CN103674856A - 基于扫描及色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法 - Google Patents

Abstract

一种基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述方法是用于有机磷农残微通道的制备；用于加入所述有机磷农残微通道中的农残快检试剂；用于扫描获取检测有机磷农残微通道的数字图片；用于有机磷农残检测微通道数字图片的色度分析。本发明基于扫描色度分析，将微通道用于有机磷农残的快速检测，具有多通量检测、重复使用、成本低廉，并具有较高的透明性，大大提高了检测有机磷的精度。

Description

基于扫描及色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法

技术领域

本发明涉及一种果蔬有机磷农残的快速检测方法，具体地说是一种将果蔬中的有机磷农残检测液加入以聚碳酸酯（PC）和聚二甲基硅氧烷（PDMS）为材料的多通量微通道中，通过扫描获取农残检测数字图片，最后分析数字图片的色度值来实现有机磷农残检测的分析方法。

背景技术

进入21世纪以来，食品安全问题引起了人们的高度重视，特别是果蔬中的农残直接危害着人们的身体健康。因此联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织（WHO）对果蔬中农药残留检测提出了更高的要求。传统的检测方法多以大型仪器为主，如气相色谱法，高效液相色谱法，毛细管电泳法等，此类检测方法虽具有较为精确的检测结果，但其检测成本高、耗时久、需专业人员操作，它还受限于一些大型检测机构，无法普及到普通老百姓家庭当中。因此开发农残快速检测方法是保障人类吃到绿色、新鲜、安全果蔬的必要条件。

有机磷农药因为其具有高效的杀虫作用而在农业生产当中扮演着重要的角色，然而有机磷农药在提高农作物产量的同时，在其表面也残留下不可低估的大量农药，当农残通过食物进入人体内时，会对人体内的胆碱酯酶产生抑制作用，导致乙酰胆碱的大量积累，从而影响神经传导，最终导致人体中枢神经中毒。

现有有机磷农残快速检测方法主要有以酶联免疫法和酶抑制法为基础的生物—光学传感器。然而由于有机磷农药属于小分子物质，通过刺激机体制备相应抗原决定簇的特异性抗体无法实现，通常需要与大分子载体偶联并经过一系列步骤才可得到特异性抗体，制备过程相对繁琐。1951年Giang和Hall(P. A. Giang and S. A. Hall; Enzymatic determination of organic phosphorus insecticides; Anal. Chem., 23 (1951), 1830-1834)提出根据有机磷农药对胆碱酯酶的活性的抑制作用并测定检测液中改变了的pH值来检测有机磷农残，此后为酶抑制法检测有机磷农残开辟了一个新的领域。后人不断利用这一抑制原理结合检测液中的中间产物的电流信号、离子的氧化还原特性或加入显色剂后的颜色变化制备出各种农残检测传感器。1961年由Ellman等人(G.L. Ellman, K.D. Courtney, V. Andres, JR. and R.M. Featherstone; A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity; biochem. Pharmacol., 7 (1961), 88-95)首次提出基于比色分析检测乙酰胆碱酯酶活性。具体来说，底物碘代硫代乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶的催化下发生水解反应，产生乙酸和硫代胆碱，硫代胆碱再与显色剂DTNB（二硫代二硝基苯甲酸）发生显色反应，产生黄色溶液。根据这一显色原理，可以结合有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用来检测有机磷农药。2001年我国提出《NY/T 448-2001蔬菜上有机磷和氨基甲酸醋类农药残毒快速检测方法》农业行业标准。经过修订于2003年颁布了国家标准：《GB/T 5009. 199-2003蔬菜中机磷和氨基甲酸醋类农药残留量的快速检测》。基于此，我国也相继出现了一些农残快检专利和产品。总体可以分为两类：农残快速检测仪和速测卡。对于农残快速检测仪主要利用内部分光光度计测定检测液反应3分钟前后吸光度值的变化，由此来计算抑制率判定农残是否超标。速测卡主要通过肉眼观察检测颜色来判定。如卢新提出对食物残留农药的检测卡片（国家专利号为：CN 2611892Y），该检测卡片的特征在于它的酶片和显色片可以分别单独，也可以在两者不接触的情况下相连，检测结果以酶片是否变为兰色以及兰色的深浅来断定农残是否超标。但由于人眼个体之间对颜色的识别存在差异，因此基于速测卡检测农残准确度不高。

