CN106645604B

CN106645604B - 羊乳蛋白质组比对方法

Info

Publication number: CN106645604B
Application number: CN201610882667.8A
Authority: CN
Inventors: 翁秀秀; 李发弟; 乐祥鹏; 李万宏; 刘欣欣
Original assignee: Lanzhou University
Current assignee: Gansu Runmu Biological Engineering Co ltd
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2016-10-10
Publication date: 2019-04-02
Anticipated expiration: 2036-10-10
Also published as: CN106645604A

Abstract

本发明提供了一种羊乳蛋白质组比对方法，所述方法包括：a.奶样采集；b.溶液配制；c.脱脂乳蛋白样品的制备；d.样品蛋白质浓度测定：用BCA试剂盒，PBS为空白，以5.0mg/mL BSA为标准蛋白，在波长为560nm下用酶标仪上测定样品蛋白OD值，获得初乳脱脂乳蛋白样品和常乳脱脂乳蛋白样品的蛋白质浓度；e.二维凝胶电泳：依次经过等电聚焦电泳操作、胶条平衡、SDS‑PAGE垂直凝胶电泳和胶图采集与分析，得到所述初乳奶样和所述常乳奶样的2‑DE图谱。本申请提供的羊乳蛋白组比对方法，能够实现同时大量分析某一生物体系的蛋白组成，为系统揭示羊乳蛋白质组随泌乳阶段的变化规律提供理论依据。

Description

羊乳蛋白质组比对方法

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体而言，涉及一种羊乳蛋白质组比对方法。

背景技术

羊奶具有比牛奶更高的营养价值，与母乳成分更为相似，可以作为牛奶不耐受婴幼儿的良好乳源。

初乳是母畜分娩后1周、特别是3天内所分泌的乳汁。初乳中含有的蛋白质、脂肪和维生素等含量显著高于常乳，特别是初乳中含有比常乳更多的具有特殊功能的蛋白质，如免疫球蛋白、血液补体系统蛋白、急性期蛋白、具有直接抗菌作用的蛋白和多肽以及生物活性蛋白等。它们在促进幼畜胃肠道发育、抵抗病原体等方面具有重要的作用。

有研究发现，初乳中IgG、IgA、IgM和总蛋白含量活性很高，其含量随着产后时间的延长而急剧变化。然而这些研究都是采用传统的生物化学方法解析初乳和常乳的蛋白丰度变化，分析手段有限，缺乏从乳蛋白整体进行系统的研究。近年来，随着蛋白质组学研究方法和技术的发展，提供了一种从蛋白表达水平揭示生命活动规律的新思路，为系统研究乳蛋白提供了强有力的研究手段。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊乳蛋白质组比对方法。

通过构建绵羊乳蛋白质的双向电泳体系，建立一种基于2-DE技术鉴别绵羊初乳和常乳的方法，为系统揭示绵羊乳蛋白质组随泌乳阶段的变化规律提供理论依据。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种羊乳蛋白质组比对方法，所述方法包括：

a.奶样采集：随机选择多只胎次相同、预产期相近母羊，分别采集得到初乳奶样和常乳奶样，保存备用；

b.溶液配制：

使用尿素、硫脲、CHAPS和超纯水配制水化上样缓冲液；

使用尿素、SDS、Tris-HCl、甘油和超纯水配制胶条平衡缓冲液母液；

使用所述胶条平衡缓冲液母液，添加DTT配制胶条平衡缓冲液I；

使用所述胶条平衡缓冲液母液，添加碘乙酰胺配制胶条平衡缓冲液II；

使用低熔点琼脂糖、Tris、甘氨酸、SDS、溴酚蓝和超纯水配制低熔点琼脂糖封胶液；

使用丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺和超纯水配制质量分数为30％的聚丙烯酰胺溶液；

使用Tris碱、超纯水和盐酸配制1.5mol/L Tris-HCl缓冲液和1mol/LTris-HCl缓冲液；

使用SDS和超纯水配制质量分数为10％的SDS溶液；

使用APS和超纯水配制质量分数为10％的APS溶液；

使用Tris碱、甘氨酸、SDS和蒸馏水制备1×TBE电泳缓冲液；

使用所述10％的SDS溶液、溴酚蓝、50％甘油、DTT、Tris-HCl制备5×上样缓冲液；

使用乙醇、乙酸和加超纯水制备卡诺氏固定液；

使用考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、硫酸铵、磷酸和蒸馏水制备考马斯亮蓝G-250染色液；

