CN106940314A - 一种抗坏血酸检测用的显色剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种显色剂及其制备方法和应用。所述显色剂由羟基氧化钴纳米片混悬液与3,3',5,5'‑四甲基联苯胺水溶液混合制得;其中所述羟基氧化钴纳米片与所述3,3',5,5'‑四甲基联苯胺的摩尔比为2:1。所述显色剂用于检测抗坏血酸,灵敏度较高,检测限较低。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料和分析化学领域,涉及一种抗坏血酸光学检测方法。
背景技术
抗坏血酸(AA)是脑系统中最重要的神经化学物质之一,某些疾病与AA水平是密切相关,因此有必要发展一种具有高度选择性和快速灵敏检测AA的分析方法。
目前关于抗坏血酸的含量的测定方法有荧光光度法、直接碘量法、紫外分光光度法、动力学光度法、间接光度法、化学发光法、电极催化氧化法、高效液相色谱法等。其中紫外可见光度法检测抗坏血酸具有检测范围大、准确度高、快速、简便、误差小等优点。但同时存在检测限高、反应时间长和操作麻烦等问题。
发明内容
为了克服上述技术缺陷,本发明提供一种检测抗坏血酸的显色剂及其应用。利用本发明所述的显色剂检测抗坏血酸更加简单、快速,灵敏度高。
本发明采用的技术方案如下:
一种显色剂,为含1.5-2.5mM的oxTMB的蓝色水溶液;所得显色剂为蓝色水溶液,pH值为5.0-7.0。
所述oxTMB的结构式如下:
所述显色剂由羟基氧化钴纳米片混悬液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液混合制得;其中所述羟基氧化钴纳米片与所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的摩尔比为2:1。
优选地,所述羟基氧化钴纳米片混悬液的浓度为35-45μg/mL,所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液的浓度为1.5-2.5mM。优选地,所述显色剂中所述羟基氧化钴浓度为40μg/mL;优选3,3',5,5'-四甲基联苯胺浓度为2.0mM。所述羟基氧化钴纳米片混悬液与所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合。
所述羟基氧化钴纳米片与TMB水溶液混合发生氧化还原反应,得到含有oxTMB的蓝色水溶液,其中所述oxTMB的浓度为1.5-2.5mM;将含有oxTMB的水溶液(即显色剂)与AA接触,二者反应使体系由蓝色变为无色,从而利用该性质来检测待测物中AA含量。
进一步优选地,所述显色剂在制备过程中还加入柠檬酸和EDTA,起到缓冲溶液的作用,更有利于TMB与羟基氧化钴纳米片反应顺利进行。其中所述柠檬酸在显色剂中浓度为0.05-0.15mM,所述EDTA在显色剂中浓度为0.4-0.6M。
作为本发明优选的实施方式之一,所述显色剂中所述羟基氧化钴纳米片混悬液由下述方法制得:
将氯化钴(CoCl2)与氢氧化钠(NaOH)加入水中,超声处理,再加入次氯酸钠(NaClO),超声处理,得到深棕色的混合溶液,离心,过滤得到羟基氧化钴纳米片;再将羟基氧化钴纳米片溶于水中配制得到羟基氧化钴纳米片混悬液。
所得羟基氧化钴纳米片的粒径为95-105nm,平均粒径为100nm。
所述氯化钴、氢氧化钠、次氯酸钠的摩尔比为9-12:0.5-2.0:500-1000,优选10:1:900。
所述超声处理时间为10-13min,具体为11min。
所述水选自二次水。
作为本发明优选的实施方式之一,所述显色剂中所述TMB水溶液由如下方法制得:常温下,先将3,3',5,5'-四甲基联苯胺粉末溶于有机溶剂中直至完全溶解,得到混合液A;再将缓冲剂和螯合剂加入水中得到混合液B,将混合液A加入混合液B中,混匀,得到TMB水溶液。
所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺粉末与缓冲剂、螯合剂的用量比例为:10mg:0.05-0.15mM:0.4-0.6M。