以上速测方法只能定性检测出农残是否超标，存在较多假阳性结果，而且农残快速检测仪相对我们下面提出的农残快检传感器价格昂贵。针对这些缺陷，我们提出了基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法。

基于色度分析检测近年来出现了不少研究团队，如：Sarun等人（Sarun Sumriddetchkajorn, Kosom Chaitavon and Yuttana Intaravanne；Mobile device-based self-referencing colorimeter for monitoring chlorine concentration in water；Sensors and Actuators B, 182 (2013), 592-597）通过智能手机成像并分析RGB（红、绿、蓝）比值实现对自来水中氯离子的测定。Lima等人(Marcelo B. Lima, Stéfani Iury E. Andrade, Inakã S. Barreto, Luciano F. Almeida and Mário César U. Araújo; A digital image-based micro-flow-batch analyzer; Microchem. J., 106 (2013), 238-243)自制微流体通道，利用装有CCD（电荷耦合元件）器件的网络摄像头获取数字图片，通过分析RGB值实现了对绿茶中丹宁酸的检测。Cantrell等人(K. Cantrell, M.M. Erenas, I. de Orbe-Payá, L. F. Capitán-Vallvey; Use of the Hue Parameter of the Hue, Saturation, Value Color Space As a Quantitative Analytical Parameter for Bitonal Optical Sensors; Anal. Chem. 82 (2010) , 531-542) 在PVC（聚氯乙烯）上制备光学传感器薄膜，分别利用相机和扫描仪成像，测量分析物的颜色变化与HSV（色调、色饱和度、亮度）中H的关系。Wen等人(J. Wen, X. Shi, Y. He, J. Zhou and Y. Li; Novel plastic biochips for colorimetric detection of biomolecules; Anal. Bioanal. Chem. 404 (2012), 1935-1944)在透明PC上制备生物芯片，通过扫描仪成像，分析灰度值来实现对人体的IgG（免疫球蛋白） 和目标 DNA的检测。Abe等人(K. Abe, K. Suzuki and D. Citterio; Inkjet-Printed Microfluidic Multianalyte Chemical Sensing Paper; Anal. Chem., 80(2008), 6928-6934)利用喷墨打印机在纸上制备生物传感器，通过扫描仪成像，分析色度值L^＊a^＊b^＊实现了对人体尿液中蛋白质、葡萄糖、pH值的检测。全吉平等人发表专利（国家专利号： CN 102759511 A）“一种对纸板吸墨检测结果进行定量化的方法”利用扫描仪成像，结合灰度直方图，定量分析了纸板吸墨的均匀性。陈鲤江（陈鲤江，刘铁根，王磊，王双；用平板扫描仪及图像处理方法检测大米粒型； 红外与激光工程，(35) 2006，402-407）等人将平板扫描仪结合彩色图像RGB值还应用到了大米粒型的检测中。北京农林科学院陆安详等人发表专利（国家专利号： CN 102565044 A）“基于图像处理的农药残留速测卡检测方法”，通过相机获取农残速测卡图片，利用分析速测卡中显色区域的R值并计算出相应抑制率来检测有机磷农残。综上所述基于色度分析的快检方法：用数码相机、手机、CCD摄像头或者扫描仪等来获取检测结果的数字图片，进而分析其色度值，如：RGB、Lab、HSV等。但在利用相机、手机或者网络摄像头获取数字图片的过程中容易受到外界光源的干扰使得获取的数字图片存在色差，进而对检测结果产生较大的影响。利用扫描仪时，虽然扫描图片不受外界影响，但由于扫描仪特殊的结构造型，它只适合扫描一定厚度的物体，通常限制厚度在几个毫米内。而现有研究团队通常用扫描仪来扫描纸片上的检测结果。但反应在纸片上的检测结果需要用一定技术手段在纸片上制造微通道，而且显色后的结果通常颜色也不太均匀。基于此本发明提出通过自制微通道，利用扫描仪扫描农残检测液，并结合色度值CMYK（青、洋红、黄、黑）中的Y值分析农残浓度。