c.脱脂乳蛋白样品的制备：将多只母羊的所述初乳奶样和所述常乳奶样分别等体积混合，离心后弃去漂浮的乳脂肪层，获得初乳脱脂乳蛋白样品和常乳脱脂乳蛋白样品，用离心管分装，-20℃冷冻保存备用；

d.样品蛋白质浓度测定：用BCA试剂盒，PBS为空白，以5.0mg/mLBSA为标准蛋白，在波长为560nm下用酶标仪上测定样品蛋白OD值，获得所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品的蛋白质浓度；

e.二维凝胶电泳：依次经过等电聚焦电泳操作、胶条平衡、SDS-PAGE垂直凝胶电泳和胶图采集与分析，得到所述初乳奶样和所述常乳奶样的2-DE图谱。

优选地，所述初乳奶样为母羊产后的第1d收集的奶样，所述常乳奶样为母羊产后的第14天收集的奶样，保存温度为-20℃。

优选地，所述步骤b具体为：

所述水化上样缓冲液：42g尿素，15.2g硫脲，4g CHAPS，用超纯水定容至100mL，分装，每管1mL，-20℃保存备用；

所述胶条平衡缓冲液母液：称取36g尿素与2g SDS，量取25mL 1.5mol/L pH为8.8的Tris-HCl以及20mL甘油，用超纯水定容至100mL，离心管分装，每管8mL，-20℃保存备用；

所述胶条平衡缓冲液I：取出冷冻的8mL胶条平衡缓冲液母液，待其融化后，添加0.16g DTT，混匀备用；

所述胶条平衡缓冲液II：取出冷冻的8mL胶条平衡缓冲液母液，待其融化后，添加0.20g碘乙酰胺，混匀备用；

所述低熔点琼脂糖封胶液：0.5g低熔点琼脂糖，0.303g Tris，1.44g甘氨酸，1mL10％SDS，100μL 1％溴酚蓝，用超纯水定容至100mL，充分搅拌，并加热充分溶解至澄清，分装，保存备用；

所述30％聚丙烯酰胺：称取150g丙烯酰胺与4g甲叉双丙烯酰胺，超纯水溶解，并定容至500mL，使用滤纸在通风厨中过滤后，装入棕色瓶，并于4℃保存；

所述1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：90.75g Tris碱，用400mL超纯水溶解，用1mol/L盐酸调pH至8.8，加超纯水定容至500mL，4℃冰箱保存备用；

所述1mol/L Tris-HCl缓冲液：12g Tris碱，用80mL超纯水溶解，用1mol/L盐酸调pH至6.8，加超纯水定容至100mL，4℃保存备用；

所述10％的SDS溶液：称取10g SDS，70mL超纯水使其充分溶解，并定容至100mL，室温保存备用；

所述10％的APS溶液：提前称取若干份0.1g APS，4℃保存；使用时，取出0.1g APS，加超纯水1mL，使其充分溶解；

所述1×TBE电泳缓冲液：称取30g Tris碱，144g甘氨酸以及10gSDS，加600mL蒸馏水，不断搅拌使其充分溶解，最后定容至1L，配置为10×TBE电泳缓冲液；使用之前，稀释10倍；

所述5×上样缓冲液：10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，500mMDTT，250mM pH为6.8的Tris-HCl，混匀后保存；

