CN103421880A - 一种有机磷农药检测方法 - Google Patents

Abstract

发明的目的是针对现有酶抑制型生物传感器的不足之处，提供了一种检测微痕量有机磷农药的可视化识别方法。采用本发明对有机磷农药进行检测，一方面，由于未对AChE进行固定化处理，采用AChE酶液，使AChE保持了最大酶活力，提高了检测灵敏度。另一方面，所用提取液提高了对待测样品中有机磷农药的提取回收率，使检测灵敏度提高至0.01ng/L。本发明方法可广泛应用于粮食、蔬菜、水果等农产品及环境中的微痕量有机磷农药的残留检测中，也可用于农产品和环境安全评价、监控有机磷农药的污染情况等。

Description

一种有机磷农药检测方法

技术领域

本发明属于有机磷类物质检测技术领域，具体涉及一种有机磷农药检测方法，即一种可视化快速检测有机磷类物质的方法。

背景技术

有机磷农药因其具有防治对象多、应用范围广、价格低等特点，已成为目前世界农药三大支柱之一，在农业稳产、高产中发挥着巨大作用。但是，由于大多数有机磷农药都属于高毒化合物，不仅污染土壤、水源等自然资源，且在动、植物体内产生蓄积，通过食物链，成为危害人们生命安全的隐患。有机磷农药残留所带来的食品安全问题是目前公共健康面临的最主要威胁之一，中毒事件频频发生，2010年4月发生在山东青岛的“问题韭菜”事件就属此类。为预防和控制有机磷农药残留对人体健康的影响，就需要加强对食品中有机磷农药残留检测的力度。因此，如何实现微痕量有机磷农药残留快速、高灵敏性、选择性的检测成为人们迫切需要解决的问题，对食品安全评价、增强我国农产品国际竞争力等方面具有重要意义。

现有检测有机磷农药的方法主要有气相色谱、质谱、气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、高效液相色谱、拉曼光谱等。这些方法虽然具备定量准确、灵敏度高等优点，但多为大型仪器，检测周期长，不适合现场检测和大批量样品的筛选，难于满足预防和控制突发事件。

酶生物传感器因其具有响应速度快、灵敏度高、可集成度高等优点而备受关注。自1962年Guilbaut研究组成功研制出第一个基于胆碱酯酶抑制反应的生物传感器以来，胆碱酯酶（特别是乙酰胆碱酯酶，AChE）抑制型生物传感器成为有机磷农药检测领域中最具活力的手段之一。依据信号转换方式的不同，AChE抑制型生物传感器主要有电化学型、光纤型、压电型、表面等离子共振型等不同类型。AChE抑制型生物传感器具有很高的灵敏性（ng/L级），为有机磷农药检测提供了一条快速、简便的途径。然而，这类检测方法也同时存在以下不足：除有机磷农药外，氨基甲酸酯类农药对AChE活性也有抑制作用，这就从原理上决定了此类传感器缺乏选择性，不能实现对单一或者某一类分析物的测定。

为此，近年来，人们应用传感器阵列，并结合模式识别计算方法作为数据处理方式来实现有机磷农药选择性检测。如Manuel del Valle研究组将三个基于三种不同来源的AChE的安培型传感器组合成了抑制型生物传感器阵列，并通过人工神经网络分析来自于传感器阵列的组合响应，研究了对敌敌畏和克百威混合物的分析检测。结果表明，这种方法改善了传感器的选择性，可以识别样品中某一抑制剂的存在。然而，无论是单一型还是阵列型酶抑制生物传感器，其测量结果都无法直观的显示出来过程，需要对测得的电信号、光信号或压电信号等进行复杂的信号转换后，才能得到肉眼可见的测量信号，限制了酶抑制生物传感器在快速检测方面的应用。不仅如此，阵列型酶抑制生物传感器所得的检测数据需经过复杂的模式识别计算方法进行处理才能最终实现选择性检测，增加了检测的难度，限制了酶抑制生物传感器的应用推广。

