CN103589706B - 纳豆激酶的提纯方法及制备方法 - Google Patents

纳豆激酶的提纯方法及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纳豆激酶的提纯方法及制备方法，其中，纳豆激酶的提纯方法包括以下步骤：1）提取，2）超过滤，3）葡聚糖凝胶G-50柱层析，4）Amberlite？IRC-50阳离子交换柱层析，5）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析，6）纳豆激酶酶蛋白结晶。纳豆激酶的提纯方法具有纯化度高及回收率高的优点。

Description

纳豆激酶的提纯方法及制备方法
【技术领域】
本发明涉及纳豆激酶的提纯方法、纳豆激酶的制备方法。
【背景技术】
纳豆（Natto）是日本传统发酵豆制品，由纳豆菌（Bacillusnatto）以大豆为主要培养基成分发酵而成。主要用于心脑血管疾病的预防与控制。1987年，日本学者Sumi等人从纳豆中发现了一种丝氨酸蛋白酶，定名为纳豆激酶（Nattokinase,NK,PhaseolusVulgarisL.)[1]。大量研究表明，纳豆激酶经小肠吸收进入血浆[2]，能显著降低血浆优球蛋白的溶解时间，降低血浆纤维蛋白原的含量，同等剂量的纳豆激酶与尿激酶（Urokinase;UK）相比，前者纤溶性大于后者[3]，而且对血浆纤维蛋白的专一性比UK高，临床上不引起出血。可见，纳豆激酶安全性好，易被人体吸收，溶栓效率高，药效持久，有望开发成新型口服溶栓剂，各地竞相生产，大多采用从固体发酵产物纳豆中制备。
【发明内容】
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种纳豆激酶的提纯方法，其纯化度高及回收率高。
本发明要解决的第二个技术问题是提供一种纳豆激酶的制备方法，其获得纯度较高的纳豆激酶。
上述第一个技术问题由以下方案解决：
一种纳豆激酶的提纯方法，包括以下步骤：
1）提取：将纳豆菌发酵液或粗纳豆激酶溶液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
2）超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
3）葡聚糖凝胶G-50柱层析：
用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述过超滤浓缩液上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；
4）AmberliteIRC-50阳离子交换柱层析：
装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
5）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：
装柱，取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液；
6）将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。
本方法采用凝胶过滤、阳、阴离子交换柱层析等纯化方法，首次分别获得层析纯、电泳纯度的酶制剂，为该酶制剂的深度开发利用奠定了广阔基础；本方法具有纯化度高及回收率高的优点。
上述第二技术问题由以下方案解决：
一种纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤：
1）种子菌制备：
101）菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基，35℃培养24h；
102）种子液制备：取一环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35℃和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液；
103）种子扩大培养：在10L种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2-3mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得二级种子菌；
2）纳豆菌液体发酵：
在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L二级种子菌，并加入20mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得纳豆菌发酵液；
其中，所述斜面培养基为营养琼脂；种子培养基的组分为：蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化钠0.5%，种子培养基的pH值为7.5；发酵培养基的组分为：蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蚕蛹粉0.2%，发酵培养基的pH值为7.5；
3）提取：将纳豆菌发酵液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