所述缓冲剂优选柠檬酸;所述螯合剂优选乙二胺四乙酸二钠(EDTA)。
所述柠檬酸水溶液的浓度为0.05-0.15mM,具体为0.1mM。所述EDTA水溶液的浓度为0.4-0.6M,具体为0.5M。所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液与柠檬酸和EDTA的混合溶液的体积比为1:1-1.05,具体为1:1.02。
所述有机溶剂优选二甲亚砜DMSO。
本发明还提供上述显色剂在还原性生物分子检测中的应用;优选对抗坏血酸的检测。
本发明还提供一种抗坏血酸的检测方法,包括如下步骤:
(1)向待测样品中加入显色剂,检测其在652nm处的紫外吸光度值,记为A;
(2)计算ΔA=A0–A,其中A0为显色剂在652nm处的紫外吸光度值;
(3)代入线性方程ΔA=0.19296C+0.01428,相关系数为0.994,求得C值;其中C为待测样品中抗坏血酸的浓度。
其中,所述线性方程由如下方法获得:向所述显色剂中依次加入0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、10μM、50μM、100μM和200μM的AA溶液后,在652nm处的紫外可见吸收强度逐渐减小,如图4A所示。将紫外吸收强度的变化值ΔA(A0-A)与加入的AA的浓度作图,其中A0及A为加入AA前后的蓝色溶液在652nm处紫外可见吸收的强度,如图4B所示。插图为紫外吸收变化值与AA浓度的线性关系图,线性范围为10nM-1μM,线性方程为A0-A=0.19296C+0.01428,相关系数为0.994,方程中C代表加入的AA浓度。检测时,蓝色溶液与AA溶液的体积比为1:2,相当于每一份AA样品被稀释了1.5倍,所以本发明对AA的检测限为6.67nM。
本发明所述显色剂的载体可为可视化试纸或其它便于检测的载体形式。所述可视化试纸具体制作方法为:将试纸浸渍显色剂中3-10min,于空气中放置3-10min,即得。
在试纸上滴上不同浓度(如0μM、5μM、20μM、50μM、100μM、200μM)的AA时,可以在试纸上观察到不同的颜色变化。依据不同颜色,判断AA浓度。
本发明提供的显色剂,在检测抗坏血酸时,显色剂的颜色变化过程如图1所示,首先,上述制得的改性六边形羟基氧化钴混合溶液直接与TMB溶液混合,即可得到上述的蓝色溶液,因为六边形羟基氧化钴纳米片与TMB发生氧化还原反应,使无色的TMB氧化成蓝色的oxTMB(氧化态),这就制得了上述所述的紫外蓝色溶液体系。
其次,由于抗坏血酸具有很强的还原性,所以当在这个体系中加入抗坏血酸过后,氧化态的oxTMB会被还原为TMB,溶液的蓝色会很快的褪去,而且加入不同浓度的抗坏血酸,溶液颜色的变化也会不同,即抗坏血酸的浓度越大,颜色褪去的程度越大。
我们发现六边形羟基氧化钴纳米片可以氧化TMB,氧化产物呈现明显的蓝色,具有强烈的可见光吸收,当体系中加入抗坏血酸时,因抗坏血酸具有强烈的还原性,可以将TMB氧化态还原,体系蓝色消失,从而可以建立抗坏血酸的快速紫外可见分析方法。据此,本发明建立了一种简单、快速检测抗坏血酸分子的比色方法,并能够应用于实际生物样品的检测。
本发明具有的优势在于:
1)所述六边形羟基氧化钴纳米片和TMB溶液制备简便,进而可建立一种简单、快速的比色方法来检测生理环境中的生理分子。
2)本发明所述显色剂可负载于可视化试纸,从而简单有效的检测抗坏血酸。
3)本发明所述用于检测抗坏血酸的方法灵敏度较高,检测限为6.67nM。
附图说明
图1为六边形羟基氧化钴纳米片混合溶液与TMB溶液混合的蓝色体系检测抗坏血酸的策略图;
图2为实施例1所得三种体系的透射电子显微镜(TEM)表征图,其中,A为CoOOH纳米片;B为TMB-CoOOH纳米片;C为TMB-AA-CoOOH纳米片。
图3为可行性试验的紫外可见光谱图,其中a为TMB-CoOOH纳米片;b为TMB-H2O2-CoOOH纳米片;c为TMB-H2O-CoOOH纳米片;d为TMB-AA-CoOOH纳米片;e为TMB-AA。
