CN110031615A - 一种超敏化学发光hrp底物液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种超敏化学发光HRP底物液，该底物液由A液和B液等体积复配而成，所述A液为1000mL,pH＝9.0，其中，含有Tris 24.23g；吩噻嗪‑10‑基‑丙基磺酸钠盐2.060g；4‑二甲氨基吡啶0.37g；鲁米诺0.44g；1mol/L的NaOH溶液1mL；余量为盐酸和纯水；所述B液为1000mL,pH＝3.5～5.0，其中，含有过氧尿素1.175g；冰乙酸2.875mL；余量为纯水与5mol/L的NaoH溶液。本发明采用目前国际最先进的增敏技术，二次增敏，使得底物液灵敏度高，高于国外Thermo Pierce厂家同类产品，发光平稳，背景更低,可达到pg级，大大节省了抗体与样品的用量，特别适用于检测低丰度的蛋白质含量。

Description

一种超敏化学发光HRP底物液及其制备方法
技术领域
本发明涉及超敏化学发光技术领域，具体涉及一种超敏化学发光HRP底物液及其制备方法。
背景技术
化学发光技术是免疫诊断技术中的一种，而免疫诊断技术的差别，大体上在抗原抗体包被和信号检测这两个环节，目前市面上化学发光HRP底物液无论应用于科研中或是应用于医学免疫诊断，大部分都依赖于进口，且价格昂贵，而国产的大部分发光液灵敏度不高，发光不稳定或是对Western blot实验操作的聚乙烯纤维膜存在损伤性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种超敏化学发光HRP底物液及其制备方法，采用目前国际最先进的增敏技术，二次增敏，使得底物液灵敏度高，发光平稳，背景更低,可达到pg级。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种超敏化学发光HRP底物液，所述A液由Tris、吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐、4-二甲氨基吡啶、鲁米诺、NaOH溶液、纯水、盐酸复配而成；所述B液由过氧尿素、冰乙酸、纯水、NaoH溶液复配而成。所述A液为1000mL,pH＝9.0，其中，含有Tris 24.23g；吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g；4-二甲氨基吡啶0.37g；鲁米诺0.44g；1mol/L的NaOH溶液1mL；余量为盐酸和纯水；
所述B液为1000mL,pH＝3.5～5.0，其中，含有过氧尿素1.175g；冰乙酸2.875mL；余量为5mol/L的NaoH溶液和纯水。
本发明还提供了上述一种超敏化学发光HRP底物液的制备方法，包括如下步骤：
S1、A液的配置
S11、配置Tris缓冲液：称取24.23g Tris加900mL超纯水溶解，得Tris缓冲液；
S12、称取吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g，加入到所得的Tris缓冲液中，搅拌至溶解；
S13、称取4-吗啉基吡啶0.37g，加入到上述的Tris缓冲液中，搅拌至溶解；
S14、称取鲁米诺0.44g，加入1mL 1mol/L的NaOH溶液，充分溶解后，再加入到缓冲液中，搅拌至溶解；
S15、向所得的缓冲液中加入适量盐酸调pH至9.0，定容为1000mL，配置完后避光保存；
S2、B液配置方法
S21、取2.875mL冰乙酸加入到950mL超纯水中，用5mol/L的NaOH溶液调pH至3.5～5.0；
S22、称取过氧尿素1.175g加入到上述液体中，搅拌至溶解，定容为1000mL，得B液；
S3、将A液与B液等体积混合后，即得，现用现配。
本发明具有以下有益效果：
采用目前国际最先进的增敏技术，采用两种增敏催化剂：吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐(SPTZ)，4-二甲氨基吡啶(DAMP)二次增敏，使得底物液灵敏度高，高于国外ThermoPierce厂家同类产品，发光平稳，背景更低,可达到pg级，大大节省了抗体与样品的用量，特别适用于检测低丰度的蛋白质含量。
附图说明
图1为不同厂家的底物液与不同浓度的HRP抗体蛋白作用后荧光强度变化情况。
图2为试剂盒中底物液(A+B)混合后于室温放置不同时间后对样品荧光的影响。
图3为检测0～10min之内不同浓度的底物液对样品荧光强度影响。
图4为不同厂家底物液在Bcl-2蛋白检测中应用(皮克级)。
图5为不同厂家底物液在p21蛋白检测中应用(皮克级)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例的一种超敏化学发光HRP底物液，通过以下步骤配置所得：
S1、A液的配置
S11、配置Tris缓冲液：称取24.23g Tris加900mL超纯水溶解，得Tris缓冲液；
S12、称取吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g，加入到所得的Tris缓冲液中,搅拌至溶解；
S13、称取4-吗啉基吡啶0.37g，加入到上述的Tris缓冲液中,搅拌至溶解；
S14、称取鲁米诺0.44g，加入1mL 1mol/L的NaOH溶液，充分溶解后，再加入到缓冲液中,搅拌至溶解；
S15、向所得的缓冲液中加入适量盐酸调pH至9.0，定容为1000mL，配置完后避光保存；
S2、B液配置方法
S21、取2.875mL冰乙酸加入到950mL超纯水中，用5mol/L的NaOH溶液调pH至3.5～5.0；
S22、称取过氧尿素1.175g加入到上述液体中，搅拌至溶解,定容为1000mL，得B液；
S3、将A液与B液等体积混合后，即得，现用现配。
图1为不同厂家的底物液与不同浓度的HRP抗体蛋白作用后荧光强度变化情况，可见，同等条件下，在不同浓度HRP抗体蛋白作用下，自研产品的荧光值都高于其他三家产品,而空白背景值与Thermo同级别产品相当，说明自研产品灵敏度较高。
图2为试剂盒中底物液(A+B)混合后于室温放置不同时间后对样品荧光的影响，可见，将自研产品中的A液与B液混合后放置于室温约40min，对样品荧光强度基本无影响，说明底物液相对比较稳定。
将自主研发的发光底物液稀释20、25、30、40、45、50倍后分别与HRP抗体蛋白作用，以市售皮克级的thermo pierce产品为对照，并每隔1min读取一次数据，并观察荧光强度变化。由图3结果显示当底物液浓度稀释40倍后作用效果与thermo pierce产品相当，并且在10min之内荧光强度比较稳定。
将经过药物处理后提取MCF-7细胞中的Bcl-2、p21蛋白，然后分别用不同的厂家底物液进行Western blot检测，由图4可知，在Bcl-2蛋白检测中自研产品，蛋白条带显示比较清晰，条带较粗，说明灵敏度比thermo同等级产品灵敏度高，背景基本相同；如图5所示，在p21蛋白检测中，自研产品不仅背景比碧云天产品低很多，且灵敏度远远高于碧云天产品。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