所述卡诺氏固定液：量取400mL乙醇与100mL乙酸，加超纯水定容至1000mL，室温保存备用；

所述考马斯亮蓝G-250染色液：称取1.2g考马斯亮蓝G-250溶于200mL无水乙醇中，称取100g硫酸铵溶于100mL磷酸中，待固体充分溶解后混合，并加蒸馏水定容至1000mL。

优选地，所述步骤d具体为：

(1)标准蛋白稀释：将5.0mg/mL BSA蛋白标准品用PBS稀释10倍，制成0.5μg/μLBSA蛋白液；

(2)样品稀释：将所述初乳脱脂乳蛋白样品稀释200倍，所述常乳脱脂乳蛋白样品稀释100倍；

(3)BCA工作液制备：按A试剂：Cu试剂＝50:1体积比配制，混匀备用；

(4)制作标准曲线：根据标准品的吸光值及对应的蛋白浓度，制作标准曲线；

(5)加样：取不同稀释倍数待测样品加入孔板；

(6)加工作液：各孔加入BCA工作液，振动晃匀，保温静置、充分显色；

(7)读吸光值：在酶标仪上于560nm波长处读取各样品吸光值；

(8)蛋白浓度计算：根据标准曲线以及待测样品的吸光值，计算出稀释后蛋白质的浓度，再根据样品稀释的倍数，计算出所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品的蛋白质浓度。

优选地，所述等电聚焦电泳操作为：

(1)取出保存的水化上样缓冲液母液，置室温溶解；室温缓慢溶解冷冻的所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品；

(2)在水化上样缓冲液母液中加入DTT和IPG buffer，并加入痕量溴酚蓝，混匀备用；

(3)取水化上样缓冲液，分别加入所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品，充分混匀，得到待测样品液；

(4)取出pH＝4～7的17cm IPG预制胶条，室温放置，待胶条解冻；

(5)将所述待测样品液沿着聚焦槽的边缘从左至右连贯加入，然后用镊子轻轻除去IPG胶条上面的保护膜；

(6)对好正、负极，将胶条胶面朝下轻轻置于样品溶液上；

(7)确保无气泡，在每根胶条上缓慢的滴加矿物油，防止水化过程液体的蒸发；对好正、负极，盖上聚焦盘盖，确保胶条与电极紧密接触；将等电聚焦盘置于等电聚焦电泳仪内，进行第一向等电聚焦，并设置聚焦程序。

进一步优选地，所述步骤(7)中，第一向等电聚焦中，一次聚焦的胶条数不超过8根，每根胶条的极限电流设置为50μA，聚焦温度设置为18℃。

优选地，所述胶条平衡为：

用蒸馏水冲洗胶条上的矿物油，用滤纸吸干；依次用胶条平衡缓冲液Ⅰ和胶条平衡缓冲液Ⅱ平衡处理聚焦好的胶条，平衡时间均为12min。

优选地，所述SDS-PAGE垂直凝胶电泳为：

(1)配制质量分数为12％的丙烯酰胺凝胶，将凝胶溶液注入灌胶器中，上面留出约1cm的空间，用无水乙醇封胶面，保持胶面平整；

(2)待凝胶凝固后，倒去无水乙醇，并用蒸馏水冲洗胶面；然后用滤纸吸去凝胶上方多余液体；

(3)处理好后，将凝胶板放在桌面上，长玻璃板在下面，短玻璃板在上面；用镊子夹住平衡好的胶条一端，并使胶面朝上放在长玻璃板上；用镊子缓慢向下推动胶条的塑料支撑膜，必要时滴加少量电泳缓冲液润滑，直至胶条与聚丙烯酰胺凝胶的胶面完全接触粘合，且接触面无任何气泡和杂质；

(4)将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解，待温度下降后，滴加于放有胶条的凝胶上方，并确保胶条底部无气泡存在；

