CN109696429A - AO-CoOOH纳米荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了AO‑CoOOH纳米荧光探针及其制备方法和应用。将CoOOH纳米片与AO溶液混合，混合物孵育15分钟，AO‑CoOOH纳米探针即制备获得。所述CoOOH纳米片与AO溶液的浓度分别为12μg/ml和0.01mM。本发明构建了一种基于羟基氧化钴(CoOOH)纳米片联合碱性橙(AO)染料的“混合即检测”型荧光纳米探针，用于检测PPi并实现在细胞和活体中成像。与其它纳米材料相比，本申请中的CoOOH纳米片由于其成本低、合成操作简便、安全等优点。特别是纳米探针可以通过将AO和CoOOH纳米片简单混合获得。AO的荧光可以被CoOOH纳米片猝灭，当添加PPi时，荧光强度会进一步降低。该方法具有操作简单、灵敏度高、选择性高等特性，可用于细胞和活体中PPi的检测和成像。

Description

AO-CoOOH纳米荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及检测技术，具体涉及AO-CoOOH纳米荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
焦磷酸根离子(PPi)不仅是工业废水中很难去除的磷源之一，而且也是一种非常重要的生物目标阴离子。研究表明,PPi可以参与许多生命过程中的能量传递和新陈代谢,如在DNA聚合酶的催化下参与DNA的复制,由此可通过对PPi的检测实现DNA序列的实时测定。PPi也可以作为早期诊断和治疗癌症、关节炎、软骨钙化和其他疾病的潜在生物标记物。此外，PPi也被用于食品添加剂。因此，建立一种快速、简单、选择性好且能应用于活细胞和活体中PPi检测的方法具有重要的意义。
目前，检测PPi的方法包括电化学法、比色法、荧光光度法等。然而，电化学检测法虽然精度高，选择性好，但重复性差。比色法存在灵敏度低、干扰严重等问题。荧光分析法已广泛应用于化学分析，但大部分方法存在需要荧光探针合成制备复杂、操作步骤繁琐等不足。最近，基于纳米材料的PPi传感器研究引起了越来越多研究者的关注，如金纳米颗粒、纳米簇、纳米棒、量子点和碳纳米材料等。然而，这些纳米材料存在合成制备工艺繁琐、耗时、原料昂贵等限制，且合成的纳米材料很少能实现在活体中的检测应用。因此，发展一种简单、灵敏的检测PPi及其活体成像的方法具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了AO-CoOOH纳米荧光探针及其制备方法和应用。
本发明的技术方案是：AO-CoOOH纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，将CoOOH纳米片与AO溶液混合，混合物孵育15分钟，AO-CoOOH纳米探针即制备获得。
本发明的进一步改进包括：
所述CoOOH纳米片与AO溶液的浓度分别为12μg/ml和0.01mM。
本发明进一步提供了按照上述方法制得的AO-CoOOH纳米荧光探针。
本发明还提供了AO-CoOOH纳米荧光探针在血清、活细胞和活体中PPi的检测中的应用。
在本申请中，本发明构建了一种基于羟基氧化钴(CoOOH)纳米片联合碱性橙(AO)染料的“混合即检测”型荧光纳米探针，用于检测PPi并实现在细胞和活体中成像。与其它纳米材料相比，本申请中的CoOOH纳米片由于其成本低、合成操作简便、安全等优点，具有一定的优势。特别是纳米探针可以通过将AO和CoOOH纳米片简单混合获得。AO的荧光可以被CoOOH纳米片猝灭，当添加PPi时，荧光强度会进一步降低。该方法具有操作简单、灵敏度高、选择性高等特性，可用于细胞和活体中PPi的检测和成像。本申请的方法可能为PPi相关的生理和病理研究提供一个新的分析平台。
附图说明
图1.CoOOH纳米片的TEM(A)和SEM(B)结果。其中：(C)CoCl2(黑色)和CoOOH纳米片(红色)的UV-vis吸收光谱。插图:CoOOH纳米片溶液颜色及其丁达尔效应照片。(D)CoOOH纳米片的XPS光谱。(E)CoOOH纳米片的傅里叶变换红外光谱结果。(F)CoOOH纳米片的Zeta电位结果。
