CN105116141B - 一种单组份tmb显色液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单组份TMB显色液,其由A液和B液混合而成;所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液制备而成;所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液制备而成。本发明相比现有技术具有如下优势:本发明的单组份TMB显色液可维持显色底物在溶液中的稳定性;保护操作者远离有机溶剂的危害,减少对环境的损害;形成稳定的水溶液体系;在2‑8℃下可保存24个月。
Description
技术领域
本发明涉及生物体外诊断试剂,特别是涉及一种单组份TMB显色液及其制备方法。
背景技术
酶联免疫检测方法(ELISA)具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点,成为蛋白质检测领域主流技术之一。以ELISA间接法为例,其主要的工作原理为:抗原包被酶标板,形成固相载体。如果样本中存在相应的IgG抗体,该抗体与酶标板上固定的抗原相结合,从而形成抗原-IgG抗体的免疫复合物,其余未结合成分经洗涤被除去。加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体进行第二步孵育,与上述免疫复合物相结合形成新的免疫复合物抗原-IgG抗体-抗人IgG-HRP,经洗涤除去未结合成分后加入TMB底物液进行显色反应,该反应产生蓝色物质,加入终止液终止显色反应,溶液从蓝色变为黄色,颜色强度与抗体含量成正比。检测过程中,用酶标仪在450nm/630nm波长进行读数,记录结果;根据所测得的吸光度值数据,与对照品进行比较,从而判断待测样品中抗体的水平。其中TMB(3,3',5,5’Tetramethyl Benzidine,即3,3',5,5’-四甲基联苯胺)以其高效、无毒、不致癌、稳定性佳等特点,为ELISA检测中最常用的显色底物。
目前国内上市的酶联免疫法试剂盒多采用双组份TMB显色底物,即分A液和B液,使用之前等体积混匀,由于TMB与过氧化物分开两瓶,具体有稳定、灵敏的特点。然而使用多年后,缺点逐渐显露:操作时多加一种溶液,既耗费时间,又增加出错率;需要多一个试剂瓶,增加成本,造成资源浪费;混合过程容易产生不均匀,批间质量差别较大,从而影响检测结果。目前国外同类产品多采用单组份TMB显色底物,然而其售价昂贵,难以采用进口原料来进行试剂盒产业化。
TMB-2HCl(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺二盐酸)形式虽然可溶于水,甚至达到1%的浓度,很容易就可根据试剂需要配制成浓度较高的溶液,然而所获得的溶液容易产品分层和沉淀。因此在实际应用中更多时候是使用3,3',5,5’一四甲基联苯胺(TMB)。由于TMB一般不易溶于水,易溶于有机溶剂。所以在TMB显色液配制时,常用有机溶剂帮助溶解,如最常用的二甲基亚矾(DMSO)、乙醇,以及二甲基甲酞胺(DMF)、甲醇、丙酮等。这类有机溶剂多易挥发、易被人体吸收等特点,多为蛋白变性剂,有潜在的神经毒性或致癌性等危害。在提倡健康和环保的今天,有机溶剂的大量使用,可能给操作者带来健康威胁,也将给环境带来不可估量的损害。近年来,更多的研究在于非有机溶剂的TMB溶液体系。
表1示出了现有技术中各种TMB显色液的组成以及TMB终浓度和过氧化氢的终浓度,其中申请号为201210560589.1的发明专利申请描述了一种单组份TMB显色液的制备方法:“其中由A液和B液等体积混合后得到,所述A液各组分的摩尔浓度为:柠檬酸0.01-0.5mol/L,磷酸氢二钠0.01-0.5mol/L,过氧化氢0.01-0.5mol/L,EDTA 0.1-1mmol/L;所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮,所述TMB的摩尔浓度为0.1-1mmol/L,所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L,所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10%。本发明调整了TMB的溶解体系,增加TMB的溶解度,聚乙烯吡咯烷酮,使单相TMB溶液在2~8度保存温度下,能保存2年。”
表1中申请号为201210560589.1发明专利有如下特点:(1)对重要成份聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone,简称PVP)的分子量等重要参数描述不详尽。聚乙烯吡咯烷酮,相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品,并以其优异独特的性能获得广泛应用。PVP按其平均分子量大小分为四级,习惯上常以K值表示,不同的K值分别代表相应的PVP平均分子量范围。K值实际上是与PVP水溶液的相对粘度有关的特征值,而粘度又是与高聚物分子量有关的物理量,因此可以用K值来表征PVP的平均分子量。通常K值越大,其粘度越大,粘接性越强。不同的分子量的性质各异,溶解度各不同,如不详细规定,难以精确重复实验。(2)实施例1中,B液中过氧化氢浓度最高达0.5mol/L,终浓度为0.25mol/L,这大大超过目前所有相关专利或产品中的相关描述(见表1),超过一般认可的“1-10mM”。过氧化氢浓度一般与TMB含量对应,过多量则引起本底极大的提高,导致产品不稳定。
表1
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供稳定性高、保存时间长、环保型的单组份TMB显色液,本发明还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。
