CN104711314A - 一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法 - Google Patents

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金鑫
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Abstract

本发明公开了一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法,本发明采用偏光显微镜观察单个金纳米棒,发现偏光显微镜能够对各向异性的纳米材料进行选择性成像,在偏光显微镜下,金纳米棒的散射光点具有较小的尺寸,能够显著降低成像的背景值,相应地图像的信噪比得到至少3倍以上的改善。由于这种独特的光学性能,各向异性纳米材料和偏光显微镜在癌细胞成像和检测中有着巨大的应用潜力。

Description

一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法
技术领域
本发明涉医学检测技术领域,尤其涉及一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法。
背景技术
近年来,金纳米棒(GNR)引起了科学家深入的研究兴趣,并得到了大范围的推广应用。在成像领域,金纳米棒的很多光学特性被用来开发体内和体外的成像技术。例如,由于表面等离子体共振效应,金纳米检有具有非常高的光学稳定性和很高的光学吸收和散射效率。事实上,它们比其他形状的纳米棒材料具有更高的光吸收和散射截面积。金纳米棒的长轴等离子体共振吸收峰可以通过改变长径比(长度和直径的比率)简单地从可见光区域调节至近红外光区域,而生物组织在近红外光区域其本上是透明的。通过动态电子弛豫过程,金纳米棒能够将光能转化成热能,从而使他们具有很强的光热转换能力。而且,由于电子空穴的快速结合过程,金纳米棒具有很高的光致发光的量子产率,其最大发射波长可以通过增大长径比进行增加。上述特点已应用于各种成像模式,包括光散射成像、光吸收成像、光热成像、光声成像和荧光成像等等。但是还有一个很重要的光学特性没有得到充分的重视,即金纳米棒能够改变入射光的偏振特性,迄今为止,还没有文献报道利用这种光去极化性质来开发新的成像方法。
偏光显微镜是一项非常好的工具,能够同时提供物理的、化学和晶体数据。在这种简单的技术中,使用偏振光对样品进行照射,而反射光和透射光使用偏振方向垂直于入射光偏振方向的检偏器来阻断。偏光显微镜能够选择性的观察各向异性的化合物和结构,被检测目标在这种情况下是明亮的。这 种技术能够对诸如纺锤体之类的双折射结构提供高分辨率的成像,而这种结构在Hoffman,暗场和相差显微镜下是看不到的。偏光显微镜对评估人体的微环境是非常有用的,能够通过减少细胞组份的散射和周围组织的污点得到较高的图像对比度和细节。
有研究表明:利用暗场显微镜和垂直偏振成像技术可以提供原位高信噪比星型金纳米颗粒的图像,实时追踪单个纳米颗粒的行为能对物理学和生物学过程提供丰富的细节信息。迄今为止,普通的偏光显微镜还没有在实验中用来观察单个纳米颗粒,主要原因是:一方面由于其他显微成像技术的存在,利用偏光显微镜进行材料分析的意识越来越少;另一方面,纳米颗粒都在纳米尺度,因为尺寸太小了,如果纳米材料没有非常强的光学性能是很难被观测到的。
发明内容
本发明提供了一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法,由于偏光显微镜具有很强的减背景能力,细胞内单个金纳米棒可以被清楚地观察到,金纳米棒与偏光显微镜可联合应用于癌症检测和新型传感器的开发。
本发明的采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法的具体步骤如下:
将细胞置于放置了玻片的塑料培养皿中,注入高糖DMEM培养基进行培养,使用1%的青霉素-链霉素,10%的牛血清在37℃,5%CO2环境中进行培养,当细胞培养24h后,溶液采用新的高糖DMEM培养基进行替换,并加入40ul抗体修饰的金纳米棒溶液,再经过4h的培养后,将盖玻片从培养皿中取出并倒置于载玻片上进行观察,成像使用Olympus BX51显微镜,显微镜装置100W的卤素钨灯、一个NA值为1.25-1.36的油浸式聚光镜、40倍的平场消色差聚光镜和型号为Olympus DP73的彩色CCD(CCD为电荷耦合元件), 盖上盖玻片后,快速置于偏光显微镜下进行观察,当偏光显微镜用于颗粒成像时,起偏器应该慢慢地旋转直到视场完全变黑;然后,再逐渐调节焦面来找到金棒,拍照时采用400ms的曝光时间。
