CN109596606A - 一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法 - Google Patents

一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，基于羟基氧化锰纳米线模拟酶催化和抗坏血酸对该酶的降解作用原理，包括以下步骤：可降解性纳米酶试纸片制备，检测卡制备，样品滴加操作，样品槽和对照槽中检测卡的颜色提取，校正样品槽中检测卡颜色评价值，颜色校正评价值与抗坏血酸拟合模型，含有抗坏血酸浓度的待测样品检测。本发明利用可降解性纳米酶构建了用于抗坏血酸测定的视觉检测卡，并可通过更换试纸片重复利用，实现抗坏血酸的快速测定。相对于现有技术，本发明对检测设备要求低，只需检测卡和智能手机即可完成检测过程。

Description

一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，特别涉及一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法。
背景技术
抗坏血酸(AA)，也被称为维生素C，存在于各种水果、蔬菜和动物饲料中，是维持人体正常生理功能最重要的维生素之一。抗坏血酸参与许多生物作用过程，如对人体内DNA和蛋白质的抗氧化、自由基的清除等起着关键作用。各种研究表明，抗坏血酸表达水平与许多疾病密切相关，如坏血病，肝病，动脉硬化，心血管疾病，癌症等。然而，作为必需的营养素，抗坏血酸不能通过人体自身的生理系统产生，它必须通过外源摄取得以补充以维持人体正常机能。因此，抗坏血酸经常作为抗氧化剂和营养补充剂添加到工业食品中。鉴于此，构建用于分析食品中抗坏血酸含量的即时检测方法或设备具有重要意义。
迄今为止，已经开发了许多分析技术和方法，例如色谱法(HPLC)，电化学法、荧光光谱法及比色检测法等。但是，大多数这些方法都存在障碍，例如设备昂贵，操作技术要求高，样品预处理复杂或检测灵敏度低等。
纳米酶，是一类具有类酶催化活性的纳米材料。作为一种新颖的天然酶模拟物，纳米酶具有优异的催化活性、稳定性、低成本和易制取等特点，从而被用于多种高性能比色检测方法中。虽然有部分方法利用纳米酶进行抗坏血酸比色检测，但它们绝大部分的检测原理是通过抗坏血酸还原纳米酶催化的产物实现检测目的，灵敏度和选择性较差；且都是溶液检测体系，仍摆脱不了不稳定、重现性差、不便携等缺陷，无法满足对抗坏血酸现场即时检测的需求。
发明内容
为了克服现有方法的上述缺陷和不足，本发明的主要目的在于提供一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸(AA)比色检测法。检测过程在试纸片及检测卡上完成，可实现对食品样品中抗坏血酸的高灵敏、稳定、快速且便携式检测。为达到上述技术效果，本发明采取的技术方案为：
本发明提供了一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸(AA)比色检测法。本方法首先将羟基氧化锰(MnOOH)纳米材料溶液均匀渗透在试纸片上，随后将其真空干燥6小时并嵌入检测卡基板的槽孔中，组装得到检测卡。然后，将抗坏血酸(AA)滴加到试纸上并孵育5分钟，使得MnOOH纳米线充分分解，最后滴加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)在室温孵育15分钟，产生随抗坏血酸浓度变化的颜色信号，结合建立的颜色评价值与抗坏血酸拟合模型，可实现对抗坏血酸的快速检测。
一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸(AA)比色检测法，包括以下步骤：
S1采用吸水纸制备圆形试纸片，并将其充分浸润在羟基氧化锰(MnOOH)纳米线水溶液中，然后取出试纸片，真空烘干后的试纸片置于常温密封容器内保存，制得可降解性纳米酶试纸片；
S2在基板上制备样品槽和1个空白对照槽，将S1制得的可降解性纳米酶试纸片嵌入到基板的样品槽和对照槽中，得到检测卡；
S3将不同浓度梯度的抗坏血酸标准液分别滴加到S2制得的检测卡的样品槽中，滴加完毕后停留使得MnOOH纳米线充分分解，然后将醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液滴加到样品槽和对照槽的检测卡上，在室温下孵育；
S4采集样品槽和空白对照槽的颜色，提取样品槽的红色通道值(R)、绿色通道值(G)和蓝色通道值(B)，空白对照槽的红色通道值(R0)、绿色通道值(G0)和蓝色通道值(B0)；
S5样品槽未校正的颜色评价值为2×R/(G+B)，空白对照槽的颜色评价值为2×R0/(G0+B0)，样品槽的校正评价值为y1＝(2×R/(G+B))-(2×R0/(G0+B0))；
S6以不同浓度抗坏血酸标准液浓度(μM)为x，其对应样品槽颜色的校正评价值为y1，进行线性拟合，得到抗坏血酸浓度与检测卡颜色校正评价值的线性回归方程y；