本发明提供了一种单组份TMB显色液,其由A液和B液混合而成;所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成;所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成。
所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0%,所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10%,所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1%,所述甘油在B液中的体积比1-2%。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
所述A液和B液以1:1的体积比混合而成。
本发明还提供了所述的单组份TMB显色液的制备方法,包括如下步骤:
(1)A液:取柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,加入过氧化脲,搅拌使之充分溶解,以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容,避光密封暂存。
(2)B液:称取聚乙烯醇,边搅拌边将其加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒;加入聚乙烯吡咯烷酮,使之充分溶解;降至室温后,加入TMB,搅拌使充分溶解;最后,加入甘油,搅拌使之充分溶解;以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容。
(3)将A液和B液混合均匀。
(4)过滤获得均一的溶液,即为单组份TMB显色液。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH为3.5-3.8。
所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0%,所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10%,所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1%,所述甘油在B液中的体积比1-2%。
所述步骤(3)中的A液和B液是以1:1的体积比混合而成,所述步骤(4)中的过滤是采用孔径20-60μm的滤纸。
本发明相比现有技术具有如下优势:
1、本发明的单组份TMB显色液采用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲体系,可维持较低的酸性环境(pH3.5-3.8),促进TMB的溶解;柠檬酸钠可螯合二价离子,消除溶液中离子的干扰,可维持显色底物在溶液中的稳定性。
2、本发明的单组份TMB显色液采用非有机溶剂体系,可保护操作者远离有机溶剂的危害,并减少对环境的损害。
3、引入安全的聚乙烯醇及聚乙烯吡咯烷酮助溶TMB,使本发明的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系。
4.采用稳定的过氧化脲作为氧化物,在聚乙烯醇及聚乙烯吡咯烷酮共同作用下,使本发明的单组份TMB显色液更加稳定。
5.甘油在冷藏环境具有一定的抗冻效果,配合其它组分使用可以使本发明的单组份TMB显色液在2-8℃保存24个月。
具体实施方式
本发明提供了一种单组份TMB显色液,由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成;
所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成。
优选的,所述过氧化脲占A液的浓度为2-20mmol/L,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
优选的,所述聚乙烯醇占B液的质量体积比(w/v)为0.4-1.0%,所述聚乙烯吡咯烷酮占B液的质量体积比(w/v)为5-10%,所述TMB占B液的质量体积比(w/v)为0.04-0.1%,所述甘油占B液的体积比(v/v)1-2%,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为为0.1mol/L,pH为3.5-3.8,是一种低pH缓冲体系,柠檬酸钠是一种螯合剂,可以增加显色底物的稳定性,使显色底物的保存期延长。本发明单组份显色底物的制备采用低pH缓冲体系,再配合其它助溶剂聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮一起使用,更容易形成稳定的体系。
本发明采用聚乙烯醇(PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为助溶剂。
所述聚乙烯醇是一种高分子聚合物,不溶于丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙二醇等有机溶剂,微溶于二甲基亚砜,聚乙烯醇含有许多醇基,具有极性,且可与水形成氢键,故溶于水;同时其又是一种极安全的高分子有机物,对人体无毒,无副作用,具有良好的生物相容性,也可用作稳定剂、分散剂、乳化剂等。本发明在配方中加入了聚乙烯醇,可帮助TMB的溶解和稳定存在,且安全可靠;本发明优选采用聚乙烯醇1788,1788表示聚合度为1700,醇解度为88%,这样就更易溶解、粘度性中且成本低。为了完全溶解PVA 1788一般需加热到65-75℃,一般配制不超过5-8%(m/v),浓度过高容易胶化。
所述聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种水溶性聚酰胺,PVP溶于水、含氯溶剂、乙醇、胺、硝基烷烃以及低分子脂肪酸,与大多数无机盐和多种树脂相溶,不溶于丙酮、乙醚等;PVP不易发生化学反应,在正常条件下贮存,干燥的PVP是很稳定的;PVP具有优良的生理惰性和生物相容性,对皮肤、眼睛无刺激,无过敏反应,无毒。本发明采用PVP作助溶剂,可帮助TMB溶解,同时使之稳定存在,且安全无毒。本发明优选采用聚乙烯吡咯烷酮K-30,其在水中的溶解度可达1g/ml,醇解度为87.0-89.0%(mol/mol)、平均分子量为45,000-58,000,其更易获得和易溶解。