图2.(A)AO(a)、AO-CoOOH纳米探针(b)、b+PPi(c)的荧光发射光谱。浓度：AO(0.01mM),CoOOH(12μg/ml),PPi(47.5μM)。(B)不同物质混合后的紫外-可见光吸收光谱。
图3.(A)不同配比AO-CoOOH纳米探针对PPi的荧光响应效果。(碱性橙0.01mM,CoOOH纳米片6,12,24,36,48μg/ml，PPi 23.8μM).(B)纳米复合探针在不同pH下对PPi的响应效果。ΔF＝F-F0,F和F0分别代表PPi存在与不存在时的荧光强度。(碱性橙0.01mM,CoOOH纳米片12μg/ml,PPi 23.8μM。pH 4-6为醋酸-醋酸钠缓冲液；pH 7-9为Tris-醋酸缓冲液，浓度均为10mM)。(C)CoOOH纳米片加入AO溶液后的荧光强度随时间的变化曲线。(D)AO-CoOOH荧光纳米探针对PPi的反应动力学曲线。(碱性橙0.01mM,CoOOH纳米片12μg/ml,PPi 23.8μM)。
图4.(A)将不同浓度的PPi(0,50,200,400,800,1600,3200,6400,12800,25600nM)加入AO-CoOOH纳米探针(碱性橙0.01mM,CoOOH纳米片12μg/ml)的荧光发射光谱图。(B)不同浓度PPi与其引起荧光变化的关系图。插图；PPi浓度(50-6400nM)与ΔF(ΔF＝F-F0)线性关系图。F和F0分别代表PPi存在与不存在时的荧光强度。
图5.AO-CoOOH纳米探针对PPi检测的选择性分析，以上物质浓度均为1.6μM。ΔF＝F-F0,F和F0分别代表PPi存在与不存在时的荧光强度。(碱性橙0.01mM,CoOOH纳米片12μg/ml)。
图6.CT26细胞加入不同物质后的激光共聚焦显微镜照片。(A)AO-CoOOH纳米探针，(B)-(D)为在A基础上再加入(0.025,0.1,2mM)PPi。(碱性橙0.01mM；CoOOH纳米片12μg/ml)；显微镜成像放大倍数为630倍。
图7.鲫鱼体内被注射AO-CoOOH纳米探针及不同浓度PPi后的荧光成像结果。(A)将200μl AO-CoOOH纳米探针(碱性橙:0.67mM；CoOOH纳米片:80μg/ml)注射到鱼体内50分钟后观察结果；(B)(A)+40μl焦磷酸根(0.1M)被注射到鱼体内40分钟后观察结果；(C)(A)+240μl焦磷酸根(0.1M)被注射到鱼体内40分钟后观察结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做详细说明。
实施例
试剂
六水氯化钴是从国药试剂公司(上海,中国)购买的。三磷酸腺苷(ATP)是从麦克林试剂公司(中国)购买的。次氯酸钠、氢氧化钠、葡萄糖(Glu)、果糖(Fru)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)是从阿拉丁试剂公司(上海,中国)购买的。磷酸钠、十二水磷酸钠、二水磷酸氢二钠、二水磷酸二氢钠、碳酸氢钠、碳酸钠、硫酸钠、九水硫化钠、硝酸钠、氯化钠和醋酸钠、氯化镁、二水氯化钙、二水氯化铜、氯化钾、氯化锌是从阿拉丁试剂公司(上海,中国)购买的。麻醉剂(ms-222)是从上海吉荧生物科技公司购买的。所有试剂都是分析纯级别的，由去离子水(Millipore,Bedford,MA,USA,18.2MΩ·cm)配制。
仪器
美国分子公司SpectraMax M5多功能酶标仪、哈希多功能参数水质仪DR6000(美国)、透射电镜JEM-1200EX(日本)、日立SU8010冷场发射扫描电子显微镜(日本)、X-ray光电子能谱仪(美国)、傅里叶红外光谱仪(美国)、Zeta电位仪(英国)、LSM 710激光共聚焦显微镜(德国)、超纯水仪F3HN00200D(美国)、细胞培养箱Hera Cell 240i Thermo公司(美国)、电子天平Mettler Toledo仪器公司(美国)、梅特勒pH计Mettler Toledo公司(瑞士)、小动物活体成像(IVIS SPECTRUM,Caliper-PE)。