所述抗体修饰的金纳米棒溶液的制备方法如下:
1)合成金纳米颗粒种子:在血清瓶中,将48μL 0.1M冰的硼氢化钠注入含有0.1M CTAB和0.00025M的HAuCl4 4mL溶液中,应用前溶液需在28℃溶液中静置2h以上;
2)在20mL的0.1M CTAB溶液中,依次加入426μL 24.28mM的HAuCl4、0.5ml 4mM的AgNO3和105μL 0.1M的AA,待溶液从黄色转化为无色时,加入60μL种子溶液并振荡20-30s;然后在溶液中静置4h以上;最后将3ml新合成的金纳米棒溶液加入到20mL含有0.1M CTAB,80μL 24.28mM HAuCl4和185μL 0.1M AA溶液中,溶液振荡30s后静置2h,得到的产品在10000rpm下离心并去除上清液两次,新制备的金纳米棒用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
3)球状纳米颗粒按照以下方法合成:2mL 24.28mM HAuCl4加入到93mL去离子水中,在回流状态下将溶液加热至沸腾,然后加入5mL 1%的柠檬酸钠溶液,并继续加热30min,待溶液冷却至室温后得到40nm的金纳米颗粒,样品用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
本发明的有益效果如下:
1)偏光显微镜能够明显降低环境的背景。
2)偏光显微镜下光点的直径要比暗场显微镜下的要小。
3)虽然金纳米棒的乐强不同,但是信噪比得到明显的增加。
4)细胞环境下的金纳米棒被清晰地观察到。金纳米棒与偏光显微镜的联合应用在癌症检测和开发新的传感器方面具有十分重要意义。
附图说明
图1:金纳棒的紫外可见吸收光谱图。
图2:金纳米球的紫外可见吸收光谱图。
图3:金纳棒的透射电子显微镜图像。
图4:金纳米球的透射电子显微镜图像。
图5:金纳米棒和金纳米球在暗场显微镜下和偏光显微镜下的图像。
金纳米棒在暗场显微镜下(A)和偏光显微镜下(B)的的图像,蓝色圆圈中在暗场下呈红色的点在偏光显微镜看不到,是因为金纳米棒的方向与偏光器和检偏器是一致的。绿色的点可能是金纳米颗粒,它们没有光去极化功能,在偏光显微镜下是看不到的;金纳米球在暗场显微镜下(C)和偏光显微镜下(D)的散射图像,白色圆圈中黄色的点是金纳米颗粒的具集体他们可以改变光的偏振方向;图中E和F分别为图A和B方框中的点的放大图和它们的光强的表面图。
图6:用EGFR抗体修饰的金纳米棒选择性地对HeLa细胞进行高信噪比成像图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例
1、试剂
柠檬酸钠、氯金酸(99.99%,HAuCl4·3H2O)、十六烷基三甲基溴化铵(99%,CTAB)均购自上海国药公司;硼氢化钠(98%,NaBH4)、抗坏血酸(99.7%,AA)、硝酸银(99.8%,AgNO3)、巯基十一烷基三甲基溴化铵(99%,MUTAB)购买于Sigma-Aldrich公司。上述试剂在使用时使用超纯水进行配制。
所有玻璃器皿均用王水(体积比HCl:HNO3=3:1)进行浸泡清洗。
2、抗体修饰的金纳米棒的合成
1)合成金纳米颗粒种子:在血清瓶中,将48μL 0.1M冰的硼氢化钠注入含有0.1M CTAB和0.00025M HAuCl4 4mL溶液中,在使用前,溶液需要在28℃溶液中静置2h以上。
2)在20mL 0.1M CTAB溶液中,依次加入426μL 24.28mM HAuCl4,0.5ml 4mM AgNO3和105μL 0.1M AA;待溶液从黄色转化为无色时,加入60μL种子溶液并振荡20-30s;然后在溶液中静置4h以上;最后,将3ml新合成的金纳米棒溶液加入到20mL含有0.1M CTAB,80μL 24.28mM HAuCl4和185μL 0.1M AA溶液中;溶液振荡30s后静置2h;得到的产品在10000rpm下离心并去除上清液两次。新制备的金纳米棒用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
3)球状纳米颗粒按照以下方法合成:2mL 24.28mM HAuCl4加入到93mL去离子水中,在回流状态下将溶液加热至沸腾;然后加入5mL 1%的柠檬酸钠溶液,并继续加热30min;最后,待溶液冷却至室温即得到40nm的金纳米颗粒。样品用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
