CN105527332A - 百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。该方法在百合总蛋白质的提取中设置转速为20000rpm，并反复沉淀离心至少3次，使得提取出来的百合总蛋白质颜色较白，质量好；增加了蛋白质的质量检测步骤，采取跑十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶的方式检测所提取出来蛋白质的质量，避免了后续第一向等电聚焦效果不好的问题。改进了第一向等电聚焦过程中聚焦程序，将聚焦程序中的步骤S1和S2两个除盐步骤的时间延长至2.5h，较好地去除了蛋白质的盐分，从而较好地完成了聚焦程序。本发明方法获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱背景清晰，蛋白质点多，蛋白质点分布均匀。

Description

百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

背景技术

百合(Liliumspp.)被誉为“球根花卉之王”，是世界五大鲜切花之一。据统计，2009年全球种球生产面积为35,749公顷,其中荷兰种植面积为23,561公顷，占66％，英国种植面积为5,400公顷，占15％，中国种植面积为4,680公顷，占13％。全球百合种球的贸易额已达20多亿美元，年贸易量达25亿粒以上。据农业部的统计数据，我国2013年百合鲜切花销售额达42.95亿元，位居鲜切花销售额的首位，具有重要的经济价值。

尖孢镰刀菌百合专化型(Fusariumoxysporumf.sp.lilii)是引起百合枯萎病的土传真菌，全世界百合种植区域均有被其感染和危害。云南作为我国重要的百合优质鲜切花产区，枯萎病时有爆发，轻者导致产量损失20-30％，严重时可造成百合绝收，且污染种植土壤，极大影响云南百合花卉产业的可持续发展。镰刀菌是一种在许多作物上引起严重病害的土传真菌，很难进行有效控制。因此选育和利用抗病品种成为主要的防治措施，采用蛋白质双向电泳技术来挖掘百合的抗病相关蛋白，可为百合抗病细胞工程育种提供理论依据。

植物在病原侵染胁迫下，除了会发生一些组织解剖学上的变化外，一些基因表达也会发生改变，有些蛋白的合成会受到抑制，同时又会有新的蛋白合成。这些病程相关基因和蛋白(Pathogenesis-relatedgene/protein,PR)是植物表现抗性的遗传基础抗性中的关键因子，也是抗病机制研究的基础。研究百合的病程相关蛋白可为抗病细胞工程育种提供理论依据。

双向电泳(Two-dimensionalelectrophoresis,2-DE)技术是蛋白质组研究的核心技术之一，也是复杂蛋白质分析分辨率最高的工具之一，其第一向为等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)，根据蛋白的等电点不同进行分离；其第二向为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)，是根据蛋白质亚基相对分子质量的不同而将第一向分离后的蛋白质进一步分离。经过电荷和质量的两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。近年来，蛋白质双向电泳技术在水稻、小麦、棉花、玉米、大豆等作物的研究中已得到广泛应用，但对于百合蛋白质双向电泳技术的研究国内外还未见报道。因此本发明通过优化百合蛋白质提取及双向电泳的各项参数，发明了百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

发明内容

本发明目的是提供一种适宜百合的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法。

本发明所提供的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：

(1)百合总蛋白质的提取：

①称取1～2g新鲜百合叶片或鳞茎于-20℃预冷的研钵中，加入10～20ml液氮，快速研磨至粉状；

②量取20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液，分2～3次清洗研钵，将研钵内粉状物清洗至50ml离心管中，迅速置于-20℃冰箱中保存过夜；取过夜的离心管于离心机上20000rpm，离心20min；弃上清；

③加入20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的80％的丙酮溶液，用枪头把离心管内的沉淀弄碎，振荡，于-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上20000rpm，离心15min，弃上清；

