CN104710530A - 抗副溶血弧菌ompk卵黄抗体制备及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，属于生物制品制备技术领域，它的步骤为利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。本发明以精制抗副溶血弧菌OMPK的卵黄抗体作为检测副溶血弧菌的快速检测方法，具有较高的专一性和特异性。

Description

抗副溶血弧菌OMPK卵黄抗体制备及其应用

技术领域

本发明属于生物制品制备技术领域，具体地涉及一种抗副溶血弧菌ompk卵黄抗体的制备及其快速检测应用，可用于副溶血弧菌引起的水生动物疾病的检测。

背景技术

近年来，随着海水养殖规模的不断扩大，病害频繁发生，成为制约养殖业健康发展的主要瓶颈之一，其中尤以弧菌病最为严重。业已证实，副溶血弧菌等是海水养殖动物的主要病原弧菌，同时也关系到水产品质量安全。然而，国内还缺乏成熟的弧菌快速检测手段以满足对水产疾病控制和水产品安全，特别是早期诊断技术和手段。目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的研究，但是大多是采用全菌苗制备多克隆抗体或多克隆抗体而建立的快速检测方法，目前，国内外已经开展了大量弧菌病免疫检测技术的研究，但是大多是采用多克隆抗体而建立的快速检测方法，存在交叉反应、特异性和灵敏性等方面的缺陷，而卵黄抗体具有不同于哺乳动物抗体的特殊生物学特性，尤其是由亚单位疫苗制备的卵黄抗体具有更好的特异性和灵敏性，在水产动物致病弧菌的快速检测中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，并作为诊断抗体建立检测副溶血弧菌的ELISA方法，用于副溶血弧菌的检测与防治。

本发明是通过如下技术方案来实现的

一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。

进一步，所述的副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备方法，根据ompk基因序列设计引物，利用所述引物对抗副溶血弧菌的基因组DNA进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶分离并回收ompk片段，并用试剂盒纯化回收的ompk片段，将纯化后的ompk片段、原核表达载体pET28a进行双酶切，用T4连接酶连接ompk酶切回收产物和pET28a酶切回收产物，得到重组阳性质粒，将重组阳性质粒在BL21感受态细胞中诱导表达，表达产物利用柱层析进行纯化。

进一步，所述根据ompk基因序列设计引物：

上游引物vp1-ompk-28a-F：5’-CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3’

下游引物vp1-ompk-28a-R：5’-CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3’(划线部分为SalI酶切位点)。

本发明还提供一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体间接ELISA方法，所述方法的最佳反应条件：抗原最适工作浓度浓度为1×10⁸cfu/mL，包被4℃过夜；一抗IgY稀释度为1:2⁸；IgY-HRP酶标抗体作1:20000稀释；选择底物的最佳反应时间为20min。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明用高纯度副溶血弧菌外膜蛋白ompk，与等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化，免疫健康海兰蛋鸡，每隔10天加强免疫1次，第3次加强免疫后1周 开始收集鸡蛋。鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗体的卵黄抗体，再应用Sephadex G-200凝胶层析柱进一步纯化，所得样品经SDS-PAGE电泳检测，证实获得精制抗副溶血弧菌外膜蛋白ompk的卵黄抗体。本发明以精制抗副溶血弧菌外膜蛋白OMPK的卵黄抗体作为检测副溶血弧菌的快速检测方法，具有较高的专一性和特异性。

建立基于IgY的间接ELISA测定抗原浓度的技术方法，确定抗原包被浓度、一抗IgY和酶标二抗最适稀释倍数，抗原包被条件的选择，底物的最佳反应时间等间接ELISA的实验条件。用建立起来的间接ELISA检测几种常见的致病性海洋弧菌及常见细菌：副溶血弧菌、哈氏弧菌、鳗弧菌、创伤弧菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。发现只能检测到副溶血弧菌，其他细菌皆为阴性，表现出了较高的特异性。

附图说明

图1重组OMPK的表达、纯化及Western blotting检测M:Marker 1:阴性对照 2:诱导前 3:诱导后 4:纯化的ompk，5:纯化的ompk蛋白Western blotting检测。

图2硫酸铵沉淀纯化后IgYSDS-PAGE电泳图：M蛋白Mark；1卵黄WSF；2硫酸铵法粗提卵黄抗体；

图3IgY的凝胶洗脱图谱；

图4不同纯化阶段IgY凝胶电泳图：M Mark；1 WSF；2第一次硫酸铵后；3第二次硫酸铵后；4凝胶层析后。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

