05-10 Bio-Rad Laboratories, Inc. PROTEIN FRACTIONATION BASED ON pI
CN104764787B (zh) * 2013-11-28 2018-03-06 无锡药明康德生物技术股份有限公司 快速测定蛋白混合物中的各组分含量的毛细管等电聚焦方法
US10578580B2 (en) * 2016-09-23 2020-03-03 University Of Notre Dame Du Lac One-step capillary isoelectric focusing and mobilization of analytes
CN106645604B (zh) * 2016-10-10 2019-04-02 兰州大学 羊乳蛋白质组比对方法
CN108226263B (zh) * 2016-12-14 2022-03-08 沈阳三生制药有限责任公司 一种尿酸氧化酶的毛细管等电聚焦检测方法
CN108195917A (zh) * 2017-11-23 2018-06-22 西北农林科技大学 一种牛羊乳清粉混掺定性半定量检测鉴定方法
CN109916988B (zh) * 2019-03-21 2021-09-21 上海交通大学 一种基于等电聚焦电泳技术的肉类品质鉴定方法
CN114354814A (zh) * 2022-01-13 2022-04-15 青岛农业大学 一种用于检测羊乳制品中掺假牛乳的小分子标记物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李君文等.食品中的蛋白质交联技术.食品工业科技.2011,第32卷(第01期),第380-384页. *

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