(5)待封胶液充分凝固后，转移至电泳槽中，并检查漏液与否；

(6)向电泳槽内加入1×电泳缓冲液后，开启循环水浴；接通电源，设置电泳程序，进行电泳；

(7)电泳结束后，取出凝胶架，取下玻璃板；撬开两层玻璃，轻轻取出凝胶，切角标记；随后进行凝胶固定、考马斯亮蓝染色，最后用蒸馏水给凝胶脱色至背景清晰。

进一步优选地，所述步骤(6)中，电泳程序为：起始时用低电压50V，电泳约30min；再加大电压至200V，设置6h；待指示剂电泳至距离凝胶底部边缘约0.5cm时，停止电泳；所述步骤(7)中，凝胶固定的时间为3小时，考马斯亮蓝染色的时间为12小时。

优选地，所述胶图采集与分析为：

将光密度扫描仪光学分辨率设置为600dpi，扫描凝胶；将扫描获得的电泳图谱通过ACD See 5.0软件进行剪切，用PDQuest 8.0软件分析凝胶图谱的蛋白表达丰度及蛋白点数量，并使用Excel软件对差异蛋白点数量等进行统计分析。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)能够实现同时大量分析不同阶段的羊乳的蛋白组成；

(2)可操作性强、结果准确。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为湖羊初乳脱脂乳蛋白样品经双向凝胶电泳分离及染色后的图谱；

图2为湖羊常乳脱脂乳蛋白样品经双向凝胶电泳分离及染色后的图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例

a.奶样采集：

奶样采集于甘肃金昌市中天羊业湖羊养殖基地进行。湖羊待产母羊饲养管理水平一致，采用全混合日粮方式饲喂。其饲料配方为青贮40％，燕麦草12％，苜蓿10％，大麦草13％，豆渣10％，精料14％，矿物质等1％。精料为母羊配合饲料556(甘肃三洋金源农牧股份有限公司)，养分含量为水分13.00％，粗蛋白质18.00％，粗纤维7.00％，粗灰分8.00％，钙1.0％，总磷0.50％，氯化钠0.55％，赖氨酸0.80％。营养指标为干物质77.74％，粗蛋白16.91％，粗纤维60.48％，钙0.78％，磷0.45％。

随机选择10只胎次相同、预产期相近母羊，经布鲁氏杆菌病检测为阴性。在母羊产后的第1d和第14d收集奶样。在每个时间点的上午8:00～9:00手工挤奶，每只15mL，每次采集乳液后，均使用阴性乳房炎检测液(有效成分主要为十二烷基硫酸盐和溴甲酚紫)检测，检测为阴性的奶样-20℃保存备用。布病检测为阴性且乳汁正常的湖羊为6只。

随机选择10只胎次相同、预产期相近母羊，是为了保证试验设计影响因素的单一性，这样羊的品种一致、胎次一致、预产期一致、营养条件一致，“不同泌乳时间(初乳、常乳)”这个影响因素就成为唯一变量。

b.溶液配制：

(1)水化上样缓冲液：42g尿素，15.2g硫脲，4g CHAPS，用超纯水定容至100mL，分装，每管1mL，-20℃保存备用；用时取出1mL母液，溶化后，现加0.01g DTT(二硫苏糖醇)，5μLIPG(固相pH梯度)buffer以及痕量溴酚蓝；

(2)胶条平衡缓冲液母液：称取36g尿素与2g SDS(十二烷基硫酸钠)，量取25mL1.5mol/L pH为8.8的Tris-HCl以及20mL甘油，用超纯水定容至100mL，离心管分装，每管8mL，-20℃冰箱保存备用；

(3)胶条平衡缓冲液I：取出冷冻的8mL胶条平衡缓冲液母液，待其融化后，添加0.16g DTT，混匀备用(用时现配)；

(4)胶条平衡缓冲液II：取出冷冻的8mL胶条平衡缓冲液母液，待其融化后，添加0.20g碘乙酰胺，混匀备用(用时现配)；

(5)低熔点琼脂糖封胶液：0.5g低熔点琼脂糖，0.303g Tris，1.44g甘氨酸，1mL10％SDS，100μL 1％溴酚蓝，用超纯水定容至100mL，充分搅拌，并加热充分溶解至澄清，分装，保存备用；