一种抗副溶血弧菌OMPK的卵黄抗体制备方法，利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应用Sephadex G-200凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。具体方法如下：

1、副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备 

(1)PCR引物设计

根据ompk基因组序列，利用Primer(Version 5.0)基因分析软件，设计引物，进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物vp1-ompk-28a-F：5’-CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3’(划线部分为EcoRI酶切位点)

下游引物vp1-ompk-28a-R：5’-CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3’(划线部分为SalI酶切位点)

(2)PCR扩增、电泳 

以引物vp1-ompk-28a-F/vp1-ompk-28a-R进行PCR扩增。PCR扩增反应体系为：

扩增条件：95℃5min；94℃1min，68℃4min，共30个循环；72℃10min。用1％琼脂糖凝胶分离并回收相应的目的片段，并用试剂盒纯化PCR产物。

(3)PCR产物酶切

按照内切酶说明书，将ompk的PCR产物用EcoRI、SalI进行双酶切分析：

混匀，37℃作用3h，1.0％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果

(4)表达质粒的双酶切

原核表达载体pET28a BamHI/SalI双酶切反应体系如下：

将各组分混匀分装入0.5mL离心管，37℃水浴作用3h。

(5)连接

分别取ompk以及pET28a酶切回收产物，参照T4连接酶(TAKARA)的说明书，连接体系中ompk与表达载体pET28a的克分子数之比约为2～10：1。

连接体系如下：

将各组分轻轻混匀，16℃连接过夜。重组阳性质粒分别命名为pET28a-ompk。

(6)原核重组表达载体在BL21中的诱导表达 

将序列和阅读框完全正确的重组阳性质粒pET28a-ompk转化BL21感受态细胞、培养，挑取单个菌落接种于3ml LB液体培养基(含100ug/ml卡那霉素)中，37℃振摇培养过夜。同时转化空载体pET28a做阴性性对照，按1:100比例转接于5ml LB液体培养基中，250rpm/min 37℃剧烈振荡培养，待其OD600nm值达到0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃进行诱导6h后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)电泳检测表达结果。

(7)表达产物的SDS-PAGE

按蛋白质的SDS-PAGE电泳方法进行，方法如下：

12％分离胶的配制：

混匀后立即小心地将分离胶灌注于准备好的玻璃板间歇中，并留出浓缩胶 所需的空间(梳齿长加1cm)，用吸管沿玻璃板壁小心滴加一层ddH2O，将凝胶垂直置于室温下，不要随意移动以免凝胶聚合后表面不平。聚合后，倾出覆盖层液体，用ddH2O洗涤凝胶顶部数次，除去未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸吸去残留的液体。

6％的浓缩胶的配制：

以上成分快速混合后灌注于已聚合的分离胶上层，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，将凝胶垂直放置于室温下，避免移动。待浓缩胶聚合后，小心拔出梳子，用ddH₂O冲洗加样槽除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶固定在电泳装置上，加入1×电泳缓冲液。取1mL的诱导表达菌，12000r/min离心30sec，弃上清，用100μL 1×SDS-PAGE加样缓冲液重悬菌体，反复冻融三次，于沸水中煮沸5～10min，冷却至室温，12000r/min离心2min，弃沉淀，其上清可直接进行SDS-PAGE分析。将样品加入到加样孔中，然后进行电泳，开始电压为90-120V，待样品进入分离胶后将电压调至120-180V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶的底部，取下凝胶，放置5倍体积的染色液中，室温振荡染色4h，将凝胶侵入脱色液中，其间更换3-4次，直至背景透明。

SDS-PAGE分析显示(见图1)：经ITPG诱导后，重组质粒pET28a-OMPK在229.1的位置出现一条着色较深的条带，与预期表达产物大小相符，初步说明目的片段在大肠杆菌BL21中得到了表达。重组表达的上清蛋白经HisTrap纯化、浓缩后， 采用Bradford方法测定ompk蛋白浓度为5.5mg ml-1。

(8)从4℃保存的培养板上挑选生长良好的单菌落，用无菌接种环接种于LB液体培养基中(含有卡那霉素100μg/ml)，37℃，160rpm振荡过夜。次日取过夜培养的5ml菌液以1：100倍稀释于500ml LB液体培养基中(含有卡那霉素100μg/ml)，37℃，200rpm振摇约3小时，至OD_600nm约为0.6-0.8之间时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，180rpm继续振摇5小时。诱导表达菌6000g，4℃离心20min，弃上清，加入适量超声裂解缓冲液以及RNase 50μg/ml、PMSF 100μg/ml、溶菌酶50μg/ml，混合均匀，同时边搅拌边加入终浓度为50μg/ml Dnase，室温作用30min。400W超声作用80次，5sec/次，间隔10sec。4℃，12000g离心15min，分离上清和沉淀。

