CN110031615A - 一种超敏化学发光hrp底物液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种超敏化学发光HRP底物液,该底物液由A液和B液等体积复配而成,所述A液为1000mL,pH=9.0,其中,含有Tris 24.23g;吩噻嗪‑10‑基‑丙基磺酸钠盐2.060g;4‑二甲氨基吡啶0.37g;鲁米诺0.44g;1mol/L的NaOH溶液1mL;余量为盐酸和纯水;所述B液为1000mL,pH=3.5~5.0,其中,含有过氧尿素1.175g;冰乙酸2.875mL;余量为纯水与5mol/L的NaoH溶液。本发明采用目前国际最先进的增敏技术,二次增敏,使得底物液灵敏度高,高于国外Thermo Pierce厂家同类产品,发光平稳,背景更低,可达到pg级,大大节省了抗体与样品的用量,特别适用于检测低丰度的蛋白质含量。
Description
技术领域
本发明涉及超敏化学发光技术领域,具体涉及一种超敏化学发光HRP底物液及其制备方法。
背景技术
化学发光技术是免疫诊断技术中的一种,而免疫诊断技术的差别,大体上在抗原抗体包被和信号检测这两个环节,目前市面上化学发光HRP底物液无论应用于科研中或是应用于医学免疫诊断,大部分都依赖于进口,且价格昂贵,而国产的大部分发光液灵敏度不高,发光不稳定或是对Western blot实验操作的聚乙烯纤维膜存在损伤性。
发明内容
为解决上述问题,本发明提供了一种超敏化学发光HRP底物液及其制备方法,采用目前国际最先进的增敏技术,二次增敏,使得底物液灵敏度高,发光平稳,背景更低,可达到pg级。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
一种超敏化学发光HRP底物液,所述A液由Tris、吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐、4-二甲氨基吡啶、鲁米诺、NaOH溶液、纯水、盐酸复配而成;所述B液由过氧尿素、冰乙酸、纯水、NaoH溶液复配而成。所述A液为1000mL,pH=9.0,其中,含有Tris 24.23g;吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g;4-二甲氨基吡啶0.37g;鲁米诺0.44g;1mol/L的NaOH溶液1mL;余量为盐酸和纯水;
所述B液为1000mL,pH=3.5~5.0,其中,含有过氧尿素1.175g;冰乙酸2.875mL;余量为5mol/L的NaoH溶液和纯水。
本发明还提供了上述一种超敏化学发光HRP底物液的制备方法,包括如下步骤:
S1、A液的配置
S11、配置Tris缓冲液:称取24.23g Tris加900mL超纯水溶解,得Tris缓冲液;
S12、称取吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g,加入到所得的Tris缓冲液中,搅拌至溶解;
S13、称取4-吗啉基吡啶0.37g,加入到上述的Tris缓冲液中,搅拌至溶解;
S14、称取鲁米诺0.44g,加入1mL 1mol/L的NaOH溶液,充分溶解后,再加入到缓冲液中,搅拌至溶解;
S15、向所得的缓冲液中加入适量盐酸调pH至9.0,定容为1000mL,配置完后避光保存;
S2、B液配置方法
S21、取2.875mL冰乙酸加入到950mL超纯水中,用5mol/L的NaOH溶液调pH至3.5~5.0;
S22、称取过氧尿素1.175g加入到上述液体中,搅拌至溶解,定容为1000mL,得B液;
S3、将A液与B液等体积混合后,即得,现用现配。
本发明具有以下有益效果:
采用目前国际最先进的增敏技术,采用两种增敏催化剂:吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐(SPTZ),4-二甲氨基吡啶(DAMP)二次增敏,使得底物液灵敏度高,高于国外ThermoPierce厂家同类产品,发光平稳,背景更低,可达到pg级,大大节省了抗体与样品的用量,特别适用于检测低丰度的蛋白质含量。
附图说明
图1为不同厂家的底物液与不同浓度的HRP抗体蛋白作用后荧光强度变化情况。
图2为试剂盒中底物液(A+B)混合后于室温放置不同时间后对样品荧光的影响。
图3为检测0~10min之内不同浓度的底物液对样品荧光强度影响。
图4为不同厂家底物液在Bcl-2蛋白检测中应用(皮克级)。
图5为不同厂家底物液在p21蛋白检测中应用(皮克级)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例的一种超敏化学发光HRP底物液,通过以下步骤配置所得:
S1、A液的配置
S11、配置Tris缓冲液:称取24.23g Tris加900mL超纯水溶解,得Tris缓冲液;