(6)30％聚丙烯酰胺：称取150g丙烯酰胺与4g甲叉双丙烯酰胺，超纯水溶解，并定容至500mL，使用滤纸在通风厨中过滤后，装入棕色瓶，并于4℃冰箱保存；

(7)1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：90.75g Tris碱，用400mL超纯水溶解，用1mol/LHCl调pH至8.8，加超纯水定容至500mL，4℃冰箱保存备用；

(8)1mol/L Tris-HCl缓冲液：12g Tris碱，用80mL超纯水溶解，用1mol/L HCl调pH至6.8，加超纯水定容至100mL，4℃冰箱保存备用；

(9)10％SDS：称取10g SDS，70mL超纯水使其充分溶解，并定容至100mL，室温保存备用；

(10)10％APS(过硫酸铵)：提前称取若干份0.1g APS，4℃保存。使用时，取出0.1gAPS，加超纯水1mL，使其充分溶解；

(11)1×TBE电泳缓冲液：称取30g Tris碱，144g甘氨酸以及10gSDS，加600mL蒸馏水，不断搅拌使其充分溶解，最后定容至1L，配置为10×TBE电泳缓冲液；使用之前，稀释10倍；

(12)5×上样缓冲液：10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，500mMDTT，250mM pH为6.8的Tris-HCl；

(13)卡诺氏固定液：量取400mL乙醇与100mL乙酸，加超纯水定容至1,000mL，室温保存备用；

(14)考马斯亮蓝G-250染色液：称取1.2g考马斯亮蓝G-250溶于200mL无水乙醇中，称取100g硫酸铵溶于100mL磷酸中，待固体充分溶解后混合，并加蒸馏水定容至1000mL。

需要特别说明的是，在其他的实施方式中，配制所需溶液所使用的试剂种类相同，但其用量是可以变化的，只要达到最终使用需求即可。

c.脱脂乳蛋白样品的制备：

将每个时间点6只母羊的奶样等体积混合，于4℃、3000×g离心15min，弃去漂浮的乳脂肪层，获得脱脂乳蛋白样品，用1.5mL离心管分装，-20℃冷冻保存备用。

d.样品蛋白质浓度测定：

取脱脂乳蛋白样品，用BCA(二喹啉甲酸)试剂盒(solarbio，PC0020)，PBS为空白，以5.0mg/mL BSA(牛血清白蛋白)为标准蛋白，在酶标仪上测定样品蛋白OD值(波长为560nm)，获得待测样品的蛋白浓度。详细操作步骤如下：