发明内容

本发明的目的是针对现有酶抑制型生物传感器的不足之处，提供了一种检测微痕量有机磷农药的可视化识别方法。具有能实现对微痕量有机磷农药的快速、高灵敏性、选择性检测，且检测成本低，操作简单等优点。

本发明的一种有机磷农药检测方法，该方法包括如下的步骤：

1）建立空白溶液标准图谱：

将AChE酶液、有机溶剂丙酮和氯化硫代乙酰胆碱溶液搅拌混合均匀；将用受pH影响而发生颜色变化的物质作为传感材料的阵列膜片放入浸泡反应，反应后将膜片干燥，进行扫描，获得的彩色阵列图像为空白溶液标准图谱；

其中受pH影响而发生颜色变化的物质为pH指示剂或水溶性卟啉衍生物。

所述pH指示剂为溴甲酚绿、溴甲酚紫、刚果红、氯酚红、溴酚蓝、溴酚红、间胺黄、甲基红、溴百里酚蓝、甲酚红、亮黄、硝嗪黄、百里酚蓝、靛蓝胭脂红中的任一种或几种。

水溶性卟啉衍生物为单磺酸基四苯基卟啉或四磺酸基四苯基卟啉。

其中AChE酶液:有机溶剂丙酮:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位（ml）:0.066～0.146摩尔单位（m mol/L）。

2）建立有机磷农药标准图谱：

将AChE酶液和有机磷农药搅拌混合进行酶抑制反应，然后在反应溶液中加入氯化硫代乙酰胆碱；再将用受pH影响而发生颜色变化的物质作为传感材料的阵列膜片放入浸泡反应，反应后干燥膜片，进行扫描，获得的彩色阵列图像为有机磷农药标准图谱。

其中AChE酶液:有机磷农药:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）: 0.017～0.018体积单位（ml）:0.066～0.146摩尔单位（m mol/L）。

3）待测样品的有机磷农药残留检测：

用提取液对待测样品进行冲洗，收集冲洗液作为待测样品液；

将AChE酶液和待测样品液混合进行酶抑制反应，然后在反应溶液中加入氯化硫代乙酰胆碱；再将用受pH影响而发生颜色变化的物质作为传感材料的阵列膜片放入浸泡反应，反应后干燥膜片，进行扫描，获得的彩色阵列图像为待测样品液图谱。

其中，为了提高检测的灵敏度，对提取液进行了长期的研究，最后确定提取液是丙酮:乙醇:水按体积比为3:1:1混合而成，这样可有效的提取样品中的农药，提高检测的灵敏度。

4）结果分析：

定性识别：将待测样品液图谱分别与空白溶液标准图谱及有机磷农药标准图谱进行对比分析，肉眼观察，当待测样品液图谱与空白溶液标准图谱相同时，则待测样品中不含有机磷农药；待测样品液图谱与有机磷农药标准图谱相同时，则待测样品中含有该已知有机磷农药，从而实现待测样品中有机磷农药的有无识别以及有机磷农药种类的识别；

定量分析：用Photoshop图像处理软件分别提取空白溶液标准图谱、有机磷农药标准图谱及待测样品液图谱中每个阵列点的红（R）、绿（G）、蓝（B）三色值，再用SPSS统计分析软件对提取的RGB数据进行聚类分析，得到树状图，根据待测样品液图谱RGB数据在树状图上的分类情况不仅可以得到待测样品液中是否含有有机磷农药、所含有机磷农药的种类，也可得到待测样品液中含有的有机磷农药的浓度，从而实现待测样品中有机磷农药的定量分析。