Claims (3)

1.一种超敏化学发光HRP底物液，该底物液由A液和B液等体积复配而成，其特征在于：所述A液由Tris、吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐、4-二甲氨基吡啶、鲁米诺、NaOH溶液、纯水、盐酸复配而成；所述B液由过氧尿素、冰乙酸、纯水、NaoH溶液复配而成。
2.如权利要求1所述的一种超敏化学发光HRP底物液，其特征在于：所述A液为1000mL,pH＝9.0，其中，含有Tris 24.23g；吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g；4-二甲氨基吡啶0.37g；鲁米诺0.44g；1mol/L的NaOH溶液1mL；余量为盐酸和纯水；
所述B液为1000mL,pH＝3.5～5.0，其中，含有过氧尿素1.175g；冰乙酸2.875mL；余量为5mol/L的NaoH溶液和纯水。
3.如权利要求1所述的一种超敏化学发光HRP底物液，其特征在于：通过以下步骤配置：
S1、A液的配置
S11、配置Tris缓冲液：称取24.23g Tris加900mL超纯水溶解，得Tris缓冲液；
S12、称取吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g，加入到所得的Tris缓冲液中，搅拌至溶解；
S13、称取4-吗啉基吡啶0.37g，加入到上述的Tris缓冲液中，搅拌至溶解；
S14、称取鲁米诺0.44g，加入1mL 1mol/L的NaOH溶液，充分溶解后，再加入到缓冲液中，搅拌至溶解；
S15、向所得的缓冲液中加入适量盐酸调pH至9.0，定容为1000mL，配置完后避光保存；
S2、B液配置方法
S21、取2.875mL冰乙酸加入到950mL超纯水中，用5mol/L的NaOH溶液调pH至3.5～5.0；
S22、称取过氧尿素1.175g加入到上述液体中，搅拌至溶解，定容为1000mL，得B液；
S3、将A液与B液等体积混合后，即得，现用现配。
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