④重复步骤(1)③2次；

⑤在超净工作台上将得到的沉淀转移到经干燥灭菌的培养皿中，待沉淀吹干后，即为提取的蛋白质干粉，将蛋白质干粉收集到离心管中，-80℃保存；

(2)百合总蛋白质的纯化和溶解

①称取步骤(1)⑤提取的蛋白质干粉40～50mg于底部连接有离心管的过滤柱中，按每1mg蛋白质干粉加7M水化液15μl的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室温放置1h；

②将底部连接有离心管的过滤柱于离心机上12000rpm，离心15min，然后弃去过滤柱，将过滤柱底部连接的离心管所收集到的滤液转移至另一离心管中；

③加入1600～2000μl附加0.1％二硫苏糖醇的无水丙酮，边加边摇匀，-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上15000rpm，4℃离心30min，弃上清；

④加入1ml在4℃预冷的附加0.1％二硫苏糖醇的超纯水，在离心机上15000rpm，4℃离心25min，弃上清；

⑤加入附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液150～200μl即为百合总蛋白质溶解液；

(3)百合总蛋白质溶解液的质量检测

①将双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且双层玻璃板的上方朝上并使双层玻璃板上方顶端面为水平，在双层玻璃板之间灌入10％的分离胶，灌入的所述分离胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面2cm，在所述分离胶上方顶面用无水乙醇封面，待所述分离胶聚合且所述分离胶与无水乙醇分层后，倒去无水乙醇，然后在所述分离胶上方顶面灌入5％的浓缩胶，灌入的所述5％的浓缩胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面1cm，插入点样梳，待所述浓缩胶聚合凝固后，将此双层玻璃板转入蛋白质电泳槽中，并在蛋白质电泳槽中加入1×电泳缓冲液，拔去点样梳，形成加样孔，用注射器针尖将加样孔内壁凸起的浓缩胶去掉使加样孔内壁平滑；取步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液4μl，加入2μl的溴酚蓝指示剂混匀后加入加样孔中，加样完毕后，接通电源，起始时，用低电流5mA电泳或用低电压50V电泳，待溴酚蓝指示剂成一条线后，再加大电流为10mA电泳或加大电压为150V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该双层玻璃板底部边缘时停止电泳；所述双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为双层玻璃板的上方，其长玻璃板和短玻璃板的宽度均为10cm，长玻璃板的长度为8cm，短玻璃板的长度为7cm；

②停止电泳后，撬开双层玻璃板，从双层玻璃板中取出凝胶置于附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液中染色，再用脱色液脱色后，置于校准型光密度仪上拍照并保存文件，如果胶图条带清晰且无拖尾，表明所提取出来的蛋白质质量好，继续进行下一步百合总蛋白质的浓度测定；

(4)百合总蛋白质的浓度测定

取步骤(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液采用Bradford法测定其百合总蛋白质的浓度，测定的百合总蛋白质浓度在3μg/μl以上，将步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液置于-80℃保存；

(5)第一向等电聚焦

①上样水化

用与步骤(2)⑤中相同的附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液将步骤(4)中于-80℃保存的百合总蛋白质溶解液稀释至3μg/μl，取所稀释的浓度为3μg/μl的百合总蛋白质溶解液300μl放入聚焦盘的槽内，做好标记，把预先解冻的固定化pH梯度胶条的保护膜去掉，然后将固定化pH梯度胶条沿聚焦盘的一端放入聚焦盘的槽内与聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液结合，让聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液被固定化pH梯度胶条吸收2-3min，再在固定化pH梯度胶条上加入2～3ml矿物油水化14～16h；

②聚焦

将盐桥用ddH₂O润湿后置于聚焦盘两端；对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序进行聚焦，所述的等电聚焦程序如下：

③第一次平衡；

④第二次平衡；

(6)第二向SDS-PAGE电泳；

(7)染色、脱色；

(8)图像采集，获得百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。

与现有技术相比，本发明的主要创新点及有益效果是：

1、本发明优化了丙酮法提取百合总蛋白的程序，克服了百合总蛋白提取得率低、质量不高的技术问题，为获得优质的百合双向电泳差异蛋白质图谱奠定了好的基础，其主要优化的步骤为：