本发明的方法，具有如下的效果：

1）检测结果形象、直观，易于观测。采用本发明对有机磷农药进行检测，测量结果以可视化图谱的方式显示，与常规电信号、光信号或压电信号相比，更加形象而直观，容易观察。

2）灵敏度高。采用本发明对有机磷农药进行检测，一方面，由于未对AChE进行固定化处理，采用AChE酶液，使AChE保持了最大酶活力，提高了检测灵敏度。另一方面，所用提取液提高了对待测样品中有机磷农药的提取回收率，使检测灵敏度提高至0.01ng/L。

3）选择性好。采用本发明对有机磷农药进行检测，以可视化传感阵列的方式，从多个不同角度对检测信号进行捕捉，信息更加全面，获得有机磷农药识别的“指纹”图谱，提高了检测选择性。

4）操作简单，便于实现现场快速检测。采用本发明对有机磷农药进行检测，可以直接利用普通的扫描仪进行检测，操作简便，便于进行现场快速检测。

本发明方法可广泛应用于粮食、蔬菜、水果等农产品及环境中的微痕量有机磷农药的残留检测中，也可用于农产品和环境安全评价、监控有机磷农药的污染情况等。

附图说明

图1：本发明方法检测结果的聚类分析树状图。

其中，空白-1、空白-2和空白-3分别表示空白溶液标准图谱的三个平行样；DDW-1、DDW-2、DDW-3、DDW-4和DDW-5分别表示浓度依次为0.01、0.1、1、5、10ng/L敌敌畏农药标图谱，而其中每个浓度分别做了三个平行样，依次表示为DDW-1-1、DDW-1-2、DDW-1-3等；检测-1、检测-2和检测-3分别表示检测样品标准图谱的三个平行样。

具体实施方式

本发明的方法，其总体步骤如下：

（1）染料溶液的配制

以pH指示剂和水溶性卟啉衍生物等染料物质为传感材料，以无水乙醇为溶剂，按染料的质量:无水乙醇的体积比为1:0.1～0.6的比例，在染料加入无水乙醇，搅拌充分溶解后，分别制备出质量浓度为1.7～10.2g/L的染料溶液，在3～4℃下避光保存。

（2）氢氧化钠处理液的配制

在氢氧化钠中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为0.0066～0.0132mol/L的氢氧化钠处理液。

（3）可视传感阵列的制备

在第（1）、（2）步完成后，用直径为150～200μm的石英毛细管将第（1）步制备出的染料溶液以手工点样的方式点到聚偏氟乙烯膜上，形成点阵（如4×4、5×5、6×6点阵），放于氮气保护下的干燥器中至完全干燥后，将膜片取出放入第（2）步制备出的氢氧化钠处理液中，浸泡作用5～10min，进行碱性处理，取出膜片，放于氮气保护下的干燥器中至完全干燥，制备出可视传感阵列。

（4）AChE酶液的配制

在AChE（500UN）中，加入蒸馏水，振荡溶解后，就制备出活力单位为55～60UN的AChE酶液。

（5）氯化硫代乙酰胆碱溶液的配制

在氯化硫代乙酰胆碱中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为43.6～87.2m mol/L的氯化硫代乙酰胆碱溶液。

（6）配制有机磷农药母液

选取市售的有机磷农药，即毒死蜱、氧化乐果、敌敌畏，分别加入有机溶剂丙酮，搅拌均匀，就制备出浓度为0.0001～1μg/L的有机磷标准农药母液。

（7）空白溶液标准图谱的建立

① 在第（1）～（6）步完成后，在反应池中，加入第（4）步制备的AChE酶液和有机溶剂丙酮及第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀。其AChE酶液:有机溶剂丙酮:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位（ml）:0.066～0.146摩尔单位（m mol/L）。

② 在第（7）-①步完成后的5～10s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（7）-①步制备出的溶液中，浸泡作用5～10min，取出可视传感阵列，自然风干或放入干燥器中干燥，放入普通扫描仪（如Epson v10扫描仪）中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得的彩色图像为空白溶液标准图谱。

