CN110878115A

CN110878115A - 蛋白质提取液、等电聚焦裂解液及其在蛋白质提取、等电聚焦及非变性凝胶电泳中的应用

Info

Publication number: CN110878115A
Application number: CN201911266225.0A
Authority: CN
Inventors: 段志贵; 彭存宇; 孟雯雯
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2019-12-11
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2020-03-13
Anticipated expiration: 2039-12-11
Also published as: CN110878115B

Abstract

本发明提供一种含无患子总皂苷的蛋白质提取液，以质量百分比计所述提取液含2％‑10％的无患子总皂苷，应用于蛋白质的提取，能够更加完全的提取细胞或组织中的全蛋白质，且对SDS‑PAGE兼容性最好；提取液天然可降解，无环境污染。本发明还公开一种无患子总皂苷在蛋白质非变性凝胶电泳中的应用，能使蛋白质复合物保持高度的完整性。本发明还公开一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，以质量百分比计所述提取液含2％‑10％的无患子总皂苷，应用于蛋白质的等电聚焦中，能将细胞或组织的全蛋白质得以更好的分离和展现。

Description

蛋白质提取液、等电聚焦裂解液及其在蛋白质提取、等电聚焦及非变性凝胶电泳中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种含无患子总皂苷的蛋白质提取液、等电聚焦裂解液及其在蛋白质提取、等电聚焦及非变性凝胶电泳中的应用。

背景技术

蛋白质(protein)是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。

现有技术中，采用尿素、CHAPS(3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐)、硫脲和DTT(二硫苏糖醇)混合溶液进行蛋白质提取，试剂复杂，其环境污染大，气味刺鼻；对后续的电泳产生影响，能使SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)时容易产生从纹，在等电聚焦时容易使蛋白质沉淀而丢失。

现有技术中，用于蛋白质相互作用研究的类表面活性剂有毛地黄苷、烷基糖苷和Triton X-100。除了Triton X-100外，烷基糖苷和毛地黄苷价格极高，每克分别高达400和3000元人民币，极大的提高了使用成本。能使部分极大的蛋白质复合物会部分解离或完全解离。

现有技术中，蛋白质等电聚焦存在以下缺陷：蛋白质溶液聚集沉淀而丢失、阴阳离子表面活性剂导致表面电荷改变而致使等电聚焦失败，目前使用的两性离子非变性去垢剂CHAPS在等电聚焦中的表现并不令人满意，也容易导致蛋白质沉淀而丢失。

综上所述，急需一种用于蛋白质提取的提取液、等电聚焦裂解液等以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

本发明提供一种含无患子总皂苷的提取液，具体技术方案如下：

一种含无患子总皂苷的蛋白质提取液，以质量百分比计提取液含2％-10％的无患子总皂苷。

以上方案中优选的，以质量百分比计提取液还包括0.8-2％的二硫苏糖醇，余量为水。

以上方案中优选的，以质量百分比计所述提取液含5％-8％的无患子总皂苷以及1.0-1.5％的二硫苏糖醇，余量为水。

应用本发明的提取液，提取液配方精简；能够更加完全的提取细胞中的全蛋白质，且对SDS-PAGE兼容性最好；提取液天然可降解，无环境污染。

本发明公开了无患子总皂苷在提取蛋白质中的应用，具体是采用上述含无患子总皂苷的蛋白质提取液。

本发明公开了无患子总皂苷在蛋白质非变性凝胶电泳中的应用，具体是采用上述含无患子总皂苷的蛋白质提取液。

本发明在于提供一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，具体方案是：

一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液含2％-10％的无患子总皂苷。

以上技术方案中优选的，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液还包括1.5％-2.5％尿素、0.5-2％二硫苏糖醇、1.5％-2.5％Ampholytes两性电解质，余量为水。

以上技术方案中优选的，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液包括5％-8％无患子总皂苷、1.8％-2.0％尿素、0.8-1.2％二硫苏糖醇、1.8％-2.2％Ampholytes两性电解质，余量为水。

应用本发明的含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，效果是：蛋白质样品只用上述等电聚焦裂解液中溶解后即可用于等电聚焦电泳，且效果比现有技术(尿素、CHAPS、硫脲和DTT混合溶液)要好得多，具体是：可以降低尿素的使用浓度；无患子总皂苷能提高等电聚焦的分辨率，不会在等电聚焦过程中造成蛋白质丢失。因此，本发明的等电聚焦裂解液能极大改善等电聚焦时的缓冲液环境，蛋白质的表面电荷不被改变且保持良好的溶解性，能将细胞或组织的全蛋白质得以更好的分离和展现。