(2)样品稀释：将产后1d脱脂乳稀释200倍，产后14d脱脂乳稀释100倍；

(3)工作液制备：根据所需总体积，按A试剂：Cu试剂＝50:1体积比配制，混匀备用；

(4)制作标准曲线：按表1所示，向96孔板加液，并做平行对照；根据标准品的吸光值及对应的蛋白浓度，制作标准曲线；

(5)加样：取不同稀释倍数待测样品20μL加入96孔板；待测样品稀释后的浓度须落在标准曲线的0.1-0.5μg/μL范围内；

(6)加工作液：各孔加入200μL工作液，振动晃匀，37℃静置15～30min充分显色；

(7)读吸光值：在酶标仪上于560nm波长处读取各样品吸光值；

(8)蛋白浓度计算：根据标曲以及待测样品的吸光值，计算出稀释后蛋白质的浓度；根据样品稀释的倍数，计算出待测蛋白浓度。

表1标准曲线绘制加液量

经BCA蛋白定量，湖羊产后第1d和第14d脱脂乳蛋白浓度分别为56.42和44.11ug/uL(表2)。可见随着泌乳期的延伸，脱脂乳蛋白浓度降低。

表2湖羊初乳和常乳脱脂乳蛋白浓度

e.二维凝胶电泳(2-DE)：

等电聚焦(IEF)电泳操作：

(1)从-20℃冰箱中取出保存的水化上样缓冲液母液，置室温溶液。室温缓慢溶解冷冻的脱脂乳蛋白样品；

(2)在1mL水化上样缓冲液母液中加入0.01g DTT和5μLIPGbuffer，并加入痕量溴酚蓝，混匀备用；

(3)取350μL水化上样缓冲液，加入250μg脱脂乳样品，充分混匀；

(4)从-20℃冰箱中取出17cm IPG预制胶条(pH 4～7)，室温放置几分钟，待胶条解冻；

(5)将待测样品液沿着聚焦槽的边缘从左至右连贯加入，然后用镊子轻轻除去IPG胶条上面的保护膜；

(6)对好正、负极，将胶条胶面朝下轻轻置于样品溶液上；

(7)确保无气泡，在每根胶条上缓慢的滴加2.5mL矿物油，防止水化过程液体的蒸发；对好正、负极，盖上聚焦盘盖，确保胶条与电极紧密接触；将等电聚焦盘置于等电聚焦电泳仪内，进行第一向等电聚焦；一次聚焦的胶条数一般不超过8根，每根胶条的极限电流设置为50μA，聚焦温度设置为18℃，并设置聚焦程序(见表3)。

表3等电聚焦程序与参数设置

胶条平衡：

聚焦结束后，进行胶条平衡。用蒸馏水冲洗胶条上的矿物油，用滤纸吸干。依次用胶条平衡缓冲液Ⅰ和胶条平衡缓冲液Ⅱ平衡处理聚焦好的胶条，平衡时间均为12min。

SDS-PAGE垂直凝胶电泳：

(1)配制12％的丙烯酰胺凝胶，将凝胶溶液注入灌胶器中，上面留出约1cm的空间，用无水乙醇封胶面，保持胶面平整；

(3)处理好后，将凝胶板放在桌面上，长玻璃板在下面，短玻璃板在上面；用镊子夹住平衡好的胶条一端，并使胶面朝上放在长玻璃板上；用镊子缓慢向下推动胶条的塑料支撑膜，必要时可滴加少量电泳缓冲液润滑，直至胶条与聚丙烯酰胺凝胶的胶面完全接触粘合，且接触面无任何气泡和杂质；

(4)将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解，待温度下降后，滴加于放有胶条的凝胶上方；确保胶条底部无气泡存在；若有气泡，则用平头镊轻轻触碰胶条的塑料支撑膜，赶尽气泡；

(6)向电泳槽内加入1×电泳缓冲液后，打开水流，循环水浴；接通电源，设置电泳的程序；起始时用低电压50V，电泳约30min；再加大电压至200V，设置6h；待指示剂电泳至距离凝胶底部边缘约0.5cm时，停止电泳；

(7)电泳结束后，取出凝胶架，取下玻璃板。撬开两层玻璃，轻轻取出凝胶，切角标记；随后进行凝胶固定(约3h)、考马斯亮蓝染色(约12h)，最后用蒸馏水给凝胶脱色至背景清晰。

胶图采集与分析：

将光密度扫描仪光学分辨率设置为600dpi，扫描凝胶。将扫描获得的电泳图谱通过ACD See 5.0软件进行剪切，用PDQuest 8.0软件分析凝胶图谱的蛋白表达丰度及蛋白点数量。并使用Excel软件对差异蛋白点数量等进行统计分析。

图1为湖羊初乳脱脂乳蛋白样品经双向凝胶电泳分离及染色后的图谱；图2为湖羊常乳脱脂乳蛋白样品经双向凝胶电泳分离及染色后的图谱。从图谱中可以看出，初乳和常乳脱脂乳蛋白点个体独立、基本没有横竖条纹，大多数蛋白点落在pI 4～7之间。

