CN103995126B - 一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的elisa试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明通过免疫沉淀技术筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL，利用原核表达载体表达GroEL重组蛋白，并利用该抗原蛋白建立了检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒。本发明试剂盒在检测鸡白痢沙门氏菌抗体过程中能够减少鸡的应激，并提高检测特异性和敏感性。

Description

一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及抗原制备及ELISA试剂盒，具体地说，涉及一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒。
背景技术
鸡白痢是由鸡白痢沙门氏菌引起的败血性传染性疾病，其排泄物是重要的传播媒介，同时也可通过鸡蛋垂直传播，是危害养鸡业最严重的疾病之一。
鸡白痢沙门氏菌多侵害20日龄以内幼雏，引起白色下痢，病死率极高，成年鸡则可带菌而无临床症状。该病既可垂直传播，又有严重的水平传播，所以造成的危害和经济损失巨大。目前西方国家已完全消灭了鸡白痢，但我国仍然爆发严重。常规的鸡白痢检测方法为平板凝集，通过针刺鸡采血，在平板上与鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原混合，通过出现凝集现象来判断是否感染鸡白痢沙门氏菌。由于通过针刺采血对鸡应激大，容易造成鸡的生产性能下降，甚至肝脾破裂死亡，蛋鸡尤为明显，同时大型鸡场存栏量大，工作量繁重，而一般阴性血清在足够时间下也会产生凝集，易造成假阳性。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是建立一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA方法，在检测鸡白痢过程中减少鸡的应激，提高特异性和敏感性。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，所述试剂盒内含有鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白。
进一步地，所述试剂盒内设有：包被鸡白痢沙门氏菌抗原的抗体检测板，酶标抗体，阳性对照为鸡白痢阳性血清，阴性对照为鸡白痢阴性血清。
作为优选，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体。
进一步地，所述鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白为纯化的鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL。
更进一步地，所述鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL是由原核表达载体pET-28a-GroEL表达的，原核表达载体pET-28a-GroEL是由以下方法构建而成的：
1）设计一对含有酶切位点的特异性引物：
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamHⅠ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC XhoⅠ；
2）利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a-GroEL载体，转化大肠杆菌DH5α感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL构建成功。
进一步地，所述试剂盒内设有：封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
封闭液为PBST配制5%脱脂奶粉；样品稀释液为1×PBS；洗涤液为PBST；显色液为100mmol柠檬酸钠溶液24.3mL，200mmol磷酸氢二钠25.7ml，加入50mg TMB，临用前加入50微升30%H2O2配制；终止液为2M浓硫酸。
本发明还提供了所述试剂盒的使用方法：
将待检血清或者蛋黄液按1:100比例经PBS稀释后加入抗体检测板中，每孔100μL，并同时设立好阴、阳性对照，37℃作用1小时；接着PBST洗三遍；用PBS将辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG抗体按1:5000稀释，每孔100μL加入反应板中，37℃作用30分钟；接着PBST洗三遍；按每孔加入100μL显色液，37℃作用约15分钟后加入2M硫酸终止液终止反应，最后通过酶标仪检测，阴性平均值+2.58SD为临界值，大于临界值判为阳性，反之为阴性。