图4为加入不同浓度AA的紫外可见吸收光谱图。A图所示为在652nm处的紫外吸收光谱图,分别加入了AA溶液浓度为0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、10μM、50μM、100μM和200μM的紫外可见吸收光度值A;B图为六边形羟基氧化钴纳米片比色检测AA的标准曲线图。
图5所示为检测鼠脑透析液中AA含量的紫外吸收光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述,但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
下述实施例中的试剂来源为:六水合氯化钴(CoCl2·6H2O);氢氧化钠(NaOH);次氯酸钠(NaClO);抗坏血酸(AA);柠檬酸(C6H8O7·H2O);乙二胺四乙酸二钠(C10H14N2O8Na·2H2O);3,3',5,5'-四甲基联苯胺(C16H20N2);二甲基亚砜((CH3)2SO),所有试剂均为分析纯,所提及的水溶剂均为二次水。
实施例1
第一步,前体的制备和表征
(a)六边形羟基氧化钴纳米片混悬液的制备:将0.0238g CoCl2粉末置于10mL离心管中得10mM CoCl2水溶液;0.4g NaOH颗粒置于10mL离心管中得1.0mM NaOH溶液;6.696mLNaClO溶液置于10mL离心管中,并用二次水稀释至10mL得0.9M NaClO溶液。取250μLNaOH与1mL CoCl2溶液置于5mL离心管中,超声1min,再加入50μLNaClO溶液,超声10min,然后离心、干燥即可得到深棕色的六边形羟基氧化钴纳米片。将羟基氧化钴纳米片分散于水中得到羟基氧化钴纳米片混悬液。
CoOOH纳米片的表征:利用透射电子显微镜对CoOOH纳米片混悬液进行表征,所得结果如图2A所示。由图可知,CoOOH在水相中分布均匀,且粒径均一。据统计分析,CoOOH的粒径分布在90-110nm,平均粒径为100nm。
(b)TMB水溶液的制备:将10mg的TMB粉末置于5mL的离心管中,加入1mL的二甲基亚砜(DMSO)使其完全溶解;0.021g柠檬酸颗粒置于5mL离心管中,加入1mL二次水使其溶解;0.0037g乙二胺四乙酸二钠(EDTA)粉末置于1mL离心管中,加入20μL二次水使其溶解;将上述溶液置于50mL离心管中,用二次水稀释至20mL即可得到TMB水溶液。
第二步,蓝色混合溶液体系的制备及其表征
蓝色体系的制备:将上述制得的浓度为40μg/mL的CoOOH纳米片悬浊液与浓度为2mM的TMB的水溶液按体积比1:1于常温下混合均匀,静止放置维持15分钟,待溶液由无色变为蓝色且稳定时,即得到本发明提供的蓝色混合溶液体系,该溶液的pH值为5.0。
表征:利用TEM对蓝色溶液体系进行表征,所得结果如图2B所示。由图可知,六边形的羟基氧化钴纳米片被TMB溶液刻蚀,据统计分析,刻蚀了的圆形纳米片尺寸分布为40-60nm,平均尺寸为50nm。
向所得蓝色溶液中加入AA,体系蓝色消失,利用TEM对加入AA的溶液体系进行表征,所得结果如图2C所示。
实施例2
利用紫外可见分光光度计,就实施例1所得显色剂的可行性试验作图,如图3所示,(a)为在5mL离心管中分别加入1mL的CoOOH纳米片悬浊液与TMB的水溶液待其颜色稳定后,置入比色皿中,测其紫外吸收强度;(b)为在2mL蓝色溶液中加入1mL H2O2的紫外吸收曲线;(c)为在2mL蓝色溶液中加入1mL H2O的紫外吸收曲线;(d)为上述同样方法制得的蓝色溶液中加入100μL浓度为100μM的AA溶液的紫外吸收曲线;(e)为分别加入1mL的TMB和上述浓度的AA水溶液的紫外吸收曲线。
b、c紫外吸收曲线在652nm处的强度基本一样,说明H2O2对体系是没有影响的,d曲线的紫外吸收强度有明显的变化,说明在上述所制的蓝色溶液体系对AA有很好的响应,那是因为强还原性的AA使具有蓝色的oxTMB还原为无色的TMB。
实施例3
将实施例1所得显色剂制成可视化试纸,利用可视化的颜色变化来检测AA,具体步骤如下:
1)确定对AA的检测限:
在实施例1所制得的显色剂蓝色水溶液中依次加入0nM、10nM、50nM、100nM、200nM、500nM、1μM、10μM、50μM、100μM和200μM的AA溶液后,在652nm处的紫外可见吸收强度逐渐减小,如图4A所示。将紫外吸收强度的变化值ΔA(A0-A)与加入的AA的浓度作图,其中A0及A为加入AA前后的蓝色溶液在652nm处紫外可见吸收的强度,如图4B所示。插图为紫外吸收变化值与AA浓度的线性关系图,线性范围为10nM-1μM,线性方程为A0-A=0.19296C+0.01428,相关系数为0.994,方程中C代表加入的AA浓度。检测时,蓝色溶液与AA溶液的体积比为1:2,相当于每一份AA样品被稀释了1.5倍,所以利用本发明所述显色剂对AA检测的检测限为6.67nM。
2)设置大鼠脑透析液液实验模型,利用实施例1所得显色剂检测含有AA的大鼠脑透析液:
在正常情况下对大鼠的脑区进行微透析,得到含有AA的脑透析液。利用本发明提供的蓝色溶液体系测定抗坏血酸得到的紫外吸收可见光谱图,如图5A所示。图5B所示,在652nm处,紫外吸收强度变化值ΔA与[AA]的线性关系,线性方程为ΔA=6.33*10-3C+0.11143,相关系数为0.983,方程中C代表AA的浓度,根据上述方程求得正常大鼠脑透析液中的AA浓度为10.23μM。后进行加标实验,在正常状态下大鼠脑透析液中AA平均含量为8.30±1.93μM,由此证明了本发明提供的蓝色溶液体系具有对AA的高选择性及高灵敏检测的能力,并能够成功应用于实际生物样品的动物模型中,进一步体现了该方法的实际应用能力。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种显色剂,其特征在于,含1.5-2.5mM的oxTMB的蓝色水溶液;所述oxTMB的结构式如下:
2.根据权利要求1所述的显色剂,其特征在于,由羟基氧化钴纳米片混悬液与3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液混合制得。
3.根据权利要求2所述的显色剂,其特征在于,所述羟基氧化钴纳米片混悬液的浓度为35-45μg/mL,所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液的浓度为1.5-2.5mM;所述羟基氧化钴纳米片混悬液与所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺水溶液按体积比1:1混合。
4.根据权利要求1-3任一所述的显色剂,其特征在于,所述显色剂在制备过程中还加入柠檬酸和EDTA。
5.根据权利要求4所述的显色剂,其特征在于,所述柠檬酸在显色剂中浓度为0.05-0.15mM,所述EDTA在显色剂中浓度为0.4-0.6M。
6.根据权利要求1所述的显色剂,其特征在于,所述显色剂中所述羟基氧化钴纳米片混悬液由下述方法制得:将氯化钴与氢氧化钠加入水中,超声处理,再加入次氯酸钠,超声处理,得到深棕色的混合溶液,离心,过滤得到羟基氧化钴纳米片;再将羟基氧化钴纳米片溶于水中配制得到羟基氧化钴纳米片混悬液。
7.根据权利要求1所述的显色剂,其特征在于,所述显色剂中所述TMB水溶液由如下方法制得:常温下,先将3,3',5,5'-四甲基联苯胺粉末溶于有机溶剂中直至完全溶解,得到混合液A;再将缓冲剂和螯合剂加入水中得到混合液B,将混合液A加入混合液B中,混匀,得到TMB水溶液。
8.权利要求1-7任一所述显色剂在还原性生物分子检测中的应用;优选在抗坏血酸检测中的应用。
9.一种抗坏血酸的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)向待测样品中加入权利要求1-7任一所述显色剂,检测其在652nm处的紫外吸光度值,记为A;
(2)计算ΔA=A0-A,其中A0为权利要求1-4任一所述显色剂在652nm处的紫外吸光度值;
(3)代入线性方程ΔA=0.19296C+0.01428,求得C值;其中C为待测样品中抗坏血酸的浓度。
10.一种可视化试纸,其特征在于,负载权利要求1-7任一所述显色剂。
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