S7另取新的步骤S2制得的检测卡，将待测样品滴加在检测卡的任意一个样品槽上，滴加完毕后停留使得MnOOH纳米线充分分解，然后将醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液滴加到样品槽上，在室温下孵育，此步骤的操作跟S3相同；然后采集样品槽和空白对照槽的3种颜色通道的值，得到待测样品的颜色校正评价值y’，带入S6中的线性回归方程，则得到待测样品中抗坏血酸的浓度x’。
优选的，步骤S1所述羟基氧化锰(MnOOH)纳米线水溶液的浓度不小于10μg/mL，更优选为10μg/mL。
优选的，步骤S1所述圆形试纸片的直径为0.6cm。
优选的，步骤S1所述浸润的时间为10～20min，更有选的为15min；优选的，所述烘干的时间为3～9h，更优选的为6h。
优选的，步骤S2所述样品槽的个数不少于8；所述样品槽为直径不小于7mm的圆槽，更优选的直径为8mm，槽深为1.5mm；所述空白对照槽为直径不小于8mm的圆槽，更优选的直径为10mm，槽深为1.5mm；所述基板的长宽高为50*50*2.5mm。
优选的，步骤S2所述空白对照槽的圆心位于基板的中心，所述样品槽均匀分布于以基板中心为圆心的圆上。
优选的，步骤S3所述抗坏血酸标准液的浓度分别为1μM，5μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM和60μM。
优选的，步骤S3所述停留的时间为3～8min，更优选的为5min；所述孵育的时间为10～20min，更优选的为15min。
优选的，步骤S3所述醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为0.5～1mM，更优选的为1mM；所述醋酸盐缓冲液的pH为3.5～4.5，更优选的为4。
优选的，步骤S4中采集样片槽和空白对照槽的颜色采用的是Apple应用商店的Color assist应用程序。
优选的，步骤S1所述羟基氧化锰(MnOOH)纳米线由水热反应法制得，其具体制备方法参见文献：(Zhang L,Zhang X,Wang Z,et al.High aspect ratio γ-MnOOH nanowiresfor high performance rechargeable nonaqueous lithium–oxygen batteries[J].Chemical Communications,2012,48(61):7598-7600.)；所述吸水纸为纤维素滤纸。
优选的，步骤S2所述基板为树脂材质，作为试纸片的承载框架，具有机械强度高、通用性强等特点。
优选的，所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸(AA)比色检测法检测抗坏血酸的浓度0～60uM。
优选的，步骤S3所述抗坏血酸标准液在样品槽中的滴加量为0.1～0.5μL/mm2；所述醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液在样品槽和对照槽的检测卡的加入量分别为0.1～0.5μL/mm2和0.1～0.5μL/mm2。
优选的，步骤S3和S7所述室温为20～30℃。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明利用纳米酶构建了用于抗坏血酸测定的视觉检测卡，基于羟基氧化锰纳米线模拟酶催化和抗坏血酸对该酶的降解作用原理。
(2)相对于现有技术，本发明可通过更换试纸片重复利用，实现抗坏血酸的快速测定，本发明在检测灵敏度、测定时间、稳定性、便携性及使用成本方面均具有显著的优势，真正意义上实现了无需仪器的操作，十分适用于果汁饮料等液体食品的快速检测应用。
附图说明
图1为本发明的基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法的设计和组装步骤。
图2为照相机记录的实施例1的检测卡上的视觉检测效果图和手机APP提取的检测卡上颜色的评价值。
图3为实施例1步骤(6)的抗坏血酸浓度与检测卡颜色的评价值的关系及拟合线性，其中右下角的插图为原始数据图。
图4为实施例1稀释样品1和2的抗坏血酸在加入标准溶液前后的检测卡上的视觉检测效果图及对应的颜色评价值。
具体实施方式
为了使本发明上述特征和发明创造中优化条件更加清楚和容易理解，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例所涉及的羟基氧化锰(MnOOH)纳米线由水热反应法制得，其具体制备方法参见文献：(Zhang L,Zhang X,Wang Z,et al.High aspect ratio γ-MnOOH nanowiresfor high performance rechargeable nonaqueous lithium–oxygen batteries[J].Chemical Communications,2012,48(61):7598-7600.)。实施例所述室温为25℃。