S12、称取吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g,加入到所得的Tris缓冲液中,搅拌至溶解;
S13、称取4-吗啉基吡啶0.37g,加入到上述的Tris缓冲液中,搅拌至溶解;
S14、称取鲁米诺0.44g,加入1mL 1mol/L的NaOH溶液,充分溶解后,再加入到缓冲液中,搅拌至溶解;
S15、向所得的缓冲液中加入适量盐酸调pH至9.0,定容为1000mL,配置完后避光保存;
S2、B液配置方法
S21、取2.875mL冰乙酸加入到950mL超纯水中,用5mol/L的NaOH溶液调pH至3.5~5.0;
S22、称取过氧尿素1.175g加入到上述液体中,搅拌至溶解,定容为1000mL,得B液;
S3、将A液与B液等体积混合后,即得,现用现配。
图1为不同厂家的底物液与不同浓度的HRP抗体蛋白作用后荧光强度变化情况,可见,同等条件下,在不同浓度HRP抗体蛋白作用下,自研产品的荧光值都高于其他三家产品,而空白背景值与Thermo同级别产品相当,说明自研产品灵敏度较高。
图2为试剂盒中底物液(A+B)混合后于室温放置不同时间后对样品荧光的影响,可见,将自研产品中的A液与B液混合后放置于室温约40min,对样品荧光强度基本无影响,说明底物液相对比较稳定。
将自主研发的发光底物液稀释20、25、30、40、45、50倍后分别与HRP抗体蛋白作用,以市售皮克级的thermo pierce产品为对照,并每隔1min读取一次数据,并观察荧光强度变化。由图3结果显示当底物液浓度稀释40倍后作用效果与thermo pierce产品相当,并且在10min之内荧光强度比较稳定。
将经过药物处理后提取MCF-7细胞中的Bcl-2、p21蛋白,然后分别用不同的厂家底物液进行Western blot检测,由图4可知,在Bcl-2蛋白检测中自研产品,蛋白条带显示比较清晰,条带较粗,说明灵敏度比thermo同等级产品灵敏度高,背景基本相同;如图5所示,在p21蛋白检测中,自研产品不仅背景比碧云天产品低很多,且灵敏度远远高于碧云天产品。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是,本发明并不局限于上述特定实施方式,本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改,这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下,本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (3)
1.一种超敏化学发光HRP底物液,该底物液由A液和B液等体积复配而成,其特征在于:所述A液由Tris、吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐、4-二甲氨基吡啶、鲁米诺、NaOH溶液、纯水、盐酸复配而成;所述B液由过氧尿素、冰乙酸、纯水、NaoH溶液复配而成。
2.如权利要求1所述的一种超敏化学发光HRP底物液,其特征在于:所述A液为1000mL,pH=9.0,其中,含有Tris 24.23g;吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g;4-二甲氨基吡啶0.37g;鲁米诺0.44g;1mol/L的NaOH溶液1mL;余量为盐酸和纯水;
所述B液为1000mL,pH=3.5~5.0,其中,含有过氧尿素1.175g;冰乙酸2.875mL;余量为5mol/L的NaoH溶液和纯水。
3.如权利要求1所述的一种超敏化学发光HRP底物液,其特征在于:通过以下步骤配置:
S1、A液的配置
S11、配置Tris缓冲液:称取24.23g Tris加900mL超纯水溶解,得Tris缓冲液;
S12、称取吩噻嗪-10-基-丙基磺酸钠盐2.060g,加入到所得的Tris缓冲液中,搅拌至溶解;
S13、称取4-吗啉基吡啶0.37g,加入到上述的Tris缓冲液中,搅拌至溶解;
S14、称取鲁米诺0.44g,加入1mL 1mol/L的NaOH溶液,充分溶解后,再加入到缓冲液中,搅拌至溶解;
S15、向所得的缓冲液中加入适量盐酸调pH至9.0,定容为1000mL,配置完后避光保存;
S2、B液配置方法
S21、取2.875mL冰乙酸加入到950mL超纯水中,用5mol/L的NaOH溶液调pH至3.5~5.0;
S22、称取过氧尿素1.175g加入到上述液体中,搅拌至溶解,定容为1000mL,得B液;
S3、将A液与B液等体积混合后,即得,现用现配。
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