CN104614519A - 一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒及使用方法和应用 - Google Patents

一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒及使用方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，包括前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体和大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，其中，前列腺特异性捕获抗体和大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体均可以同待测抗原特异性结合；硝酸纤维素膜单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。本发明还公开了其使用方法和应用。本发明试剂盒，采用化学发光法检测抗原，一方面，在单个检测孔内检测同一个样品可平行测定三次以上，实现了高通量的检测，同时对样品的需求量减少了，并有效降低了检测时的区内偏差，提高了检测精密度。另一方面，采用化学发光的检测方法，使得检测灵敏度获得大大提高。

Description

一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒及使用方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒及使用方法和应用。
背景技术
发光分析中的发光是指当一个分子的电子从激发态跃迁到基态时所发出的光，当基态分子吸收化学反应释放的能量跃迁到激发态，处于激发态的分子以光辐射的形式返回基态时产生的光就称为化学发光。基于化学发光强度(峰值强度或发光总量)和被测物含量之间的关系建立的分析方法称为化学发光分析法，它具有灵敏度高，线性范围宽，选择性好，仪器设备简单等特点，化学发光分析法凭其自身的优势在无机物、有机痕量和超痕量分析领域都得到了广泛应用。近年来，其分析领域扩展到如氨基酸、蛋白质、维生素、激素、生物碱和各类药物等复杂有机物的检测，化学发光分析法的发展为生命、环境、材料方面的科学研究提供了高灵敏、高效的全新分析手段，推动了这方面科学理论和高新技术的发展。从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析以酶标记生物活性物质进行免疫分析，免疫复合物上的酶再作用于发光底物，根据测定的发光信号进行定量分析。目前，常用的酶标记物有辣根过氧化物酶。
辣根过氧化物酶是一个阳离子酶，当用它来催化鲁米诺-过氧化氢反应时，即使是在发光体系中加入增强剂对碘苯酚，仅仅是在开始的几分钟化学发光强度明显增强，并且达到峰值，后来因HRP与底物氧化自由基产物相互作用而使酶的失活，导致化学发光强度迅速衰减。
发明内容
本发明目的是提供一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒及使用方法和应用，以解决现有技术的不足。
本发明采用以下技术方案：
一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，包括前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体和大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，其中，前列腺特异性捕获抗体和大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体均可以同待测抗原特异性结合；硝酸纤维素膜单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。
进一步地，所述大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体采用改良过碘酸钠法制备。
进一步地，所述改良过碘酸钠法具体步骤如下：
步骤一、取1mg大豆过氧化物酶溶于100μL PBS中，加入12mg/mL NaIO4溶液100μL，混匀，置室温避光反应15min；
步骤二、取出步骤一得到的溶液，后加入100μL，1v/v％乙二醇室温反应30min；
步骤三、向步骤二得到的溶液中加入575uL，1mg/mL前列腺特异性抗体，混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和前列腺特异性抗体结合；
步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5mg/mL NaBH4溶液80μL，混匀，置4℃还原反应2h；
步骤五、加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复步骤五操作两次；
步骤六、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体，加PBS 500μL复溶；
步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。
进一步地，所述前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的制备方法如下：
选用孔径为0.45μm白色的硝酸纤维素膜，前列腺特异性捕获抗体点样缓冲液为0.1mM PBS，6wt％蔗糖和0.001wt％甲基紫染料的混合液，前列腺特异性捕获抗体浓度为0.25mg/mL，控制温度22～24℃，湿度50％进行点样，4℃包被过夜后，置于恒温恒湿箱中干燥1～2h，最终在硝酸纤维素膜上的单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。
进一步地，所述大豆过氧化物酶所作用的发光底物液为1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐(SPTZ)、0.6mM 4-吗啉吡啶(MORPH)、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液。
上述大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
步骤一、封闭前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的非特异性活性位点
用150μL 5wt％牛血清白蛋白加入到前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜上，室温封闭2h；
步骤二、前列腺特异性捕获抗体与待检测抗原发生第一次免疫反应
将100μL待检测血清加入步骤一封闭好的硝酸纤维素膜上，同时设置阴性对照即加入的血清种不含待检测物，阳性对照即血清中含有已知浓度待检测抗原，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干；
步骤三、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体与待检测抗原发生第二次免疫反应
加入100μL一定稀释度的大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体于步骤二得到的硝酸纤维素膜上，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干；
步骤四、大豆过氧化物酶所作用的发光底物液加入，发光信号检测
在步骤三得到的硝酸纤维素膜上加入大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，利用CCD成像立即采集各孔的化学发光信号。
上述大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒在血清检测中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，采用化学发光法检测抗原，一方面，在单个检测孔内检测同一个样品可平行测定三次以上，实现了高通量的检测，同时对样品的需求量减少了，并有效降低了检测时的区内偏差，提高了检测精密度。另一方面，采用化学发光的检测方法，使得检测灵敏度获得大大提高。
2、本发明试剂盒采用大豆过氧化物酶作为标记酶，其为阴离子酶，不会因为氧化反应产物作用失活，发光信号的衰退没有辣根过氧化物酶迅速，即会产生一个较长时间的化学发光信号，具有更高的稳定性。此外，大豆过氧化物酶是从大豆皮中提取出来的提取原料来源充足、价廉易得，有望用于商品化化学发光免疫检测，以降低检测成本。
3、本发明酶标记化学发光免疫检测试剂盒中使用大豆过氧化物酶在发光系统中加入两种增敏剂(MORPH和SPTZ)来增强发光信号，增敏后的发光强度在较长的时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。
附图说明
图1是本发明大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒进行检测抗原的流程示意图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步的解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，包括前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体和大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，其中，前列腺特异性捕获抗体和大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体均可以同待测抗原特异性结合；硝酸纤维素膜单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。标记酶除了大豆过氧化物酶，还可以是其它含有糖苷键的酶。捕获抗体可以是针对不同待测抗原的多种捕获抗体。
所述大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体采用改良过碘酸钠法制备，具体步骤如下：
步骤一、取1mg大豆过氧化物酶溶于100μL PBS中，加入12mg/mL NaIO4溶液100μL，混匀，置室温避光反应15min；
步骤二、取出步骤一得到的溶液，后加入100μL，1v/v％乙二醇室温反应30min；
步骤三、向步骤二得到的溶液中加入575μL，1mg/mL前列腺特异性抗体，混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和前列腺特异性抗体结合；
步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5mg/mL NaBH4溶液80μL，混匀，置4℃还原反应2h；
步骤五、加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复步骤五操作两次；
步骤六、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体，加PBS 500μL复溶；
步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。
所述前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的制备方法如下：选用孔径为0.45μm白色的硝酸纤维素膜，前列腺特异性捕获抗体点样缓冲液为0.1mM PBS，6wt％蔗糖和0.001wt％甲基紫染料的混合液，前列腺特异性捕获抗体浓度为0.25mg/mL，控制温度22～24℃，湿度50％进行点样，4℃包被过夜后，置于恒温恒湿箱中干燥1～2h，最终在硝酸纤维素膜上的单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。
所述大豆过氧化物酶所作用的发光底物液为1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-吗啉吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液。
上述大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒的使用方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤一、封闭前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的非特异性活性位点
用150μL 5wt％牛血清白蛋白加入到前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜上，室温封闭2h；
步骤二、前列腺特异性捕获抗体与待检测抗原发生第一次免疫反应
将100μL待检测血清加入步骤一封闭好的硝酸纤维素膜上，同时设置阴性对照即加入的血清种不含待检测物，阳性对照即血清中含有已知浓度待检测抗原，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干；
步骤三、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体与待检测抗原发生第二次免疫反应
加入100μL一定稀释度(5000×)的大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体于步骤二得到的硝酸纤维素膜上，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干；
步骤四、加入大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，检测发光信号
在步骤三得到的硝酸纤维素膜上加入大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，利用CCD成像立即采集各孔的化学发光信号。
以下实施例涉及的PBS为10mM pH 7.4；TTBS缓冲液为含有100mM pH 7.5Tris-HCL配制的0.3％Tween20；大豆过氧化物酶购自美国Bio-Research Products公司；前列腺特异性捕获抗体和前列腺特异性抗体购自上海瑞齐生物科技有限公司。
实施例1
第一步，大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体的制备
1、取1mg大豆过氧化物酶溶于100μL PBS中，加入12mg/mL NaIO4溶液100μL，混匀，置室温避光反应15min；
2、取出步骤1得到的溶液，后加入100μL，1v/v％乙二醇室温反应30min；
3、向步骤2得到的溶液中加入575μL，1mg/mL前列腺特异性抗体，混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和前列腺特异性抗体结合；
4、向步骤3得到的溶液中加入5mg/mL NaBH4溶液80μL，混匀，置4℃还原反应2h；
5、加入和步骤4得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复步骤五操作两次；
6、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体，加PBS 500μL复溶；
7、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。
第二步，前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的制备
选用孔径为0.45μm白色的硝酸纤维素膜，前列腺特异性捕获抗体点样缓冲液为0.1mM PBS，6wt％蔗糖和0.001wt％甲基紫染料的混合液，前列腺特异性捕获抗体浓度为0.25mg/mL，控制温度22～24℃，湿度50％进行点样，4℃包被过夜后，置于恒温恒湿箱中干燥1～2h，最终在硝酸纤维素膜上的单孔内同时有3个包被前列腺特异性捕获抗体的点。
第三步，封闭非特异性活性位点
用150μL 5wt％牛血清白加入到前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜上，室温封闭2h。
第四步，前列腺特异性捕获抗体与待检测抗原发生第一次免疫反应
将100μL待检测血清加入第三步封闭好的硝酸纤维素膜上，同时设置阴性对照即加入的血清种不含待检测物，阳性对照即血清中含有已知浓度待检测抗原，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干。
第五步，大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体与待检测抗原发生第二次免疫反应
加入100μL一定稀释度的大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体于第四步得到的硝酸纤维素膜上，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干。
第六步，大豆过氧化物酶所作用的发光底物液加入，发光信号检测
在第五步得到的硝酸纤维素膜上加入发光底物液：1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-马琳吡啶、0.4mM鲁米诺和、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液，利用CCD成像立即采集各孔的化学发光信号。因每个孔内有三个点，每个点对应的是血清检验中的指标，因而，在单孔内可以平行检测同一血清样品三次。且测定的前列腺特异抗原浓度为0.3ng/mL。

Claims (7)

1.一种大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体和大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，其中，前列腺特异性捕获抗体和大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体均可以同待测抗原特异性结合；硝酸纤维素膜单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。
2.根据权利要求1所述的大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体采用改良过碘酸钠法制备。
3.根据权利要求2所述的大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述改良过碘酸钠法具体步骤如下：
步骤一、取1mg大豆过氧化物酶溶于100μL PBS中，加入12mg/mL NaIO4溶液100μL，混匀，置室温避光反应15min；
步骤二、取出步骤一得到的溶液，后加入100μL，1v/v％乙二醇室温反应30min；
步骤三、向步骤二得到的溶液中加入575uL，1mg/mL前列腺特异性抗体，混匀，装入透析袋，于50mM pH 9.6碳酸盐缓冲液4℃透析24h，使大豆过氧化物酶和前列腺特异性抗体结合；
步骤四、向步骤三得到的溶液中加入5mg/mL NaBH4溶液80μL，混匀，置4℃还原反应2h；
步骤五、加入和步骤四得到的溶液等体积的饱和硫酸铵溶液，盐析0.5h，10000rpm离心15min，去上清，沉淀以PBS溶解，装入透析袋，于PBS中4℃透析过夜，重复步骤五操作两次；
步骤六、次日取出离心，除去不溶物，上层清液为大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体，加PBS 500μL复溶；
步骤七、效价测定合格后，加入等量甘油，分装小瓶保存。
4.根据权利要求1所述的大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的制备方法如下：
选用孔径为0.45μm白色的硝酸纤维素膜，前列腺特异性捕获抗体点样缓冲液为0.1mM PBS，6wt％蔗糖和0.001wt％甲基紫染料的混合液，前列腺特异性捕获抗体浓度为0.25mg/mL，控制温度22～24℃，湿度50％进行点样，4℃包被过夜后，置于恒温恒湿箱中干燥1～2h，最终在硝酸纤维素膜上的单孔内同时有3个以上包被前列腺特异性捕获抗体的点。
5.根据权利要求1所述的大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述大豆过氧化物酶所作用的发光底物液为1.2mM 3-(10′-吩噻嗪基)丙基-1-磺酸盐、0.6mM 4-吗啉吡啶、0.4mM鲁米诺、0.4mM H2O2以及50mM pH 8.5的Tris-HCl缓冲液组成的混合溶液。
6.权利要求1-5任一权利要求所述的大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、封闭前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜的非特异性活性位点
用150μL 5wt％牛血清白蛋白加入到前列腺特异性捕获抗体包被的硝酸纤维素膜上，室温封闭2h；
步骤二、前列腺特异性捕获抗体与待检测抗原发生第一次免疫反应
将100μL待检测血清加入步骤一封闭好的硝酸纤维素膜上，同时设置阴性对照即加入的血清种不含待检测物，阳性对照即血清中含有已知浓度待检测抗原，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干；
步骤三、大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体与待检测抗原发生第二次免疫反应
加入100μL一定稀释度的大豆过氧化物酶标记的前列腺特异性抗体于步骤二得到的硝酸纤维素膜上，室温孵育30min，TTBS缓冲液震荡洗涤四次，每次8min，转速设置250rpm，最后拍干；
步骤四、大豆过氧化物酶所作用的发光底物液加入，发光信号检测
在步骤三得到的硝酸纤维素膜上加入大豆过氧化物酶所作用的发光底物液，利用CCD成像立即采集各孔的化学发光信号。
7.权利要求1-5任一权利要求所述的大豆过氧化物酶标记化学发光免疫检测试剂盒在血清检测中的应用。
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