CN103063661A - 一种tmb显色液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是一种TMB显色液及其制备方法，属于生物体外诊断试剂技术领域，由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠0.01-0.5mol/L，过氧化氢0.01-0.5mol/L，EDTA0.1-1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB的摩尔浓度为0.1-1mmol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10%。本发明调整了TMB的溶解体系，增加TMB的溶解度，聚乙烯吡咯烷酮，使单相TMB溶液在2～8度保存温度下，能保存2年。

Description

一种TMB显色液及其制备方法
技术领域
本发明是一种TMB显色液及其制备方法，属于生物体外诊断试剂技术领域。
背景技术
酶联免疫吸附(ELISA)检测方法由于具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，已被广泛应用于抗原、抗体、细胞因子以及生化物质等的检测。酶联免疫吸附(ELISA)检测方法有很多种，但各种方法都离不开酶结合物和显色剂。在ELISA试剂中应用最广泛的酶是辣根过氧化物酶(HRP)，HRP的底物是过氧化物，如过氧化氢，而该系统的显色剂有多种，目前最常用的是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
TMB，即3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，是辣根过氧化物酶的常用底物。检测时，HRP催化过氧化物释放出氧，无色的TMB被氧化成蓝色的产物，蓝色产物通常可以在370nm或620-650nm测定吸光度；加入酸性的终止液终止反应后，蓝色溶液变成橙黄色，在450nm波长有最大吸收峰。通过测量吸光度，便可定性或定量判断出被检测物的含量。相对于其他显色剂来讲，TMB以显色高效、无毒、不致癌、稳定性好等特点成为ELISA检测的主流显色剂。
通常的TMB显色试剂由多个组份组成，必须在使用前进行配制，并且容易产生沉淀，使用相对不太方便，并且也容易导致检测结果不太稳定。某些厂家的生产的TMB显色试剂通常分为A、B两种贮存液，使用前将A液和B液按比例混合，这样操作繁琐且容易发生错配，造成实验失败。另外有些厂家也生产单相TMB显色液，但是存在溶解度低，稳定性差，保存时间短，灵敏度不高，显色背景高等的缺点。
如中国专利，专利号为200610028624X名称为《酶联免疫体外诊断试剂中显色剂的制备》中公开的一种TMB显色液制备方法，用该法最终得到的试剂稳定性不高，2～8度只能保存15月左右，显色背景也比较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种稳定性高、保存时间长、显色背景低的TMB显色液及其制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是该TMB显色液由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.01-0.5 mol/L，磷酸氢二钠0.01-0.5 mol/L，过氧化氢0.01-0.5mol/L，EDTA0.1-1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB 的摩尔浓度为0.1-1mmol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10%。
作为优选，所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.5mol/L，磷酸氢二钠0.5mol/L，过氧化氢0.5mol/L，EDTA 1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB 的摩尔浓度为1mmol/L，所述HCl 的摩尔浓度为0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为10%。
本发明所述TMB显色液的制备方法包括以下步骤：
a、  配制A液：使柠檬酸的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，过氧化氢的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，EDTA 的终摩尔浓度为0.1-1mmol/L；搅拌均匀，充分溶解；
b、  配制B液：使TMB 的终摩尔浓度为0.1-1mmol/L，HCl的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，聚乙烯吡咯烷酮的终质量分数为0.1-10%；搅拌均匀，充分溶解；
c、  最后将A液和B液等体积混合后，调整pH值在3.8-4.2之间，得到TMB显色液粗液；
d、  将TMB显色液粗液用0.22um微孔滤膜抽滤，得到所述TMB显色液。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、把所有组分全部配制在一个溶液中，仅由单一溶液组成，简化ELISA实验的操作步骤，降低实验中可能发生的随机误差。
2、本产品调整了TMB的溶解体系，增加TMB的溶解度，加入稳定剂聚乙烯吡咯烷酮，使单相TMB溶液能够长期稳定保存，在2～8度保存温度下，能保存2年。
