CN103115950A - 一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法,将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提,再通过一系列步骤提纯,得到大麦的水溶蛋白,将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳,分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图,利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线,可以准确检测大麦种子的纯度。

Description

一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法
技术领域
本发明具体涉及一种检测大麦种子纯度的方法。
背景技术
大麦是酿造啤酒的重要原料,品种的纯度是大麦质量的一项重要指标,不同纯度大麦由于可能掺杂其他品种大麦,带来不同类型蛋白质,导致酿造特征也不尽相同。所以,用于啤酒生产的大麦纯度对制麦工艺和啤酒酿造性能影响很大。不同纯度大麦也存在价格差异,而仅从外观和经验无法准确检测纯度,造成制麦和啤酒企业在大麦原料选取上容易造成一定损失,因此对大麦纯度检测方法的建立十分必要。
本研究利用蛋白质双向电泳技术和PDQuest分析软件对不同纯度大麦水溶蛋白的电泳图谱进行分析,通过纯品种大麦的差异性蛋白点,得到纯度与其差异点3D图高度关系的标准曲线,利用该曲线可以检测大麦品种的纯度。本方法具有准确、快捷的特点,是一种有效检测大麦品种纯度的方法。
发明内容
本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法,将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提,再通过一系列步骤提纯,得到大麦的水溶蛋白,将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳,分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图,利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线,可以准确检测大麦种子的纯度。
具体步骤如下:
第一步、蛋白提取:取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h,并漩涡震荡3~5次,10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚,室温提取30min,10000g离心10min,酚相加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min;离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥;将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜,13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳。
第二步、双向电泳:取蛋白上清液加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条,上样量为110μg;
电泳条件:倒入电泳缓冲液,接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流垂直电泳。
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶置于固定液中固定1~2h,考马斯亮蓝法进行染色,利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点,进行3D效果图的比较,绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线;
第四步、对待测样品进行电泳,得到同一区域蛋白点的3D图,并计算其纯度。
以上所述配方中,提取液所用试剂均为优级纯,其余试剂均为分析纯,所用水为双蒸水或超纯水,其中:
提取液:0.1M/L Tris-HCl(pH8.8),50mM/L二巯基苏糖醇(DTT),20mM/L乙二胺四乙酸(EDTA),1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF),1μM/L胃蛋白酶抑制剂(pepstatin),和10mM/L亮肽素,余量为水。
清洗液A:100mM/L醋酸铵、10mM/L二巯基苏糖醇的甲醇溶液。
清洗液B:10mM/L二巯基苏糖醇的90%乙醇。
裂解液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH310,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,余量为水。
样品缓冲液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,10mg/L溴酚蓝,余量为水。
自制胶条配方:0.6g尿素、540μL水、30%丙烯酰胺溶液200μL、pH4~6载体两性电解质24μL、pH3~10载体两性电解质溶液4.8μL,轻缓混匀后加入5μL10%过硫酸胺和4μL四甲基乙二胺,轻轻混匀;快速吸取上述混合液,从直径1mm、长11cm玻璃管的一端缓慢均匀灌入约7cm,室温聚合1h。
电泳缓冲液中,阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠溶液150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸溶液200mL。
平衡缓冲液:0.05M/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.8)、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)十二烷基硫酸钠、6mM/L尿素,余量为水。
分离胶:3.3mL水、4.0mL30%丙烯酰胺、2.5mL1.5M/L Tris-HCl、0.1mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺。
固定液:10%乙酸,40%乙醇,余量为水。
染色液:0.12%考马斯亮蓝G-250,10%硫酸铵,10%磷酸,20%甲醇,余量为水。
本发明能够快速准确地得到纯种大麦的双向电泳图谱,通过图谱比对得到差异蛋白点,应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图,利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线,可以准确检测大麦的纯度。
附图说明
图1、不同纯度大麦差异蛋白点1、2的变化,其中A-E依次对应纯度100、65、40、18、0%的大麦。
图2、不同纯度差异蛋白点1、2的3D图,其中a-e依次为对应纯度100、65、40、18、0%大麦对应高度。
图3、差异蛋白点高度变化与纯度关系的标准曲线1。
图4、差异蛋白点高度变化与纯度关系的标准曲线2。
图5、样品a、b在差异点1、2的3D高度图。
具体实施方式
实施例一、大麦纯度与差异性蛋白3D图高度的标准曲线1
第一步、蛋白提取:
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种为纯度为100、65、40、18、0%的甘啤四号大麦样品。手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入3倍体积提取液室温浸提2h。10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8的Tris平衡酚,室温提取30min。10000g离心10min,上清液吸出,Tris平衡酚再次提取。两部分酚相合并加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min。离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥。将得到蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜。13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液Bradford法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳。
第二步、双向电泳:
取蛋白上清加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条;
电泳条件:倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸200mL)。接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流电泳。
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h,进行“Blue silver”考马斯亮蓝染色,利用凝胶成像系统获取图像,通过PDQuest软件选取甘啤4号区别于单2号蛋白点,3D图的高度与纯度见表1,通过该蛋白的3D图的高度得到其与纯度关系的标准曲线1,y=30.825x2+7.9949x-0.8631,R2=0.9936。
表1:
3D图高度 纯度
0 0
0.75 18
1 40
1.3 65
1.7 100
实施例二、大麦纯度与差异性蛋白3D图高度的标准曲线2
第一步、蛋白提取:
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种为纯度为100、65、40、18、0%的甘啤四号大麦样品。手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入3倍体积提取液室温浸提2h。10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8的Tris平衡酚,室温提取30min。10000g离心10min,上清液吸出,Tris平衡酚再次提取。两部分酚相合并加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min。离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥。将得到蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜。13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液Bradford法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳。
第二步、双向电泳:
取蛋白上清加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条;
电泳条件:倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸200mL)。接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流电泳。
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h,进行“Blue silver”考马斯亮蓝染色,利用凝胶成像系统获取图像,通过PDquest软件选取甘啤4号区别于单2号的另一个蛋白点,3D图的高度与纯度见表2,通过该蛋白的3D图的高度得到其与纯度关系的标准曲线2,y=13.82x2+19.717x-0.8487,R2=0.9935。
表2:
3D图高度 纯度
0 0
0.7 18
1.2 40
1.5 65
2.1 100
实施例三、样品a纯度检测
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种得到纯度为50%的甘啤四号大麦样品,提取及差异蛋白点3D图高度获得同实施例一、二,区域1蛋白点高度为1.3,带入标区纯度为49%,误差为1%;区域2蛋白点高度为1.1,带入标区纯度为45.2%,误差为4.8%。
实施例四、样品b纯度检测
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种得到纯度为80%的甘啤四号大麦样品,提取及差异蛋白点3D图高度获得同实施例一、二,区域1蛋白点高度为1.8,带入标区纯度为79.4%,误差为0.6%;区域2蛋白点高度为1.5,带入标区纯度为80.5%,误差为0.5%。
综上所述,本发明在检测大麦品种的纯度方面可以作为一种有效的方法。

Claims (1)

1.一种利用双向电泳检测大麦种子纯度的方法,具体操作步骤如下:
第一步、蛋白提取:取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h,并漩涡震荡3~5次,10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚,室温提取30min,10000g离心10min,酚相加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min;离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥;将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜,13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳;
第二步、双向电泳:取蛋白上清液加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条,上样量为110μg;
电泳条件:倒入电泳缓冲液,接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦;
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流垂直电泳;
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶置于固定液中固定1~2h,考马斯亮蓝法进行染色,利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点,进行3D效果图的比较,绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线;
第四步、对待测样品进行电泳,得到同一区域蛋白点的3D图,并计算其纯度;
以上所述配方中,提取液所用试剂均为优级纯,其余试剂均为分析纯,所用水为双蒸水或超纯水,其中:
提取液:0.1M/L Tris-HCl pH8.8,50mM/L二巯基苏糖醇,20mM/L乙二胺四乙酸,1mM/L苯甲基磺酰氟,1μM/L胃蛋白酶抑制剂和10mM/L亮肽素,余量为水;
清洗液A:100mM/L醋酸铵、10mM/L二巯基苏糖醇的甲醇溶液;
清洗液B:10mM/L二巯基苏糖醇的90%乙醇;
裂解液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,余量为水;
样品缓冲液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,10mg/L溴酚蓝,余量为水;
自制胶条配方:0.6g尿素、540μL水、30%丙烯酰胺溶液200μL、pH4~6载体两性电解质24μL、pH3~10载体两性电解质溶液4.8μL,轻缓混匀后加入5μL10%过硫酸胺和4μL四甲基乙二胺,轻轻混匀;快速吸取上述混合液,从直径1mm、长11cm玻璃管的一端缓慢均匀灌入约7cm,室温聚合1h;
电泳缓冲液中,阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠溶液150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸溶液200mL;
平衡缓冲液:0.05M/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液pH8.8、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)十二烷基硫酸钠、6mM/L尿素,余量为水;
分离胶:3.3mL双蒸水、4.0mL30%丙烯酰胺、2.5mL1.5M/L Tris-HCl、0.1mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺,余量为水;
固定液:10%乙酸,40%乙醇,余量为水;
染色液:0.12%考马斯亮蓝G-250,10%硫酸铵,10%磷酸,20%甲醇,余量为水。
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