实施例1
(1)采用纤维素滤纸制备直径为0.6cm的圆形试纸片，并将其充分浸润在浓度为10μg/mL的羟基氧化锰(MnOOH)纳米线水溶液中，然后取出试纸片，15分钟后取出试纸片，真空烘干6h后，置于常温密封容器内保存，制得可降解性纳米酶试纸片；
(2)在基板上制备8个样品槽(直径8mm，槽深1.5mm)和1个空白对照槽(直径10mm，槽深1.5mm)，将S1制得的可降解性纳米酶试纸片嵌入到基板的样品槽中，得到检测卡；
(3)分别配置浓度为1μM，5μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM和60μM的抗坏血酸溶液并分别滴加到S2制得的检测卡的样品槽中，滴加量为每个样品槽10μL，滴加完毕后停留5min使得MnOOH纳米线充分分解，然后将浓度为1mM的醋酸盐缓冲液(醋酸盐缓冲液的pH值为4.0)稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液滴加到样品槽和对照槽的检测卡上，滴加量为每个样品槽10μL，对照槽为15μL，然后在室温下孵育15min；
(4)用智能手机采集样品槽和对照槽的颜色，再利用手机中Color assist应用程序分别提取8个样品槽颜色的红色通道值(R)、绿色通道值(G)和蓝色通道值(B)，对照槽颜色的红色通道值(R0)、绿色通道值(G0)和蓝色通道值(B0)；
(5)样品槽未校正的颜色评价值为2×R/(G+B)，空白对照槽的颜色评价值为2×R0/(G0+B0)，样品槽的校正评价值为y1＝(2×R/(G+B))-(2×R0/(G0+B0))；得到8个样品槽的未校正的颜色评价值分别为0.66135，0.69173，0.74815，0.88608，0.928，0.97248，1.07547和1.07159，空白对照槽的颜色评价值为0.653846。进一步得到8个样品槽的校正评价值分别为0.0075，0.03788，0.0943，0.23223，0.27415，0.31863，0.42162和0.41774；
(6)将不同浓度抗坏血酸标准液浓度(μM)为x，其对应样品槽颜色的校正评价值为y，进行线性拟合，得到抗坏血酸浓度与检测卡校正颜色评价值的线性回归方程y＝0.0082x+0.0138(R2＝0.996)，线性区间为1-50μM；
(7)采用从广州市番禺区当地超市购买的苹果汁饮料，以标准加入法对所构建的检测卡进行实际分析性能验证。首先，将2个饮料样品(样品1和2)，分别以10000rpm/min的速度离心10min，取上清液并稀释1000-5000倍到一定浓度，得到稀释样品1和2。另取新的步骤(2)制得的检测卡，将稀释后的样品1和样品2分别滴加在检测卡的任意不同的样品槽中，滴加量为每个样品槽10μL，滴加完毕后停留5min使得MnOOH纳米线充分分解，然后将浓度为1mM的醋酸盐缓冲液(pH值为4.0)稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液滴加到样品槽和对照槽的检测卡上，滴加量为每个样品槽10μL，对照槽为15μL，然后在室温下孵育15min；用智能手机采集样品槽的颜色，再利用手机中Color assist应用程序分别提取2个样品槽颜色的红色通道值(R)、绿色通道值(G)和蓝色通道值(B)，对照槽颜色的红色通道值(R0)、绿色通道值(G0)和蓝色通道值(B0)；样品槽未校正的颜色评价值为2×R/(G+B)，空白对照槽的颜色评价值为2×R0/(G0+B0)，样品槽的校正评价值为y＝(2×R/(G+B))-(2×R0/(G0+B0))；得到2个样品槽的未校正的颜色评价值分别为0.6698和0.7019，空白对照槽的颜色评价值为0.6388。进一步得到2个样品槽的校正评价值y1和y2，再带入步骤(6)所述的线性回归方程y＝0.0082x+0.0138(R2＝0.996)中，计算的到稀释样品1和样品2中原有抗坏血酸浓度分别为2.1μM和6.0μM。进一步，另取稀释样品1和2各99μL，分别向稀释样品1和2中添加1μL浓度为1mM的抗坏血酸标准溶液，得到加标后的稀释样品，取样后按照步骤(3)滴加样品到检测卡中未使用的样品槽中，然后按照步骤(4)，得到2个样品的颜色评价值0.7539和0.786，校正后，代入所得线性回归方程中，计算得加标后样品的抗坏血酸的浓度分别为12.3μM和16.3μM，则测得的增加值分别为(12.3μM*(99+1)μL-2.1μM*99μL)/(99+1)μL＝10.22μM，(16.3μM*(99+1)μL-6.0μM*99μL)/(99+1)μL＝10.36μM，与人为添加量10μM符合程度高。本方法可在短时间(15min)完成检测，且对检测设备要求低，只需检测卡和智能手机即可完成检测过程。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，包括以下步骤：
