CN103884765A - 辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：1）利用辣椒花药进行蛋白质的提取；2）第一向IPG等电聚焦电泳；3）胶条的平衡；4）胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；5）凝胶扫描和图像分析；从而得辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的辣椒花药蛋白质的双向电泳凝胶图谱，且实验结果稳定，此发明为进一步开展辣椒蛋白组学和分子生物学的研究奠定了重要的工作基础。

Description

辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

技术领域

本发明涉及一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

背景技术

辣椒（Chili Pepper）原产于中拉丁美洲热带地区，原产国是墨西哥。为一年生或多年生植物，其Vc的含量在蔬菜中居第一位，具有较高的营养价值。辣椒为常异花授粉植物，杂交优势显著。但在杂交繁种中，由于母本去雄费时费工，且杂交种子纯度难以保证。而利用CMS三系配套法生产杂交种子，不但可减少人工去雄的麻烦，降低制种成本，而且能保障杂交种子的纯度。目前,国内外已选育出多个辣椒胞质雄性不育系，并逐步应用于辣椒杂交种子的生产。因此，利用CMS三系配套法生产杂交种子在辣椒生产上具有极大的潜力和市场需求。但是通过自然变异获得不育系的概率比较小，且数量少。另外，如果引进不育系，其需要稳定的时间周期又比较长。因此，稳定不育系的难获得，已成为目前辣椒利用CMS三系配套法杂交制种的最大障碍。利用基于双向电泳的蛋白质组学技术，可以快速挖掘出辣椒育性不同的差异基因表达的产物，从而阐述不育机制，为将来辣椒杂交制种工作提供重要技术支撑。

现有研究辣椒不育机理的方法往往借助于基因组学技术，可以在一定程度上挖掘植物不育的重要基因。但是因为蛋白质是基因表达的最终产物，所以找出与不育相关的直接差异蛋白将更有助于不育机理的研究。利用基于双向电泳的差异蛋白质组学技术，获得高质量的差异蛋白图谱，是研究不育机理的强有力工具。目前利用双向电泳获得蛋白图谱的方法在生物医学领域和部分植物研究（如苹果叶片）等植物种类有一定程度的应用，但是在辣椒，特别是花药研究方面几乎空白。张彩霞等借助酚抽提法在苹果叶片中得到了高质量的蛋白质点图谱。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能得到高质量辣椒花药双向电泳蛋白质图谱的获取方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：

1）、利用辣椒花药进行蛋白质的提取；

2）、第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳：

取步骤1）所得的蛋白提取液40μL、240～280μL的IPG buffer混匀后配成水化溶液，装入等电聚焦槽中；利用等电聚焦胶条进行等电聚焦；设定参数如下：

IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入380mg尿素、15mg的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5.5mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10；

3）、胶条的平衡：

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.45mol/L，pH8.8）中加入6mol的尿素，150ml的甘油，25g的十二烷基硫酸钠(SDS)；得平衡缓冲液；

②、在10ml平衡缓冲液中加入80mg二硫苏糖醇均匀混合后，将步骤2）的等电聚焦完成后的胶条置于上述含二硫苏糖醇的平衡缓冲液中振荡（为轻微振荡，振荡频率为60～100rpm）平衡20min；

③、在10ml平衡缓冲液中加入200mg碘乙酰胺均匀混合后，将步骤②所得的胶条放入上述含碘乙酰胺的平衡缓冲液中，再振荡（为轻微振荡，振荡频率为60～100rpm）平衡20min；

④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗，干燥（即，将胶条边缘置于滤纸上1分钟，吸去多余水分）；

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶，得转移后胶条；

②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；所述琼脂糖封顶液的制备方法为：在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.2mg的溴酚蓝；

然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，进行第二向电泳(恒流30mA，4～5h)；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；

所述电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入2g Tris base、12.3g甘氨酸和0.8g SDS。

③、第二向电泳结束后，将凝胶放置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色10～14小时（例如为过夜，12小时）；倒掉染色液，加入脱色液，继续在摇床上振荡脱色，每隔20min换一次脱色液，直至凝胶背景透明；

所述脱色液由35％乙醇、20%乙酸和45％超纯水组成，上述%为体积%；

所述考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于350ml甲醇、100ml乙酸和550ml超纯水中；

5）、凝胶扫描和图像分析：

包括将考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，从而得辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱。