发明内容

本发明要解决的具体技术问题是现有农残快速检测方法只能定性检测，存在较多的假阳性结果；利用相机、手机等获取检测图片容易受到外部光源的干扰，且利用扫描仪获取检测图片通常只限定于相对厚度较薄的检测样品。本发明的目的是提供一种适合扫描的微通道，并利用分析色度值进而实现对有机磷农残的快速、定量检测方法，即一种基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的措施是一种基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述方法是：以PC为基底，在其上面分别覆盖按照一定尺寸设计好的PDMS微通道薄膜和PDMS表面覆盖层，形成厚度为几毫米后的透明、密封、多通量微通道。利用扫描仪幻灯片片匣悬空固定微通道，将有机磷农残快检试剂加入微通道中，采用透射式扫描模式和RGB色彩模式扫描微通道获取数字图片，并将图片以TIFF格式保存。最后利用Photoshop软件分析扫描后数字图片的色度值Y，Y值的变化量定量检测农残的浓度。其所述方法按以下步骤进行：

用于有机磷农残微通道的制备；

用于加入所述有机磷农残微通道中的农残快检试剂；

用于扫描获取检测有机磷农残微通道的数字图片；

用于有机磷农残检测微通道数字图片的色度分析。

基于上述技术方案，进一步的，附加技术方案如下：

所述用于有机磷农残微通道的制备是透明基底层、透明通道层与透明覆盖层通过物理吸附结合为一体构成微通道。

所述透明基底层是透明塑料薄膜、透明薄硅片和透明薄石英片中的一种。

所述透明通道层是由PDMS聚合物制成的厚度为2～4mm的薄片，并在薄片上开设有至少一纵向通透的农残快检试剂微通道孔。

所述透明覆盖层（3）是PDMS薄膜开设有与微通道孔（2-1）相应位置的并小于微通道孔的快检试剂加样孔（3-1）。

所述农残快检试剂的组成及其含量按体积比为碘代硫代乙酰胆碱﹕二硫代二硝基苯甲酸﹕乙酰胆碱酯酶﹕果蔬农残待检液 = 1﹕1﹕1﹕25，进行混合获得。

所述果蔬农残待检液是苹果、白菜或芹菜中的一种的农残提取液。

所述扫描方法是采用平板式扫描仪，利用扫描仪幻灯片片匣将微通道悬空固定于扫描仪中，扫描颜色模式为RGB模式，进行透射式扫描。

所述有机磷农残检测微通道数字图片的格式是TIFF格式，并利用photoshop软件获取色度值Y。

实施本发明上述一种基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，与现有农残快速检测技术相比，其直接带来的和必然产生的优点与积极效果在于：（1）农残检测微通道具有多通量检测、重复使用、成本低廉等优点；（2）微通道采用透明基底层和透明PDMS材料制备而成，具有较高的透明性，可大大提高检测结果精度；（3）采用扫描仪和微通道来获取检测图片可避免外部光照对图片成像时的干扰，使得分析结果更为准确；（4）扫描模式采用透射式扫描相比反射式扫描减少了光程差，避免了白光能量的损失，从而获取更为清晰的图片,使得检测结果更为准确；（5）图片保存格式为TIFF格式，保存了扫描图片时的全部颜色信息,对于色度的分析和农残检测结果更为准确；（6）采用Photoshop软件直接读取检测图片的颜色信息，方便快捷；（7）图像颜色分析Y值可实现对有机磷农残检测的定量输出；（8）整个检测过程中所用仪器为普通办公扫描设备，未经过任何改造，更容易普及到日常生活当中。