本发明还提供了一种表达鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL的载体。
进一步地，所述载体为原核表达载体，是由以下方法构建而成的：
1）设计一对含有酶切位点的特异性引物：
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamHⅠ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC XhoⅠ；
2）利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a-GroEL载体，转化大肠杆菌DH5α感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL构建成功。
本发明的有益效果在于：
本发明通过免疫沉淀技术筛选出鸡白痢沙门氏菌优势抗原GroEL，该抗原具有良好的特异性和敏感性，可用于鸡蛋和血清中鸡白痢沙门氏菌抗体检测，可以大大减少鸡的应激，提高经济效益，提高工作效率。
附图说明
图1为本发明实施例1中鸡白痢阴、阳性血清纯化IgG；
其中，A为鸡白痢阳性血清纯化IgG，M：蛋白分子量标准；1：纯化前；2：纯化后；B为鸡白痢阴性血清纯化IgG，M：蛋白分子量标准；1：纯化后；2：纯化前。
图2为本发明实施例1中免疫沉淀技术筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原；A为SDS-PAGE电泳图；B为肽指纹图谱分析图；
其中，M：蛋白分子量标准；1：鸡阴性血清（纯化后IgG）；2：鸡白痢沙门氏菌阳性血清（纯化后IgG）；3：鸡白痢沙门氏菌抗原复合物；4：beads+兔抗鸡IgG二抗+鸡白痢沙门氏菌抗原复合物；5：beads+兔抗鸡IgG二抗+鸡阴性血清（纯化后IgG）+鸡白痢沙门氏菌抗原复合物；6：beads+兔抗鸡IgG二抗+鸡白痢沙门氏菌阳性鸡血清（纯化后IgG）+鸡白痢沙门氏菌抗原复合物。
图3为本发明实施例2中鸡白痢沙门氏菌基因组电泳鉴定图；
其中，M：基因组分子量标准λDNAHind III；1：鸡白痢沙门氏菌基因组DNA。
图4为本发明实施例2中鸡白痢沙门氏菌GroEL基因扩增片段的电泳鉴定图；
其中，M：DNA分子量标准；1：鸡白痢沙门氏菌GroEL基因扩增片段。
图5为本发明实施例2中pMD19-T-GroEL连接产物的双酶切电泳鉴定图；
其中，A：GroEL基因PCR鉴定；M：DNA分子量标准；1：GroEL基因；B：pMD19-T-GroEL双酶切鉴定；M：DNA分子量标准；1：空载质粒双酶切前；2：pMD19-T-GroEL质粒双酶切后。
图6为本发明实施例2中pET-28a-GroEL连接产物的双酶切电泳鉴定图；
其中，A：GroEL基因PCR鉴定；M：DNA分子量标准；1：GroEL基因；B：pET-28a-GroEL双酶切鉴定；M：DNA分子量标准；1：空载质粒双酶切前；2：pET-28a-GroEL质粒双酶切后。
图7为本发明实施例3中原核表达载体的转化与诱导表达SDS-PAGE电泳图；
其中，M：蛋白分子量标准；1：诱导前空载体；2：诱导后空载体；3：含pET-28a-GroEL质粒的BL21基因工程菌诱导前表达细菌总蛋白；4：含pET-28a-GroEL质粒的BL21基因工程菌诱导后表达细菌总蛋白。
图8为本发明实施例3中GroEL重组蛋白的蛋白印迹鉴定；
其中，A：His单克隆抗体检测；1：GroEL-His重组蛋白；2：空载体诱导对照；B：鸡白痢阴性血清(鸡场采集)检测；3：GroEL-His重组蛋白；4：空载体诱导对照；C：鸡白痢阳性血清(鸡场采集)检测；5：空载体诱导对照；6：GroEL-His重组蛋白。
图9为本发明实施例3中GroEL重组蛋白的纯化中SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析；
其中，M：蛋白分子量标准；1：含pET-28a-GroEL质粒的BL21基因工程菌诱导表达细菌总蛋白；2：穿透液蛋白；3：洗脱液蛋白；4：纯化的GroEL-His蛋白。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1免疫沉淀（pulldown）技术筛选鸡白痢沙门氏菌优势抗原
1平板凝集实验
取10μL鸡白痢、鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原滴于一块干净的玻片上，接着取10μL鸡场采集的血清滴于该玻片上，上下颠倒进行充分混合，2min内出现凝集颗粒，液体清亮判为阳性，不出现凝集颗粒则判为阴性，以SPF鸡为阴性对照。分别鉴定出鸡白痢阴、阳血清用于免疫沉淀。