S1采用吸水纸制备圆形试纸片，并将其充分浸润在MnOOH纳米线水溶液中，然后取出试纸片，真空烘干后的试纸片置于常温密封容器内保存，制得可降解性纳米酶试纸片；
S2在基板上制备样品槽和1个空白对照槽，将S1制得的可降解性纳米酶试纸片嵌入到基板的样品槽和对照槽中，得到检测卡；
S3将不同浓度梯度的抗坏血酸标准液分别滴加到S2制得的检测卡的样品槽中，滴加完毕后停留使得MnOOH纳米线充分分解，然后将醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液滴加到样品槽和对照槽的检测卡上，在室温下孵育；
S4采集样品槽和空白对照槽的颜色，提取样品槽的红色通道值R、绿色通道值G和蓝色通道值B，空白对照槽的红色通道值R0、绿色通道值G0和蓝色通道值B0；
S5样品槽未校正的颜色评价值为2×R/(G+B)，空白对照槽的颜色评价值为2×R0/(G0+B0)，样品槽的校正评价值为y1＝(2×R/(G+B))-(2×R0/(G0+B0))；
S6以不同浓度抗坏血酸标准液浓度μM为x，其对应样品槽颜色的校正评价值为y1，进行线性拟合，得到抗坏血酸浓度与检测卡颜色校正评价值的线性回归方程y；
S7另取新的步骤S2制得的检测卡，将待测样品滴加在检测卡的任意一个样品槽上，滴加完毕后停留使得MnOOH纳米线充分分解，然后将醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶液滴加到样品槽上，在室温下孵育，此步骤的操作跟S3相同；然后采集样品槽和空白对照槽的3种颜色通道的值，得到待测样品的颜色校正评价值y’，带入S6中的线性回归方程，则得到待测样品中抗坏血酸的浓度x’。
2.根据权利要求1所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S1所述MnOOH纳米线水溶液的浓度不小于10μg/mL。
3.根据权利要求2所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S1所述圆形试纸片的直径为0.6cm；步骤S1所述浸润的时间为10～20min；所述烘干的时间为3～9h。
4.根据权利要求1或2所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S2所述样品槽的个数不少于8；所述样品槽为直径不小于7mm的圆槽；所述空白对照槽为直径不小于8mm的圆槽；所述基板的长宽高为50*50*2.5mm，所述基板为树脂材质；所述空白对照槽的圆心位于基板的中心，所述样品槽均匀分布于以基板中心为圆心的圆上。
5.根据权利要求1或2所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S3所述抗坏血酸标准液的浓度分别为1μM，5μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM和60μM。
6.根据权利要求1所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S3所述停留的时间为3～8min；所述孵育的时间为10～20min；步骤S3所述醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的浓度为0.5～1mM；所述醋酸盐缓冲液的pH为3.5～4.5。
7.根据权利要求1或2所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S3所述抗坏血酸标准液在样品槽中的滴加量为0.1～0.5μL/mm2；所述醋酸盐缓冲液稀释的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液在样品槽和对照槽的检测卡的加入量分别为0.1～0.5μL/mm2和0.1～0.5μL/mm2。
8.根据权利要求1或2所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S4中采集样片槽和空白对照槽的颜色采用的是Apple应用商店的Color assist应用程序。
9.根据权利要求1或2所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，步骤S1所述MnOOH纳米线由水热反应法制得；所述吸水纸为纤维素滤纸；步骤S3和S7所述室温为20～30℃。
10.根据权利要求1所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法，其特征在于，所述基于可降解性纳米酶的抗坏血酸比色检测法检测抗坏血酸的浓度范围为0～60uM。
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