CN105116141A - 一种单组份tmb显色液及其制备方法 - Google Patents

一种单组份tmb显色液及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种单组份TMB显色液，其由A液和B液混合而成；所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成；所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成。本发明相比现有技术具有如下优势：本发明的单组份TMB显色液可维持显色底物在溶液中的稳定性；保护操作者远离有机溶剂的危害，减少对环境的损害；形成稳定的水溶液体系；在2-8℃下可保存24个月。

Description

一种单组份TMB显色液及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物体外诊断试剂,特别是涉及一种单组份TMB显色液及其制备方法。
背景技术
酶联免疫检测方法(ELISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，成为蛋白质检测领域主流技术之一。以ELISA间接法为例，其主要的工作原理为：抗原包被酶标板，形成固相载体。如果样本中存在相应的IgG抗体，该抗体与酶标板上固定的抗原相结合，从而形成抗原-IgG抗体的免疫复合物，其余未结合成分经洗涤被除去。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体进行第二步孵育，与上述免疫复合物相结合形成新的免疫复合物抗原-IgG抗体-抗人IgG-HRP，经洗涤除去未结合成分后加入TMB底物液进行显色反应，该反应产生蓝色物质，加入终止液终止显色反应，溶液从蓝色变为黄色，颜色强度与抗体含量成正比。检测过程中，用酶标仪在450nm/630nm波长进行读数，记录结果；根据所测得的吸光度值数据，与对照品进行比较，从而判断待测样品中抗体的水平。其中TMB(3,3',5,5’TetramethylBenzidine，即3,3',5,5’-四甲基联苯胺)以其高效、无毒、不致癌、稳定性佳等特点，为ELISA检测中最常用的显色底物。
目前国内上市的酶联免疫法试剂盒多采用双组份TMB显色底物，即分A液和B液，使用之前等体积混匀，由于TMB与过氧化物分开两瓶，具体有稳定、灵敏的特点。然而使用多年后，缺点逐渐显露：操作时多加一种溶液，既耗费时间，又增加出错率；需要多一个试剂瓶，增加成本，造成资源浪费；混合过程容易产生不均匀，批间质量差别较大，从而影响检测结果。目前国外同类产品多采用单组份TMB显色底物，然而其售价昂贵，难以采用进口原料来进行试剂盒产业化。
TMB-2HCl(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸)形式虽然可溶于水，甚至达到1％的浓度，很容易就可根据试剂需要配制成浓度较高的溶液，然而所获得的溶液容易产品分层和沉淀。因此在实际应用中更多时候是使用3,3',5,5’一四甲基联苯胺(TMB)。由于TMB一般不易溶于水，易溶于有机溶剂。所以在TMB显色液配制时，常用有机溶剂帮助溶解，如最常用的二甲基亚矾(DMSO)、乙醇，以及二甲基甲酞胺(DMF)、甲醇、丙酮等。这类有机溶剂多易挥发、易被人体吸收等特点，多为蛋白变性剂，有潜在的神经毒性或致癌性等危害。在提倡健康和环保的今天，有机溶剂的大量使用，可能给操作者带来健康威胁，也将给环境带来不可估量的损害。近年来，更多的研究在于非有机溶剂的TMB溶液体系。
表1示出了现有技术中各种TMB显色液的组成以及TMB终浓度和过氧化氢的终浓度，其中申请号为201210560589.1的发明专利申请描述了一种单组份TMB显色液的制备方法：“其中由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠0.01-0.5mol/L，过氧化氢0.01-0.5mol/L，EDTA0.1-1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的摩尔浓度为0.1-1mmol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10％。本发明调整了TMB的溶解体系，增加TMB的溶解度，聚乙烯吡咯烷酮，使单相TMB溶液在2～8度保存温度下，能保存2年。”
表1中申请号为201210560589.1发明专利有如下特点：(1)对重要成份聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，简称PVP)的分子量等重要参数描述不详尽。聚乙烯吡咯烷酮，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并以其优异独特的性能获得广泛应用。PVP按其平均分子量大小分为四级，习惯上常以K值表示，不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值，而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量，因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越强。不同的分子量的性质各异，溶解度各不同，如不详细规定，难以精确重复实验。(2)实施例1中，B液中过氧化氢浓度最高达0.5mol/L，终浓度为0.25mol/L，这大大超过目前所有相关专利或产品中的相关描述(见表1)，超过一般认可的“1-10mM”。过氧化氢浓度一般与TMB含量对应，过多量则引起本底极大的提高，导致产品不稳定。
表1
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供稳定性高、保存时间长、环保型的单组份TMB显色液，本发明还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。