2鸡白痢阴、阳性血清纯化IgG
2.1透析袋处理：取200ml溶液Ⅰ（用蒸馏水配制，含2%（W/V）碳酸氢钠、1mmolEDTA，氢氧化钠调pH为8.0构成）于烧杯中，将烧杯置于水浴锅内煮沸，接着将一定长度的透析袋放入溶液Ⅰ中缓慢搅动，10min后取出烧杯自然冷却，接着用蒸馏水彻底冲洗透析袋7-8次；下一步取200ml溶液Ⅱ（蒸馏水配制1mmolEDTA，氢氧化钠调pH为8.0）于烧杯中，操作同上。
2.2分别取经过平板凝集实验鉴定的鸡白痢阴、阳性血清300μL加入2ml EP管，接着加入等体积300μL灭菌生理盐水充分混匀。逐滴加入饱和硫酸铵溶液600μL使其饱和度达到50%，室温放置30min，4℃、12000rpm，离心10min弃上清。加入1ml灭菌生理盐水溶解沉淀，再次逐滴加入饱和硫酸铵溶液538μL使其饱和度达到35%，室温放置30min，4℃、12000rpm，离心10min弃上清。加入1ml灭菌生理盐水溶解沉淀，重复上述操作。最后离心20min，尽量弃掉上清。加入300μL灭菌生理盐水溶解沉淀，装入透析袋中，4℃透析24h，当中换液数次、用1%氯化钡溶液检测透析效果。鸡白痢阴、阳性血清纯化IgG前后的蛋白质分子量见图1。
透析完毕测定IgG浓度，测定结果为25μg/μL。之后取少量抗体，加入6×SDS上样缓冲液煮沸10min进行SDS-PAGE，检测纯化IgG纯度。
检测纯化IgG纯度是因为免疫沉淀要求用到的抗体具备良好的纯度，鸡场采集的血清含有很多非IgG成分，容易影响免疫沉淀的结果，通过SDS-PAGE可以清楚看到除了IgG重轻链外，较少其他杂蛋白，达到免疫沉淀的要求。
3鸡白痢沙门氏菌抗原复合物的制备
取10μL鸡白痢沙门氏菌标准株533甘油菌加入到5ml LB液体培养基活化过夜，接着全部转入200ml LB液体培养基37℃振摇培养过夜，4℃、5000g/min离心5min收集菌体，用20ml灭菌PBS清洗菌体、离心弃上清。用10ml灭菌PBS重悬菌体，对收集的菌体进行超声裂解，裂解条件为：4℃冰浴，槽温40℃，间断超声，工作2s、间歇3s，共1800s，功率为35%。接着12000g/min，离心20min，弃沉淀、收集上清，测定蛋白浓度，测定结果为20μg/μL，将鸡白痢沙门氏菌抗原复合物保存于-80℃用于免疫沉淀。
4免疫沉淀探寻鸡白痢沙门氏菌蛋白抗原
4.1protein A/G beads处理
取500μL25%protein A/G beads4℃、3000rpm离心3min弃上清；加入2M盐酸胍至1ml4℃颠倒孵育30min-1h；4℃、3000rpm离心3min弃上清；加入灭菌水500μL重悬beads，4℃、3000rpm离心3min弃上清，重复该步骤3次。接着加入Lysis Buffer500μL重悬beads，4℃颠倒孵育1h；4℃、3000rpm离心3min弃上清；加入Lysis Buffer500μL重悬beads，4℃、3000rpm离心3min弃上清，重复该步骤2次；最后加入Lysis Buffer500μL重悬beads，保存于4℃。
4.2beads、兔抗鸡IgG、鸡白痢阴阳性血清（纯化后IgG）偶联物制备
取50μLbeads、60μL兔抗鸡IgG、200μL鸡白痢阳性血清（纯化后IgG）加入1.5ml EP管，之后加入690μL Lysis Buffer混匀，4℃颠倒孵育8h；按相同操作取50μL beads、60μL兔抗鸡IgG、200μL鸡白痢阴性血清（纯化后IgG）进行偶联；同时取50μLbeads、60μL兔抗鸡IgG，4℃颠倒孵育4h偶联作为对照。
4.3免疫沉淀（pulldown）实验
取鸡白痢沙门氏菌抗原复合物解冻，将990μL上清转移到1.5mlEP管中，分为3管，其中每管加入10μL beads4℃颠倒孵育4h，4℃、3000rpm离心3min，将900μL上清转移到新的1.5ml EP管中；分别将偶联好的beads、兔抗鸡IgG、鸡白痢阳性血清（纯化后IgG）复合物，beads、兔抗鸡IgG、鸡白痢阴性血清（纯化后IgG）复合物，beads、兔抗鸡IgG复合物加入到该EP管内，并加入15μL蛋白酶抑制剂，4℃颠倒孵育8h。4℃、3000rpm离心3min，小心弃上清；向其中加入1mlLysis Buffer轻轻重悬复合物，4℃、3000rpm离心3min弃上清，如此重复洗涤4-6次。最后离心完全弃掉上清，加入40μL1×SDS上样缓冲液煮沸10min，之后12000rpm离心5min。同时取20μL鸡白痢沙门氏菌抗原复合物、按1：20稀释的鸡白痢鸡白痢阴、阳性血清（纯化后IgG）分别加入6×SDS上样缓冲液煮沸10min。
4.4SDS-PAGE电泳、染色、脱色