本发明的显色底物TMB适用于以过氧化物为酶促反应底物的显色系统中。其中所述的过氧化物为1-10mM的过氧化脲(也称过氧化尿素,下同),较过氧化氢稳定,以此类物质为底物的酶为辣根过氧化酶(HRP)。
所述甘油与其它组分配合使用,可增加冷藏条件下的稳定性。
本发明还提供了上述单组份TMB显色液的制备方法,包括如下步骤:
(1)A液:取900ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,加入过氧化脲0.188-1.88g,搅拌使之充分溶解,以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L,避光密封暂存。
(2)B液:称取聚乙烯醇4-10g,边搅拌边将其加入500ml室温(不超过40℃)的0.1mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,分散均匀后再升温加速溶解,最后于60-65℃水浴中搅拌溶解,并保温2-2.5小时,直到溶液不再含有微小颗粒,这样可以防止结块,加快溶解速度;加入聚乙烯吡咯烷酮50-100g,使之充分溶解;降至室温后,加入TMB0.4-1.0g,搅拌使充分溶解,注意加入TMB后避免强光照射;最后,加入甘油10-20ml,搅拌使之充分溶解;以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L。
(3)将A液和B液以1:1的体积比混合均匀。
(4)用孔径20-60μm的滤纸过滤,获得均一的溶液,保存于棕色玻璃或塑料瓶中,密封避光保存于2-8℃。
上述水为去离子水,所用化学试剂为分析纯及以上,上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为0.1mol/L(柠檬酸为0.07mol/L,柠檬酸钠0.03mol/L),pH值为3.5-3.8。
实施例1
本实施例提供了一种单组份TMB显色液,由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液包括如下浓度的各组分:
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:0.1mol/L,pH3.5-3.8
过氧化脲:2mmol/L
所述B液包括如下浓度的各组分:
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:0.1mol/L,pH3.5-3.8
聚乙烯醇:0.4%(w/v)
聚乙烯吡咯烷酮:5%(w/v)
TMB:0.04%(w/v)
甘油:1%(v/v)
所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液含有0.07mol/L柠檬酸和0.03mol/L柠檬酸钠,PH为3.5-3.8;所述聚乙烯醇为聚乙烯醇1788;所述聚乙烯吡咯烷酮为聚乙烯吡咯烷酮K-30。
本发明还提供了上述单组份TMB显色液的制备方法,包括如下步骤:
(1)A液:取900ml柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,加入过氧化脲0.188g,搅拌使之充分溶解,以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L,避光密封暂存。
(2)B液:称取醇解度为86.5-89.0mol%的聚乙烯醇1788共4g,边搅拌边将其加入室温(不超过40℃)的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液500ml中,分散均匀后再升温加速溶解,最后于60℃水浴中搅拌溶解,并保温2.5小时,直到溶液不再含有微小颗粒;加入聚乙烯吡咯烷酮K30为50g,使之充分溶解;降至室温后,加入TMB 0.4g,搅拌使充分溶解,注意加入TMB后避免强光照射;最后,加入甘油10ml,搅拌使之充分溶解;以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容至1L。
(3)将A液和B液各1L等体积混合均匀。
(4)用新华滤纸过滤(孔径20-60μm),获得均一的溶液,保存于棕色玻璃中,密封避光保存于2-8℃。
上述水为去离子水,所用化学试剂为分析纯及以上,其具体来源如表2所示。上述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液浓度为0.1mol/L,其配制方法为:取900ml去离子水,加入21.01g的柠檬酸C6H8O7·H2O溶解后,加入29.41g的柠檬酸钠Na3C6H5O7·2H2O,搅拌均匀后,用去离子水定容至1L,pH值为3.5-3.8。
表2
实施例2
本实施例提供了一种单组份TMB显色液,由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液包括如下浓度的各组分:
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:0.1mol/L,pH3.5-3.8
过氧化脲:10mmol/L
所述B液包括如下浓度的各组分:
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:0.1mol/L,pH3.5-3.8
聚乙烯醇:0.7%(w/v)
聚乙烯吡咯烷酮:7.5%(w/v)
TMB:0.07%(w/v)
甘油:1.5%(v/v)
原料及制备方法同实施例1。
实施例3
本实施例提供了一种单组份TMB显色液,由A液和B液以1:1的体积比混合而成。