4）超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
5）葡聚糖凝胶G-50柱层析：
用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；
6）AmberliteIRC-50阳离子交换柱层析：
装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
7）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：
装柱，取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液；
8）将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。
本发明结合从选用纳豆菌进行高效地发酵产酶及对纳豆菌发酵液进行质量地提纯，得出纯度较高的纳豆激酶，为该酶制剂的深度开发利用奠定了广阔基础。
【附图说明】
图1为实施例二的菌种生长曲线图；
图2为实施例二的酶活力随温度的变化曲线图；
图3为实施例二的酶活力随转速的变化曲线图；
图4为实施例三的SephadexG-50柱层析洗脱曲线图；
图5为实施例三的Amberlite柱层析洗脱曲线图；
图6为实施例三的DEAE-纤维素DE-52柱层析洗脱曲线图；
图7为实施例三的纳豆激酶的蛋白结晶图；
图8为实施例四的纳豆激酶的SDS-PAGE电泳的实验结果图；
图9为实施例四的蛋白质相对分子质量的标准曲线图；
图10为实施例五的纳豆激酶溶血效果图。
【具体实施方式】
实施例一
本实施例提供的一种纳豆激酶的液体发酵方法，包括以下步骤：
1）种子菌制备：
101）菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基，35℃培养24h；纳豆菌，英文名称为Bacillusnatto，由中科院广东分院微生物研究所提供；
102）种子液制备：取一环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35℃和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液；
103）种子扩大培养：在10L种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2.5mL豆油以防止冒泡，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，即得二级种子菌；
2）纳豆菌液体发酵：
在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L二级种子菌，并加入20mL豆油防止冒泡，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得纳豆菌发酵液。
其中，所述斜面培养基为市售营养琼脂；种子培养基的组分为：蛋白胨1.5%、葡萄糖1.5%、氯化钠0.5%，即种子培养基包括以下比例组分：水100ML、蛋白胨1.5g、葡萄糖1.5g、氯化钠0.5g，种子培养基的pH值为7.5；发酵培养基的组分为：蛋白胨1.5%、葡萄糖2%、磷酸氢二钾0.4%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、大豆1%、玉米0.2%、蚕蛹粉0.2%，即发酵培养基包括以下比例组分：水100ML、蛋白胨1.5g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾0.4g、磷酸二氢钾0.2g、硫酸镁0.05g、大豆1g、玉米0.2g、蚕蛹粉0.2g，发酵培养基的pH值为7.5。
经检测，上述纳豆菌液体发酵液进行2000r/min离心,上清液的酶活力达1320U/mL。
酶活力的测定方法参见由中国农业出版社出版、徐凤彩为主编、姜涌明为副主编的《酶工程》；酶活力单位定义为：在酶活力测定条件下，于275nm波长下光吸收值每分钟增加0.001个单位的酶量为1个酶活力单位（U）。
实施例二
在本实施例中，进行陈述探讨实施例一中的纳豆菌发酵产酶工艺条件。在本实施例中，酶活力的测定方法参见由中国农业出版社出版、徐凤彩为主编、姜涌明为副主编的《酶工程》；酶活力单位定义为：在酶活力测定条件下，于275nm波长下光吸收值每分钟增加0.001个单位的酶量为1个酶活力单位（U）。
菌种生长曲线：在装有400mL种子培养基的1000mL锥形瓶中接入5%的种子液，在温度为35℃、摇床转速为140r/min的条件下培养；每隔2h取样，直到28h，测菌浓度（OD600）与酶活力；以时间(h)为横坐标，OD600值与酶活力为纵坐标，作图为纳豆菌生长曲线。菌浓度（OD600）的概念见于《纳豆激酶摇床发酵条件的优化》，该文章发表于《药物生物技术》，2005，12（1）：19～21。由图1可见，在0～8h时，纳豆菌生长处于调整期；10～22h后处于对数生长期，22～24h处于稳定期，而后快速下降，进入衰退期。本研究采用发酵最佳时间为24h。
