CN104458719B

CN104458719B - 一种单组份tmb显色液的制备方法

Info

Publication number: CN104458719B
Application number: CN201410685416.1A
Authority: CN
Inventors: 杨秦; 张志新; 陶家春; 叶正义
Original assignee: CHENGDU VERO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: CHENGDU VERO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2017-04-05
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: CN104458719A

Abstract

本发明公开了一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：首先，分别称取柠檬酸7‑10g、磷酸氢二钠16‑20g、过硼酸钠0.1‑0.5g置于1000mL烧杯A中，加入800mL纯化水溶解；其次，将烧杯A溶液的pH调整为4.5‑6.0，加入甘油20‑30mL，再加入1‑3gEDTA；然后，称取TMB5‑40mg置于100mL烧杯B中，加入10‑30ml乙醇使其溶解；最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL，摇匀。通过本发明所制备的TMB显色液为单组份显色液，其与现有双组份TMB显色液相比，具有操作方便、灵敏度高，稳定性好、显色背景低的优点。

Description

一种单组份TMB显色液的制备方法

技术领域

本发明涉及TMB显色液领域，具体地，涉及一种单组份TMB显色液的制备方法。

背景技术

TMB是一种过氧化物酶底物，用于ELISA反应。底物产生一种可溶性淡蓝色的末端产物，可在370或635nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定量和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少，从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。

现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液大多为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，在使用上存在缺点一是不够方便，二是在包装材料上存在成本提高和资源浪费；三是使用中的混合过程容易造成批间质量不均一；四是还存在稳定性差、保存时间短、显色背景高、灵敏度低等的缺点。

现有技术的TMB显色液及其制备方法，由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠0.01-0.5mol/L，过氧化氢0.01-0.5mol/L，EDTA0.1-1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的摩尔浓度为0.1-1mmol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10%。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种单组份TMB显色液的制备方法，以克服现有TMB显色液稳定性差、显色背景高、操作麻烦的问题。

本发明解决上述问题所采用的技术方案是：一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

首先，分别称取柠檬酸7-10g、磷酸氢二钠16-20g、过硼酸钠0.1-0.5g置于1000mL烧杯A中，加入800mL纯化水溶解；

其次，将烧杯A溶液的pH调整为4.5-6.0，加入甘油20-30mL，再加入1-3gEDTA；

然后，称取TMB5-40mg置于100mL烧杯B中，加入10-30ml乙醇使其溶解；

最后，将烧杯A、烧杯B中的溶液均转移到1000mL的容量瓶，加纯化水定容至1000mL，摇匀。

采用本方法所制备的TMB显色液为单组份显色液，单组份TMB显色液避免了TMB显色液在使用之间需要将A、B液混合的操作步骤，简化操作流程，减少了操作时间，提高了效率，同时避免了因A、B液不同批次间的差异导致混合的显色剂的显色效果；并且，不会存在因HCl挥发导致的TMB显色液的有效显色成分的浓度发生改变，进而提高了TMB显色液的灵敏度；本方法中采用了过硼酸钠，与现有的过氧化氢相比较，其作为氧化剂在酶联免疫显色阶段具有较好的氧化性；并且，本方法将pH控制在4.5-6.0之间，将TMB显色液的pH控制在该范围内使得制备的单组份TMB显色液在显色过程中具有较好的稳定性、较低的显色背景；且本发明过硼酸钠替换现有的过氧化氢、过氧化脲，实验证明，过氧化硼具有更好的氧化性，本发明还加入了EDTA，使得通过本方法所制备的TMB显色液具有更好的稳定性。

进一步地，TMB10-30mg。

将TMB的质量设置为10-30mg所制备的单组份TMB显色液具有较好的显色效果，以及具有较高的灵敏度。

一种单组份TMB显色液的制备方法，所述乙醇替换成DMSO。DMSO为一种极性非质子溶剂，具有较好的渗透性，能与有机溶剂、水互溶，因此，DMSO能加快TMB的溶解，使之溶解的更充分，且使溶解后的溶液更稳定。