所有配方参考《分子克隆三》配制12%蛋白胶，电泳时将4.3煮过的样品都分别加到一个孔内，然后再加一个蛋白分子量标准，开始以80V电压进行电泳，当样品进入分离胶后调为160V电压，直到10kDa蛋白带在胶最下缘时停止。值得注意的是pull down实验后所有蛋白胶、染色、脱色溶液均应使用超纯水配制，在取胶、染色、脱色时均应戴上一次性塑料手套和口罩，所有器皿用浓硫酸泡过，防止蛋白污染。
4.5目的蛋白切割及保存
Pull down实验后通过SDS-PAGE染色、脱色发现有目的蛋白（见图2A），首先利用凝胶成像系统拍下照片，接着戴好手套、口罩，将蛋白胶用超纯水洗涤两遍，用新的手术刀片切下目的条带，放到干净的进口1.5mlEP管内。每条特异条带放入一个EP管内，之后装到自封袋内，做好标记暂时冻存于-20℃。将目的蛋白条带送到中国科学院生物物理所进行肽指纹图谱分析（见图2B），将分析得到的数据放到数据库进行比对，确定得到目的蛋白为GroEL蛋白。
实施例2鸡白痢沙门氏菌GroEL原核表达载体的构建
1鸡白痢沙门氏菌全基因组的提取
取鸡白痢沙门氏菌标准株533甘油菌10μL接种5mlLB液体培养基，37℃振摇过夜。
按照细菌基因组DNA快速提取试剂盒说明操作：取2ml培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。加入200μL缓冲液RB重悬，10000rpm离心30s，弃上清。将细胞振荡重悬于180μL缓冲液RB。加入20μL蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀，再加入200μL结合液CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。冷却后加入100μL异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将上一步混合物加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中）13000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。加入500μL抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。加入700μL漂洗液WB（加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加60μL洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热），室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
制备1%的琼脂糖凝胶，取5μL DNA溶液与6×DNA上样缓冲液混合后上样电泳，20min后观察并记录实验结果（见图3）。剩余DNA溶液存放-20℃。
2鸡白痢沙门氏菌基因GroEL的克隆
根据GenBank上登陆的GroEL系列，用Primer5.0设计特异性引物扩增GroEL基因片段。
上游引物GroEL-F:5'-CGCggatcc ATGGCAGCTAAAGACGTA-3'，含BamHⅠ酶切位点；
下游引物GroEL-R:5'-CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC-3',含XhoⅠ酶切位点。
以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，建立50μL PCR反应体系：
扩增程序：94℃预变性2min,94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环，最后72℃延伸5min，16℃保存。制备1%的琼脂糖胶电泳检测PCR结果（见图4）。
按照胶回收试剂盒说明操作回收DNA片段：电泳分离待回收的DNA片段，从琼脂糖凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5mL Eppendorf管中。估计凝胶体积，按100μL胶块加300μL ADB溶胶液的比例加入溶胶液，55℃-65℃溶胶约10min，期间轻摇EP管数次，使胶完全溶化。胶块完全溶解后将溶胶液转移至吸附柱中，室温12000rpm离心60s，去掉废液。向吸附柱内加入200μL漂洗液，12000rpm离心30s，去掉废液。重复洗涤一次，去掉废液后空管12000rpm离心2min以除去漂洗液。将吸附柱转移至一个干净的1.5mL Eppendorf管中，向吸附柱中央加适量体积的事先预热的洗脱缓冲液（30-50μL），室温放置2min，12000rpm离心2min，洗脱得到DNA，保存于-20℃。