培养温度对产酶的影响：在装有400mL种子培养基的1000mL锥形瓶中接入5%的种子液，温度分别为25℃、28℃、35℃、39℃，摇床转速为140r/min，培养24h后测定酶活力；以温度为横坐标，酶活力为纵坐标，作图为培养温度对纳豆菌产酶的影响曲线。由图2可见，在35℃下酶活力最高，酶活力为173.2U/mL。因此纳豆菌发酵产酶的最适温度为35℃。本研究采用35℃下发酵生产酶。
不同转速对产酶的影响：在装有400mL种子培养基的1000mL锥形瓶中接入5%的种子液，温度为35℃，摇床转速分别为100r/min、140r/min、170r/min、200r/min，培养24h后测定酶活力；以摇床转速为横坐标，酶活力为纵坐标，作图为摇床转速对纳豆菌产酶的影响曲线。由图3可见，摇床转速为170r/min为纳豆菌产酶的最适转速。因此本研究采用摇床转速170r/min发酵生产酶。
L9（34）正交设计：在单因素确定的基础上，采用L9（34）正交实验对pH、接种量、装液量3个因素进行优化，从而确定纳豆菌产酶的最适条件；三因素分别是：A---pH：A1(pH6)，A2(pH7)，A3(pH8)；B---接种量：B1(5%)，B2(10%)，B3(15%)；C---装液量：C1(40%)，C2(50%)，C3(60%)；培养条件具体为：采用1000mL锥形瓶装液，摇床转速为170r/min，温度为35℃，培养时间为24h；分别测定酶活力。结果如表1，从表1中看出，对纳豆菌发酵的影响程度为A＞B＞C；而最佳组合为A2B3C1，即：pH7，接种量15%，装液量40%。
表1纳豆菌液体发酵正交试验分析表
实施例三
本实施例提供的是一种纳豆激酶的提纯方法，包括以下步骤：
1）提取：将实施例一制备的纳豆菌发酵液2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
2）超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
3）葡聚糖凝胶G-50柱层析：
葡聚糖凝胶G-50按通俗的处理方法（厂家会在产品说明书给出通俗的处理方法）进行预处理，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱（2.5cm×30cm），取所述超滤浓缩液8mL上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱,流速为1mL/min；收集洗脱液（在波长280nm下测定蛋白含量，并测酶活力），合并含酶的洗脱液，并浓缩（浓缩的具体方法，可以超过滤、透析、低温冷冻干燥，或由本领域技术人员选择符合本步骤目的的具体浓缩方法）至原体积的1/3，得第一浓缩液24ml；
如图4所示，经葡聚糖凝胶G-50柱层析，仅出现1个蛋白质峰，蛋白质峰与酶活力峰重叠；
4）AmberliteIRC-50阳离子交换柱层析：
AmberliteIRC-50树脂按通俗的处理方法（厂家会在产品说明书给出通俗的处理方法）进行预处理，装柱（2×18cm），取所述第一浓缩液8mL上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液（在波长280nm下测定蛋白含量，并测酶活力），合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩（浓缩的具体方法，可以超过滤、透析、低温冷冻干燥，或由本领域技术人员选择符合本步骤目的的具体浓缩方法）至原体积的1/3，得第二浓缩液25ml；
如图5所示，经AmberliteIRC-50阳离子交换柱层析，洗脱液出现1个蛋白峰，蛋白质峰与酶活力峰重叠；
AmberliteIRC-50树脂的一种通俗处理方法具体是，浓度为0.5mol/L的HCl溶液浸泡半小时后，蒸馏水洗至中性，再用浓度为0.5mol/L的NaOH溶液浸泡半小时后用蒸馏水洗至中性，最后用浓度为0.5mol/L的HCl溶液浸泡半小时，蒸馏水洗至中性；
5）DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：
DEAE-CelluloseDE-52按通俗的处理方法（厂家会在产品说明书给出通俗的处理方法）进行预处理，装柱（2×18cm），取所述第二浓缩液3.5mL上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH8.00.2mol/L磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液（在波长280nm下测定蛋白含量，并测酶活力），合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，并浓缩（浓缩的具体方法，可以超过滤、透析、低温冷冻干燥，或由本领域技术人员选择符合本步骤目的的具体浓缩方法）至原体积的1/3，得第三浓缩液19ml；
如图6所示，经DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析，洗脱液出现1个蛋白峰，蛋白质峰与酶活力峰重叠；上述所收集的洗脱液，就是收集与此蛋白质峰对应的洗脱液；
DEAE-CelluloseDE-52的一种通俗处理方法具体是，用浓度为0.5mol/L的NaOH溶液浸泡半小时后，蒸馏水洗至中性，再用浓度为0.5mol/L的HCl溶液浸泡半小时后用蒸馏水洗至中性，最后用浓度为0.5mol/L的NaOH溶液浸泡半小时，蒸馏水洗至中性；