3、信噪比高，提高了检测的灵敏度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以下实施例是对本发明的解释而本发明并不局限于以下实施例。
实施例1：TMB显色液的制备：
a、配制A液：在1L水中加入柠檬酸0.5mol，磷酸氢二钠0.5mol，过氧化氢0.5mol，EDTA 1mmol，搅拌均匀，充分溶解；
b、配制B液：在1L水中加入TMB1mmol，HCl0.5mol，再加入终质量浓度为10%的聚乙烯吡咯烷酮；搅拌均匀，充分溶解；
c、最后将A液和B液等体积混合后，调整pH=4.0，得到TMB显色液粗液；
d、将TMB显色液粗液用0.22um微孔滤膜抽滤，得到所述TMB显色液。
实施例2：将用实施例1的方法制备的TMB显色液与丹麦Kem-En-Tec Diagnostics公司商品化的TMB ONE显色液进行比较。
以Human IL-17A 双抗体夹心法ELISA为例，显色15min，测得OD值（λ=450nm）如下表1：
HumanIL-17A pg/ml KEM-OD值 实施例1-OD值
500.00 2.680 2.976
200.00 1.308 1.576
80.00 0.606 0.738
32.00 0.292 0.361
12.80 0.166 0.198
5.12 0.116 0.131
2.05 0.094 0.101
0.00 0.076 0.078
从表1中得出：KEM ONE在Human IL-17A 浓度为2.05 pg/ml时的信噪比是0.094/0.076=1.24，而实施例1的方法得到的TMB显色液在Human IL-17A浓度为2.05pg/ml时的信噪比是0.101/0.078=1.29，明显优于KEM ONE。
其他实施例：实施例1中所述TMB显色液也可以按如下表2中各组分的配制浓度，不同配制浓度所得的TMB显色液以Human IL-17A 双抗体夹心法ELISA为例，在Human IL-17A 浓度为2.05pg/ml时信噪比结果如下表2：
柠檬酸mol/L 磷酸氢二钠mol/L 过氧化氢mol/L EDTA mmol/L TMB mmol/L HCl mol/L 聚乙烯吡咯烷酮 信噪比
0.01 0.01 0.01 0.1 0.1 0.01 0.1% 1.24
0.05 0.05 0.05 0.2 0.2 0.05 0.2% 1.25
0.1 0.1 0.1 0.4 0.4 0.1 0.5% 1.26
0.2 0.2 0.2 0.6 0.6 0.2 2% 1.27
0.3 0.3 0.3 0.8 0.8 0.3 5% 1.28
0.5 0.5 0.5 1.0 1.0 0.5 10% 1.29
由此可以看出，以最后一组数据也就是实施例1中的配制浓度进行制备得到的TMB显色液的信噪比最高，检测结果最稳定。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其配比、工艺所取名称等可以不同。凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。
虽然本发明已以实施例公开如上，但并非用以限定本发明的保护范围，任何熟悉该项技术的技术人员，在不脱离本发明的构思和范围内所作的更动与润饰，均应属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种TMB显色液，其特征在于：由A液和B液等体积混合后得到，所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.01-0.5 mol/L，磷酸氢二钠0.01-0.5 mol/L，过氧化氢0.01-0.5mol/L，EDTA0.1-1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB 的摩尔浓度为0.1-1mmol/L，所述HCl的摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为0.1-10%。
2.根据权利要求1所述的TMB显色液，其特征在于：所述A液各组分的摩尔浓度为：柠檬酸0.5mol/L，磷酸氢二钠0.5mol/L，过氧化氢0.5mol/L，EDTA 1mmol/L；所述B液包括TMB、HCl和聚乙烯吡咯烷酮，所述TMB 的摩尔浓度为1mmol/L，所述HCl 的摩尔浓度为0.5mol/L，所述聚乙烯吡咯烷酮的质量分数为10%。
3.一种用于权利要求1所述TMB显色液的制备方法包括以下步骤：
a、配制A液：使柠檬酸的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，磷酸氢二钠的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，过氧化氢的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，EDTA 的终摩尔浓度为0.1-1mmol/L；搅拌均匀，充分溶解；
b、配制B液：使TMB 的终摩尔浓度为0.1-1mmol/L，HCl的终摩尔浓度为0.01-0.5mol/L，聚乙烯吡咯烷酮的终质量分数为0.1-10%；搅拌均匀，充分溶解；
c、最后将A液和B液等体积混合后，调整pH值在3.8-4.2之间，得到TMB显色液粗液；
d、将TMB显色液粗液用0.22um微孔滤膜抽滤，得到所述TMB显色液。
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