（8）有机磷农药标准图谱的建立

① 在第（1）～（7）步完成后，在反应池中，加入第（4）步制备的AChE酶液和第（6）步制备的有机磷农药母液，搅拌混合均匀，酶抑制反应5～10min。其AChE酶液:有机磷农药的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位（ml）。

② 在第（8）-①步完成后的反应溶液中，加入第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀。其AChE酶液:有机磷农药:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位（ml）:0.066～0.146摩尔单位（m mol/L）。

③ 在第（8）-②步完成后的5～10s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（8）-②步制备出的溶液中，浸泡作用5～10min，取出可视传感阵列，自然风干或放入干燥器中干燥，放入普通扫描仪（如Epson v10扫描仪）中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得的彩色图像为有机磷农药标准图谱。

（9）待测样品检测

① 待测样品液的配制

在第（1）～（8）步完成后，按照待测样品的质量:提取液（丙酮:乙醇:水按体积比3:1:1混合配制而成）的体积比为1:1～2.5的比例，用提取液对待测样品（即小麦、高粱、玉米和大米）进行冲洗，收集冲洗液待测样品液。

② 待测样品液图谱的获得

在第（9）-①步完成后，首先在反应池中，加入第（4）步制备的AChE酶液和第（9）-①步制备的待测样品液，搅拌混合均匀，反应5～10min。其AChE酶液:待测样品液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位（ml）。再在反应溶液中以AChE酶液:待测样品液:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位（ml）:0.066～0.146摩尔单位（m mol/L）加入第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入第（3）步中制备的可视传感阵列，浸泡作用5～10min，取出可视传感阵列，自然风干或放入干燥器中干燥，放入普通扫描仪（如Epson v10扫描仪）中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得的彩色图像为待测样品液图谱。

③ 检测结果判断

在第（9）-②步完成后，将第（9）-②步中获得的待测样品液图谱分别与第（7）-②步中获得的空白溶液标准图谱及第（8）-③步中获得的有机磷农药标准图谱进行对比分析：

首先用肉眼观察，当第（9）-②步中获得的待测样品液图谱与第（7）-②步中获得的空白溶液标准图谱相同时，则待测样品中不含有机磷农药；当第（9）-②步中获得的待测样品液图谱与第（8）-③步中获得的有机磷农药标准图谱相同时，则待测样品中含有该已知有机磷农药，从而实现待测样品中有机磷农药的定性识别。

然后再用Photoshop图像处理软件分别提取第（7）-②步中获得的空白溶液标准图谱、第（8）-③步中获得的不同浓度有机磷农药标准图谱及第（9）-②步中获得的待测样品液图谱中每个阵列点的红（R）、绿（G）、蓝（B）三色值，再用SPSS统计分析软件对提取的RGB数据进行聚类分析，得到树状图，根据待测样品液图谱RGB数据在树状图上的分类情况分析待测样品液中所含有机磷农药的种类及浓度，从而实现待测样品中有机磷农药的定量分析。

下面结合具体实施方式进一步说明本发明。

实施例1

（1）染料溶液的配制

以14种pH指示剂（包括溴甲酚绿、溴甲酚紫、刚果红、氯酚红、溴酚蓝、溴酚红、间胺黄、甲基红、溴百里酚蓝、甲酚红、亮黄、硝嗪黄、百里酚蓝和靛蓝胭脂红）和2种卟啉衍生物（包括单磺酸四苯基卟啉和四磺酸基四苯基卟啉）等16种染料物质为传感材料，以无水乙醇为溶剂，按染料的质量:无水乙醇的体积比为1:0.6的比例，在染料加入无水乙醇，搅拌充分溶解后，分别制备出16种质量浓度为1.7g/L的染料溶液，在3℃下避光保存。