A、提高了百合总蛋白质的提取步骤中的离心转速[见步骤(1)]，设置转速为20000rpm，并反复沉淀离心至少3次，使得提取出来的百合总蛋白质颜色较白，质量好。

B、增加了蛋白质的质量检测步骤[见本发明方法步骤(3)]，本发明采取跑十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶的方式检测所提取出来蛋白质的质量，避免了后续第一向等电聚焦效果不好的问题。

2、本发明方法改进了第一向等电聚焦过程中聚焦程序[见本发明方法步骤(5)]，将聚焦程序中的步骤S1和S2两个除盐步骤的时间由常规的0.5h延长至2.5h，较好地去除了蛋白质的盐分，从而较好地完成了聚焦程序，为获得优质的百合蛋白质图谱进一步奠定了良好的基础。见图2和图3，图2是本发明方法获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱，其图谱背景清晰，蛋白质点多，点分布均匀，图3是聚焦程序中的步骤S1和S2两个除盐步骤的时间为常规的0.5h的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱，而图3的蛋白质点极少，图谱质量差，不能用于后续的蛋白质组学研究。

3、本发明建立的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，为研究百合蛋白质组学提供了良好的技术基础，对推进花卉蛋白质组学研究具有重要的实践意义和应用前景。

附图说明

图1是百合总蛋白质质量检测胶图。图1中条带清晰、无拖尾。

图2是本发明方法获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。图谱中蛋白质点多。

图3是对照获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。图谱中蛋白质点少。

具体实施方式

以下实施例及对照所用材料均可从商业渠道购买，实施例及对照中无特殊说明的为常规方法。

实施例1本发明方法

本发明所提供的百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，包括以下步骤：

(1)百合总蛋白质的提取：

①称取1g新鲜百合叶片于-20℃预冷的研钵中，加入10ml液氮，快速研磨至粉状。

②量取20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液，分3次清洗研钵，将研钵内粉状物清洗至50ml离心管中，迅速置于-20℃冰箱中保存过夜；取过夜的离心管于离心机上20000rpm，离心20min；弃上清。

所述附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液的制备方法为：10g三氯乙酸溶于100ml丙酮中，用前加1ml苯甲基磺酰氟和0.1g二硫苏糖醇即为附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液。

③加入20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的80％的丙酮溶液，用枪头把离心管内的沉淀弄碎，振荡，于-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上20000rpm，离心15min，弃上清。

所述附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的80％的丙酮溶液的制备方法为：将120ml丙酮用超纯水稀释至150ml得80％的丙酮，用前加入0.15g二硫苏糖醇和1.5ml苯甲基磺酰氟即为附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的80％的丙酮溶液。

④重复步骤(1)③2次。

⑤在超净工作台上将得到的沉淀转移到经干燥灭菌的培养皿中，待沉淀吹干后，即为提取的蛋白质干粉，将蛋白质干粉收集到离心管中，-80℃保存。

(2)百合总蛋白质的纯化和溶解

①称取步骤(1)⑤提取的蛋白质干粉40mg于底部连接有离心管的过滤柱中，按每1mg蛋白质干粉加7M水化液15μl的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室温放置1h。

所述7M水化液的制备方法为：称取8.4g尿素、3.04g硫脲、0.8g3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐于50ml离心管中，并用超纯水稀释至20ml；随后将其分装至1.5～2ml的离心管中，每个离心管中分装1ml，备用。

②将底部连接有离心管的过滤柱于离心机上12000rpm，离心15min，然后弃去过滤柱，将过滤柱底部连接的离心管所收集到的滤液转移至另一离心管中。

③加入1600μl附加0.1％二硫苏糖醇的无水丙酮，边加边摇匀，-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上15000rpm，4℃离心30min，弃上清。