6）将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。将结晶粉末用SCD500离子溅射仪喷金，XL-30环境扫描电镜下观察拍照，加速电压20KV，得到结晶相片,如图7所示。
如表2所示，通过上述方法，纳豆激酶经分离纯化，活力回收达74%，比活力达5908U/mg蛋白质，被纯化了9.58倍，达到层析纯，并获得酶蛋白的结晶。
表2纳豆激酶的分离纯化表
可见，通过结合实施例一和实施例三，就可以制备纳豆激酶酶蛋白结晶。
实施例四
本实施例主要针对实施例三中所得出的纳豆激酶酶蛋白结晶进行SDS-PAGE电泳，具体包括以下步骤：
（1）安装好垂直板电泳槽，配置凝胶；本实验选用10%分离胶、3%浓缩胶进行电泳分离；配制参照下表3；其中，凝胶贮液：30g丙烯酰胺（Acr）和0.8g双丙烯酰胺（Bis）溶于蒸馏水中，定容至100mL，过滤后4℃贮存备用；分离胶缓冲液（1.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH8.8）：称取18.15gTris溶解后，加6mol/LHCl溶液4mL，调pH至8.8，定容至100mL；浓缩胶缓冲液（0.5mol/LTris-HCl缓冲液，pH6.8）：称取6gTris溶解后，加6mol/LHCl溶液8mL，调pH至6.8，定容至100mL；10%SDS溶液：取5gSDS加蒸馏水溶解并定容至50mL；10%AP溶液：取5g过硫酸铵溶于蒸馏水中，定容至50mL；
表3凝胶配置的具体信息
试剂/mL 10%分离胶 3%浓缩胶
凝胶贮液 1.7 0.33
分离胶缓冲液 1.9 \
浓缩胶缓冲液 \ 0.25
10%SDS溶液 0.05 0.02
蒸馏水 1.3 1.4
10%AP溶液 0.05 0.02
TEMED溶液 0.002 0.002
总体积 5 2
（2）凝胶板的制备：将已配好的分离胶缓慢注入凝胶模中，加到距玻璃板顶端3cm处，立即覆盖3-5mm水层，静置聚合，至胶与水层间形成清晰的界面；除去水层，并用滤纸吸干；将配好的浓缩胶迅速倒在分离胶上层，并插入梳子，静置聚合约40min；聚合好后，加入电极缓冲液，小心拔出梳子；其中，电极缓冲液（0.1%SDS-0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸缓冲液，pH8.3）：取Tris、甘氨酸和SDS溶液，调pH至8.3，加蒸馏水溶解后定容至1000mL；
（3）加样：将上述纳豆激酶酶蛋白结晶和兔磷酸化酶、牛血清蛋白、兔肌动蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂五个标准蛋白分别用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液配置成20mg/mL浓度的溶液，加入等体积的样品裂解液，在沸水中保温5min，冷却后取15μL上样；其中，样品裂解液（2×SDS上样缓冲液，2.5mL）：1mL10%SDS溶液，0.1mLβ-巯基乙醇，0.5mL浓缩胶缓冲液，0.15mL蒸馏水，0.5mL甘油，0.25mL2%溴酚蓝；
（4）电泳：加样完毕，接上电源；开始用80V电压，过浓缩胶后用120V电压进行电泳；当溴酚蓝迁移至距凝胶下端约1cm处，即可停止电泳；
（5）染色、脱色：电泳结束后，小心卸下凝胶，并将凝胶浸没在染色液中染色1h左右，倒出染色液，用蒸馏水洗凝胶数次，加入脱色液，数小时换液一次，直至凝胶的蓝色背景褪尽，蛋白质区带清晰为止，结果见图8，纳豆激酶酶蛋白结晶的蛋白质的迁移距离是12.5cm，五个标准蛋白质的迁移距离从上到下分别是（单位为cm）：3.6cm、5.5cm、8.3cm、12.2cm、15cm；其中，脱色液（7.5%冰乙酸-5%甲醇溶液）：取75mL冰乙酸、50mL甲醇溶液，加蒸馏水定容至1000mL；染色液（0.1%考马斯亮蓝R-250-45%甲醇溶液-10%冰乙酸溶液）：取0.1g考马斯亮蓝R-250，加入45mL甲醇溶液、10mL冰乙酸溶液，用蒸馏水定容至100mL。
根据兔磷酸化酶、牛血清蛋白、兔肌动蛋白、牛碳酸酐酶、胰蛋白酶抑制剂这五个标准蛋白质的相对分子量Mr的值分别为97400Da、66200Da、43000Da、31000Da、20100Da及它们的迁移距离，以标准相对分子量的蛋白质的相对迁移率（Rf）作横坐标，标准蛋白质相对分子量（Mr）的对数作纵坐标作图，得到蛋白质Mr的标准曲线图，如图9所示。
根据蛋白质Mr的标准曲线图和纳豆激酶酶蛋白的Rf值，可求出纳豆激酶酶蛋白的相对分子量为27784.335Da。
实施例五
本实施例主要针对实施例三中所得出的纳豆激酶酶蛋白结晶进行溶血试验。
取四份0.1g新鲜鸡血凝块，分别放入从左到右的四个试管中，然后在从左到右的四个试管中分别加入：2mL的pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液，2mL的所述粗酶液，2mL的所述第一浓缩液，2mL的浓度为30mg/mL的纳豆激酶酶蛋白结晶溶液，每100ml纳豆激酶酶蛋白结晶溶液中包括100ml的pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液和30mg的纳豆激酶酶蛋白结晶；然后，均在室温下放置46h，轻轻晃匀，观察溶血效果，结果如图10所示；从结果图来看，除对照管外，其他试管中的鸡血凝块均已完全溶解，达到了很好的溶血效果。