（2）氢氧化钠处理液的配制

在氢氧化钠中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为0.0066mol/L的氢氧化钠处理液。

（3）可视传感阵列的制备

在第（1）、（2）步完成后，用直径为150μm的石英毛细管将第（1）步制备出的染料溶液以手工点样的方式点到聚偏氟乙烯膜上，形成4×4点阵，放于氮气保护下的干燥器中至完全干燥后，将膜片取出放入第（2）步制备出的氢氧化钠处理液中，浸泡作用5min，进行碱性处理，取出膜片，放于氮气保护下的干燥器中至完全干燥，就制备出可视传感阵列。

（4）AChE酶液的配制

在AChE（500UN）中，加入蒸馏水，振荡溶解后，就制备出活力单位为55UN的AChE酶液。

（5）氯化硫代乙酰胆碱溶液的配制

在氯化硫代乙酰胆碱中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为43.6m mol/L的氯化硫代乙酰胆碱溶液。

（6）配制毒死蜱农药母液

选取市售的有机磷农药毒死蜱，加入有机溶剂丙酮，搅拌均匀，就制备出浓度为0.0001～1μg/L的毒死蜱农药母液。

（7）空白溶液标准图谱的建立

① 在第（1）～（6）步完成后，在反应池中，加入第（4）步制备的AChE酶液和有机溶剂丙酮及第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀。其AChE酶液:有机溶剂丙酮:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）:0.073摩尔单位（m mol/L）。

② 在第（7）-①步完成后的5s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（7）-①步制备出的溶液中，浸泡作用5min，取出可视传感阵列，自然风干或放入干燥器中干燥，放入Epson v10扫描仪中，采用仪器自带软件采集反应后可视传感阵列的图像，获得的彩色图像为空白溶液标准图谱。

（8）毒死蜱农药标准图谱的建立

① 在第（1）～（7）步完成后，在反应池中，加入第（4）步制备的AChE酶液和第（6）步制备的毒死蜱农药母液，搅拌混合均匀，酶抑制反应5min。其AChE酶液:毒死蜱农药的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）。

② 在第（8）-①步完成后的反应溶液中，加入第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀。其AChE酶液:毒死蜱农药:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）:0.073摩尔单位（m mol/L）。

③ 在第（8）-②步完成后的5s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（8）-②步制备出的溶液中，浸泡作用5min，取出可视传感阵列，自然风干或放入干燥器中干燥，放入Epson v10扫描仪中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得的彩色图像为浓度为0.01～100ng/L毒死蜱农药标准图谱。

（9）待测样品检测

① 待测样品液的配制

在第（1）～（8）步完成后，按照待测样品的质量:提取液的体积比为1:1的比例，用提取液对小麦待测样品进行冲洗，收集冲洗液，冲洗液就是待测样品液；其中提取液是丙酮:乙醇:水按体积比为3:1:1混合而成。

② 待测样品液图谱的获得

在第（9）-①步完成后，首先在反应池中，加入第（4）步制备的AChE酶液和第（9）-①步制备的待测样品液，搅拌混合均匀，反应5min。其AChE酶液:待测样品液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）。再在反应溶液中以AChE酶液:待测样品液:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）:0.073摩尔单位（m mol/L）加入第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入第（3）步中制备的可视传感阵列，浸泡作用5min，取出可视传感阵列，自然风干或放入干燥器中干燥，放入Epsonv10扫描仪中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得的彩色图像为待测样品液图谱。

③ 检测结果判断

在第（9）-②步完成后，将第（9）-②步中获得的待测样品液图谱分别与第（7）-②步中获得的空白溶液标准图谱与第（8）-③步中获得的毒死蜱农药标准图谱进行对比分析：