重组OMPK蛋白的纯化参照HisTrap说明书略作修改，步骤如下：

用3-5个柱床体积的蒸馏水洗去柱内的乙醇，用至少5个柱床体积的结合缓冲液平衡柱，采用1ml/min的流速。用注射器将裂解液上到柱上，用10－15个柱床体积结合缓冲液冲洗，直到吸收曲线稳定在基线。用5个柱床体积的洗脱缓冲液分部或线性梯度洗脱，收集洗脱液，采用Bradford方法测定蛋白的浓度。

2、蛋鸡的免疫 

用浓度为1mg/ml的副溶血弧菌外膜蛋白ompk，与等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化，免疫健康海兰蛋鸡。免疫采取胸、颈、翼下4点皮下注射，首次免疫注射含弗氏完全佐剂的抗原，剂量为每只1.0ml。10d后第1次加强免疫，每只1.5ml；20d后进行第2次加强免疫，每只2.0ml；第2次加强免疫后1周开始收集鸡蛋，根据具体效价确定是否进行进行第3次加强免疫。加强免疫时注射含弗氏不完全佐剂的抗原。同时设未免疫对照组。

3、初步分离、提取和纯化IgY

鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，加入9倍体积的蒸馏水，调pH 5.2，4℃静置12h后10000r/min离心20min，收集上清液得到粗提物。然后滴加等体积饱和硫酸铵溶液使其饱和度达50％，4℃静置过夜后离心得到沉淀物，用等体积蒸馏水溶解后滴加饱和硫酸铵溶液使其饱和度达33％，4℃静置1h后离心得到沉淀物，用原1/2体积PBS缓冲液溶解沉淀物，并用透析袋除盐。透析液经Sephadex G-200凝胶层析柱进一步纯化，冷冻干燥，-20℃保存，并通过SDS-PAGE电泳检测样品纯化效果。

按蛋白质的SDS-PAGE电泳方法进行，方法如下：

12％分离胶的配制：

匀后立即小心地将分离胶灌注于准备好的玻璃板间歇中，并留出浓缩胶所需的空间(梳齿长加1cm)，用吸管沿玻璃板壁小心滴加一层ddH2O，将凝胶垂直置于室温下，不要随意移动以免凝胶聚合后表面不平。聚合后，倾出覆盖层液体，用ddH2O洗涤凝胶顶部数次，除去未聚合的丙烯酰胺，并用滤纸吸去残留的液体。

6％的浓缩胶的配制：

将以上成分快速混合后灌注于已聚合的分离胶上层，并立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子，将凝胶垂直放置于室温下，避免移动。待浓缩胶聚合后，小心拔出梳子，用ddH₂O冲洗加样槽除去未聚合的丙烯酰胺，将凝胶固定在电泳装置上，加入1×电泳缓冲液。取1mL的诱导表达菌，12000r/min离心30sec，弃上清，用100μL 1×SDS-PAGE加样缓冲液重悬菌体，反复冻融三次，于沸水中煮沸5～10min，冷却至室温，12000r/min离心2min，弃沉淀，其上清可直接进行SDS-PAGE分析。将样品加入到加样孔中，然后进行电泳，开始电压为90-120V，待样品进入分离胶后将电压调至120-180V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶的底部，取下凝胶，放置5倍体积的染色液中，室温振荡染色4h，将凝胶侵入脱色液中，其间更换3-4次，直至背景透明。

用硫酸铵法提取的IgY为无气味残留，经测定，蛋白浓度为0.911±0.09mg/mL。通过SDS-PAGE电泳图谱(图2)可知，IgY的重链分子量为67kD，轻链分子量为23kD.。卵黄WSF的蛋白条带很多，硫酸铵法纯化的条带也比较清晰，杂蛋白减少很多。

将硫酸铵二次盐析后PEG-6000浓缩后的样品通过Superdex G-75凝胶柱，自动收集，绘制洗脱曲线。结果见图3。

以抗副溶血弧菌特异性IgY的水溶液组分、第一次硫酸铵后溶液、第二次硫酸铵后溶液、凝胶层析后溶液为样品，用SDS-PAGE电泳检测IgY纯化情况，结果见图4。

实施例2间接ELISA方法的建立 

一种抗副溶血弧菌OMPK的卵黄抗体间接ELISA方法，所述方法的最佳反应条件为：抗原最适工作浓度浓度为1×10⁸cfu/mL，包被4℃过夜；一抗IgY稀释度为1:2⁸；IgY-HRP酶标抗体作1:20000稀释；选择底物的最佳反应时间为20min。具体步骤为：