3、单个金纳米棒和纳米颗粒成像
成像实验在Olympus BX51显微镜上进行操作。显微镜需要装置100W的卤素钨灯,一个NA值为1.25-1.36的油浸式聚光镜、40倍的平场消色差聚光镜和型号为Olympus DP73的彩色CCD。为了进行单个金纳米棒和金纳米颗粒的成像,将制备得到的溶液稀释40倍,并将20uL溶液滴在载玻片上,然后盖上盖玻片后,快速置于暗场显微镜和偏光显微镜下进行观察。当偏光显微镜用于颗粒成像时,起偏器应该慢慢旋转直到视场完全变黑。然后,再逐渐调节焦面来找到金棒。拍照时采用400ms的曝光时间,最终得到的数据用Image J,Excel和Origin进行处理分析。
4、细胞培养和细胞环境下金纳米棒的成像
实验中用到的HeLa细胞购自美国典型菌种收藏所。将细胞置于放置了盖玻片的塑料培养皿中,注入高糖DMEM培养基进行培养,使用1%的青霉素-链霉素,10%的牛血清在37℃、5%CO2环境中进行培养。当细胞培养24h后,溶液采用新的培养基进行替换,并加入40ul金纳米棒溶液。再经过4h的培养后,将盖玻片从培养皿中取出并倒置于载玻片上进行观察。采用400ms的曝光时间采集图片。
5、金纳米棒和纳米球的表征
图1-4分别给出了金纳米棒和金纳米球的紫外可见光谱和透射电子显微镜图。金纳米棒通过三步生长法获得,最终的金纳米棒的长轴等离子体共振吸收峰调节至650nm,长径比在2.2左右,已有研究表明这个长径比的金纳米棒相对于其他的长径比金纳米棒具有更高的散射效率。三步法不仅很容易重复制作所需形状和尺寸的金纳米棒,而且提高了金纳米棒的单分散性,得到金纳米棒的两个紫外可见的峰位置分别在650nm和532nm。透过通射电子显微镜统计得到的金纳米棒的长度和直径分别为75.2±6.5nm和37.1±4.3nm,证明了金纳米棒具有较少的尺寸分布。柠檬酸包裹的金纳米球通过常规技术合成。最终得到的金纳米球溶液为红色,在533nm具有较窄的吸收峰。透射电子显微镜进一步证实了金纳米球的直径在44.1±3.7nm。
6、偏光显微镜选择性地对玻片上的纳米粒子成像
偏光显微镜是一项非常特殊的技术,可以观察光学各向异性特征的样品。在这项技术中,起照明作用的偏振光被检偏器滤掉后形成了黑暗的背景,同时各向异性的样品显得比较明亮。众所周知,对单个纳米粒子进行成像对研究纳米粒子的事件十分重要,可以提供物理学和生物学过程细节信息。直到现在,偏光显微镜还没有用于单个纳米粒子的监测,其困难在于纳米粒子一般在纳米尺度,不容易被偏光显微镜检测到。然而,由于金纳米棒优良的光学特性,我们通过仔细调节偏光显微镜的光学元件成功观测到了单个粒子。 如图5B,单个金纳米检在偏光显微镜下呈现明亮的红色,这与其长轴等离子体共振吸收峰是一致的。图中多个亮黄色的点出现可能是由于金纳米棒的聚集造成的。作为对比,同一区域的金纳米棒也使用暗场显微镜进行了成像(图5A)。在暗场显微镜下会有更多的亮点出现。它们当中的大多数是绿色的,这可能是由于球状纳米粒子的散射造成的,这是因为通过种子生长法制备得到的金纳米棒总是会伴随着一些颗粒的产生。
为了证明这一点,我们进一步研究了直径为44nm的金纳米球在偏光显微镜下和暗场显微镜下的散射,如图5C和D,结果显示:在暗场下呈现绿色的金纳米球在偏光显微镜下观察不到了,这是因为单个的金纳米球各向是均一性的,不会对光去极化。但是,如果金纳米球的二聚体、三聚体或者多聚体生成,这些团聚体具有这些功能。同时,它们当中极少数的点呈现红色。据报道单个金纳米棒可以看成一个方向偶极子,这些消失的红点是由于金纳米的方向很特殊,即金纳米棒的长轴与偏光器或者检偏器是一致的。因此,偏光显微镜在观察玻片上静止的金纳米棒时还有一定局限性的,但是对观察不同环境下动态的金纳米棒应该是很有用的。因此偏光显微镜对观察各向异性的金纳米棒仍然是一个很好的技术。
相比于暗场显微镜,偏光显微镜用于纳米颗粒成像时有很多新的突出特点。首先,我们可以非常直观地观察到,在偏光显微镜下金纳米棒的光点要比在暗场图像下小很多。事实上,在偏光显微镜下单个光点占到71±26相素,只在暗场显微下的光点的42%左右,如图5E和5F所示,主要原因是金棒的散射光和照射光束在偏光显微镜的检测器处会有一定的干涉,所以,偏光显微镜能够提供样品更高的空间分布图像;第二,单个金纳米棒的平均强度比暗视场显微镜下的强度要高,而且光的强度是变化的。强度的不同是不可无法避免的。当金纳米棒的与偏光器和检偏器的夹角为45度时检测到的光强是最大的。作为比较,当长轴方向垂直于检偏器时是检测不到光强的;最后, 而且最重要的是偏光显微镜可以显著地降低背值。如图所示,暗场下模糊的白色斑点在偏光显微镜下被清除了。因为溶液或者玻片上的物质不能够去光去极化。所以,我们通过下面的方向来计算金信噪比,SNR=(Is-Ib)/b,其中Is为金纳米棒的光强,Ib背景光强,b为背景噪音。结果显示:偏光显微镜下相比于暗场显微镜,信噪比增大了3.6倍。我们得出的结论是:当金纳米棒能够被偏光显微镜轻易的观测到时,这种技术在生物学领域将得到广泛的应用。