首先肉眼观察，当第（9）-②步中获得的待测样品液图谱与第（8）-③步中获得的毒死蜱农药标准图谱相同时，则小麦待测样品中残留有有机磷农药，且残留的是毒死蜱农药。

然后再用Photoshop图像处理软件分别提取第（7）-②步中获得的空白溶液标准图谱、第（8）-③步中获得的不同浓度有机磷农药标准图谱及第（9）-②步中获得的待测样品液图谱中每个阵列点的RGB三色值，再用SPSS统计分析软件对提取的RGB数据进行聚类分析，得到树状图，根据待测样品液图谱RGB数据在树状图上的分类情况分析待测样品液中所含毒死蜱农药的浓度，从而实现待测样品中毒死蜱农药的定量分析，检测结果表明，本发明方法能够检测的样品中有毒死蜱的浓度最近值为0.018ng/L。从而表明，本发明的方法，结合配制的提取液能够非常精确的检测样品中的农药残留

实施例2

一种微痕量有机磷农药可视化快速识别方法，其具体的方法步骤同实施例1，其中：

第（1）步中：按染料的质量:无水乙醇的体积比为1:0.3的比例，在染料加入无水乙醇，搅拌充分溶解后，分别制备出质量浓度为5.1g/L的染料溶液，在3.5℃下避光保存。

第（2）步中：在氢氧化钠中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为0.001mol/L的氢氧化钠处理液。

第（3）步中：用直径为180μm的石英毛细管将第（1）步制备出的染料溶液以手工点样的方式点到聚偏氟乙烯膜上，形成点阵4×4点阵，放于氮气保护下的干燥器中至完全干燥后，将膜片取出放入第（2）步制备出的氢氧化钠处理液中，浸泡作用8min。

第（4）步中：在AChE（500UN）中，加入蒸馏水，振荡溶解后，就制备出活力单位为60UN的AChE酶液。

第（5）步中：在氯化硫代乙酰胆碱中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为43.6m mol/L的氯化硫代乙酰胆碱溶液。

第（6）步中：选取市售的氧化乐果农药，分别加入有机溶剂丙酮，搅拌均匀，就制备出浓度为0.0001～1μg/L的氧化乐果农药母液。

第（7）-①步中：其AChE酶液:有机溶剂丙酮:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017体积单位（ml）:0.066摩尔单位（m mol/L）。

第（7）-②步中：在第（7）-①步完成后的8s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（7）-①步制备出的溶液中，浸泡作用8min。

第（8）-①步中：其AChE酶液:氧化乐果农药的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017体积单位（ml）。

第（8）-②步中：其AChE酶液: 氧化乐果农药:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017体积单位（ml）:0.066摩尔单位（m mol/L）。

第（8）-③步中：在第（8）-②步完成后的8s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（8）-②步制备出的溶液中，浸泡作用8min。获得的彩色图像为0.01～100ng/L氧化乐果农药标准图谱。

第（9）-①步中：按照待测样品的质量:提取液的体积比为1:1.8的比例，用提取液对高粱待测样品进行冲洗。

第（9）-②步中：其AChE酶液:待测样品液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017体积单位（ml）。再在反应溶液中以AChE酶液:待测样品液:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.017体积单位（ml）:0.066摩尔单位（m mol/L）加入第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入第（3）步中制备的可视传感阵列，浸泡作用8min。

第（9）-③步中：当第（9）-②步中获得的待测样品液图谱与第（8）-③步中获得的氧化乐果农药标准图谱相同时，则高粱待测样品中残留有有机磷农药，且残留的是氧化乐果农药。同样可以根据待测样品液图谱RGB数据在树状图上的分类情况分析待测样品液中所含氧化乐果农药的浓度。本实施例的检测结果表明检测的高粱中氧化乐果农药的浓度为0.07ng/L。

实施例3

一种微痕量有机磷农药可视化快速识别方法，其具体的方法步骤同实施例1，其中：

第（1）步中：按染料的质量:无水乙醇的体积比为1:0.1的比例，在染料加入无水乙醇，搅拌充分溶解后，分别制备出质量浓度为10.2g/L的染料溶液，在4℃下避光保存。

第（2）步中：在氢氧化钠中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为0.0132mol/L的氢氧化钠处理液。