CoOOH纳米片及AO-CoOOH纳米荧光探针的制备
本发明合成的CoOOH纳米片是参照现有文献中的方法制得。首先，125μl氢氧化钠(1M)添加到500μl的氯化钴溶液(10mM)中，混合后超声1分钟。然后,将25μl次氯酸钠溶液(0.9M)加入混合物中，超声10分钟。随后，将混合物离心，用去离子水清洗三次。最后将产物重新分散在1ml水中，其最终浓度为0.25mg/ml。将CoOOH纳米片(12μg/ml)与AO(0.01mM)溶液混合，混合物孵育15分钟，AO-CoOOH纳米探针即制备获得。
缓冲液中PPi的检测
将不同浓度的PPi(50,200,400,800,1600,3200,6400,12800,25600nM)加入到制得AO-CoOOH纳米探针中，孵育60分钟后，在激发波长为490nm，在510到750nm范围内收集荧光发射光谱。
荧光显微镜成像
为了探究纳米探针在细胞水平下对PPi的检测效果，首先将CT26接种在铺有玻片(直径14mm)的24孔板里培养18小时，然后用500μl的PBS将细胞洗涤两次，将一定浓度的AO-CoOOH纳米探针加入细胞培养板后放入37℃含5％CO2的培养箱中培养2小时，再用PBS洗涤两次加入PPi孵育1小时，在蔡司AXIO Abserver A1荧光显微镜和蔡司LSM 710激光共聚焦显微镜下观察结果。
小动物活体成像
为了研究纳米探针在活体中对PPi的检测效果，本发明将200μl纳米探针腹腔注射到鲫鱼体内，50分钟后，在水体中加入麻醉剂三卡因将鱼麻醉，在小动物活体成像仪(激发500nm，荧光发射540nm)下观察结果。观察后，在鱼体的同一部位注射一定浓度的PPi，40分钟后，在小动物活体成像仪下观察结果。
CoOOH纳米片表征
CoOOH纳米片用透射电镜(TEM),扫描电镜(SEM),紫外可见吸收光谱(UV-vis)，X射线光电子能谱(XPS),傅里叶变换红外光谱和Zeta电位等技术进行表征。如图1A、B所示，CoOOH纳米片的TEM和SEM图像清晰地显示了CoOOH纳米片的形貌是六边形的，与之前的报道一致。插图中显示羟基氧化钴纳米片溶液颜色是棕黑色，有明显的丁达尔效应，其在300nm到800nm范围内具有宽的吸收带(图1C)，这使其成为针对多种荧光剂的潜在猝灭剂，包括本申请中使用的AO荧光染料也具有良好的猝灭效果。利用X射线光电子能谱(XPS)的成分分析表明该材料确实含有Co和O元素(图1D)。图1E显示CoOOH纳米片的傅里叶变换红外光谱结果，584cm-1、1620cm-1和3420cm-1处的峰分别代表Co-O、Co-O2、O-H官能团。CoOOH纳米片的ζ电位的测量约32.8mV(图1F),其表面带正电荷。上述数据充分证明了CoOOH纳米片是成功制备的。
AO-CoOOH纳米探针检测PPi的原理
如图2A所示，AO在530nm处显示强烈的荧光发射峰(曲线a)，在CoOOH纳米片的存在下，CoOOH纳米片将AO的荧光有效地猝灭(曲线b)。当加入PPi后，荧光得到进一步的猝灭。通过图2B的紫外-可见光吸收光谱可见，只有当AO、CoOOH、PPi共同存在时，三者混合物的吸收光谱才发生明显蓝移，这说明三者形成了一定形式的耦合作用，推测正是因为这种耦合作用引起了PPi存在时AO-CoOOH复合物的荧光进一步明显猝灭。
实验条件优化
为了达到更好的传感检测性能，本发明优化了实验条件。本发明研究了滴加不同浓度的CoOOH纳米片到AO溶液中，再加入等量PPi引起的体系荧光变化(图3A)。结果显示，当CoOOH纳米片浓度为12μg/ml时，加入多少浓度的PPi引起的荧光猝灭程度最大。因此，本发明选择比例为0.01mM：12μg/ml AO-CoOOH复合物为最优探针比例。本发明接着探究了pH对检测体系荧光变化的影响。如图3B所示，在pH为3.0-9.0的范围内，检测体系的荧光强度都得到猝灭，当pH 4.0时，荧光猝灭效果最显著。同时，本发明也对孵育时间进行了考察，首先是对CoOOH纳米片与AO溶液的孵育时间进行优化。如图3C所示，CoOOH加入到AO溶液后，其荧光迅速猝灭，5分钟后基本平衡，因此，本发明选择5分钟的反应时间用于接下来的实验。接着，本发明将PPi加入荧光纳米探针，用于探究荧光探针对PPi的反应时间。如图3D所示，加入PPi后，荧光探针的荧光逐渐缓慢猝灭，且在60分钟时基本达到稳定状态。