本发明提供了一种单组份TMB显色液，其由A液和B液混合而成；所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成；所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成。
所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0％，所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10％，所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1％，所述甘油在B液中的体积比1-2％。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
所述A液和B液以1:1的体积比混合而成。
本发明还提供了所述的单组份TMB显色液的制备方法，包括如下步骤：
(1)A液：取柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入过氧化脲，搅拌使之充分溶解，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容，避光密封暂存。
(2)B液：称取聚乙烯醇，边搅拌边将其加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；加入聚乙烯吡咯烷酮，使之充分溶解；降至室温后，加入TMB，搅拌使充分溶解；最后，加入甘油，搅拌使之充分溶解；以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容。
(3)将A液和B液混合均匀。
(4)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为3.5-3.8。
所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0％，所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10％，所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1％，所述甘油在B液中的体积比1-2％。
所述步骤(3)中的A液和B液是以1:1的体积比混合而成，所述步骤(4)中的过滤是采用孔径20-60μm的滤纸。
本发明相比现有技术具有如下优势：
1、本发明的单组份TMB显色液采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系，可维持较低的酸性环境(pH3.5-3.8)，促进TMB的溶解；柠檬酸钠可螯合二价离子，消除溶液中离子的干扰，可维持显色底物在溶液中的稳定性。
2、本发明的单组份TMB显色液采用非有机溶剂体系，可保护操作者远离有机溶剂的危害，并减少对环境的损害。
3、引入安全的聚乙烯醇及聚乙烯吡咯烷酮助溶TMB，使本发明的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系。
4.采用稳定的过氧化脲作为氧化物，在聚乙烯醇及聚乙烯吡咯烷酮共同作用下，使本发明的单组份TMB显色液更加稳定。
5.甘油在冷藏环境具有一定的抗冻效果，配合其它组分使用可以使本发明的单组份TMB显色液在2-8℃保存24个月。
具体实施方式
本发明提供了一种单组份TMB显色液，由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成；
所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成。
优选的，所述过氧化脲占A液的浓度为2-20mmol/L，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
优选的，所述聚乙烯醇占B液的质量体积比(w/v)为0.4-1.0％，所述聚乙烯吡咯烷酮占B液的质量体积比(w/v)为5-10％，所述TMB占B液的质量体积比(w/v)为0.04-0.1％，所述甘油占B液的体积比(v/v)1-2％，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为为0.1mol/L，pH为3.5-3.8，是一种低pH缓冲体系，柠檬酸钠是一种螯合剂，可以增加显色底物的稳定性，使显色底物的保存期延长。本发明单组份显色底物的制备采用低pH缓冲体系，再配合其它助溶剂聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮一起使用，更容易形成稳定的体系。
本发明采用聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为助溶剂。
所述聚乙烯醇是一种高分子聚合物，不溶于丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙二醇等有机溶剂，微溶于二甲基亚砜，聚乙烯醇含有许多醇基，具有极性，且可与水形成氢键，故溶于水；同时其又是一种极安全的高分子有机物，对人体无毒，无副作用，具有良好的生物相容性，也可用作稳定剂、分散剂、乳化剂等。本发明在配方中加入了聚乙烯醇，可帮助TMB的溶解和稳定存在，且安全可靠；本发明优选采用聚乙烯醇1788，1788表示聚合度为1700，醇解度为88％，这样就更易溶解、粘度性中且成本低。为了完全溶解PVA1788一般需加热到65-75℃，一般配制不超过5-8％(m/v)，浓度过高容易胶化。
所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种水溶性聚酰胺，PVP溶于水、含氯溶剂、乙醇、胺、硝基烷烃以及低分子脂肪酸，与大多数无机盐和多种树脂相溶，不溶于丙酮、乙醚等；PVP不易发生化学反应，在正常条件下贮存，干燥的PVP是很稳定的；PVP具有优良的生理惰性和生物相容性，对皮肤、眼睛无刺激，无过敏反应，无毒。本发明采用PVP作助溶剂，可帮助TMB溶解，同时使之稳定存在，且安全无毒。本发明优选采用聚乙烯吡咯烷酮K-30，其在水中的溶解度可达1g/ml，醇解度为87.0-89.0％(mol/mol)、平均分子量为45,000-58,000，其更易获得和易溶解。
本发明的显色底物TMB适用于以过氧化物为酶促反应底物的显色系统中。其中所述的过氧化物为1-10mM的过氧化脲(也称过氧化尿素，下同)，较过氧化氢稳定，以此类物质为底物的酶为辣根过氧化酶(HRP)。
所述甘油与其它组分配合使用，可增加冷藏条件下的稳定性。
本发明还提供了上述单组份TMB显色液的制备方法，包括如下步骤：
(1)A液：取900ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入过氧化脲0.188-1.88g，搅拌使之充分溶解，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L，避光密封暂存。
(2)B液：称取聚乙烯醇4-10g，边搅拌边将其加入500ml室温(不超过40℃)的0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，分散均匀后再升温加速溶解，最后于60-65℃水浴中搅拌溶解，并保温2-2.5小时，直到溶液不再含有微小颗粒，这样可以防止结块，加快溶解速度；加入聚乙烯吡咯烷酮50-100g，使之充分溶解；降至室温后，加入TMB0.4-1.0g，搅拌使充分溶解，注意加入TMB后避免强光照射；最后，加入甘油10-20ml，搅拌使之充分溶解；以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L。
(3)将A液和B液以1:1的体积比混合均匀。
(4)用孔径20-60μm的滤纸过滤，获得均一的溶液，保存于棕色玻璃或塑料瓶中，密封避光保存于2-8℃。
上述水为去离子水，所用化学试剂为分析纯及以上，上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为0.1mol/L(柠檬酸为0.07mol/L，柠檬酸钠0.03mol/L)，pH值为3.5-3.8。
实施例1
本实施例提供了一种单组份TMB显色液，由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L,pH3.5-3.8
过氧化脲:2mmol/L
所述B液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L,pH3.5-3.8
聚乙烯醇:0.4％(w/v)
聚乙烯吡咯烷酮:5％(w/v)
TMB:0.04％(w/v)
甘油:1％(v/v)
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液含有0.07mol/L柠檬酸和0.03mol/L柠檬酸钠，PH为3.5-3.8；所述聚乙烯醇为聚乙烯醇1788；所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K-30。
本发明还提供了上述单组份TMB显色液的制备方法，包括如下步骤：
(1)A液：取900ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入过氧化脲0.188g，搅拌使之充分溶解，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L，避光密封暂存。
(2)B液：称取醇解度为86.5-89.0mol％的聚乙烯醇1788共4g，边搅拌边将其加入室温(不超过40℃)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液500ml中，分散均匀后再升温加速溶解，最后于60℃水浴中搅拌溶解，并保温2.5小时，直到溶液不再含有微小颗粒；加入聚乙烯吡咯烷酮K30为50g，使之充分溶解；降至室温后，加入TMB0.4g，搅拌使充分溶解，注意加入TMB后避免强光照射；最后，加入甘油10ml，搅拌使之充分溶解；以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L。
(3)将A液和B液各1L等体积混合均匀。
(4)用新华滤纸过滤(孔径20-60μm)，获得均一的溶液，保存于棕色玻璃中，密封避光保存于2-8℃。
上述水为去离子水，所用化学试剂为分析纯及以上，其具体来源如表2所示。上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为0.1mol/L，其配制方法为：取900ml去离子水，加入21.01g的柠檬酸C6H8O7·H2O溶解后，加入29.41g的柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O，搅拌均匀后，用去离子水定容至1L，pH值为3.5-3.8。
表2
实施例2
本实施例提供了一种单组份TMB显色液，由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L,pH3.5-3.8
过氧化脲:10mmol/L
所述B液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L,pH3.5-3.8
聚乙烯醇:0.7％(w/v)
聚乙烯吡咯烷酮:7.5％(w/v)
TMB:0.07％(w/v)
甘油:1.5％(v/v)
原料及制备方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供了一种单组份TMB显色液，由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L,pH3.5-3.8
过氧化脲:20mmol/L
所述B液包括如下浓度的各组分：
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：0.1mol/L,pH3.5-3.8
聚乙烯醇:1.0％(w/v)
聚乙烯吡咯烷酮:10％(w/v)
TMB:0.1％(w/v)
甘油:2％(v/v)
原料及制备方法同实施例1。
实施例4
本实施例提供了在酶联免疫法试剂盒中单组份TMB与终止液的联合使用的应用实例，其检测方法包括如下步骤：
用DIA.PRO公司的“巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)”检测血清或血浆标本中的巨细胞病毒IgG抗体(以下组份除另有说明，皆为该试剂盒的成份)：
(1)在已包被CMV抗原的微孔板中加入样本100u1，样本分别为阴性对照(CAL10IU/mL)、阳性对照(CAL68IU/mL)、临界对照(CAL20.5IU/mL)，各做2个复孔；另外设空白对照2孔，不加样本。置37℃保温30min。
(2)弃去孔内液体，用工作洗涤液，洗板4次。加入抗人IgG-HRP酶结合物溶液100u1，其中空白对照孔不加抗人IgG-HRP酶结合物溶液。置37℃保温30min。
(3)弃去孔内液体，用工作洗涤液，洗板4次。
(4)各孔加入实施例1的单组份TMB显色液及DIAPRO的单组份TMB各100u1,置37℃保温15min。
(5)各孔分别加入终止液，各100u1，终止反应。
(6)分别于终止后，将反应板置酶标仪中，于450nm波长处用空白孔校零，读取各孔OD值，结果如表3。
(7)结果判断:其中以CAL2的均值为临界对照值(CutOff值)。样本读数比临界对照值高，则为阳性；样本读数比临界对照值低，则为阴性。
表3
结果表明，实施例1中的单组份TMB显色液与对照商品化试剂显色效果相当。
实施例5
本实施例提供了实施例1的单组份TMB显色液的稳定性测试。
测试方法：将实施例4的步骤(1)的样本换为高值样品L1、中值样品L2、低值样品L3(为“巨细胞病毒IgG抗体参考品”中的最低检测限参考品，来源于中国食品药品检定研究院，标准物质编号为360004)，并设空白对照；步骤(4)所用的TMB显色液是分别放置于2-8℃保存至0个月，6个月，12个月，18个月和24个月的实施例1的单组份TMB显色液；其它步骤同实施例4。
测试结果见表4，可以看出，实施例1中的单组份TMB显色液可以在2-8℃下稳定保存24个月。
表4

Claims (10)

1.一种单组份TMB显色液，其特征在于，由A液和B液混合而成；
所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成；
所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成。
2.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0％，所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10％，所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1％，所述甘油在B液中的体积比1-2％。
4.根据权利要求3所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
5.根据权利要求4所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述A液和B液以1:1的体积比混合而成。
6.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)A液：取柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，加入过氧化脲，搅拌使之充分溶解，以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容，避光密封暂存；
(2)B液：称取聚乙烯醇，边搅拌边将其加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；加入聚乙烯吡咯烷酮，使之充分溶解；降至室温后，加入TMB，搅拌使充分溶解；最后，加入甘油，搅拌使之充分溶解；以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容；
(3)将A液和B液混合均匀；
(4)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
7.根据权利要求6所述的单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH为3.5-3.8。
8.根据权利要求7所述的单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
9.根据权利要求8所述的单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0％，所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10％，所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1％，所述甘油在B液中的体积比1-2％。
10.根据权利要求9所述的单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中的A液和B液是以1:1的体积比混合而成，所述步骤(4)中的过滤是采用孔径20-60μm的滤纸。
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