CN111505274B - 一种用于酶联免疫反应的单组份tmb显色液的制备方法 - Google Patents

一种用于酶联免疫反应的单组份tmb显色液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于酶联免疫反应的单组份TMB显色液的制备方法，本发明所含组份包括：柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液、TMB、过氧化氢、二甲基亚砜、甘油、聚乙烯醇、羟丙基‑β‑环糊精、双烷烃基磺基丁二酸钠、氨基三亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸二钠及反丁烯二酸。本发明中的单组份TMB显色液灵敏度高、稳定性好，显色性强，可以在4℃避光条件下稳定保存至少12个月。

Description

一种用于酶联免疫反应的单组份TMB显色液的制备方法
【技术领域】
本发明涉及生物体外诊断试剂技术领域，特别是涉及一种单组份TMB显色液及其制备方法。
【背景技术】
在分子生物学与病理领域中，进行Western、免疫组化(IHC)或原位杂交等试验时，传统的方法一般使用DAB(3,3’-二氨基联苯胺)作为辣根过氧化物酶(HRP)的显色底物，在显色反应中产生棕色沉淀。DAB具有一定的致癌性，而且DAB作为HRP的底物，配成溶液后稳定性差，灵敏度也比较低。TMB(3,3",5,5"-四甲基联苯胺)是一种无致癌特性的试剂，也是HRP的显色底物之一，具有高灵敏度的特性，因此被广泛用于ELISA反应(酶联免疫反应)。
现有市售的酶联免疫试剂盒所采用的TMB显色液大多为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，因此存在以下缺点：使用不够方便、提高了包装材料的成本、浪费资源，且使用中的混合过程容易造成批间质量不均一。市售的酶联免疫试剂盒也有采用单组份的TMB显色液，但是现有的单组份TMB显色液存在稳定性差、保存时间短、显色背景高、灵敏度低等问题。
在研究单组份TMB显色液时，发现在增强其稳定性方面研究比较多，公开号CN105974107A的中国专利文献，公布了采用糖类化合物或其衍生物、缓冲液、二甲基亚砜、TMB、甘油及氧化剂等为主要成分的TMB显色液，通过加入稳定剂聚乙烯吡咯烷酮，解决单组份TMB显色液的稳定性问题，但聚乙烯吡咯烷酮气味较大，在制备过程对环境不友好。另外，我们在研究中发现，在寻找稳定剂实验的过程中，在通过添加稳定剂解决稳定性的同时，显色性能会出现不同程度地下降，达不到TMB显色液的应用要求，因此有必要研究新的显色液，同时解决单组份显色液稳定性差、保存时间短、灵敏度低、显色性能差等问题。
【发明内容】
本发明目的在于克服现有技术的不足而提供一种稳定性好，保存时间长、灵敏度高、显色效果好的单组份TMB显色液以及制备方法。
本发明提供一种单组份TMB显色液，其成份包括柠檬酸、柠檬酸钠、TMB、过氧化氢、二甲基亚砜、甘油、聚乙烯醇、羟丙基-β-环糊精、双烷烃基磺基丁二酸钠、氨基三亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸二钠及反丁烯二酸。
其中，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，其中柠檬酸的浓度为0.07mol/L，柠檬酸钠的浓度为0.03mol/L；
进一步地，所述TMB的浓度为0.1-0.5g/L；
进一步地，所述过氧化氢的浓度为0.027-0.17g/L，所述二甲基亚砜的体积比为3-5％，所述甘油的体积比为0.5-1.5％，所述聚乙烯醇的浓度为3-5g/L，所述羟丙基-β-环糊精的浓度为2-4g/L，所述氨基三亚甲基膦酸的浓度为0.5-1g/L，所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为0.1-0.5g/L；
进一步地，所述双烷烃基磺基丁二酸钠的浓度为1-5g/L；
进一步地，所述双烷烃基磺基丁二酸钠具有式(I)的结构式，其中，R1、R2为烷链基团，所述R1、R2基团为以下基团的一种：R1、R2均为己基，R1、R2均为2-乙己基，R1、R2均为辛基。
优选地，所述双烷烃基磺基丁二酸钠为双(2-乙己基)磺基丁二酸钠。
Figure BDA0002471358180000031
进一步地，所述反丁烯二酸的浓度为0.1-0.5g/L；
进一步地，所述TMB显色液的pH值为3.6-3.8。
