CN101776601B - 一种快速检测农药残留的方法 - Google Patents
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Abstract
一种快速检测农药残留的方法，涉及有机磷农药的荧光检测方法。本发明利用带程序的荧光分光光度计，以卟啉化合物为荧光指示剂和显色剂，经制备卟啉溶液和有机磷农药溶液及液态检测溶液，测量液态卟啉检测溶液中有机磷农药。本发明具有检测灵敏度高，检测限低，准确性高，操作简便，便于现场快速检测，经济性好，便于推广应用等特点。本发明可广泛应用于粮食、食品等易含有有机磷农药残留的微痕量检测，也可用于蔬菜、水果等食品安全评估和环境检测中。
Description
技术领域
本发明属于化学农药的检测技术领域，具体涉及有机磷农药荧光检测方法。
技术背景
有机磷农药是目前使用最广泛的化学农药，在农业生产中作为防治农作物病虫害的主要生产资料，具有重要的作用。有机磷农药的使用大大的提高了农作物的产量，但是它在给人类带来了经济效益的同时，也对人们身体健康及外部生态环境造成了危害。环境中残存的有机磷类农药不仅会影响人体的各项机能，还会对人体的神经系统及其它系统机能结构构成潜在的危害，甚至会降低肌体的免疫功能，表现有“三致”危害(致癌、致畸、致突变)。从上个世纪40年代至今，有机磷农药的使用已经走过了60多年，目前在大气、水、土壤、食品、蔬菜瓜果中，甚至在人迹罕至的南极和北极，也检测出了残留的有机磷农药成分。有机磷农药残留已经成为当今世界上主要的污染源之一。因此，如何降低有机磷农药的危害，引起了当前国际社会的普遍关注。
为了保障人类健康和维护生态环境，必须加强有机磷类农药残留的检测和防治。由于有机磷类农药品种多、化学结构和性质各异、待测组分复杂，尤其是近年来，高效、低毒、低残留的有机磷农药品种不断涌现，对有机磷农药残留检测技术提出了更高的要求。因此，实现微痕量有机磷农药的快速、灵敏度高、在线实时的检测，可以实现对食品、农产品的质量评估和环境安全评价，监控有机磷农药污染，在保障人民生命安全和身体健康方面也具有重要意义。
最近几年的有机磷农药残留检测研究集中在生物传感器上，生物传感器主要基于乙酰胆碱酯酶的抑制原理或者直接利用有机磷水解酶检测。AChE通过水解乙酰胆碱为乙酸和胆碱从而阻断乙酰胆碱在神经突触上的传递。而有毒的有机磷化合物可以抑制AChE，导致体内乙酰胆碱的聚集从而影响肌肉反应并且导致重要器官的坏死最终导致人体死亡。AChE可以被有机磷化合物、氨基甲酸酯类农药和其他化合物抑制，所以AChE传感器的选择性较差，只能被用来预测有机磷农药残留的总量或是进行粗筛。
现有的检测有机磷农药残留地方法，如2008年11月5日公开的，公开号为CN101299029A的“一种检测有机磷农药残留试纸的制备及其使用方法”专利，公开的方法是以新鲜的母鸡或母鸭的血为原料制备乙酰胆碱酯酶，将乙酰胆碱酯酶固定于滤纸上，将滤纸冷冻干燥后切片，使用时配制底物液，显色液和增敏液。其原理是利用增敏液处理后的有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，使乙酰胆碱酯酶的底物乙酸萘酯不能分解，从而加入固蓝B盐后显示的颜色深浅不一致。该方法的缺点为：(1)乙酰胆碱酯酶的价格较为昂贵；(2)乙酰胆碱酯酶不易保存，需要在冷冻条件下保存；(3)该方法所需的药品较多，操作过程较为繁琐；(4)该方法只能粗略的定性检测有机磷农药，不能实现定量检测。又如2008年2月27日公开的，公开号为CN101131350A的“一种检测微痕量甲基磷酸二甲酯的方法”专利，公开的方法是以植物酯酶液和TPPS为指示剂，在液相光谱检测装置的反应池中加入TPPS-植物酯酶复合溶液指示有机磷农药DMMP对植物酯酶的抑制程度，通过反应前后吸光度的变化测定农药残留量。