AO-CoOOH纳米探针对PPi的检测
在最优化的条件下，本发明进行了PPi的检测实验。如图4A所示，当PPi浓度在0-25600nM范围内，随着PPi浓度的增加，体系的荧光强度逐渐减小，并且在高浓度PPi时荧光猝灭逐渐减缓。图4B是不同浓度PPi与其引起荧光变化的关系图，插图为其相应的标准曲线，结果显示其线性相关系数为0.999，PPi的浓度与F具有良好的线性关系(y＝0.16238x+208.47075)，其最低检测限为50nM。与之前报道的方法相比较，AO-CoOOH纳米探针对PPi的检测效果较好。
表1.对比已报道不同检测PPi方法的线性范围与灵敏度
选择性考察
选择性是分析检测方法的关键指标之一。因此，本发明选用一些常见阴离子、生物分子和金属离子进行干扰性分析实验。如图5所示，只有目标物PPi对体系的响应是最显著的。因此，该纳米探针对PPi的选择性较好。
AO-CoOOH纳米探针检测血清样品中的PPi
为了考察纳米探针在实际样品中的检测效果，本发明选用健康人血清来进行加标回收实验。在健康人血清样品中未检测到PPi。因此，本发明将终浓度为3.2μM和6.4μM PPi加入血清样品中，利用AO-CoOOH纳米探针来进行检测，检测结果如表2所示，其回收率达到102.34％和114.06％,相对标准偏差为0.49％到1.20％，由此可见，本发明设计的纳米传感体系在实际样品中的应用是成功的。
表2.AO-CoOOH纳米探针检测血清样品中的PPi(n＝3)
AO-CoOOH纳米探针用于细胞内PPi的检测
本发明将AO-CoOOH纳米探针应用于细胞内PPi的检测，选用小鼠结肠癌细胞(CT26)进行实验。AO-CoOOH纳米探针与CT26细胞孵育2小时，用PBS洗涤两次，再加入终浓度分别为0.025,0.1,2mM PPi孵育1小时，在激光共聚焦显微镜下进行观察。结果如图6所示，单独加入纳米探针的细胞中具有较强烈的荧光，PPi的加入使荧光得到进一步猝灭，且随着PPi浓度的增加，荧光强度逐渐被减弱。上述结果表明，本发明设计的荧光纳米探针可实现对细胞内PPi的检测。
AO-CoOOH纳米探针用于鲫鱼体内PPi的检测
为了研究纳米探针在活体中对焦磷酸根的检测及荧光成像效果效果，本发明将AO-CoOOH纳米探针及PPi注射到鲫鱼体内，并在小动物荧光成像仪下观察结果。结果如图7所示，单独被注射纳米探针的鱼体中具有较强烈的荧光，PPi的加入使荧光得到进一步猝灭，且随着PPi浓度的增加，荧光强度减小。以上结果表明，本申请的荧光纳米探针对活体中PPi的检测及荧光成像是可行的。
结论
总而言之，本发明发展的基于CoOOH纳米片联合AO染料的“混合即检测”型荧光纳米探针，可应用于检测PPi并实现在细胞和活体中成像。同时，该纳米探针可成功应用于实际样品的检测。该方法操作简单方便更容易被生理学家所采用。本申请不仅为细胞的检测提供了一种新方法，同时也为细胞在生理和病理的分析中提供了一个分析平台。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.AO-CoOOH纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，将CoOOH纳米片与AO溶液混合，混合物孵育15分钟，AO-CoOOH纳米探针即制备获得。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CoOOH纳米片与AO溶液的浓度分别为12μg/ml和0.01mM。
3.AO-CoOOH纳米荧光探针，其特征在于，按照权利要求1或2的方法制得。
4.AO-CoOOH纳米荧光探针在血清中PPi的检测中的应用。
5.AO-CoOOH纳米荧光探针在活细胞中PPi的检测中的应用。
6.AO-CoOOH纳米荧光探针在活体中PPi的检测中的应用。
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