所述A液包括如下浓度的各组分:
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:0.1mol/L,pH3.5-3.8
过氧化脲:20mmol/L
所述B液包括如下浓度的各组分:
柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:0.1mol/L,pH3.5-3.8
聚乙烯醇:1.0%(w/v)
聚乙烯吡咯烷酮:10%(w/v)
TMB:0.1%(w/v)
甘油:2%(v/v)
原料及制备方法同实施例1。
实施例4
本实施例提供了在酶联免疫法试剂盒中单组份TMB与终止液的联合使用的应用实例,其检测方法包括如下步骤:
用DIA.PRO公司的“巨细胞病毒IgG抗体检测试剂盒(酶联免疫法)”检测血清或血浆标本中的巨细胞病毒IgG抗体(以下组份除另有说明,皆为该试剂盒的成份):
(1)在已包被CMV抗原的微孔板中加入样本100u1,样本分别为阴性对照(CAL10IU/mL)、阳性对照(CAL68IU/mL)、临界对照(CAL20.5IU/mL),各做2个复孔;另外设空白对照2孔,不加样本。置37℃保温30min。
(2)弃去孔内液体,用工作洗涤液,洗板4次。加入抗人IgG-HRP酶结合物溶液100u1,其中空白对照孔不加抗人IgG-HRP酶结合物溶液。置37℃保温30min。
(3)弃去孔内液体,用工作洗涤液,洗板4次。
(4)各孔加入实施例1的单组份TMB显色液及DIA PRO的单组份TMB各100u1,置37℃保温15min。
(5)各孔分别加入终止液,各100u1,终止反应。
(6)分别于终止后,将反应板置酶标仪中,于450nm波长处用空白孔校零,读取各孔OD值,结果如表3。
(7)结果判断:其中以CAL2的均值为临界对照值(Cut Off值)。样本读数比临界对照值高,则为阳性;样本读数比临界对照值低,则为阴性。
表3
结果表明,实施例1中的单组份TMB显色液与对照商品化试剂显色效果相当。
实施例5
本实施例提供了实施例1的单组份TMB显色液的稳定性测试。
测试方法:将实施例4的步骤(1)的样本换为高值样品L1、中值样品L2、低值样品L3(为“巨细胞病毒IgG抗体参考品”中的最低检测限参考品,来源于中国食品药品检定研究院,标准物质编号为360004),并设空白对照;步骤(4)所用的TMB显色液是分别放置于2-8℃保存至0个月,6个月,12个月,18个月和24个月的实施例1的单组份TMB显色液;其它步骤同实施例4。
测试结果见表4,可以看出,实施例1中的单组份TMB显色液可以在2-8℃下稳定保存24个月。
表4
Claims (6)
1.一种单组份TMB显色液,其特征在于,由A液和B液以1:1的体积比混合而成;
所述A液是由过氧化脲溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成;所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L;
所述B液是由聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、TMB和甘油溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液制备而成,所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0%,所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10%,所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1%,所述甘油在B液中的体积比1-2%,所述柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L。
2.根据权利要求1所述的单组份TMB显色液的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)A液:取柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,加入过氧化脲,搅拌使之充分溶解,以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容,避光密封暂存;
(2)B液:称取聚乙烯醇,边搅拌边将其加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒;加入聚乙烯吡咯烷酮,使之充分溶解;降至室温后,加入TMB,搅拌使充分溶解;最后,加入甘油,搅拌使之充分溶解;以柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液定容;
(3)将A液和B液混合均匀;
(4)过滤获得均一的溶液,即为单组份TMB显色液。
3.根据权利要求2所述的单组份TMB显色液的制备方法,其特征在于,所述A液和B液中的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液的浓度为0.1mol/L,pH为3.5-3.8。
4.根据权利要求3所述的单组份TMB显色液的制备方法,其特征在于,所述过氧化脲在A液中的浓度为2-20mmol/L。
5.根据权利要求4所述的单组份TMB显色液的制备方法,其特征在于,所述聚乙烯醇在B液中的质量体积比为0.4-1.0%,所述聚乙烯吡咯烷酮在B液中的质量体积比为5-10%,所述TMB在B液中的质量体积比为0.04-0.1%,所述甘油在B液中的体积比1-2%。
6.根据权利要求5所述的单组份TMB显色液的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中的A液和B液是以1:1的体积比混合而成,所述步骤(4)中的过滤是采用孔径20-60μm的滤纸。
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