附图说明

图1是本发明有机磷农残检测微通道透明基底层。

图2是本发明有机磷农残检测微通道透明通道层。

图3是本发明有机磷农残检测微通道透明覆盖层。

图4 是本发明加入有机磷农残检测试剂。

图5 是本发明有机磷农残检测数字图片的获取途径。

图6 是本发明有机磷农残检测数字图片的色度分析。

图7 是本发明不同浓度下马拉硫磷农残检测数字图片。

图8 是本发明不同浓度下马拉硫磷农残检测数字图片的色度分析。

图中：1：透明基底层； 2：透明通道层；2-1：透明微通道孔；3：透明覆盖层；3-1：快检试剂加样孔；3-2：快检试剂通气孔；4：移液枪；5：平板扫描仪；6：透明微通道检测片；7：计算机。

具体实施方式

具体实施本发明一种基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，以马拉硫磷农残检测为例对本发明的具体实施方式做出进一步的说明。

1、模板设计： 利用CAXA软件分别对透明基底层、透明通道层、透明覆盖层尺寸设计。本发明所采用扫描仪为ScanMaker i800 Plus平板扫描仪，因此模板设计尺寸不超过所用扫描仪扫描范围。设计其中一种模板如下：整个农残检测微通道尺寸为25mm×75mm，其中通道层厚度为3mm，内有8个4mm×13mm的条形通道，同时在每个条形通道的顶端处设有正三角形加样槽，两者同时构成透明微通道孔。透明覆盖层厚度为1mm，在与透明通道层加样槽相同的位置处设同样大小尺寸的快检试剂加样孔，同时在距条形透明通道层低端0.95mm处，透明覆盖层设有0.6mm×4mm矩形通气孔；

2、有机磷农残微通道的制备：选用道康宁公司产品Sylgard 184硅橡胶来制备聚二甲基硅氧烷PDMS薄膜，具体步骤是：（1）选用两个内径均为117mm×117mm的方形洁净培养皿作为陈放聚二甲基硅氧烷（PDMS）液体混合物的载体。分别取制备PDMS所用材料基质12.94g与固化剂1.43g放入上述其中一个培养皿中混合均匀，利用电吹风去除混合液中的气泡，再放入80℃的烤箱中烘烤一小时获得微通道透明覆盖层。再次分别取制备PDMS所用材料基质38.82g与固化剂4.31g放入上述其中一个培养皿中混合均匀，利用电吹风去除混合液中的气泡，再放入80℃的烤箱中烘烤一小时获得微通道透明通道层。（2）按上述步骤1所述模板以1:1比例打印在A4纸上，并用手术刀分别对透明通道层中的微通道孔，以及透明覆盖层中的快检试剂加样孔和矩形通气孔进行通透剪切，同时分别对透明通道层和透明覆盖层剪切。（3）用透明胶带将上述纸质模板分别固定于制作相应透明通道层和透明覆盖层的PDMS表面，用手术刀分别对PDMS进行雕刻，后分别用洗洁精、95%酒精和超纯水对雕刻好的PDMS清洗，即得透明通道层和透明覆盖层。（4）按上述步骤1所述模板基底尺寸剪切透明PC，并与透明通道层和覆盖层通过物理吸附结合制备微通道；

3、农残检测标准曲线制作：取5.95g无水磷酸氢二钾和1.6g磷酸二氢钾按溶于500mL超纯水中作为缓冲液。取80mg二硫代二硝基苯甲酸和7.8mg碳酸氢钠溶于10mL缓冲液中作为显色剂。取25mg碘代硫代乙酰胆碱，溶于3mL超纯水中作为底物。用缓冲液稀释乙酰胆碱酯酶成5unit／mL作为抑制有机磷农药的酶液。以100μg/mL丙酮中的马拉硫磷农药标准品作为母液溶于缓冲液中，配制成浓度分别为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4μg/mL的马拉硫磷农药，将不同浓度马拉硫磷农药250μL置于离心管内，再分别取10μL显色液和10μL酶液置于每个离心管内，37℃下，温育30min。取10μL底物分别加入每个离心管内，反应10min后，从离心管内取177μL农残快检试剂加入上述步骤2所述微通道内；