在该专利中，采用的药品为植物酯酶，对DMMP的检测限为10ppt。该方法的缺点为：(1)植物酯酶的价格较为昂贵；(2)植物酯酶不易保存，需要在冷冻条件下保存；(3)该方法只能实现定性的检测DMMP，不能对有机磷农药实现定量检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有的检测有机磷类农药残留方法的不足之处，提供一种快速检测有机磷农药的方法，具有灵敏度高、重现性好的特点，可以实现对微痕量有机磷农药残留实时、快速的检测。
本发明的原理是：利用卟啉类化合物与有机磷农药作用产生荧光强度的变化对有机磷农药残留进行检测。卟啉类化合物是以卟吩为母体的一种大环高分子化合物，由于具有较大的平面大环结构和显色能力很强的特点，是一类超高灵敏显色剂。卟吩环上的四个meso-(5，10，15，20)位以及八个β-(2，3，7，8，12，13，17，18)位均可被其它基团取代而生成一系列的卟吩衍生物，即卟啉。卟啉环的各个原子基本处于同一平面，形成一个极易受到吡咯环和次甲基的电子效应影响的拥有11个共轭双键的高度共轭体系。这一结构特征使卟啉既表现出刚性平面带来的分子识别能力，又表现出共轭体系导致的丰富的电子光谱；同时高度共轭体系使其化学性质比较稳定、颜色较深。因而卟啉具有刚柔性、电子缓冲性、光电磁、光敏性和高度的化学稳定性以及光谱响应宽等许多特性。金属卟啉，由于配位键的形成使得卟啉环的对称性和轴向配位作用增强，结合位点增多，性质较非金属卟啉更为活泼。卟啉与金属卟啉具有优良的光敏性能，是检测粮食及食品中痕量的有机磷类农药残留的理想敏感材料。卟啉对农药残留敏感的光学本质是由于p-p作用和n-p作用的存在，主要可以反映到卟啉的吸收光谱、荧光光谱或反射光谱的变化上。卟啉化合物与有机磷农药分子作用后，导致卟啉化合物的荧光强度增强，并且荧光强度增强与加入的有机磷农药的浓度呈线性关系，由此可以定量的检测有机磷农药的含量。
本发明的目的是这样实现的：一种检测有机磷农药的方法，利用市购的带程序的荧光分光光度计，以卟啉化合物为荧光指示剂和显色剂，经过制备卟啉溶液和有机磷农药溶液及液态卟啉检测溶液，检测液态卟啉检测溶液中有机磷农药的荧光光谱，然后对荧光光谱进行比较分析来检测待测样品液中的残留的有机磷农药。其具体步骤如下：
(1)卟啉溶液的配制
以卟啉(即四苯基卟啉、单羟基四苯基卟啉、四苯基锌卟啉、四苯基五氟锌卟啉、四苯基铕卟啉、四苯基锰卟啉等中的1种)为荧光指示剂和显色剂，以有机溶剂乙腈为定容剂，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶259.0～325.5的比例，分别将卟啉加入有机溶剂乙腈中，搅拌溶解后，就分别制备出6种卟啉质量浓度为0.003～0.004g/L的卟啉溶液，分别放置于冰箱中，并在3～4℃下避光保存，备用。
(2)配制已知有机磷农药溶液
1)配制农药母液
选取市售的有机磷农药(如氧化乐果、敌敌畏、水胺硫磷、毒死蜱)，分别加入有机溶剂乙腈中，搅拌均匀，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶104～1010，配制4种农药母液。
2)配制液态卟啉检测溶液
第(2)-1)步完成后，按照第(1)步制备出的1种卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的1种已知有机磷农药母液的体积比为1∶1～2.5的比例，在第(1)步制备出的1种卟啉溶液中，加入第(2)-1)步制备出的1种已知有机磷农药母液，搅拌混合均匀后，就制备出1种液态卟啉检测溶液，直至在第(1)步制备出的6种卟啉溶液中，分别加完第(2)-1)步制备出的4种已知有机磷农药母液为止。然后，对每种液态卟啉检测溶液，再用有机溶剂乙腈进行稀释，再分别配制出浓度梯度从小到大为2x10-7μl/L～0.2μl/L的5个浓度梯度的液态卟啉检测溶液，最后共制备出120种液态卟啉检测溶液。分别静置5～15分钟后进行检测。