感受态细胞制备：挑取LB平板上新活化的DH5α的单菌落接种于3.5ml LB液体培养基中，37℃振摇培养12h左右，直至对数期生长后期，将该菌落悬液按1:100-1:50比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃振摇培养2-3h至OD600=0.4左右。将菌液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃3000rpm离心7min，弃上清。用预冷的0.06mol/L的CaCl2溶液15ml轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，4℃3000rpm离心10min，弃上清。用预冷的0.06mol/L的Cacl2溶液20ml轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，4℃3000rpm离心10min，弃上清。加入2ml预冷含15%甘油的0.06mol/L的Cacl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置30min,即成感受态细胞悬液。冰上将感受态细胞分装成每管50μL，贮存于-80℃，可保存半年。
将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接。连接体系为：GroELgene4μL、1μL pMD19-T vector、5μL SolutionⅠ，16℃连接3h。
连接产物的转化：取感受态细胞DH5α于冰上解冻，将10μL连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min.42℃水浴热激90s，立即冰浴3min.之后将全部液体涂布于LBA平板上，37℃培养12h，观察菌落生长情况。从LBA平板上随机挑取若干个菌落亚克隆到另一块新的LBA平板上，做好标记，37℃培养过夜。
GroEL pMD19-T连接产物PCR鉴定：
扩增程序：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环，最后72℃延伸5min，16℃保存。制备1%的琼脂糖胶电泳检测PCR结果是否阳性。
GroEL pMD19-T连接产物双酶切鉴定：
将PCR鉴定为阳性的菌落接种到5ml LBA液体培养基37℃培养过夜提取质粒双酶切鉴定。
按照高纯度质粒小量快速提取试剂盒说明操作：取1.5ml过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，尽可能的倒干上清，收集菌体。用250μL溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。加250μL的溶液P2，温和上下翻转4-7次使菌体充分裂解，室温放置4min。加350μL溶液P3，立即温和地上下翻转4-7次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min,小心取上清。将上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30-60s，倒掉收集管中的废液。加入700μL漂洗液WB（已加入无水乙醇），12000rpm离心30s，弃掉废液。加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL事先在65-70℃水浴加热的洗脱缓冲液，室温放置2min，12000rpm离心1min。质粒保存于-20℃。
双酶切鉴定体系：
置于37℃温箱5h，制备1%的琼脂糖胶电泳鉴定酶切产物是否为阳性（见图5）。最后将PCR鉴定、双酶切鉴定均阳性的菌液送去测序。
将测序结果与NCBI上发表的GroEL系列进行比对，同源性为100%。
3鸡白痢沙门氏菌GroEL原核表达载体的构建
回收DNA产物和表达载体pET-28a的酶切体系：
置于37℃温箱5h，制备1%的琼脂糖胶电泳酶切产物。按照胶回收试剂盒说明操作回收酶切后GroEL基因和表达载体（操作同前）。
目的基因片段与表达载体的连接：
混匀，16℃连接过夜。第二天转化感受态细胞DH5α（操作同前）。
对重组表达载体进行PCR、双酶切鉴定（操作同前），电泳结果见图6。
实施例3重组蛋白的表达和纯化
1重组原核表达载体的转化与诱导表达
将构建好的重组表达质粒pET-28a-GroEL原核表达载体分别转化Ecoli.BL21感受态细胞，涂布于LBK平板，37℃培养过夜，利用卡那霉素抗性筛选重组转化体。分别随机挑取3个单菌落及pET-28aEcoli.BL21空载体至5mlLBK液体培养基，37℃振摇培养约4h至OD600=0.6-0.8，分别取样1ml，之后加入终浓度为1mmol/L IPTG，37℃振摇约6h，分别取样1ml。对诱导前、诱导后的样品，5000rpm离心10min收集菌体。分别加入一定量蒸馏水和6×SDS上样缓冲液煮沸10min，之后进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白表达情况。