所述附加0.1％二硫苏糖醇的无水丙酮的制备方法为：用前在2ml无水丙酮中加0.2g二硫苏糖醇。

④加入1ml在4℃预冷的附加0.1％二硫苏糖醇的超纯水，在离心机上15000rpm，4℃离心25min，弃上清。

所述附加0.1％二硫苏糖醇的超纯水的制备方法为：用前在1ml超纯水中加0.1g二硫苏糖醇。

⑤加入附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液150μl即为百合总蛋白质溶解液。

所述附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液制备方法为：取步骤(2)①制备的7M水化液1ml，用前加入2μl载体两性电解质和0.01g二硫苏糖醇即为附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液。

(3)百合总蛋白质溶解液的质量检测

①将双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且双层玻璃板的上方朝上并使双层玻璃板上方顶端面为水平，在双层玻璃板之间灌入10％的分离胶，灌入的所述分离胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面2cm，在所述分离胶上方顶面用无水乙醇封面，待所述分离胶聚合且所述分离胶与无水乙醇分层后，倒去无水乙醇，然后在所述分离胶上方顶面灌入5％的浓缩胶，灌入的所述5％的浓缩胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面1cm，插入点样梳，待所述浓缩胶聚合凝固后，将此双层玻璃板转入蛋白质电泳槽中，并在蛋白质电泳槽中加入1×电泳缓冲液，拔去点样梳，形成加样孔，用注射器针尖将加样孔内壁凸起的浓缩胶去掉使加样孔内壁平滑；取步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液4μl，加入2μl的溴酚蓝指示剂混匀后加入加样孔中，加样完毕后，接通电源，起始时，用低电流5mA电泳或用低电压50V电泳，待溴酚蓝指示剂成一条线后，再加大电流为10mA电泳或加大电压为150V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该双层玻璃板底部边缘时停止电泳；所述双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为双层玻璃板的上方，其长玻璃板和短玻璃板的宽度均为10cm，长玻璃板的长度为8cm，短玻璃板的长度为7cm。

所述10％的分离胶的制备：吸取4ml的超纯水、3.3ml的30％聚丙烯酰胺、2.5ml的1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.1ml的10％十二烷基磺酸钠、0.1ml的10％过硫酸氨、0.004ml的四甲基乙二胺混匀即为10％的分离胶。

所述5％的浓缩胶的制备：吸取2.1ml的超纯水、0.5ml的30％聚丙烯酰胺、0.38ml的1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、0.03ml的10％十二烷基磺酸钠、0.03ml的10％过硫酸氨、0.003ml的四甲基乙二胺混匀即为5％的浓缩胶。

10％的分离胶制备和5％的浓缩胶制备中所述的30％聚丙烯酰胺、1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、10％十二烷基磺酸钠、10％过硫酸氨均是按以下方法制备得到：

30％聚丙烯酰胺的制备：称取150g丙烯酰胺、4g甲叉双丙烯酰胺，加超纯水定容至500ml，滤纸过滤后所得滤液即为30％聚丙烯酰胺，装入棕色瓶中4℃冰箱保存。

1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的制备：称取90.75g的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐加入400ml超纯水，再用1mol/L盐酸调pH至8.8，加超纯水定容至500ml，4℃冰箱保存。

10％十二烷基磺酸钠的制备：称取10g十二烷基磺酸钠，用超纯水定容至100ml，室温保存。

10％过硫酸氨的制备：称取0.1g过硫酸氨，用超纯水定容至1ml，4℃冰箱保存。

所述1×电泳缓冲液的制备：称取三羟甲基氨基甲烷盐酸盐30g、甘氨酸144g、十二烷基磺酸钠10g，加超纯水定容至1L为10×电泳缓冲液，用超纯水将所述10×电泳缓冲液稀释为1×电泳缓冲液。