(3)检测已知有机磷农药的基本荧光光谱
第(2)步完成后，对市购的装载有程序的荧光分光光度计通电，预热后打开荧光分光光度计并设定扫描范围为350nm-700nm、狭缝宽度为5nm、扫描速度为1000nm/min，再根据第(1)步制备出的1种卟啉溶液(即四苯基卟啉、单羟基四苯基卟啉、四苯基锌卟啉、四苯基五氟锌卟啉、四苯基铕卟啉、四苯基锰卟啉等溶液中的1种)设定相应的激发波长414nm～452nm。然后在荧光分光光度计的检测池中，再将第(2)-2)步制备出的1种相应的液态卟啉检测溶液按照浓度从低到高的顺序，依次加入，分别进行测量和记录相应的荧光光谱，并通过荧光分光光度计的信号处理系统分别将其基本荧光光谱保存和打印输出，直至测量出第(2)-2)步制备出的120种液态卟啉检测溶液的基本荧光光谱为止，并保存和打印输出，备用。
(4)检测待测样品的荧光光谱
1)待测样品液的配制
第(3)步完成后，按照待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1～2.5的比例，用有机溶剂乙腈对待测样品(即小麦、高粱、玉米、大米等)进行冲洗，收集冲洗液，即为待测样品的残留有机磷农药溶液(简称待测样品液)。
2)检测待测样品液的荧光光谱
第(4)-1)步完成后，按照第(1)步配制的1种卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的待测样品液的体积比为1∶1～2.5∶1.5～3.0的比例，将卟啉溶液和有机溶剂及待测样品液，混合搅拌均匀后，放入荧光分光光度计的检测池中，通过荧光分光光度计的程序测量其荧光光谱，并记录保存及打印。
(5)分析判断
1)定性判断
第(4)步完成后，装载有程序的荧光分光光度计自动将第(4)-2)步测量的荧光光谱与其保存的第(3)步测量出的24种已知有机磷农药的基本光谱逐一进行分析比较并判断：当第(4)-2)测得的荧光光谱与第(3)步测量的某一已知有机磷农药的荧光光谱完全一致时，则待测样品中残留有有机磷农药，且残留的有机磷农药为该已知的有机磷农药；否则，该待测样品中不含有该已知有机磷农药。
2)定量分析
第(5)-1)步完成后，当待测样品中残留有有机磷农药时，再将第(3)步测得的对应的卟啉-已知有机磷农药的5种不同浓度梯度的荧光光谱的最高峰的荧光强度，作标准导数工作曲线，得到线性回归方程F＝klogC+b，然后将第(4)-2)步测得的待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度F代入线性回归方程，就精确确定待测样品中残留的有机磷农药的量C。
本发明在使用中，在选用荧光指示剂和显色剂时，根据具体情况，可选用本发明所述的检测效果好的6种卟啉，也可选用其他卟啉。在选用定容剂时，可选用本发明方法所用的乙腈作为有机溶剂，也可选用其他有机溶剂如乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮等。在测量已知有机磷农药的基本光谱中配制农药母液时，可以选取本发明所述的常用的4种有机磷农药，也适用于其他有机磷农药，选用的已知有机磷农药种类越多，测量时虽繁杂些，但检测残留有机磷农药的种类也多些，检测范围也更宽些。在配制液态卟啉检测溶液时，选用每种液态卟啉检测溶液的浓度梯度时，可选用本发明所述的5种梯度，也可是其它5种以上的梯度，梯度越多，所作的线性回归方程越准确，根据线性回归方程计算出的有机磷农药残留量越准确；最少不得少于5种。