7、以金纳米棒为探针选择性检测癌细胞
以金纳米棒为探针,在其表面修饰具有选择性识别癌细胞的功能分子,实现了对癌细胞的检测。如图6所示,用EGFR抗体修饰的金纳米棒,可以选择性地对HeLa细胞进行高信噪比成像,而对于不表达EGFR的细胞,如HepG2细胞反而不能够被识别。
金纳米棒的很多特性都用来开发了各种成像技术,但其对光的去极化特性仍然没有的扫很好的应用,本研究中,我们采用偏光显微镜观察单个金纳米棒,偏光显微镜用于成像会有很明显的优势,我们发现偏光显微镜能够对各向异性的纳米材料进行选择性成像,相比较而言,传统的暗场显微镜没有这种功能。在偏光显微镜下,金纳米棒的散射光点具有较小的尺寸,能够显著降低成像的背景值,相应地图像的信噪比得到至少3倍以上的改善。更重要的是,即使在细胞中单个金纳米棒也能够被偏光显微镜以极小的背景值观测到,由于这种独特的光学性能,各向异性纳米材料和偏光显微镜在癌细胞成像和检测中有着巨大的应用潜力。
在本发明中,我们用偏光显微镜对单个金纳米棒进行了成像。研究结果表明:偏光显微镜只能够监测具有光去极化功能的各向异性的金纳米颗粒,而暗场场显微镜没有这种选择性,单个各向异性的金纳米棒能够被偏光显微镜选择性的观测到,但是球状的金纳米颗粒如果不形成团聚体是看不到的。偏光显微镜用于单个金纳米棒成像有几个特点:首先:偏光显微镜能够明显 降低环境的背景;第二:偏光显微镜下光点的直径要比暗场显微镜下的要小;第三:虽然金纳米棒的乐强不同,但是信噪比得到明显的增加;最后:细胞环境下的金纳米棒被清晰地观察到。金纳米棒与偏光显微镜的联合应用在癌症检测和开发新的传感器方面具有十分重要意义。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法,其特征在于:所述方法的具体步骤如下:
1)将细胞置于放置了玻片的塑料培养皿中,注入高糖DMEM培养基,使用1%的青霉素-链霉素,10%的牛血清在37℃、5%CO2环境中进行培养;
2)培养24h后,采用新的高糖DMEM培养基替换,并加入40ul抗体修饰的金纳米棒溶液,再培养4h;
3)将盖玻片从培养皿中取出并倒置于载玻片上进行观察,成像使用Olympus BX51显微镜,显微镜装置100W的卤素钨灯、一个NA值为1.25-1.36的油浸式聚光镜、40倍的平场消色差聚光镜和型号为Olympus DP73的彩色CCD,盖上盖玻片后,快速置于偏光显微镜下进行观察,当偏光显微镜用于颗粒成像时,起偏器应缓慢地旋转直至视场完全变黑,再逐渐调节焦面来找到金纳米棒,拍照时采用400ms的曝光时间。
2.如权利要求1所述的一种采用偏光显微镜观测纳米颗粒用于细胞成像的方法,其特征在于:所述2)部步骤中抗体修饰的金纳米棒溶液的制备方法如下:
1)合成金纳米颗粒种子:在血清瓶中,将48μL 0.1M冰的硼氢化钠注入含有0.1M CTAB和0.00025M的HAuCl44mL溶液中,应用前溶液需在28℃溶液中静置2h以上;
2)在20mL的0.1M CTAB溶液中,依次加入426μL 24.28mM的HAuCl4、0.5ml 4mM的AgNO3和105μL 0.1M的AA,待溶液从黄色转化为无色时,加入60μL种子溶液并振荡20-30s;然后在溶液中静置4h以上;最后,将3ml新合成的金纳米棒溶液加入到20ml含有0.1M CTAB,80μL 24.28mM HAuCl4和185μL 0.1M AA溶液中,溶液振荡30s后静置2h,得到的产品在10000rpm下离心并去除上清液两次,新制备的金纳米棒用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
3)球状纳米颗粒按照以下方法合成:2mL 24.28mM HAuCl4加入到93mL去离子水中,在回流状态下将溶液加热至沸腾,然后加入5mL 1%的柠檬酸钠溶液,并继续加热30min,待溶液冷却至室温,得到40nm的金纳米颗粒,样品用紫外可见和透射电子显微镜进行表征。
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