第（3）步中：用直径为200μm的石英毛细管将第（1）步制备出的染料溶液以手工点样的方式点到聚偏氟乙烯膜上，形成点阵4×4点阵，放于氮气保护下的干燥器中至完全干燥后，将膜片取出放入第（2）步制备出的氢氧化钠处理液中，浸泡作用10min。

第（4）步中：在AChE（500UN）中，加入蒸馏水，振荡溶解后，就制备出活力单位为55UN的AChE酶液。

第（5）步中：在氯化硫代乙酰胆碱中加入蒸馏水，搅拌充分溶解后，就制备出浓度为87.2m mol/L的氯化硫代乙酰胆碱溶液。

第（6）步中：选取市售的敌敌畏农药，分别加入有机溶剂丙酮，搅拌均匀，就制备出浓度为0.0001～1μg/L的敌敌畏农药母液。

第（7）-①步中：其AChE酶液:有机溶剂丙酮:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）:0.146摩尔单位（m mol/L）。

第（7）-②步中：在第（7）-①步完成后的10s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（7）-①步制备出的溶液中，浸泡作用10min。

第（8）-①步中：其AChE酶液:敌敌畏农药的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）。

第（8）-②步中：其AChE酶液:敌敌畏农药:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）:0.146摩尔单位（m mol/L）。

第（8）-③步中：在第（8）-②步完成后的10s内，立即将第（3）步中制备的可视传感阵列，放入第（8）-②步制备出的溶液中，浸泡作用10min。获得的彩色图像为浓度为0.01～100ng/L的敌敌畏农药标准图谱。

第（9）-①步中：按照待测样品的质量:提取液的体积比为1:2.5的比例，用提取液对玉米待测样品进行冲洗。

第（9）-②步中：其AChE酶液:待测样品液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）。再在反应溶液中以AChE酶液:待测样品液:氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：1酶活单位（UN）:0.018体积单位（ml）:0.146摩尔单位（m mol/L）加入第（5）步制备的氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入第（3）步中制备的可视传感阵列，浸泡作用10min。

第（9）-③步中：当第（9）-②步中获得的待测样品液图谱与第（8）-③步中获得的敌敌畏农药标准图谱相同时，则小麦待测样品中残留有有机磷农药，且残留的是敌敌畏农药。同样可以根据待测样品液图谱RGB数据在树状图上的分类情况分析待测样品液中所含敌敌畏农药的浓度。

实验结果

用本实施例3的检测方法进行试验：

首先，在反应池中依次加入1.8ml AChE酶液（55UN）、180μl丙酮和200μl 87.2m mol/L氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入可视传感阵列，浸泡作用10min。取出，自然风干后，放入Epsonv10扫描仪中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得空白溶液标准图谱。

然后，在反应池中先加入1.8ml AChE酶液和180μl 0.0001～1μg/L 敌敌畏农药母液，酶抑制反应10min后，再加入200μl 87.2m mol/L氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入可视传感阵列，浸泡作用10min。取出，自然风干后，放入扫描仪中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得浓度为0.01～100ng/L敌敌畏农药标准图谱。

最后，按照待测样品的质量:提取液（丙酮:乙醇:水按体积比3:1:1混合配制而成）的体积比为1:2.5的比例，用提取液对玉米待测样品进行冲洗。在反应池中先加入1.8ml AChE酶液和180μl 待测样品液，酶抑制反应10min后，再加入200μl 87.2m mol/L氯化硫代乙酰胆碱溶液，搅拌混合均匀，立即放入可视传感阵列，浸泡作用10min。取出，自然风干后，放入扫描仪中，采集反应后可视传感阵列的图像，获得待测样品液图谱。

