CN103115950A - 一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 - Google Patents
一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103115950A CN103115950A CN2013100459003A CN201310045900A CN103115950A CN 103115950 A CN103115950 A CN 103115950A CN 2013100459003 A CN2013100459003 A CN 2013100459003A CN 201310045900 A CN201310045900 A CN 201310045900A CN 103115950 A CN103115950 A CN 103115950A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- purity
- water
- electrophoresis
- barley
- surplus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法,将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提,再通过一系列步骤提纯,得到大麦的水溶蛋白,将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳,分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图,利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线,可以准确检测大麦种子的纯度。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种检测大麦种子纯度的方法。
背景技术
大麦是酿造啤酒的重要原料,品种的纯度是大麦质量的一项重要指标,不同纯度大麦由于可能掺杂其他品种大麦,带来不同类型蛋白质,导致酿造特征也不尽相同。所以,用于啤酒生产的大麦纯度对制麦工艺和啤酒酿造性能影响很大。不同纯度大麦也存在价格差异,而仅从外观和经验无法准确检测纯度,造成制麦和啤酒企业在大麦原料选取上容易造成一定损失,因此对大麦纯度检测方法的建立十分必要。
本研究利用蛋白质双向电泳技术和PDQuest分析软件对不同纯度大麦水溶蛋白的电泳图谱进行分析,通过纯品种大麦的差异性蛋白点,得到纯度与其差异点3D图高度关系的标准曲线,利用该曲线可以检测大麦品种的纯度。本方法具有准确、快捷的特点,是一种有效检测大麦品种纯度的方法。
发明内容
本发明提供一种检测大麦种子纯度的方法,将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提,再通过一系列步骤提纯,得到大麦的水溶蛋白,将人工混种不同纯度大麦的蛋白进行双向电泳,分析双向电泳图可以找到混种的差异性蛋白点。应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图,利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线,可以准确检测大麦种子的纯度。
具体步骤如下:
第一步、蛋白提取:取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h,并漩涡震荡3~5次,10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚,室温提取30min,10000g离心10min,酚相加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min;离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥;将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜,13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳。
第二步、双向电泳:取蛋白上清液加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条,上样量为110μg;
电泳条件:倒入电泳缓冲液,接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流垂直电泳。
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶置于固定液中固定1~2h,考马斯亮蓝法进行染色,利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点,进行3D效果图的比较,绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线;
第四步、对待测样品进行电泳,得到同一区域蛋白点的3D图,并计算其纯度。
以上所述配方中,提取液所用试剂均为优级纯,其余试剂均为分析纯,所用水为双蒸水或超纯水,其中:
提取液:0.1M/L Tris-HCl(pH8.8),50mM/L二巯基苏糖醇(DTT),20mM/L乙二胺四乙酸(EDTA),1mM/L苯甲基磺酰氟(PMSF),1μM/L胃蛋白酶抑制剂(pepstatin),和10mM/L亮肽素,余量为水。
清洗液A:100mM/L醋酸铵、10mM/L二巯基苏糖醇的甲醇溶液。
清洗液B:10mM/L二巯基苏糖醇的90%乙醇。
裂解液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH310,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,余量为水。
样品缓冲液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,10mg/L溴酚蓝,余量为水。
自制胶条配方:0.6g尿素、540μL水、30%丙烯酰胺溶液200μL、pH4~6载体两性电解质24μL、pH3~10载体两性电解质溶液4.8μL,轻缓混匀后加入5μL10%过硫酸胺和4μL四甲基乙二胺,轻轻混匀;快速吸取上述混合液,从直径1mm、长11cm玻璃管的一端缓慢均匀灌入约7cm,室温聚合1h。
电泳缓冲液中,阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠溶液150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸溶液200mL。
平衡缓冲液:0.05M/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液(pH8.8)、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)十二烷基硫酸钠、6mM/L尿素,余量为水。