本发明还提供了一种上述单组份TMB显色液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1.配制柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸，柠檬酸钠溶于去离子水中，搅拌至溶解完全；
2.称取聚乙烯醇，边搅拌边将其加入至柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，待其完全溶解后，再依次加入羟丙基-β-环糊精，双烷烃基磺基丁二酸钠，氨基三亚甲基膦酸，乙二胺四乙酸二钠及反丁烯二酸，搅拌使其充分溶解直到没有悬浮颗粒为止；
3.称取TMB，加入二甲基亚砜，使其充分溶解；
4.将步骤3所得的溶液加入步骤2所得的溶解中，避光搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；
5.在步骤4所得的溶液加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分混匀；
6.在步骤5所得的溶液加入甘油，边加入边搅拌，使之充分混匀；
7.对步骤6所得到的溶液用HCl调节pH至3.6-3.8，微孔滤膜过滤所得的溶液，即为单组份的TMB显色液，过滤后避光2-8℃保存。
本发明的原理在于，TMB显色液中含双烷烃基磺基丁二酸钠，作为一种双亲性的分子，其溶于极性的水溶液中，其亲油基团向内，亲水基团向外形成胶束，胶束使TMB被包藏或吸附，可以使TMB稳定地在水溶液中分散，提高TMB的溶解量，从而使得TMB显色的灵敏性提高。反丁烯二酸作为抗氧化助剂，能作用与显色液体系减缓氧化，可以提高TMB溶液的稳定性。
本发明与现有技术对比的有益效果在于：
本发明为单组份TMB显色液，通过TMB、二甲基亚砜、甘油、缓冲液以及稳定剂和抗氧化助剂以特定浓度互配，使显色液灵敏度高、稳定性好、保存时间长、灵敏度与稳定性均比商用显色液强。
本发明同时解决了现有的单组份TMB显色液在制备过程产生气味的问题，在解决稳定性的基础上还提高了显色性能，可以作为替代现有商用TMB显色液的理想选择。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
实施例1
本实施例提供一种单组份TMB显色液包括如下浓度的各组分：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L，其中柠檬酸0.07mol/L，无水柠檬酸钠0.03mol/L；
聚乙烯醇：3g
羟丙基-β-环糊精：2g
双(2-乙己基)磺基丁二酸钠：1g
氨基三亚甲基膦酸：0.5g
乙二胺四乙酸二钠：0.1g
反丁烯二酸：0.1g
甘油：5ml
二甲基亚砜：30ml
TMB：0.1g
过氧化氢：0.027g
所述的TMB显色液pH为3.6-3.8
本实施例所述单组份TMB显色液制备方法如下：
a.配制柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，将称量好的柠檬酸及柠檬酸钠溶于去离子水中，搅拌使其溶解完全；
b.将称量好的聚乙烯醇、羟丙基-β-环糊精、氨基三亚甲基膦酸、双(2-乙己基)磺基丁二酸钠、乙二胺四乙酸二钠、反丁烯二酸分别加入到步骤a中所得到柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，搅拌使其充分溶解；
c.将称量好的TMB加入到量取好的二甲基亚砜中，使其充分溶解；
d.将步骤c中所得的溶液加入到步骤b所得的溶液中，避光充分搅拌，直到溶液中不再有微小颗粒；
e.将量取好的过氧化氢加入到步骤d所得到的溶液中，搅拌使其充分混匀；
f.将量取好的甘油加入到步骤e所得到的溶液中，搅拌使之充分溶解；
g.用HCl调节pH至3.6，加入去离子水定容至1L；
h.用微孔滤膜过滤得到均一的溶液即为本实施例所述的一种单组份TMB显色液。
上述制备的TMB显色液保存方式为避光密封存放于4℃。
实施例2
本实施例提供一种单组份TMB显色液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L，其中柠檬酸0.07mol/L，柠檬酸钠0.03mol/L
聚乙烯醇：3.5g
羟丙基-β-环糊精：2.8g
双(2-乙己基)磺基丁二酸钠：3g
氨基三亚甲基膦酸：0.85g
乙二胺四乙酸二钠：0.22g
反丁烯二酸：0.2g
甘油：7.5ml
二甲基亚砜：50ml
TMB：0.5g
过氧化氢：0.17g
加入HCl至TMB显色液pH值为3.8
本实施例所述单组份显色液采用如实施例1所述方法制备而成并保存。
实施例3
本实施例提供一种单组份TMB显色液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L，其中柠檬酸0.07mol/L，柠檬酸钠0.03mol/L
聚乙烯醇：5g
羟丙基-β-环糊精：4g
磺基丁二酸二己酯钠盐：5g
氨基三亚甲基膦酸：1g
乙二胺四乙酸二钠：0.5g
反丁烯二酸：0.5g
甘油：15ml
二甲基亚砜：50ml
TMB：0.5g
过氧化氢：0.17g
加入HCl至TMB显色液pH值为3.7
本实施例所述单组份显色液采用如实施例1所述方法制备而成并保存。
实施例4
本实施例提供了在酶联免疫反应中单组份TMB显色液与商品化TMB显色液的显色效果对比。
本实施例检测了经抗原免疫后的小鼠血清效价，同时设置未加入稀释血清的孔作为空白对照：
1)小鼠血清稀释100倍，再按3倍的稀释梯度做7个稀释梯度；
2)在已包被抗原的微孔板中加入100μl的稀释血清，另设空白对照组为血清稀释液，置37℃放置1小时；
3)弃去孔内液体，用洗涤液洗板4次，加入100μl HRP标记的羊抗小鼠IgG二抗，置37℃放置1小时；
4)弃去孔内液体，用洗涤液洗板6次；
5)各孔加入实施例1，2，3中的单组份TMB显色液及商品化的TMB显色液各100μl，置室温避光放置15分钟；
6)分别于各孔加入50μl终止液，终止反应；
7)将微孔板置于酶标仪中读数，于450nm波长处读取各孔的OD值，结果如表1。
表1：
Figure BDA0002471358180000081
结果表明，实施例1、2、3中的单组份TMB显色液与对照商品化试剂显色效果相当。
实施例5：保存稳定性测试
配制未加入双烷烃基磺基丁二酸钠和反丁烯二酸的TMB显色液，其它成份同实施例1，2，3所述的TMB显色液，分别命名为对照TMB显色液1，对照TMB显色液2，对照TMB显色液3；另外配制未加入双烷烃基磺基丁二酸钠的同实施例3的所述的TMB显色液，命名为对照TMB显色液4，分别对实施例1，2，3和对照的TMB显色液1，2，3，4的显色效果和稳定性进行比较。对实施例1，2，3所述单组份TMB显色液，上述对照TMB显色液和和商品化TMB显色液置于2-8℃环境中避光保存0天，3个月，6个月，9个月，12个月，测量其OD值。测量方法如下：
将辣根将辣根过氧化物酶加入到96孔微孔板中，之后加入100μl的实施例1，2，3中的TMB显色液，室温避光放置15分钟，加入50μl终止液，终止反应，在450nm波长处读取各孔的OD值，结果如表2。
表2：
Figure BDA0002471358180000091
上述结果表明，实施例1，2，3中所述单组份TMB显色液的稳定性保持较好，表明本发明所述的TMB显色液稳定性良好，可以在2-8℃下稳定保存至少12个月。对比实施例1，2，3，未加入双烷烃基磺基丁二酸钠和反丁烯二酸的TMB显色液和商业化TMB显色液在保存3个月之后的OD值均有明显下降，未加入双烷烃基磺基丁二酸钠的实施例4较实施例3的OD值介于商品化TMB与实施例3的OD值之间，说明双烷烃基磺基丁二酸钠和反丁烯二酸分别对商品化TMB的稳定性有增强的效果。而实施例1-3的OD值均高于商品化TMB的OD值，说明加入双烷烃基磺基丁二酸钠和反丁烯二酸后，TMB显色液的稳定性更好，保存12个月后的OD值均明显高于商品化的TMB显色液。原理是双烷烃基磺基丁二酸钠本身是一种较好的表面活性剂，其同时具备亲水和亲油基团，可以使TMB稳定地在水溶液中分散，提高TMB的溶解度，从而使得TMB的灵敏性提高；另外反丁烯二酸自身的抗氧化性能提升显色液长期的稳定性，保证了本发明TMB显色液良好的稳定性。
实施例6：温度稳定性测试数据
对实施例1、2、3所述单组份TMB显色液和实施例5中的对照TMB显色液1，2，3，4分别置于4℃、10℃、25℃、37℃避光放置6小时，测量其OD值。测量方法如下：
将辣根过氧化物酶加入到96孔微孔板中，之后加入100μl的实施例1，2，3中的TMB显色液，室温避光放置15分钟，加入50μl终止液，终止反应，在450nm波长处读取各孔的OD值，结果如表3。
不难发现，本实施例中实施例1-3TMB显色液OD值较商业化在温度变化的情况下更趋向稳定。另外，对照TMB显色液1-3在未加入双烷烃基磺基丁二酸钠和反丁烯二酸的情况下，在温度变化下OD值稳定性相对较差；另外，特别地，对照TMB显色液4未加入双烷烃基磺基丁二酸钠的情况下，OD值大于商业化TMB，介于实施例3和对照TMB显色液3之间，由此说明双烷烃基磺基丁二酸钠对于TMB显色液随温度变化有稳定的作用。另外不难看出，反丁烯二酸对稳定性能的促进作用是显著的。原理是双烷烃基磺基丁二酸钠本身是一种较好的表面活性剂，其同时具备亲水和亲油基团，可以使TMB稳定地在水溶液中分散，能够有效降低温度变化对活性成分的影响，有效提升显色液的稳定性；另外反丁烯二酸自身的抗氧化性能降低显色液随温度变化的影响，保证了本发明TMB显色液良好的稳定性。
表3：
Figure BDA0002471358180000111
实施例7：显色性能测试数据
根据上述实施例6所述表2很容易看出，在保存时间相同(如分别在0个月、3个月、6个月、9个月、12个月)的情况下，根据实施例1-3制得的显色液的OD值均高于商品化显色液。另外根据实施例7所述表3中的数据也很容易看出，在保存温度相同(如分别在4℃、10℃、25℃、37℃)的情况下，根据实施例1-3制得的显色液的OD值同样高于商品化显色液。由此说明，在满足前文所述稳定性的同时，本发明提供的单组份TMB显色液还具备显色性能优于现有商品化单组份TMB显色液的优势。原理在于，实施例1-3中添加的双烷烃基磺基丁二酸钠，在增强溶液体系的稳定性同时，亲水基团向外形成胶束，胶束使TMB被包藏或吸附，可以使TMB稳定地在水溶液中分散，提高TMB的溶解量，从而提高了显色性能。
上述参照具体实施方式对该单组份TMB显色液及其制备方法进行了详细的描述，但实施实例的描述是说明性而并非限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不不脱离本发明技术的实质和范围下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于酶联免疫反应的单组份TMB显色液，其特征在于，其组分包括：柠檬酸、柠檬酸钠、TMB、二甲基亚砜、反丁烯二酸、甘油、过氧化氢、聚乙烯醇、氨基三亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸二钠、羟丙基-β-环糊精、双烷烃基磺基丁二酸钠。
2.根据权利要求1所述的一种用于酶联免疫反应的单组份TMB显色液，其特征在于，每1L显色液包含以下组分：
柠檬酸13.4g，柠檬酸钠7.74g，TMB 0.1-0.5g，二甲基亚砜的体积占比为3-5%，反丁烯二酸0.1-0.5g，甘油的体积比为0.5-1.5%，过氧化氢0.026-0.17g，聚乙烯醇3-5g，氨基三亚甲基膦酸 0.5-1g，乙二胺四乙酸二钠0.1-0.5g，羟丙基-β-环糊精2-4g，双烷烃基磺基丁二酸钠 1-5g。
3.根据权利要求1所述的一种用于酶联免疫反应的单组份TMB显色液，其特征在于，所述双烷烃基磺基丁二酸钠为如下结构式：
Figure QLYQS_1
;其中，R1、R2为烷链基团，所述R1、R2基团为以下基团的一种：R1、R2均为己基，R1、R2均为2-乙己基，R1、R2均为辛基。
4.根据权利要求1所述的一种用于酶联免疫反应的单组份TMB显色液，其特征在于，所述TMB显色液pH值为3.6-3.8。
5.权利要求1-4任意一项所述单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.配制柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸，柠檬酸钠溶于去离子水中，搅拌至溶解完全；
B.称取聚乙烯醇，搅拌下加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中至充分溶解，再依次加入羟丙基-β-环糊精、双烷烃基磺基丁二酸钠、氨基三亚甲基膦酸、乙二胺四乙酸二钠及反丁烯二酸，搅拌至充分溶解；
C.称取TMB并加入二甲基亚砜至充分溶解后，加入步骤B所得溶液中，避光搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；
D.在步骤C所得的溶液加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分混匀；
E.在步骤D所得的溶液加入甘油，边加入边搅拌，使之充分混匀；
F.对步骤E所得到的溶液用HCl调节pH值至3.6-3.8，微孔滤膜过滤所得的溶液，即得所述单组份TMB显色液。
6.权利要求1-4任意一项所述的单组份TMB显色液在体外诊断酶联免疫试剂中的应用。
7.权利要求5所述的单组份TMB显色液的制备方法在体外诊断酶联免疫试剂中的应用。
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