本发明的还公开了无患子总皂苷在等电聚焦中的应用，具体是采用上述的等电聚焦裂解液进行等电聚焦。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是现有技术中无患子总皂苷的结构通式；

图2是现有技术中毛地黄苷结构式；

图3是现有技术中Triton X-100结构式；

图4是现有技术中烷基糖苷结构式；

图5是实施例1中无患子皂苷及其他蛋白质裂解液的SDS-PAGE图；

图6是实施例4中无患子皂苷用于等电聚焦后的双向电泳图；

图7是现有技术中CHAPS用于等电聚焦后的双向电泳图；

图8是实施例7中毛地黄苷(A)、无患子皂苷(B)、烷基糖苷(C)以及Triton X100(D)四种表面活性剂的BN-PAGE；

图9是四种表面活性剂的BN-SDS二维凝胶电泳图，其中：图9A为无患子皂苷的BN-SDS二维凝胶电泳图；图9B为毛地黄苷的BN-SDS二维凝胶电泳图；图9C为烷基糖苷的BN-SDS二维凝胶电泳图；图9D为Triton X100的BN-SDS二维凝胶电泳图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实施例1：

一种含无患子总皂苷的蛋白质提取液(即无患子总皂苷蛋白质提取液)，以质量百分比计所述提取液含8％的无患子总皂苷和1％的DTT，余量为蒸馏水。

无患子总皂苷是从无患子假果皮中纯化出来的一类三萜皂苷或倍半萜皂苷的混合物，由极性的糖苷链和非极性的五环三萜组成的具有表面活性剂性能的类表面活性剂，其结构通式如图1，其结构上与毛地黄苷(如图2)有些许相似，与Triton-X100(如图3)和烷基糖苷(如图4)存在较大的区别。

采用上述提取液进行蛋白质提取，详情如下：

将组织或细胞与无患子皂苷提取液按照1：5(g/ml)的比例研磨或超声提取5分钟，12000g离心10分钟，取上清的蛋白质提取液。其他的提取液按照与无患子皂苷提取液同样的步骤进行，待提取的细胞数量相同。详见图5，其中：泳道1为8M尿素、8％无患子总皂苷、1％DTT混合液，泳道2为实施例1的无患子总皂苷蛋白质提取液，泳道3为8M尿素、4％皂苷、1％DTT混合液，泳道4为8M尿素、4％CHAPS、1％DTT混合液；泳道5为8M尿素、4％皂苷、2M硫脲、1％DTT，泳道6为8M尿素、4％CHAPS、2M硫脲、1％DTT混合液(现有技术中最好的提取液)。从图5中可以明确的看出，实施例1的无患子总皂苷蛋白质提取液能够更加完全地提取细胞中的全蛋白质，主要原因在于无患子总皂苷能够提高蛋白质复合体在水溶液中的溶解度而不破坏蛋白质的相互作用；对SDS-PAGE兼容性最好。

实施例2-3：

本实施例2与实施例1不同之处在于：

一种含无患子总皂苷的提取液(即无患子总皂苷蛋白质提取液)，以质量百分比计所述提取液含2％的无患子总皂苷和2％的DTT，余量为蒸馏水。

本实施例3与实施例1不同之处在于：

一种含无患子总皂苷的提取液(即无患子总皂苷蛋白质提取液)，以质量百分比计所述提取液含10％的无患子总皂苷和0.8％的DTT，余量为蒸馏水。

实施例2-3的无患子总皂苷蛋白质提取液也能够很好地提取细胞中的全蛋白质，对SDS-PAGE兼容性也好。

实施例4：

一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液含8％的无患子总皂苷、2％尿素、1％二硫苏糖醇、2％Ampholytes两性电解质，余量为水。

将本实施例的等电聚焦裂解液进行等电聚焦，具体是：将本实施例的等电聚焦裂解液与现有技术中的裂解液(CHAPS等电聚焦裂解液：8M硫脲、2M硫脲、4％CHAPS、1％DTT、2％Ampholytes两性电解质)分别溶解细胞全蛋白质，然后加入到等电聚焦的IPG胶条上，按照表1常规的等电聚焦程序进行：

表1等电聚焦电压程序

步骤	电压	梯度	微安	时间/电压时	功能单元
						1	250	线性	25	30分钟
2	500	快速	25	1小时	脱盐
						3	4000	线性	25	3小时
4	4000	快速	25	20000伏时
						5	500	快速	25	24小时	保持