分离胶:3.3mL水、4.0mL30%丙烯酰胺、2.5mL1.5M/L Tris-HCl、0.1mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺。
固定液:10%乙酸,40%乙醇,余量为水。
染色液:0.12%考马斯亮蓝G-250,10%硫酸铵,10%磷酸,20%甲醇,余量为水。
本发明能够快速准确地得到纯种大麦的双向电泳图谱,通过图谱比对得到差异蛋白点,应用PDQuest软件分析人工混种的3D效果图,利用差异蛋白点高度与纯度关系的标准曲线,可以准确检测大麦的纯度。
附图说明
图1、不同纯度大麦差异蛋白点1、2的变化,其中A-E依次对应纯度100、65、40、18、0%的大麦。
图2、不同纯度差异蛋白点1、2的3D图,其中a-e依次为对应纯度100、65、40、18、0%大麦对应高度。
图3、差异蛋白点高度变化与纯度关系的标准曲线1。
图4、差异蛋白点高度变化与纯度关系的标准曲线2。
图5、样品a、b在差异点1、2的3D高度图。
具体实施方式
实施例一、大麦纯度与差异性蛋白3D图高度的标准曲线1
第一步、蛋白提取:
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种为纯度为100、65、40、18、0%的甘啤四号大麦样品。手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入3倍体积提取液室温浸提2h。10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8的Tris平衡酚,室温提取30min。10000g离心10min,上清液吸出,Tris平衡酚再次提取。两部分酚相合并加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min。离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥。将得到蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜。13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液Bradford法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳。
第二步、双向电泳:
取蛋白上清加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条;
电泳条件:倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸200mL)。接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流电泳。
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h,进行“Blue silver”考马斯亮蓝染色,利用凝胶成像系统获取图像,通过PDQuest软件选取甘啤4号区别于单2号蛋白点,3D图的高度与纯度见表1,通过该蛋白的3D图的高度得到其与纯度关系的标准曲线1,y=30.825x2+7.9949x-0.8631,R2=0.9936。
表1:
3D图高度 | 纯度 |
0 | 0 |
0.75 | 18 |
1 | 40 |
1.3 | 65 |
1.7 | 100 |
实施例二、大麦纯度与差异性蛋白3D图高度的标准曲线2
第一步、蛋白提取:
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种为纯度为100、65、40、18、0%的甘啤四号大麦样品。手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入3倍体积提取液室温浸提2h。10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8的Tris平衡酚,室温提取30min。10000g离心10min,上清液吸出,Tris平衡酚再次提取。两部分酚相合并加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min。离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥。将得到蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜。13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液Bradford法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳。
第二步、双向电泳:
取蛋白上清加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条;
电泳条件:倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸200mL)。接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦。
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流电泳。
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h,进行“Blue silver”考马斯亮蓝染色,利用凝胶成像系统获取图像,通过PDquest软件选取甘啤4号区别于单2号的另一个蛋白点,3D图的高度与纯度见表2,通过该蛋白的3D图的高度得到其与纯度关系的标准曲线2,y=13.82x2+19.717x-0.8487,R2=0.9935。
表2:
3D图高度 | 纯度 |
0 | 0 |
0.7 | 18 |
1.2 | 40 |
1.5 | 65 |
2.1 | 100 |
实施例三、样品a纯度检测
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种得到纯度为50%的甘啤四号大麦样品,提取及差异蛋白点3D图高度获得同实施例一、二,区域1蛋白点高度为1.3,带入标区纯度为49%,误差为1%;区域2蛋白点高度为1.1,带入标区纯度为45.2%,误差为4.8%。
实施例四、样品b纯度检测
取甘啤4号纯种大麦以单2号作为混种得到纯度为80%的甘啤四号大麦样品,提取及差异蛋白点3D图高度获得同实施例一、二,区域1蛋白点高度为1.8,带入标区纯度为79.4%,误差为0.6%;区域2蛋白点高度为1.5,带入标区纯度为80.5%,误差为0.5%。
综上所述,本发明在检测大麦品种的纯度方面可以作为一种有效的方法。
Claims (1)
1.一种利用双向电泳检测大麦种子纯度的方法,具体操作步骤如下:
第一步、蛋白提取:取人工混种不同纯度的大麦经手工去皮后液氮研磨,取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h,并漩涡震荡3~5次,10000g离心10min,取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚,室温提取30min,10000g离心10min,酚相加入4倍体积清洗液A,-80℃提取3h,10000g离心10min;离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B各洗涤、离心3次后,冷冻干燥;将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液,室温漩涡振荡裂解1h,4℃裂解过夜,13000ppm4℃离心10min,取5μL上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量,按上样量分装,准备电泳;
第二步、双向电泳:取蛋白上清液加入适量样品缓冲液,上样于自制胶条,上样量为110μg;
电泳条件:倒入电泳缓冲液,接通电源,室温下200V恒压电泳30min,500V恒压电泳30min,1350V恒压电泳4h,进行等电聚焦;
等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出,在平衡缓冲液中平衡30min,转移至12%的分离胶上,20mA恒流垂直电泳;
第三步、染色及分析:
电泳结束后将凝胶置于固定液中固定1~2h,考马斯亮蓝法进行染色,利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件找到该纯品种与混种的差异性蛋白点,进行3D效果图的比较,绘制差异性蛋白点3D图高度与纯度关系的标准曲线;
第四步、对待测样品进行电泳,得到同一区域蛋白点的3D图,并计算其纯度;
以上所述配方中,提取液所用试剂均为优级纯,其余试剂均为分析纯,所用水为双蒸水或超纯水,其中:
提取液:0.1M/L Tris-HCl pH8.8,50mM/L二巯基苏糖醇,20mM/L乙二胺四乙酸,1mM/L苯甲基磺酰氟,1μM/L胃蛋白酶抑制剂和10mM/L亮肽素,余量为水;
清洗液A:100mM/L醋酸铵、10mM/L二巯基苏糖醇的甲醇溶液;
清洗液B:10mM/L二巯基苏糖醇的90%乙醇;
裂解液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,余量为水;
样品缓冲液:7M/L尿素,2M/L硫脲,4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐,1%(w/v)二巯基苏糖醇,0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10,2%(v/v)载体两性电解质pH4~6,10mM/L苯甲基磺酰氟,10mg/L溴酚蓝,余量为水;
自制胶条配方:0.6g尿素、540μL水、30%丙烯酰胺溶液200μL、pH4~6载体两性电解质24μL、pH3~10载体两性电解质溶液4.8μL,轻缓混匀后加入5μL10%过硫酸胺和4μL四甲基乙二胺,轻轻混匀;快速吸取上述混合液,从直径1mm、长11cm玻璃管的一端缓慢均匀灌入约7cm,室温聚合1h;
电泳缓冲液中,阴极电泳缓冲液:20mM/L氢氧化钠溶液150mL,阳极电泳缓冲液:10mM/L磷酸溶液200mL;
平衡缓冲液:0.05M/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸溶液pH8.8、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)十二烷基硫酸钠、6mM/L尿素,余量为水;
分离胶:3.3mL双蒸水、4.0mL30%丙烯酰胺、2.5mL1.5M/L Tris-HCl、0.1mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺,余量为水;
固定液:10%乙酸,40%乙醇,余量为水;
染色液:0.12%考马斯亮蓝G-250,10%硫酸铵,10%磷酸,20%甲醇,余量为水。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310045900.3A CN103115950B (zh) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | 一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201310045900.3A CN103115950B (zh) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | 一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103115950A true CN103115950A (zh) | 2013-05-22 |
CN103115950B CN103115950B (zh) | 2014-11-26 |
Family
ID=48414376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310045900.3A Expired - Fee Related CN103115950B (zh) | 2013-02-05 | 2013-02-05 | 一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN103115950B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103884765A (zh) * | 2014-02-21 | 2014-06-25 | 杭州市农业科学研究院 | 辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 |
CN107991368A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-04 | 广东省生物资源应用研究所 | 促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法 |
CN108195918A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-06-22 | 河南省农业科学院小麦研究所 | 一种小麦成熟籽粒总蛋白双向电泳方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101891799A (zh) * | 2010-06-21 | 2010-11-24 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法 |