作为本发明的辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的改进：

所述步骤4）中的SDS-PAGE胶的制备方法中所用的凝胶溶液为12%的凝胶溶液；所述12%的凝胶溶液的制备方法为：

在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液、10ml的Tris-Hcl缓冲液（1.5mol/L，pH8.8）、0.4ml的SDS水溶液、200μL的过硫酸铵水溶液、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；

每ml丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水；每ml SDS水溶液中含有100mg的SDS，其余为水；每ml过硫酸铵水溶液中含有100mg的过硫酸铵，其余为水。

备注说明：将上述12%的凝胶溶液注入玻璃板夹层中，玻璃板夹层的上部留1cm的空间，用超纯水封面，保持胶面平衡，聚合30分钟，得SDS-PAGE胶；此为常规技术。

作为本发明的辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法的改进：

所述蛋白质的提取包括以下步骤：

①、取0.4g辣椒花药用液氮研磨后将其悬浮于10ml的三氯乙酸/丙酮溶液中，-20℃沉淀10小时；

所述三氯乙酸/丙酮溶液由8%的三氯乙酸和92%的丙酮组成，上述%为体积%；

②、将步骤①的所得物离心(4℃，13000r／min，20min)，弃上清；

③、将步骤②所得的沉淀悬浮于10ml的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心(4℃，13000r／min，20min)，可将所得的沉淀重复上述悬浮和离心2～3次；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1：0.09的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为4℃的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀真空抽干至含水量≤0.05%（质量%），得到粗蛋白干粉；加入lml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心(4℃，13000r／min，30min)，所得的即为蛋白提取液，-20℃保存；

所述裂解液A为在每ml水中加入380mg尿素、100mg硫脲、30mg3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、6.2mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10，0.174mg苯甲基磺酰氟制备而得。

本发明的主要目的是挖掘开发出一种高质量制备辣椒花药全蛋白的方法，从而能得到高质量的双向电泳差异蛋白质图谱。

在发明过程中，考虑到辣椒花药富含RNA和蛋白质类物质的特性，利用丙酮对辣椒花药蛋白进行多次沉淀抽提，改进了裂解液配方，提高了离心速率和粗蛋白沉淀的清洗次数和裂解液中尿素的浓度，建立了一套适合辣椒的差异双向电泳蛋白质组学方法，获得了高质量的辣椒花药蛋白质差异图谱。运用本发明的方法能获得蛋白质点清晰、数目较多、分布均匀、背景清楚的辣椒花药蛋白质的双向电泳凝胶图谱，且实验结果稳定，此发明为进一步开展辣椒蛋白组学和分子生物学的研究奠定了重要的工作基础。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1：辣椒品种‘杭椒1号’花药蛋白质组双向电泳图谱。

图2：辣椒品种‘保加利亚尖椒’花药蛋白质组双向电泳图谱。

图3：辣椒品种‘杭椒1号’花药酚抽提法蛋白质组双向电泳图谱。

图4：辣椒品种‘杭椒1号’花药采用裂解液B得到的蛋白质组双向电泳图谱。

具体实施方式

实施例1、一种辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，使用的辣椒材料为羊角椒类型的‘杭椒1号’，取其花药；依次进行以下步骤：

1）、蛋白质的提取：

包括以下步骤：

①、取0.4g辣椒花药加入3ml液氮，研磨后将其悬浮于10ml含8％（v/v）三氯乙酸(丙酮配制)溶液中，-20℃沉淀10小时；

②、将步骤①的所得物离心(4℃，13000r／min，20min)，弃上清；

③、将步骤②所得的沉淀悬浮于10ml的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心(4℃，13000r／min，20min)，将所得的沉淀重复上述悬浮和离心3次；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1：0.09的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为4℃的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀真空抽干30分钟（含水量≤0.05%），得到粗蛋白干粉；加入lml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心(4℃，13000r／min，30min)，所得的即为蛋白提取液，-20℃保存；

所述裂解液A为在每ml水中加入380mg尿素、100mg硫脲、30mg3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、6.2mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10，0.174mg苯甲基磺酰氟制备而得；

2）、第一向IPG等电聚焦(IEF)电泳：

取步骤1）所得的蛋白提取液40μL、260μL的IPG buffer混匀后配成水化溶液，装入17cm等电聚焦槽中；取17cm长度美国伯乐公司生产的pH3-10的等电聚焦胶条一根，揭掉封膜，放入聚焦槽中，保证该胶条在水化溶液中被均匀浸湿；再滴矿物油至槽深1/2处，盖住整个胶条，盖上槽盖，进行等电聚焦。等电聚焦操作严格按照仪器使用说明书进行；IEF设定参数如下：