利用PDQuest 8.0软件，检测分析图谱上的蛋白位点。产后1d和14d时间点脱脂乳蛋白的凝胶图谱中，分离得到的蛋白点数分别为118和125个，重复胶的匹配率分别为100％和99％。

根据PDQuest 8.0软件对凝胶图谱的分析结果，产后第1d和第14d湖羊脱脂乳蛋白的表达丰度存在差异，以产后第1d脱脂乳蛋白分离图谱为参照，第14d检测到34个蛋白差异点，其中有11个点仅存在于1d脱脂乳蛋白图谱中，1个点仅存在于14d脱脂乳蛋白图谱中，其它22个点为表达量的差异，其中12个上调，10个下调。

本申请提供的羊乳蛋白质组对比方法，能够实现同时大量分析某一生物体系的蛋白组成，为系统揭示绵羊乳蛋白质组随泌乳阶段的变化规律提供理论依据。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种羊乳蛋白质组比对方法，其特征在于，所述方法包括：

b.溶液配制：

使用尿素、硫脲、CHAPS和超纯水配制水化上样缓冲液；

使用Tris、超纯水和盐酸配制1.5mol/L Tris-HCl缓冲液和1mol/L Tris-HCl缓冲液；

使用SDS和超纯水配制质量分数为10％的SDS溶液；

使用APS和超纯水配制质量分数为10％的APS溶液；

使用Tris、甘氨酸、SDS和蒸馏水制备1倍稀释的TBE电泳缓冲液；

使用所述10％的SDS溶液、溴酚蓝、50％甘油、DTT、Tris-HCl制备5倍稀释的上样缓冲液；

使用乙醇、乙酸和加超纯水制备卡诺氏固定液；

d.样品蛋白质浓度测定：用BCA试剂盒，PBS为空白，以5.0mg/mL BSA为标准蛋白，在波长为560nm下用酶标仪测定样品蛋白OD值，获得所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品的蛋白质浓度；

e.二维凝胶电泳：依次经过等电聚焦电泳操作、胶条平衡、SDS-PAGE垂直凝胶电泳和胶图采集与分析，得到所述初乳奶样和所述常乳奶样的2-DE图谱；

所述SDS-PAGE垂直凝胶电泳为：

（1）配制质量分数为12％的丙烯酰胺凝胶，将凝胶溶液注入灌胶器中，上面留出约1cm的空间，用无水乙醇封胶面，保持胶面平整；

（2）待凝胶凝固后，倒去无水乙醇，并用蒸馏水冲洗胶面；然后用滤纸吸去凝胶上方多余液体；

（3）处理好后，将凝胶板放在桌面上，长玻璃板在下面，短玻璃板在上面；用镊子夹住平衡好的胶条一端，并使胶面朝上放在长玻璃板上；用镊子缓慢向下推动胶条的塑料支撑膜，必要时滴加少量电泳缓冲液润滑，直至胶条与聚丙烯酰胺凝胶的胶面完全接触粘合，且接触面无任何气泡和杂质；

（4）将低熔点琼脂糖封胶液加热溶解，待温度下降后，滴加于放有胶条的凝胶上方，并确保胶条底部无气泡存在；

（5）待封胶液充分凝固后，转移至电泳槽中，并检查漏液与否；

（6）向电泳槽内加入1倍稀释的电泳缓冲液后，开启循环水浴；接通电源，设置电泳程序，进行电泳；

（7）电泳结束后，取出凝胶架，取下玻璃板；撬开两层玻璃，轻轻取出凝胶，切角标记；随后进行凝胶固定、考马斯亮蓝染色，最后用蒸馏水给凝胶脱色至背景清晰。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初乳奶样为母羊产后的第1d收集的奶样，所述常乳奶样为母羊产后的第14天收集的奶样，保存温度为-20℃。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤b具体为：