②停止电泳后，撬开双层玻璃板，从双层玻璃板中取出凝胶置于附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液中染色，再用脱色液脱色后，置于校准型光密度仪上拍照并保存文件，如果胶图条带清晰且无拖尾，表明所提取出来的蛋白质质量好；继续进行下一步百合总蛋白质的浓度测定，否则重新提取总蛋白。

所述附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液的制备：称取100g硫酸铵和1.2g考马斯亮蓝G250溶于200ml超纯水中，并加入100ml磷酸，用前加入200ml甲醇。

所述脱色液的制备：称取50g硫酸铵溶于900ml的超纯水中，用前加入100ml的甲醇。

本发明提取的百合总蛋白质溶解液，经上述质量检测获得的百合总蛋白质质量检测胶图如图1所示。图1中条带清晰且无拖尾，表明本发明方法提取出来的蛋白质质量好。

(4)百合总蛋白质的浓度测定

取步骤(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液采用Bradford法测定其百合总蛋白质的浓度，测定的百合总蛋白质浓度在3μg/μl以上，将步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液置于-80℃保存，留作下一步的实验，否则重新提取总蛋白。

在步骤(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液同时达到步骤(3)百合总蛋白质溶解液的质量检测和步骤(4)百合总蛋白质的浓度测定的要求时，进行以下步骤。

(5)第一向等电聚焦

①上样水化

用与步骤(2)⑤中相同的附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液将步骤(4)中于-80℃保存的百合总蛋白质溶解液稀释至3μg/μl，取所稀释的浓度为3μg/μl的百合总蛋白质溶解液300μl放入聚焦盘的槽内，做好标记，把预先解冻的固定化pH梯度胶条的保护膜去掉，然后将固定化pH梯度胶条沿聚焦盘的一端放入聚焦盘的槽内与聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液结合，让聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液被固定化pH梯度胶条吸收2-3min，再在固定化pH梯度胶条上加入2～3ml矿物油水化14～16h。

②聚焦

将盐桥用ddH₂O润湿后置于聚焦盘两端；对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序进行聚焦，所述的等电聚焦程序如下：

③第一次平衡

将聚焦盘槽内固定化pH梯度胶条转移至水化盘中的槽内，水化盘中的每个槽转移一根经步骤(5)②聚焦的固定化pH梯度胶条，再向槽内加入5ml附加1％二硫苏糖醇的胶条平衡液I，然后将水化盘置于摇床上40rpm摇晃15min即第一次平衡结束。

所述附加1％二硫苏糖醇的胶条平衡液I的制备方法：首先配制胶条平衡缓冲液母液：容量瓶中加入36g尿素、2g十二烷基磺酸钠、1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐25ml和20％的甘油20ml，用超纯水定容至100ml得胶条平衡缓冲液母液，分装至10ml的离心管中，每管10ml，-20℃冰箱保存备用；取一支10ml的胶条平衡缓冲母液，用前加入0.2g二硫苏糖醇并充分混匀即为附加1％二硫苏糖醇的胶条平衡液I。

④第二次平衡

第一次平衡结束后，倒掉或吸掉水化盘中的胶条平衡缓冲液I，并用滤纸吸取多余的胶条平衡缓冲液I，将水化盘中的槽内的固定化pH梯度胶条取出竖直放在滤纸上，让滤纸吸取多余的胶条平衡缓冲液I，以免损失蛋白或损坏凝胶表面，然后将固定化pH梯度胶条放回水化盘中的槽内，再加入5ml附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ，继续将水化盘在水平摇床上40rpm摇晃15min即第二次平衡结束，第二次平衡结束后，倒掉或吸掉水化盘中的附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ，并用滤纸吸取多余的附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ。

所述附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ的制备：取步骤(5)③中所述的一支10ml的胶条平衡缓冲母液，用前加入0.25g碘乙酰胺并混匀即为附加5％碘乙酰胺的胶条平衡缓冲液Ⅱ。