上述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入380mg尿素、15mg的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5.5mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10。

3）、胶条的平衡；

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.45mol/L，pH8.8）中加入6mol的尿素，150ml的甘油，25g的十二烷基硫酸钠(SDS)；得平衡缓冲液；

②、在10ml平衡缓冲液中加入80mg二硫苏糖醇均匀混合后，将步骤2）的等电聚焦完成后的胶条置于上述含二硫苏糖醇的平衡缓冲液中轻微振荡（振荡频率为80rpm）平衡20min；

③、在10ml平衡缓冲液中加入200mg碘乙酰胺均匀混合后，将步骤②所得的胶条放入上述含碘乙酰胺的平衡缓冲液中，再振荡（振荡频率为80rpm）平衡20min；

④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗1s，然后将胶条边缘置于滤纸上1分钟，吸去多余水分。

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；

①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶(1.5mm厚)，转移时使胶条紧贴凝胶，确保无气泡产生；得转移后胶条；

所述SDS-PAGE胶的制备方法为：

首先配制12%的凝胶溶液：

在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液（每ml混合溶液中含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水）、10ml的Tris-Hcl缓冲液（1.5mol/L，pH8.8）、0.4ml的SDS水溶液（每mlSDS水溶液中含有100mg的SDS）、200μL的过硫酸铵水溶液（每ml过硫酸铵水溶液中含有100mg的过硫酸铵）、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺。

将上述12%的凝胶溶液注入玻璃板夹层中，玻璃板夹层的上部留1cm的空间，用超纯水封面，保持胶面平衡，聚合30分钟，得SDS-PAGE胶。

②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；所述琼脂糖封顶液的制备方法为：在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.2mg的溴酚蓝。

然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，进行第二向电泳(恒流30mA，4～5h)；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；

所述电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入2g Tris base、12.3g甘氨酸和0.8g SDS。

③、第二向电泳结束后，将凝胶放置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色过夜；倒掉染色液，加入脱色液[35％(v/v)乙醇、20%(v/v)乙酸和45％(v/v)超纯水]，继续在摇床上振荡脱色，每隔20min换一次脱色液，直至凝胶背景透明。

所述考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于350ml甲醇、100ml乙酸和550ml超纯水中。

5）、凝胶扫描和图像分析。

考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，用PDQuest7.3.1图像分析软件处理图像，对图像进行格式调整、背景消减、斑点检测、胶图匹配。如图1所示。

图1为辣椒品种‘杭椒1号’花药蛋白质组双向电泳图谱。

根据图1，我们分别能得出以下结论：

针对细长果形的辣椒花药蛋白质组双向电泳图谱为电泳点数目多，无横纵条纹，点分布均匀，图谱清楚，背景清晰，图谱质量高。

实施例2、辣椒品种‘保加利亚尖椒’花药替代实施例1中的辣椒花药，其余同实施例1。

最终所得的图谱如图2所示。根据图2，我们分别能得出以下结论：针对较粗大果形的辣椒花药，利用本发明方法也能稳定得到高质量的蛋白表达图谱。蛋白图谱清楚，蛋白点数目多，背景非常清晰。

对比例1-1、将实施例1中的辣椒品种‘杭椒1号’花药采用现有的蛋白酚抽提法，然后进行双向电泳，最终所得的图谱如图3所示。根据图3，我们分别能得出以下结论：已有的蛋白酚抽提法得到的辣椒花药双向电泳蛋白质图谱蛋白点数少，背景不清晰；本发明技术更适合应用于辣椒花药高质量蛋白质组图谱的获得。

对比例1-2、

仅将实施例1的步骤（1）④中的裂解液A改成了裂解液B：在每ml水中加入280mg尿素、250mg硫脲、20mg3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5.5mg二硫苏糖醇、12μL载体两性电解质Ampholine pH3-10，40%，10μL苯甲基磺酰氟制备而得。其余同实施例1。

最终所得的图谱如图4所示。根据图4，我们分别能得出以下结论：借助于裂解液B的双向电泳技术所得到的蛋白图谱蛋白点数目较少，且图谱有较为明显的纵条纹，图谱质量不高。而本发明技术中采用裂解液A则更适合于辣椒高质量双向电泳蛋白图谱的获取。

Claims (3)