所述胶条平衡缓冲液I：取出冷冻的8mL胶条平衡缓冲液母液，待其融化后，添加0.16gDTT，混匀备用；

所述低熔点琼脂糖封胶液：0.5g低熔点琼脂糖，0.303g Tris，1.44g甘氨酸，1mL 10％SDS，100μL 1％溴酚蓝，用超纯水定容至100mL，充分搅拌，并加热充分溶解至澄清，分装，保存备用；

所述1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：90.75g Tris，用400mL超纯水溶解，用1mol/L盐酸调pH至8.8，加超纯水定容至500mL，4℃保存备用；

所述1mol/L Tris-HCl缓冲液：12g Tris，用80mL超纯水溶解，用1mol/L盐酸调pH至6.8，加超纯水定容至100mL，4℃保存备用；

所述1倍稀释的TBE电泳缓冲液：称取30g Tris，144g甘氨酸以及10g SDS，加600mL蒸馏水，不断搅拌使其充分溶解，最后定容至1L，配置为10倍稀释的TBE电泳缓冲液；使用之前，稀释10倍；

所述5倍稀释的上样缓冲液：10％ SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，500mM DTT，250mM pH为6.8的Tris-HCl，混匀后保存；

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤d具体为：

（1）标准蛋白稀释：将5.0mg/mL BSA蛋白标准品用PBS稀释10倍，制成0.5μg/μL BSA蛋白液；

（2）样品稀释：将所述初乳脱脂乳蛋白样品稀释200倍，所述常乳脱脂乳蛋白样品稀释100倍；

（3）BCA工作液制备：按A试剂：Cu试剂＝50:1体积比配制，混匀备用；

（4）制作标准曲线：根据标准品的吸光值及对应的蛋白浓度，制作标准曲线；

（5）加样：取不同稀释倍数待测样品加入孔板；

（6）加工作液：各孔加入BCA工作液，振动晃匀，保温静置、充分显色；

（7）读吸光值：在酶标仪上于560nm波长处读取各样品吸光值；

（8）蛋白浓度计算：根据标准曲线以及待测样品的吸光值，计算出稀释后蛋白质的浓度，再根据样品稀释的倍数，计算出所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品的蛋白质浓度。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述等电聚焦电泳操作为：

（1）取出保存的水化上样缓冲液母液，置室温溶解；室温缓慢溶解冷冻的所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品；

（2）在水化上样缓冲液母液中加入DTT和IPG buffer，并加入痕量溴酚蓝，混匀备用；

（3）取水化上样缓冲液，分别加入所述初乳脱脂乳蛋白样品和所述常乳脱脂乳蛋白样品，充分混匀，得到待测样品液；

（4）取出pH＝4～7的17cm IPG预制胶条，室温放置，待胶条解冻；

（5）将所述待测样品液沿着聚焦槽的边缘从左至右连贯加入，然后用镊子轻轻除去IPG胶条上面的保护膜；

（6）对好正、负极，将胶条胶面朝下轻轻置于样品溶液上；

（7）确保无气泡，在每根胶条上缓慢的滴加矿物油，防止水化过程液体的蒸发；对好正、负极，盖上聚焦盘盖，确保胶条与电极紧密接触；将等电聚焦盘置于等电聚焦电泳仪内，进行第一向等电聚焦，并设置聚焦程序。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（7）中，第一向等电聚焦中，一次聚焦的胶条数不超过8根，每根胶条的极限电流设置为50μA，聚焦温度设置为18℃。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶条平衡为：

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（6）中，电泳程序为：起始时用低电压50V，电泳约30min；再加大电压至200V，设置6h；待指示剂电泳至距离凝胶底部边缘约0.5cm时，停止电泳；所述步骤（7）中，凝胶固定的时间为3小时，考马斯亮蓝染色的时间为12小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胶图采集与分析为：

将光密度扫描仪光学分辨率设置为600dpi，扫描凝胶；将扫描获得的电泳图谱通过ACDSee 5.0软件进行剪切，用PD Quest 8.0软件分析凝胶图谱的蛋白表达丰度及蛋白点数量，并使用Excel软件对差异蛋白点数量进行统计分析。