本发明不局限于上述实施例，基于上述实施例的、未做出创造性劳动的简单替换，应当属于本发明揭露的范围。

Claims (2)

1.一种纳豆激酶的提纯方法，包括以下步骤：
1)提取：将纳豆菌发酵液或粗纳豆激酶溶液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
2)超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
3)葡聚糖凝胶G-50柱层析：
用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；
4)AmberliteIRC-50阳离子交换柱层析：
装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
5)DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：
装柱，取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液；
6)将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。
2.一种纳豆激酶的制备方法，包括以下步骤：
1)种子菌制备：
101)菌种活化:将纳豆菌转移至斜面培养基，35℃培养24h；
102)种子液制备：取一环活化菌种，接入装有500mL种子培养基的1000mL锥形瓶，在温度为35℃和摇床转速为140r/min的条件下培养24h，得种子液；
103)种子扩大培养：在10L种子罐中装入5L种子培养基，灭菌并冷却后接入750mL种子液，并加入2-3mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得二级种子菌；
2)纳豆菌液体发酵：
在100L发酵罐中装入40L发酵培养基，灭菌冷却后接入6L二级种子菌，并加入20mL豆油，通入无菌空气，控制温度在35℃，培养24h，得纳豆菌发酵液；
其中，所述斜面培养基为营养琼脂；种子培养基的组分为：蛋白胨1.5％、葡萄糖1.5％、氯化钠0.5％，种子培养基的pH值为7.5；发酵培养基的组分为：蛋白胨1.5％、葡萄糖2％、磷酸氢二钾0.4％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、大豆1％、玉米0.2％、蚕蛹粉0.2％，发酵培养基的pH值为7.5；上述种子培养基和发酵培养基中的％指代的是g/100ml水；
3)提取：将纳豆菌发酵液进行2000r/min离心，收集上清液，得粗酶液；
4)超过滤：将所述粗酶液进行超过滤，收集排阻相对分子质量为10000以上的物质，得超滤浓缩液；
5)葡聚糖凝胶G-50柱层析：
用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液平衡并装柱，取所述超滤浓缩液上样，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，并浓缩至原体积的1/3，得第一浓缩液；
6)AmberliteIRC-50阳离子交换柱层析：
装柱，取所述第一浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L的磷酸钠缓冲液透析，并浓缩至原体积的1/3，得第二浓缩液；
7)DEAE-CelluloseDE-52阴离子交换柱层析：
装柱，取所述第二浓缩液上样，用pH值为6.0、浓度为1/15mol/L的磷酸钠缓冲液与pH值为pH8.0、浓度为0.2mol/L的磷酸钠缓冲液进行线性梯度洗脱；收集洗脱液，合并含酶的洗脱液，用pH值为7.5、浓度为0.1mol/L磷酸钠缓冲液透析，浓缩至原体积的1/3，得第三浓缩液；
8)将所述第三浓缩液装在无盖培养皿中，放置在4℃下，直至出现结晶，取结晶在干燥器中进行干燥，收集结晶粉末，得纳豆激酶酶蛋白结晶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN1594560A (zh) * 2004-06-29 2005-03-16 浙江大学 以离子交换层析为主要手段分离纯化纳豆激酶的方法
CN102337282A (zh) * 2011-05-25 2012-02-01 王沁 一种溶栓蛋白酶基因nks1及用途
CN102604917A (zh) * 2012-04-01 2012-07-25 范铭琦 一种高纯度纳豆激酶的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chromium (III) removal by weak acid exchanger Amberlite IRC-50 (Na);S. Mustafa, et al.;《Journal of Hazardous Materials》;20080229;第160卷;1-5 *
纳豆激酶分离纯化技术的研究;史丰坤,等;《山东轻工业学院学报》;20080930;第22卷(第3期);24-27 *

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