(6)第二向SDS-PAGE电泳

①制备聚丙烯酰胺凝胶

将一块大双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且大双层玻璃板的上方朝上并使大双层玻璃板上方顶端面为水平，量取10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液注入所述大双层玻璃板之间，注入的所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液上方顶面距离大双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面1cm，在所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液上方顶面用无水乙醇封面，聚合30min，当所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液与无水乙醇分层后，表明10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液已聚合即制成聚丙烯酰胺凝胶。所述大双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为大双层玻璃板的上方，大双层玻璃板中的长玻璃板和短玻璃板的宽度均为20cm，长玻璃板的长度为18cm，短玻璃板的长度为16cm。

所述10％的聚丙烯酰胺凝胶溶液的制备：取超纯水15.9ml、30％聚丙烯酰胺13.3ml、1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐10ml、10％十二烷基磺酸钠0.4ml、10％过硫酸氨0.4ml和四甲基乙二胺0.016ml混匀即为10％聚丙烯酰胺凝胶溶液，所述30％聚丙烯酰胺按步骤(3)①中所述的30％聚丙烯酰胺的制备方法制备得到，所述1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐按步骤(3)①中所述的1.5mol/LpH8.8三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的制备方法制备的得到，所述10％十二烷基磺酸钠按步骤(3)①中所述的10％十二烷基磺酸钠的制备方法制备的得到，所述10％过硫酸氨按步骤(3)①中所述的10％过硫酸氨的制备方法制备的得到。

②用滤纸吸去步骤(6)①中所述的大双层玻璃板之间聚丙烯酰胺凝胶上方多余的无水乙醇后，将该大双层玻璃板平放在桌面上，长玻璃板朝下，短玻璃板朝上，大双层玻璃板的上方对着操作人员。

③在桌面上放置干的两层滤纸，将在步骤(5)经第二次平衡后的水化盘中的固定化pH梯度胶条取出放在桌面上所述的两层滤纸上，另一份两层滤纸用超纯水浸湿，挤去多余水分后，直接置于固定化pH梯度胶条上表面，吸干固定化pH梯度胶条上的矿物油及固定化pH梯度胶条上多余的百合总蛋白质溶解液，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

④用镊子夹住步骤(6)③经滤纸吸干矿物油及多余百合总蛋白质溶解液的固定化pH梯度胶条完全浸没在1×电泳缓冲液中1～2s，所述1×电泳缓冲液与步骤(3)①中所述的1×电泳缓冲液相同，然后取出固定化pH梯度胶条放在步骤(6)②中平放在桌面上的所述大双层玻璃板中长玻璃板长出的长玻璃板的上表面，且该固定化pH梯度胶条的支撑膜贴在长玻璃板的上表面，然后用镊子将该固定化pH梯度胶条推入该大双层玻璃板之间，且使该固定化pH梯度胶条位于该大双层玻璃板之间聚丙烯酰胺凝胶的下面，并与该聚丙烯酰胺凝胶的胶面完全接触；注意不要在所述固定化pH梯度胶条下方产生任何气泡，在用镊子推固定化pH梯度胶条时，要注意是推动该固定化pH梯度胶条背面的支撑膜，镊子不要碰到该固定化pH梯度胶条的胶面。

⑤将步骤(6)④放有固定化pH梯度胶条的大双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，短玻璃板的平面对着操作人员，大双层玻璃板的上方朝上，从大双层玻璃板的上方向大双层玻璃板之间加入低熔点琼脂糖封胶液封面，放置5min，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

所述低熔点琼脂糖封胶液的制备：在容量瓶中加入低熔点琼脂糖0.5g、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐0.303g、甘氨酸1.44g，1ml10％十二烷基磺酸钠、100μl的1％溴酚蓝，加超纯水定容至100ml，80℃度水浴加热溶解至澄清即为低熔点琼脂糖封胶液，室温保存；所述10％十二烷基磺酸钠按步骤(3)①所述的10％十二烷基磺酸钠的制备方法制备的得到。

⑥在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将步骤(6)⑤封有低熔点琼脂糖封胶液的大双层玻璃板移至电泳槽的槽内，向电泳槽槽内加入1×电泳缓冲液，所述1×电泳缓冲液与步骤(3)①中所述的1×电泳缓冲液相同，接通电源，起始时用低电流10mA电泳或用低电压100V电泳,待大双层玻璃板之间的百合总蛋白质溶解液完全从大双层玻璃板之间的固定化pH梯度胶条中走出，看到溴酚蓝指示剂呈一条直线后，再加大电流为20mA电泳或加大电压为300V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该大双层玻璃板底部边缘时即停止电泳；电泳结束后，撬开大双层玻璃板，取出大双层玻璃板之间的聚丙烯酰胺凝胶，并切角以作记号。

(7)染色和脱色

预先将200ml固定液加入塑料盒中，再将步骤(6)⑥取出的聚丙烯酰胺凝胶放入固定液中，盒上做标记，将塑料盒放在摇床上以40rpm的转速摇动3h；然后倒掉塑料盒内的固定液，用超纯水清洗塑料盒内的聚丙烯酰胺凝胶2次，加入附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液200ml，在摇床上以40rpm的转速摇动染色12h，弃去染色液，用超纯水漂洗至没有考马斯亮蓝G250残渣；加入200ml脱色液，在摇床上以40rpm的转速摇动脱色2d，所述附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液与步骤(3)②中所述的附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液相同，所述脱色液与步骤(3)②中所述的脱色液相同。

所述固定液的制备：量取乙醇400ml、乙酸400ml，用超纯水定容至1L。

(8)图像采集

将步骤(7)经脱色的聚丙烯酰胺凝胶置于校准型光密度仪上拍照并保存文件得到百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图，校准型光密度仪型号为GS900。本发明方法获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱如图2所示。图2蛋白质点多，点分布均匀，背景清晰。

对照

对照除实施例1中步骤(5)②聚焦中等电聚焦程序中步骤S1和S2的时间为0.5h外，其余各步骤均与实施例1相同，即对照步骤(5)②聚焦中等电聚焦程序如下：

对照获得的百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱如图3所示，图3中蛋白质点少。

Claims (1)

1.百合总蛋白的提取及双向电泳差异蛋白质图谱的获取方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)百合总蛋白质的提取：

①称取1～2g新鲜百合叶片或鳞茎于-20℃预冷的研钵中，加入10～20ml液氮，快速研磨至粉状；

②量取20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的10％三氯乙酸-丙酮溶液，分2～3次清洗研钵，将研钵内粉状物清洗至50ml离心管中，迅速置于-20℃冰箱中保存过夜；取过夜的离心管于离心机上20000rpm，离心20min；弃上清；

③加入20ml附加1％苯甲基磺酰氟和0.1％二硫苏糖醇的80％的丙酮溶液，用枪头把离心管内的沉淀弄碎，振荡，于-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上20000rpm，离心15min，弃上清；

④重复步骤(1)③2次；

⑤在超净工作台上将得到的沉淀转移到经干燥灭菌的培养皿中，待沉淀吹干后，即为提取的蛋白质干粉，将蛋白质干粉收集到离心管中，-80℃保存；

(2)百合总蛋白质的纯化和溶解

①称取步骤(1)⑤提取的蛋白质干粉40～50mg于底部连接有离心管的过滤柱中，按每1mg蛋白质干粉加7M水化液15μl的比例，加入7M水化液，加入7M水化液后室温放置1h；

②将底部连接有离心管的过滤柱于离心机上12000rpm，离心15min，然后弃去过滤柱，将过滤柱底部连接的离心管所收集到的滤液转移至另一离心管中；

③加入1600～2000μl附加0.1％二硫苏糖醇的无水丙酮，边加边摇匀，-20℃冰箱中放置2h后，取出离心管于离心机上15000rpm，4℃离心30min，弃上清；

④加入1ml在4℃预冷的附加0.1％二硫苏糖醇的超纯水，在离心机上15000rpm，4℃离心25min，弃上清；

⑤加入附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液150～200μl即为百合总蛋白质溶解液；

(3)百合总蛋白质溶解液的质量检测

①将双层玻璃板竖直夹在灌胶架上，且双层玻璃板的上方朝上并使双层玻璃板上方顶端面为水平，在双层玻璃板之间灌入10％的分离胶，灌入的所述分离胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面2cm，在所述分离胶上方顶面用无水乙醇封面，待所述分离胶聚合且所述分离胶与无水乙醇分层后，倒去无水乙醇，然后在所述分离胶上方顶面灌入5％的浓缩胶，灌入的所述浓缩胶的上方顶面距离双层玻璃板中的短玻璃板的上方顶端面1cm，插入点样梳，待所述浓缩胶聚合凝固后，将此双层玻璃板转入蛋白质电泳槽中，并在蛋白质电泳槽中加入1×电泳缓冲液，拔去点样梳，形成加样孔，用注射器针尖将加样孔内壁凸起的浓缩胶去掉使加样孔内壁平滑；取步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液4μl，加入2μl的溴酚蓝指示剂混匀后加入加样孔中，加样完毕后，接通电源，起始时，用低电流5mA电泳或用低电压50V电泳，待溴酚蓝指示剂成一条线后，再加大电流为10mA电泳或加大电压为150V电泳，待溴酚蓝指示剂达到该双层玻璃板底部边缘时停止电泳；所述双层玻璃板为宽度相等长度不等的两块玻璃板重叠放在一起且长玻璃板和短玻璃板一端对齐，长玻璃板和短玻璃板没有对齐的一边为双层玻璃板的上方，其长玻璃板和短玻璃板的宽度均为10cm，长玻璃板的长度为8cm，短玻璃板的长度为7cm；

②停止电泳后，撬开双层玻璃板，从双层玻璃板中取出凝胶置于附加20％甲醇的考马斯亮蓝G250染液中染色，再用脱色液脱色后，置于校准型光密度仪上拍照并保存文件，如果胶图条带清晰且无拖尾，表明所提取出来的蛋白质质量好；继续进行下一步百合总蛋白质的浓度测定；

(4)百合总蛋白质的浓度测定

取步骤(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液采用Bradford法测定其百合总蛋白质的浓度，测定的百合总蛋白质浓度在3μg/μl以上，将步骤步(2)⑤获得的百合总蛋白质溶解液置于-80℃保存；

(5)第一向等电聚焦

①上样水化

用与步骤(2)⑤中相同的附加2μl/ml载体两性电解质和0.01％二硫苏糖醇的7M水化液将步骤(4)中于-80℃保存的百合总蛋白质溶解液稀释至3μg/μl，取所稀释的浓度为3μg/μl的百合总蛋白质溶解液300μl放入聚焦盘的槽内，做好标记，把预先解冻的固定化pH梯度胶条的保护膜去掉，然后将固定化pH梯度胶条沿聚焦盘的一端放入聚焦盘的槽内与聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液结合，让聚焦盘槽内的百合总蛋白质溶解液被固定化pH梯度胶条吸收2-3min，再在固定化pH梯度胶条上加入2～3ml矿物油水化14～16h；

②聚焦

将盐桥用ddH₂O润湿后置于聚焦盘两端；对好正、负极，盖上盖子，设置等电聚焦程序进行聚焦，所述的等电聚焦程序如下：

③第一次平衡；

④第二次平衡；

(6)第二向SDS-PAGE电泳；

(7)染色、脱色；

(8)图像采集，获得百合总蛋白双向电泳差异蛋白质图谱。