-
2013
- 2013-02-05 CN CN201310045900.3A patent/CN103115950B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101891799A (zh) * | 2010-06-21 | 2010-11-24 | 中国科学院遗传与发育生物学研究所 | 一种低分子量麦谷蛋白亚基的提取分离鉴定方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
MINDEN J等: "Comparative proteomics and difference gel electrophoresis", 《BIOTECHNIQUES》 * |
兰海燕 等: "蛋白质凝胶电流技术在作物品种鉴定中的应用", 《中国农业科学》 * |
夏先锋 等: "大麦和麦芽水溶性蛋白提取方案的优化及双向电泳图谱的建立", 《食品科技》 * |
杨艳华 等: "水稻叶片蛋白质组双向电泳实验条件的改进", 《应用与环境生物学报》 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103884765A (zh) * | 2014-02-21 | 2014-06-25 | 杭州市农业科学研究院 | 辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 |
CN103884765B (zh) * | 2014-02-21 | 2015-12-09 | 杭州市农业科学研究院 | 辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 |
CN108195918A (zh) * | 2017-12-15 | 2018-06-22 | 河南省农业科学院小麦研究所 | 一种小麦成熟籽粒总蛋白双向电泳方法 |
CN107991368A (zh) * | 2017-12-19 | 2018-05-04 | 广东省生物资源应用研究所 | 促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法 |
CN107991368B (zh) * | 2017-12-19 | 2019-07-12 | 广东省生物资源应用研究所 | 促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN103115950B (zh) | 2014-11-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103149263B (zh) | 一种利用双向电泳技术鉴定大麦品种的方法 | |
WO2020123319A3 (en) | Methods of using master / copy arrays for spatial detection | |
SG11202000336RA (en) | Application of cas protein, method for detecting target nucleic acid molecule and kit | |
CN103115950B (zh) | 一种利用双向电泳技术检测大麦种子纯度的方法 | |
CN103267791B (zh) | 草莓双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 | |
CN104198621A (zh) | 一种纸和纸板中多类防腐剂特定迁移量的同时测定方法 | |
MX2019006098A (es) | Ensayo de anticuerpos. | |
CN105651432A (zh) | 一种质子交换膜燃料电池接触状态表征方法 | |
Horká et al. | Free flow and capillary isoelectric focusing of bacteria from the tomatoes plant tissues | |
MX358153B (es) | Metodo y sistema para determinar una respuesta biologica de un objetivo a una substancia candidato soluble. | |
WO2013052237A3 (en) | Systems and methods for assay of bio-contaminants in water | |
CN102706971A (zh) | 一种以离子液体作为添加剂的反向微乳毛细管电动色谱分析化妆品中的糖皮质激素的方法 | |
CN202956099U (zh) | 纺织品尺寸变化率自动测量装置 | |
Deng et al. | Trace determination of short-chain aliphatic amines in biological samples by micellar electrokinetic capillary chromatography with laser-induced fluorescence detection | |
CN103884765B (zh) | 辣椒花药双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 | |
CN205808814U (zh) | 一种用于核电晶间腐蚀试样的弯曲工装 | |
CN102095777A (zh) | 胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法 | |
CN102095776A (zh) | 脐带来源间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法 | |
CN104034756A (zh) | 基于神经细胞传感器的便携式藻类腹泻性毒素检测仪器 | |
CN104075924B (zh) | 一种适用于反刍动物骨骼肌全蛋白制备及双向电泳技术 | |
CN106198691A (zh) | 一种利用双向电泳体系获取北美鹅掌楸花蜜蛋白质二维电泳图谱的方法 | |
CN204831224U (zh) | 一种图像式dwtt断口测量仪器 | |
CN204008408U (zh) | 晶间腐蚀试验工装 | |
CN205537476U (zh) | 一种锥面同轴度测量仪 | |
WO2018065116A8 (en) | Cartridge and analysis system for testing a sample |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141126 Termination date: 20170205 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |