CN106198504A - 一种增强型化学发光检测试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种增强型化学发光检测试剂盒，其特征在于，包含A液和B液，所述A液为含有0.5mg/ml 4‑morp、0.5mg/ml SPTZ和0.002mg/ml鲁米诺的pH 9.0的0.2M Tris‑HCl溶液，所述B液为含有双氧水的缓冲溶液。本发明还提供了一种使用以上试剂盒的方法。通过使用本发明的增强型化学发光检测试剂盒及方法可提高化学发光检测的灵敏度和特异性，与普通的化学发光检测试剂和方法相比，灵敏度提高了20‑40倍，从而可节约抗体，由此可节约抗体，降低成本。发光底物工作液与样品的孵育时间从传统方法的数分钟缩短到3‑5s，几乎滴加至样品上充分接触后即可进行后续步骤，无需等待，从而减少了操作者的工作量，并降低了样品在操作过程中被污染的风险。

Description

一种增强型化学发光检测试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及生化实验试剂领域，更特别地，涉及一种新型增强型化学发光检测试剂盒以及使用该试剂盒的的增强型化学发光检测方法。
背景技术
蛋白免疫印迹(Western blot)是一种通过抗体特异性染色来检测样品中是否存在特定蛋白质的生物化学方法。该方法先通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将样品中不同分子量的蛋白质分离，然后通过转膜，将凝胶上的蛋白质转印至膜上，并保持电泳后的蛋白质位置不变，然后再用带有标志物的抗体与目标蛋白质特异性结合从而显示目标蛋白质。
在蛋白免疫印迹实验中，常常使用化学发光的方法来来显示目标蛋白。即，特异性抗体与目标蛋白质特异性结合，然后用缀合有HRP的二抗特异性结合一抗，从而使目标蛋白质上带有HRP，当用HRP的底物进行孵育时，目标蛋白质上的HRP催化该底物显色或发光。
然而，现有的化学发光试剂或ECL试剂盒灵敏度太低，低丰度的蛋白样本很难检测出来；一抗的用量需求也会增大，增加了很多不必要的浪费。因此需要一种超敏的新型增强型化学发光检测试剂盒。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供了一种增强型化学发光检测试剂盒，其包含A液和B液，所述A液为含有0.5mg/ml 4-morp(4-吗啉吡啶)、0.5mg/ml SPTZ(吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠)和0.002mg/ml鲁米诺的pH 9.0的0.2M Tris-HCl溶液，所述B液为含有双氧水的缓冲液。
优选地，所述B液为含有0.054％双氧水的pH 5.0的0.05M乙酸溶液。
优选地，所述tris-HCl的pH用HCl调节得到。
优选地，所述乙酸溶液的pH用NaOH调节得到。
优选地，所述增强型化学发光检测试剂盒还可包含显影液和定影液。
本发明还提供了一种新型增强型化学发光检测方法，其使用上述试剂盒来进行，包括以下步骤：
1)将所述A液与所述B液混合，得到混合液；
2)用所述混合液孵育待检测的样品；
3)使经孵育的样品曝光，然后进行显影和定影。
优选地，所述样品为已经转印有蛋白质并经过缀合有HRP的抗体孵育后或者经过一抗和缀合有HRP的二抗孵育后的PVDF膜。
优选地，在所述混合液中，所述A液与所述B液的体积比为1:1。
优选地，步骤2)的孵育时间为3-5s。
优选地，包括以下步骤：
1)将所述A液与所述B液等体积混合，得到混合工作液；
2)用所述混合工作液孵育已经转印有蛋白质并经过缀合有HRP的抗体孵育后或者经过一抗和缀合有HRP的二抗孵育后的PVDF膜3-5s；
3)使经孵育的样品暗盒中曝光5s，然后进行显影和定影。
本发明使用4-MORP和SPTZ做增强剂，提高了鲁米诺的发光强度，从而可提高化学发光反应的灵敏度和光强度，与普通的化学发光试剂和方法相比，灵敏度提高了20-40倍，由此可节约抗体，降低成本。发光底物工作液与样品的孵育时间从传统方法的数分钟缩短到3-5s，几乎滴加至样品上充分接触后即可进行后续步骤，无需等待，从而减少了操作者的工作量，并降低了样品在操作过程中被污染的风险。
附图说明
图1为使用本发明的增强型化学发光检测试剂盒和方法与使用普通的化学发光检测试剂和方法染色GST重组蛋白的对比图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1增强型化学发光检测试剂盒的A液和B液的配制
1.A液：
首先称取12.12g Tris到500ml烧杯中，加纯水400ml，用稀HCl调PH到9.0，最后定容到500ml，配制成500ml pH 9.0的0.2M Tris-HCl溶液；称量250mg 4-morp、250mg SPTZ加入到该Tris-HCl溶液中。向该Tris-HCl溶液加入100μl浓度为10mg/ml的鲁米诺溶液，搅拌均匀后4℃避光保存。
2.B液：
取1.4375ml冰乙酸加入纯水400ml，用NaOH溶液调pH至5.0，最后定容到500ml，然后加入0.9ml 30％H2O2，4℃避光保存。
实施例2使用实施例1的试剂盒对样品进行化学发光检测
通过以下方法检测样品中的GST重组蛋白含量
1.SDS-PAGE电泳
将GST重组蛋白用蛋白上样缓冲液稀释至1.6μg/ml,再用蛋白上样缓冲液对半稀释至800、400、200、100、50、25、12.5ng/ml备用；
将以上样品各取10μl上样至12％SDS-PAGE的上样孔中进行电泳，相应的，各上样孔中GST重组蛋白的量分别为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125ng。浓缩电压75V，30min，分离电压120V，至溴酚蓝刚跑出分离胶为止。
2.转膜
300mA恒流半小时，将分离胶上的蛋白质转印至0.45μm的PVDF膜上。
3.免疫反应
将转印好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶(0.5％TBST配)，封闭1h；
用稀释稀释至20ng/ml的Anti-GST兔多克隆抗体孵育膜，于4℃静置过夜；
用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min；
将二抗(Jackson HRP山羊抗兔)用TBST稀释5000倍，室温下孵育30min后，用TBST在室温下脱色摇床上洗三次，每次5min。
4.化学发光
将A液和B液等体积混合，将膜的转印有蛋白质的面朝上，将混合液滴加到经上述处理的PVDF膜上，使膜与混合液充分接触即可不需等待。
将膜用保鲜膜包好，放入暗匣中曝光5s。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。
以普通的化学发光试剂得到的结果为对比，结果如图1所示，使用普通的化学发光试剂时，几乎检测不到0.125ng和0.25ng的蛋白量，而使用本发明的新型增强型化学发光试剂盒和方法检测0.125ng的蛋白量时都能得到中等强度的条带，其灵敏度是使用普通化学发光试剂时的近40倍。
基于本发明的化学发光试剂盒的高灵敏度，可在检测较高浓度的蛋白质时，适当减少一抗的用量，从而节省实验花费。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种增强型化学发光检测试剂盒，其特征在于，包含A液和B液，所述A液为含有0.5mg/ml 4-morp、0.5mg/ml SPTZ和0.002mg/ml鲁米诺的pH 9.0的0.2M Tris-HCl溶液，所述B液为含有双氧水的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的增强型化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述B液为含有0.054％双氧水的pH 5.0的0.05M乙酸溶液。
3.根据权利要求1所述的增强型化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述Tris-HCl溶液的pH用HCl调节得到。
4.根据权利要求2所述的增强型化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述乙酸溶液的pH用NaOH调节得到。
5.根据权利要求1所述的增强型化学发光检测试剂盒，其特征在于，还包含显影液和定影液。
6.一种增强型化学发光检测方法，其特征在于，使用权利要求1-5中任一项所述的增强型化学发光检测试剂盒来进行，包括以下步骤：
1)将所述A液与所述B液混合，得到混合工作液；
2)用所述混合工作液孵育待检测的样品；
3)使经孵育的样品曝光，然后进行显影和定影。
7.根据权利要求6所述的增强型化学发光检测方法，其特征在于，所述样品为已经转印有蛋白质并经过缀合有HRP的抗体孵育后或者经过一抗和缀合有HRP的二抗孵育后的PVDF膜。
8.根据权利要求6所述的增强型化学发光检测方法，其特征在于，在所述混合液中，所述A液与所述B液的体积比为1:1。
9.根据权利要求6所述的增强型化学发光检测方法，其特征在于，步骤2)的孵育时间为3-5s。
10.根据权利要求7所述的增强型化学发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将所述A液与所述B液等体积混合，得到混合液；
2)用所述混合液孵育已经转印有蛋白质并经过缀合有HRP的抗体孵育后或者经过一抗和缀合有HRP的二抗孵育后的PVDF膜3-5s；
3)使经孵育的样品暗盒中曝光5s，然后进行显影和定影。
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