结果分析：将待测样品液图谱分别空白溶液标准图谱及敌敌畏农药标准图谱进行对比分析知，待测样品液图谱与空白溶液标准图谱不同，而与敌敌畏农药标准图谱相同，这说明小麦待测样品中残留有有机磷农药敌敌畏。为进一步确认待测样品中含有敌敌畏的浓度，用Photoshop软件提取各个图像中每个阵列点的RGB数据，再用SPSS软件以平方Euclidean距离为度量标准，采用Ward法，对全部RGB数据进行聚类分析，获得树状图，如图1所示。从树状图上可知，本发明的方法不仅可以将空白溶液标准图谱与敌敌畏农药标准图谱区分开来，而且可以分辨0.01～100ng/L范围内不同浓度的敌敌畏农药标准图谱，灵敏度可达0.01ng/L。待测样品液图谱与0.01ng/L敌敌畏农药标准图谱聚为一类，这说明待测样品中含有0.01ng/L的敌敌畏农药。最终实现待测样品中有机磷农药的定性和定量分析。

Claims (6)

1.本发明的一种有机磷农药检测方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1）建立空白溶液标准图谱：

将AChE酶液、有机溶剂丙酮和氯化硫代乙酰胆碱溶液搅拌混合均匀；将用受pH影响而发生颜色变化的物质作为传感材料的阵列膜片放入浸泡反应，反应后将膜片干燥，进行扫描，获得的彩色阵列图像为空白溶液标准图谱；

2）建立有机磷农药标准图谱：

将AChE酶液和有机磷农药搅拌混合进行酶抑制反应，然后在反应溶液中加入氯化硫代乙酰胆碱；再将用受pH影响而发生颜色变化的物质作为传感材料的阵列膜片放入浸泡反应，反应后干燥膜片，进行扫描，获得的彩色阵列图像为有机磷农药标准图谱；

3）待测样品的有机磷农药残留检测：

用提取液对待测样品进行冲洗，收集冲洗液作为待测样品液；

将AChE酶液和待测样品液混合进行酶抑制反应，然后在反应溶液中加入氯化硫代乙酰胆碱；再将用受pH影响而发生颜色变化的物质作为传感材料的阵列膜片放入浸泡反应，反应后干燥膜片，进行扫描，获得的彩色阵列图像为待测样品液图谱；

4）结果分析：

定性识别：将待测样品液图谱分别与空白溶液标准图谱及有机磷农药标准图谱进行对比分析，肉眼观察，当待测样品液图谱与空白溶液标准图谱相同时，则待测样品中不含有机磷农药；待测样品液图谱与有机磷农药标准图谱相同时，则待测样品中含有该已知有机磷农药，从而实现待测样品中有机磷农药的有无识别以及有机磷农药种类的识别；

定量分析：用Photoshop图像处理软件分别提取空白溶液标准图谱、有机磷农药标准图谱及待测样品液图谱中每个阵列点的红（R）、绿（G）、蓝（B）三色值，再用SPSS统计分析软件对提取的RGB数据进行聚类分析，得到树状图，根据待测样品液图谱RGB数据在树状图上的分类情况确定待测样品液中含有的有机磷农药的浓度，从而实现待测样品中有机磷农药的定量分析。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的受pH影响而发生颜色变化的物质为pH指示剂或水溶性卟啉衍生物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的pH指示剂为溴甲酚绿、溴甲酚紫、刚果红、氯酚红、溴酚蓝、溴酚红、间胺黄、甲基红、溴百里酚蓝、甲酚红、亮黄、硝嗪黄、百里酚蓝、靛蓝胭脂红中的任一种或几种。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的水溶性卟啉衍生物为单磺酸基四苯基卟啉或四磺酸基四苯基卟啉。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的AChE酶液、有机溶剂丙酮和氯化硫代乙酰胆碱溶液的数量比为：AChE酶1酶活单位（UN）:0.017～0.018体积单位有机溶剂丙酮:0.066～0.146摩尔单位氯化硫代乙酰胆碱。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的提取液是丙酮:乙醇:水按体积比为3:1:1混合而成。

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