本实施例无患子皂苷和CHAPS用于等电聚焦后的双向电泳图详见图6和图7，可知：使用无患子总皂苷可以降低尿素的使用浓度，比现有技术(8M硫脲、2M硫脲、4％CHAPS、1％DTT)要好得多。无患子总皂苷能提高等电聚焦的分辨率，不会在等电聚焦过程中造成蛋白质丢失，而现有技术在等电聚焦过程中导致了蛋白质的丢失。因此，在蛋白质的等电聚焦时，使用无患子总皂苷配方能极大改善等电聚焦时的缓冲液环境，蛋白质的表面电荷不被改变(不改变蛋白质本身的等电点)且保持良好的溶解性(等电聚焦电泳过程中不发生聚集沉淀)，能将细胞或组织的全蛋白质得以更好地分离和展现。

实施例5-6：

本实施例5与实施例4不同之处在于：

一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液含5％的无患子总皂苷、1.8％尿素、1.2％二硫苏糖醇、2.2％Ampholytes两性电解质，余量为水。

本实施例6与实施例4不同之处在于：

一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液含10％的无患子总皂苷、1.5％尿素、0.5％二硫苏糖醇、1.5％Ampholytes两性电解质，余量为水。

实施例5-6的等电聚焦裂解液也能将细胞或组织的全蛋白质得以更好地分离和展现。

实施例7：

无患子皂苷在蛋白质非变性凝胶电泳上的应用，具体是：

取毛地黄苷、烷基糖苷、Triton X-100以及本实施例中无患子总皂苷分别配置成4.6％的水溶液，然后分别用来提取相同量的小鼠线粒体膜蛋白，随用采用blue native-PAGE(BN-PAGE)来分离提取到的蛋白质，详见图8，其中：A为毛地黄苷；B为无患子皂苷；C为烷基糖苷；D为Triton X100。从图8可知：只有B泳道最大程度保持了最上端的蛋白质复合物的完整性，本实施例采用无患子皂苷更加温和，不破坏相互作用蛋白质之间的疏水相互作用，最大程度上使蛋白质复合物保持了高度的完整性。

随后采用SDS-PAGE进行了第二维电泳，结果如图9A、图9B、图9C以及图9D，无患子皂苷能观测到更多的蛋白质相互作用的数据，图9A靠近maker的相互作用蛋白质正是在blue native-PAGE图中最上方的蛋白质复合物，而毛地黄苷、烷基糖苷和Triton X-100均为观测到。说明采用毛地黄苷、烷基糖苷和Triton X-100提取蛋白质时，这种多达15种蛋白质结合在一起的复合物被破坏。因此，本实施例无患子总皂苷在研究蛋白质相互作用时更具优势，能更加真实地反应蛋白质的实际相互作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种含无患子总皂苷的蛋白质提取液，其特征在于，以质量百分比计所述提取液含2％-10％的无患子总皂苷。

2.根据权利要求1所述的蛋白质提取液，其特征在于，以质量百分比计所述提取液还包括0.8-2％的二硫苏糖醇，余量为水。

3.根据权利要求2所述的蛋白质提取液，其特征在于，以质量百分比计所述提取液含5％-8％的无患子总皂苷以及1.0-1.5％的二硫苏糖醇，余量为水。

4.无患子总皂苷在提取蛋白质中的应用，其特征在于，采用如权利要求1-3任意一项所述的蛋白质提取液提取蛋白质。

5.无患子总皂苷在蛋白质非变性凝胶电泳中的应用，其特征在于，采用如权利要求1所述的蛋白质提取液提取蛋白质。

6.一种含无患子总皂苷的等电聚焦裂解液，其特征在于，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液含2％-10％的无患子总皂苷。

7.根据权利要求5所述的等电聚焦裂解液，其特征在于，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液还包括1.5％-2.5％尿素、0.5-2％二硫苏糖醇、1.5％-2.5％Ampholytes两性电解质，余量为水。

8.根据权利要求7所述的等电聚焦裂解液，其特征在于，以质量百分比计所述等电聚焦裂解液包括5％-8％无患子总皂苷、1.8％-2.0％尿素、0.8-1.2％二硫苏糖醇、1.8％-2.2％Ampholytes两性电解质，余量为水。

9.无患子总皂苷在等电聚焦中的应用，其特征在于，采用如权利要求6-8任意一项所述的等电聚焦裂解液进行等电聚焦。