1.辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是包括以下步骤：

1）、利用辣椒花药进行蛋白质的提取；

2）、第一向IPG等电聚焦电泳：

取步骤1）所得的蛋白提取液40μL、240～280μL的IPG buffer混匀后配成水化溶液，装入等电聚焦槽中；利用等电聚焦胶条进行等电聚焦；设定参数如下：

所述IPG buffer的制备方法为：在每ml水中加入380mg尿素、15mg的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、5.5mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10；

3）、胶条的平衡：

①、配制平衡缓冲液：

在1L的Tris-Hcl缓冲液（0.45mol/L，pH8.8）中加入6mol的尿素，150ml的甘油，25g的十二烷基硫酸钠，得平衡缓冲液；

②、在10ml平衡缓冲液中加入80mg二硫苏糖醇均匀混合后，将步骤2）的等电聚焦完成后的胶条置于上述含二硫苏糖醇的平衡缓冲液中振荡平衡20min；

③、在10ml平衡缓冲液中加入200mg碘乙酰胺均匀混合后，将步骤②所得的胶条放入上述含碘乙酰胺的平衡缓冲液中，再振荡平衡20min；

④、将步骤③所得的胶条用去离子水冲洗，干燥；

4）、胶条的转移及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳：

①、将步骤3）所得的平衡后的胶条转移至SDS-PAGE胶，得转移后胶条；

②、将转移后胶条用琼脂糖封顶液进行封闭；所述琼脂糖封顶液的制备方法为：在浓度为0.01g/mL的琼脂糖溶液5ml中加入0.2mg的溴酚蓝；

然后在第二向电泳槽的上下槽中分别加入电泳缓冲液，进行第二向电泳（恒流30mA，4～5h）；直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止；

所述电泳缓冲液的制备方法为：在每L水中加入2g Tris base、12.3g甘氨酸和0.8g SDS。

③、第二向电泳结束后，将凝胶放置于考马斯亮蓝R-250染色液中，振荡染色10～14小时；倒掉染色液，加入脱色液，继续振荡脱色，每隔20min换一次脱色液，直至凝胶背景透明；

所述脱色液由35％乙醇、20%乙酸和45％超纯水组成，上述%为体积%；

所述考马斯亮蓝R-250染色液的制备方法为：1.0g考马斯亮蓝R-250粉末溶于350ml甲醇、100ml乙酸和550ml超纯水中；

5）、凝胶扫描和图像分析：

包括将考马斯亮蓝显色后的胶片通过BIO-RAD公司的GS-800calibrated Densitometer电泳扫描分析系统获取图像，从而得辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱。

2.根据权利要求1所述的辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述步骤4）中的SDS-PAGE胶的制备方法中所用的凝胶溶液为12%的凝胶溶液；所述12%的凝胶溶液的制备方法为：

在13.4ml的超纯水中加入16.0ml的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液、10ml的Tris-Hcl缓冲液（1.5mol/L，pH8.8）、0.4ml的SDS水溶液、200μL的过硫酸铵水溶液、20μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺；

每ml丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的混合水溶液含292mg的丙烯酰胺、8mg的甲叉双丙烯酰胺，其余为水；每ml SDS水溶液中含有100mg的SDS，其余为水；每ml过硫酸铵水溶液中含有100mg的过硫酸铵，其余为水。

3.根据权利要求1或2所述的辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征是：

所述蛋白质的提取包括以下步骤：

①、取0.4g辣椒花药用液氮研磨后将其悬浮于10ml的三氯乙酸/丙酮溶液中，-20℃沉淀10小时；

所述三氯乙酸/丙酮溶液由8%的三氯乙酸和92%的丙酮组成，上述%为体积%；

②、将步骤①的所得物离心，弃上清；

③、将步骤②所得的沉淀悬浮于10ml的B-巯基乙醇冷丙酮溶液；离心；

所述B-巯基乙醇冷丙酮溶液的制备方法为：将冷丙酮与B-巯基乙醇按照1：0.09的体积比进行混合；所述冷丙酮为温度为4℃的丙酮；

④、将步骤③所得的沉淀真空抽干至含水量≤0.05%（质量%），得到粗蛋白干粉；加入lml裂解液A以溶解上述粗蛋白干粉，离心，所得的即为蛋白提取液；

所述裂解液A为在每ml水中加入380mg尿素、100mg硫脲、30mg3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、6.2mg二硫苏糖醇、10μL载体两性电解质Ampholine pH3-10，0.174mg苯甲基磺酰氟制备而得。

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