1、用棋盘式滴定法确定最佳抗原包被浓度和最佳一抗浓度

将10⁹cfu/mL浓度的副溶血弧菌作系列10倍梯度稀释至10⁴cfu/mL。每个稀释度包被3个孔、每孔100μL，4℃过夜。一抗IgY初始浓度为1.97mg/mL,依次作系列10倍稀释至1:10¹⁰，酶标抗体做1:20000稀释，间接ELISA测定。以能产生OD₄₅₀值为1.0左右，且P/N值(阳性对照OD₄₅₀值-空白对照OD₄₅₀值/阴性对照OD₄₅₀值-空白对照OD₄₅₀值)最大的抗原稀释度和抗体稀释度作为抗原、抗体最适反应比^[1,2]。

采用方阵滴定法做抗原和特异性IgY抗体的倍比稀释，结果显示当抗原浓度为10⁸和10⁹cfu/mL、一抗浓度为1:2⁸时OD₄₅₀的值均靠近1.0，但抗原浓度为10⁸cfu/mL时OD₄₅₀的值较大，所以确定抗原浓度为10⁸cfu/mL一抗浓度1:2⁸。

2、酶标二抗最适浓度的确定

将抗原、一抗稀释至最适反应比，兔抗鸡IgY-HRP酶标二抗分别稀释为1：10000、1：15000、1：20000、1：25000、1：30000，其他条件相同，进行间接ELISA检测。根据P/N值确定酶标二抗的最适浓度。结果显示，当酶标二抗浓度为1:15000和1:20000时，阳性值最接近1.0，而只有在1:20000P/N值最大，所以确定HRP酶标二抗最佳工作浓度为1:20000。

3、包被条件的选择

以最佳抗原包被酶标板，包被条件分别为：37℃1h后4℃过夜；37℃2h后4℃过夜；4℃过夜；37℃2h，一抗IgY、酶标二抗为最佳浓度，其他条件相同， 进行间接ELISA检测。根据P/N值确定最佳包被条件。选择37℃1h后4℃过夜、常温1h后4℃过夜、4℃过夜、37℃2h，4种不同的包被条件。结果显示，当包被液的包被条件为37℃2h时值最接近1.0，且P/N值最大。

4、灵敏度评价：

副溶血弧菌悬液稀释梯度为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²cfu/mL为检测样品，同时做空白对照和阴性对照。通过比较样品和阴性对照OD₄₅₀值，以P/N值≥2.1为最低检测限。副溶血弧菌悬液的稀释浓度依次为10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²cfu/mL，各项条件均为最佳条件，进行间接ELISA检测OD₄₅₀值，能检测到10³cfu/mL的副溶血弧菌，灵敏度高。

Claims (4)

1.一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体制备方法，其特征在于利用副溶血弧菌重组ompk蛋白对蛋鸡进行接种免疫，对接种后的鸡所产的鸡蛋在除去蛋白后用蒸馏水漂洗得到纯卵黄液，对纯卵黄液进行离心、收集上清液，应用饱和硫酸铵溶液沉淀法制备粗制的卵黄抗体，再应用凝胶层析柱进一步纯化，获得精制抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的副溶血弧菌重组ompk蛋白的制备方法，根据ompk基因序列设计引物，利用所述引物对抗副溶血弧菌的基因组DNA进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶分离并回收ompk片段，并用试剂盒纯化回收的ompk片段，将纯化后的ompk片段、原核表达载体pET28a进行双酶切，用T4连接酶连接ompk酶切回收产物和pET28a酶切回收产物，得到重组阳性质粒，将重组阳性质粒在BL21感受态细胞中诱导表达，表达产物利用柱层析进行纯化。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述根据ompk基因序列设计引物：上游引物vp1-ompk-28a-F：5’-CCGGAATTCTTCGGCGGTCGCTCTGG-3’

下游引物vp1-ompk-28a-R：5’-CGCGTCGACGAACTTGTAAGTTACTGC-3’。

4.一种抗副溶血弧菌ompk的卵黄抗体间接ELISA方法，其特征在于所述方法的反应条件：抗原工作浓度浓度为1×10⁸cfu/mL，包被4℃过夜；一抗IgY稀释度为1:2⁸；IgY-HRP酶标抗体作1:20000稀释；选择底物的反应时间为20min。