实验证明，DMSO作为溶剂一乙醇相比，稳定性更好。

综上，本发明的有益效果是：

1、本发明所制备的TMB显色液为单组份显色液，单组份TMB显色液避免了TMB显色液在使用之间需要将A、B液混合的操作步骤，减少了操作时间，提高了效率，同时避免了因A、B液不同批次间的差异导致混合的显色剂的显色效果；并且，不会导致的TMB显色液的有效显色成分的浓度发生改变，进而提高了TMB显色液的灵敏度。

2、本发明中采用了过硼酸钠，与现有的过氧化氢相比较，其作为氧化剂在酶联免疫显色阶段具有较好的氧化性。

3、本发明将pH控制在4.5-6.0之间，将TMB显色液的pH控制在该范围内使得制备的单组份TMB显色液在显色过程中具有较好的稳定性、较低的显色背景。

4、本发明加入了EDTA，调高了所制备的TMB显色液的稳定性。

具体实施方式

下面结合实施例，对发明作进一步地的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：

一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

首先，分别称取柠檬酸7g、磷酸氢二钠16g、过硼酸钠0.1g置于1000mL烧杯A中，加入800mL纯化水溶解；

其次，将烧杯A溶液的pH调整为4.5，加入甘油20mL，再加入1EDTA；

然后，称取TMB5mg置于100mL烧杯B中，加入10ml乙醇使其溶解；

实施例2：

一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

首先，分别称取柠檬酸10g、磷酸氢二钠20g、过硼酸钠0.5g置于1000mL烧杯A中，加入800mL纯化水溶解；

其次，将烧杯A溶液的pH调整为6.0，加入甘油30mL，再加入3gEDTA；

然后，称取TMB40mg置于100mL烧杯B中，加入30ml乙醇使其溶解；

实施例3：

一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

首先，分别称取柠檬酸9g、磷酸氢二钠18g、过硼酸钠0.2g置于1000mL烧杯A中，加入800mL纯化水溶解；

其次，将烧杯A溶液的pH调整为5.0，加入甘油25mL，再加入2gEDTA；

然后，称取TMB30mg置于100mL烧杯B中，加入20ml乙醇使其溶解；

实施例4：

一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

然后，称取TMB30mg置于100mL烧杯B中，加入10mlDMSO使其溶解；

实施例5：

一种单组份TMB显色液的制备方法，包括以下步骤：

然后，称取TMB30mg置于100mL烧杯B中，加入30mlDMSO使其溶解；

表1

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4	实施例5
						显色时间（min）	17	16	14	14	13
吸光度	5.6	5.6	5．7	5.8	5.9

表2

表1是通过本发明所制备的单组份显色液的性能比较数据；

表2是单独的过硼酸钠与过氧化氢、过氧化脲的吸光度值比较。

如表1所示，通过本发明所制备的单组份TMB显色液的显色时间均低于20min，吸光度均大于5.5，而现有的TMB显色液的显色时间在20min左右、吸光度一般都低于5.5，故本发明所之制备的单组份TMB显色液不仅克服了现有双组份显色液在使用时操作麻烦的问题，同时具有更好的显色效果和稳定性能，其中，实施例3、实施例4、实施例5具有更短的显色时间，证明加入TMB的量为10-30mg时具有所在制备的单组份TMB显色液具有更快的灵敏度，实施例3、实施例4、实施例5的吸光度值高于实施例1、实施例2，证明pH值在5.0左右时具有更好的稳定性，且实施例4、实施例5的吸光度值高于实施例3，证明将传统的溶剂乙醇用DMSO替换后，所制备的单组份TMB显色液具有更高的吸光度值，更稳定，提高了显色效果。

如表2所示，与过氧化氢、过氧化脲相比，过硼酸钠具有更好的氧化性。

如上所述，可较好的实现本发明。

Claims

1.一种单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述TMB10-30mg。

3.根据权利要求1或2所述的一种单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述乙醇替换成DMSO。