4、扫描获取微通道检测数字图片：利用扫描仪幻灯片片匣将检测微通道悬空固定于扫描仪内，扫描仪扫描模式设为透射式扫描，采用分辨率为3200dpi，颜色模式选取RGB色彩模式，图片保存格式为TIFF格式；

5、色度分析制备标准曲线：Photoshop软件打开上述步骤4中保存的图片，利用颜色读取工具分别读取不同浓度下检测区域的色度值Y。结果表明：Y值的变化量随马拉硫磷检测液浓度的增大而减小。以此制作标准曲线图，如图8所示；

6、果蔬中的有机磷农残检测：以果蔬中的苹果、梨、桃、葡萄、白菜、西葫芦、芹菜中的苹果为例进行马拉硫磷农残检测。以100μg/mL丙酮中的马拉硫磷农药标准品作为母液溶于缓冲液中，配制成浓度为10μg/mL的马拉硫磷溶液。用超纯水将从当地超市购买回来的苹果结合果蔬清洗剂和超纯水清洗3次，待苹果表皮水珠自然风干后，将10μg/mL的马拉硫磷农药用喷雾瓶喷洒在苹果表面上，等待3个小时以后，苹果表皮农残自然风干。用削皮刀削2g苹果表皮并制成碎末溶于10mL的缓冲液中，快速摇匀器摇3min，提取1.5mL上述溶液，于离心机内离心3min，取250μL上层清液作为果蔬农残待检液加入离心管内。再分别取10μL显色液和10μL酶液置于离心管内，37℃下，温育30min。取10μL底物分别加入离心管内，反应10min后，从离心管内取177μL农残快检试剂加入上述步骤2所述微通道中的任一微通道内等待扫描；

7、重复上述步骤4和5，获取苹果快检试剂扫描后的色度值Y，在标准曲线中找出苹果中的马拉硫磷农残的量。

Claims (9)

1.一种基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述方法是按下列步骤进行：

用于有机磷农残微通道的制备；

用于加入所述有机磷农残微通道中的农残快检试剂；

用于扫描获取检测有机磷农残微通道的数字图片；

用于有机磷农残检测微通道数字图片的色度分析。

2.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述用于有机磷农残微通道的制备是透明基底层（1）、透明通道层（2）与透明覆盖层（3）通过物理吸附结合为一体构成微通道。

3.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述透明基底层（1）是透明塑料薄膜、透明薄硅片和透明薄石英片中的一种。

4.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述透明通道层（2）是由PDMS聚合物制成的厚度为2～4mm的薄片，并在薄片上开设有至少一纵向通透的农残快检试剂微通道孔（2-1）。

5.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述透明覆盖层（3）是PDMS聚合物薄膜开设有与微通道孔（2-1）相应位置的并小于微通道孔的快检试剂加样孔（3-1）。

6.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述农残快检试剂的组成及其含量按体积比为碘代硫代乙酰胆碱﹕二硫代二硝基苯甲酸﹕乙酰胆碱酯酶﹕果蔬农残待检液 = 1﹕1﹕1﹕25，进行混合获得。

7.如权利要求6所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述果蔬农残待检液是苹果、白菜或芹菜中的一种的农残提取液。

8.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述扫描方法是采用平板式扫描仪，利用扫描仪幻灯片片匣将微通道悬空固定于扫描仪中，扫描颜色模式为RGB模式，进行透射式扫描。

9.如权利要求1所述的基于扫描色度分析的微通道用于有机磷农残速测方法，其所述有机磷农残检测微通道数字图片的格式是TIFF格式，并利用photoshop软件获取色度值Y。

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