SDS-PAGE电泳：参照分子克隆实验指南的方法配制12%的分离胶，按Bio-RAD产品说明书装好制胶板，加入分离胶（是梳子到胶面的距离约1cm），胶面上加一层水室温放置，胶充分聚合后吸去上层水用新的去离子水洗一次，再次将水吸干，加入配好的浓缩胶，插入梳子，胶充分聚合后拔出梳子即可上样进行电泳。恒压100V电泳至样品进入分离胶后，电压改为200V，电泳完毕后用适量染色液浸泡凝胶染色45min。脱色液脱色，其间更换新的脱色液数次，直至条带清晰，观察SDS-PAGE电泳后目的蛋白的表达情况（见图7）。
2重组筛选蛋白的Western-Blotting鉴定
（1）同“重组原核表达载体的转化与诱导表达”将表达样品进行SDS-PAGE电泳；
（2）转印装置的准备：电泳结束后将蛋白胶取下，按需要的蛋白胶部分大小裁剪PVDF膜，并置于无水甲醇活化30s，之后连同蛋白胶、滤纸6张置于转印液中浸泡10min。转印电极装置从负极到正极依次放置海绵垫、3层滤纸、凝胶、PVDF膜、3层滤纸和海绵垫，放置时用玻棒轻轻滚动排除所有气泡并且注意应使PVDF膜贴近凝胶；
（3）电转移：固定好转印电极后，将电极插入电转槽，注满转印缓冲液，恒压100V转印1h；
（4）封闭：取出PVDF膜标记好蛋白面，转移至5%脱脂奶封闭液中4℃过夜；
（5）一抗孵育：倾去封闭液，加入适当5%脱脂奶稀释的一抗溶液（抗His-tag单克隆抗体按1:10000稀释，鸡白痢沙门氏菌阴、阳性血清按1：500稀释）中，室温反应1h；
（6）洗涤：倾去抗体，PBST洗涤30min,其间换液数次；
（7）酶标二抗孵育：加入适当5%脱脂奶稀释的二抗溶液（山羊抗小鼠IgG-HRP按1：20000稀释，兔抗鸡IgG-HRP按1:5000稀释）中，室温反应30min；
（8）洗涤：倾去抗体，PBST洗涤1h，其间换液数次；
（9）显影：根据Western blot发光检测试剂盒提供的步骤进行，根据膜的大小，取等量的BufferA和BufferB混匀，配制成发光检测液；用镊子将免疫反应后的膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，以去除膜上多余的液体，膜的蛋白面朝上，置于洁净的保鲜膜上。用移液枪将配制好的发光检测液转移到蛋白面上，使其均匀覆盖，室温孵育3min；用镊子夹持蛋白膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，以去除膜上多余的液体。膜的蛋白面朝上，包裹于洁净的保鲜膜内，轻轻赶出其间气泡，固定在X片暗盒中；在暗室中取出一张X片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光时间依蛋白表达水平而定，将达到曝光时间的X片从暗盒中取出，放入X片洗片机中，洗片显影（见图8）。
3重组蛋白的纯化
大量表达：
1）过夜摇菌：取10μL甘油菌加入5ml LBK培养液，37℃过夜培养；
2）大量培养：将过夜培养的5ml菌液转入200ml对应的LBK中，放入摇床220-240rpm，37℃培养，当测得OD=0.6-0.8时，加入200μL1MIPTG诱导表达4-6h后，5000g，10min，4℃收集菌体，尽量弃上清；
3）清洗菌体：用30-50ml高压后的PBS（pH7.4）重悬菌体沉淀，然后重新5000g，10min，4℃收集菌体，尽量弃上清；
4）超声裂解菌体：用10ml高压后的PBS（pH7.4）重悬菌体沉淀，将菌液转入干净的50ml烧杯中，用10ml的PBS冲洗离心管，将残余的菌液也转入烧杯中。冰浴状态下放入超声裂解操作台，将探头固定于菌液中部，不能碰到杯体；
参数设置：输出功率35%
间隙开2s，停3s，共1800s
槽温度40℃；
5）分离上清和沉淀：将裂解产物放入高压灭菌过的80ml离心管中，配平后12000g，20min，4℃离心，分离上清沉淀；
6）可溶性分析：取裂解产物上清50μL，加入10μL6×SDS loadingbuffer,取小量沉淀溶于50μL高压后的PBS，加入10μL6×SDS loadingbuffer；分别混匀后沸水中煮10min,之后SDS-PAGE、考马斯亮蓝染色、脱色液脱色分析蛋白是可溶性表达、还是包涵体表达。
可溶性蛋白纯化（His-tag）：
1）除杂：用已高压灭菌的0.45μm的滤器将超声裂解后的上清除杂；
2）柱子处理：用NPI250（洗液）充分清洗柱子（5-10倍柱床体积），用NPI10（平衡液）充分平衡柱子（控制流速在1ml/min，5-10倍柱床体积）；
3）上样：将已过滤器的菌液加入经处理过的柱床内（控制流速在1ml/min），尽量重复上样两次（上样前取出100μL的原液），收集穿透液；
4）除杂蛋白：用NPI20（除杂液）除去非特异性结合在柱内的杂蛋白（控制流速在1ml/min，5-10倍柱床体积），收集除杂液；
5）用NPI250（洗液）控制流速在1ml/min，分管收集蛋白（用高压过的1.5mlEP管）；
6）分光光度计测蛋白浓度；
7）SDS-PAGE考马斯亮蓝染色分析（原液、穿透液、除杂液、纯化蛋白液），见图9。
实施例4检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒
检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒具体包括以下成分：
抗体检测板：包被有纯化的GroEL蛋白；
封闭液：PBST配制5%脱脂奶粉；
样品稀释液：1×PBS；
洗涤液：PBST；
显色液：100mmol柠檬酸钠溶液24.3mL，200mmol磷酸氢二钠25.7ml，加入50mg TMB，临用前加入50微升30%H2O2配制；
终止液：2M浓硫酸；
酶标抗体：辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体；
阳性对照为鸡白痢阳性血清；
阴性对照为鸡白痢阴性血清。
实施例5鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA检测法
通过将筛选到的鸡白痢沙门氏菌优势抗原原核表达纯化包被并用5%脱脂奶粉封闭好的ELISA抗体检测板，将待检血清或者蛋黄液按1:100（PBS稀释）加入抗体检测板中，每孔100μL，并同时设立好阴阳性对照，37℃作用1小时；接着PBST洗三遍；用PBS将兔抗鸡IgG-HRP按1:5000稀释,每孔100μL加入抗体检测板中，37℃作用30分钟；接着PBST洗三遍；按每孔加入100μL显色液，37℃作用约15分钟后加入2M硫酸终止液终止反应，最后通过酶标仪检测，将阴性值平均值+2.58SD为临界值，大于临界值判为阳性，反之为阴性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种检测鸡白痢沙门氏菌抗体的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内含有鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白。
2.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有：包被鸡白痢沙门氏菌抗原的抗体检测板，酶标抗体，阳性对照为鸡白痢阳性血清，阴性对照为鸡白痢阴性血清。
3.根据权利要求2所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡IgG抗体。
4.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述鸡白痢沙门氏菌抗原GroEL蛋白为纯化的鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL。
5.根据权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述鸡白痢沙门氏菌重组蛋白GroEL是由原核表达载体pET-28a-GroEL表达的，原核表达载体pET-28a-GroEL是由以下方法构建而成的：
1)设计一对含有酶切位点的特异性引物：
GroEL-F:CGCggatccATGGCAGCTAAAGACGTA BamH Ⅰ；
GroEL-R:CCGctcgagCATCATGCCGCCCATACC XhoⅠ；
2)利用上述特异性引物，以鸡白痢沙门氏菌基因组为模板，扩增GroEL基因片段，再利用各自引物上的限制性内切酶，分别对PCR扩增产物和pET-28a原核表达载体进行酶切，用T4DNA连接酶将扩增片段的酶切产物连接到pET-28a酶切产物上，构建pET-28a-GroEL载体，转化大肠杆菌DH5α感受态中，经酶切鉴定和测序鉴定，表明重组原核表达载体pET-28a-GroEL构建成功。
6.根据权利要求1所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内设有：封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
7.根据权利要求1-6任一项所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为：
将待检血清或者蛋黄液按1:100比例经PBS稀释后加入抗体检测板中，每孔100μL，并同时设立好阴、阳性对照，37℃作用1小时；接着PBST洗三遍；用PBS将辣根过氧化物酶标记兔抗鸡IgG抗体按1:5000稀释，每孔100μL加入反应板中，37℃作用30分钟；接着PBST洗三遍；按每孔加入100μL显色液，37℃作用约15分钟后加入2M硫酸终止液终止反应，最后通过酶标仪检测，阴性平均值+2.58SD为临界值，大于临界值判为阳性，反之为阴性。
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