本发明采用上述技术方案后，取得的主要效果如下：
(1)操作简单，便于实现现场快速检测。采用本发明检测有机磷农药不需要准备除样品外的其他试剂，可以直接利用市购的荧光分光光度计进行检测。由于本发明采用的显色剂是液态存在，不需要固定，便于进行快速检测。
(2)检测灵敏度高。采用本发明对有机磷农药进行检测，由于卟啉化合物固有的较高的摩尔吸光系数使得其对有机磷农药具有较高的灵敏度，可以实现准确的检测。
(3)检测限低。采用本发明对有机磷农药进行检测，最低检测限可至1ppt，从而可以精确检测微痕量的有机磷农药残留。
(4)经济效益高，本发明所用材料种类和用量及检测设备都较少，操作程序简单，具有较高的经济价值。
(5)操作简单。本发明所采用的仪器为市售的荧光分光光度计，操作简单，稳定性好。
(6)便于推广应用。由于本发明方法简单、操作简便，只采用简单设备且灵敏度高。因而便于推广应用。
本发明方法可以广泛应用于粮食，食品等易含有有机磷农药残留的微痕量检测，也可用于蔬菜、水果等食品安全评估和环境监测，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中四苯基五氟锌卟啉用乙腈溶解后与不同浓度的有机磷农药毒死蜱作用的荧光光谱图，图2为图1的波峰位置的放大图。图3为四苯基五氟锌卟啉与毒死蜱的荧光导数工作曲线，其线性方程为：F＝1.187logC+65.391，R2＝0.9952。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种快速检测有机磷农药残留的方法，其具体方法步骤如下：
(1)卟啉溶液的配制
以四苯基五氟锌卟啉为原料，选取有机溶剂乙腈为定溶剂，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶259.0的比例，将四苯基五氟锌卟啉加入有机溶剂乙腈中，搅拌溶解后，制得浓度为0.004g/L的四苯基五氟锌卟啉溶液。放置于冰箱中，并在3℃下避光保存，备用。
(2)配制已知有机磷农药溶液
1)配制农药母液
选取市售的有机磷农药毒死蜱，加入有机溶剂乙腈中，搅拌均匀，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的毒死蜱农药母液。
2)配制液态卟啉检测溶液
第(2)-1)步完成后，按照第(1)步制备出的四苯基五氟锌卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的毒死蜱农药母液的体积比为1∶1的比例，再用有机溶剂乙腈进行稀释，分别配制出浓度梯度从小到大(为：2x10-7μl/L、2x10-6μl/L、2x10-5μl/L、2x10-4μl/L、2x10-3μl/L)的5个梯度的液态卟啉检测溶液，搅拌混合均匀，静置10分钟后进行检测。
(3)检测已知有机磷农药的基本荧光光谱
第(2)步完成后，对市购的装载有程序的荧光分光光度计通电，预热后打开荧光分光光度计并设定扫描范围为350nm-700nm、狭缝宽度为5nm、扫描速度为1000nm/min，并设定相应的激发波长为416nm。然后在荧光分光光度计的检测池中按照第(2)-2)步制备出的浓度从低到高的顺序，依次加入，分别进行测量并记录相应的荧光光谱，并通过荧光分光光度计的信号处理系统分别将其基本荧光光谱保存和打印输出备用。
(4)检测待测样品的荧光光谱
1)待测样品液的配制
第(3)步完成后，按照小麦待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1的比例，用有机溶剂乙腈对待测样品小麦进行冲洗，收集冲洗液，即为待测样品的残留有机磷农药溶液(简称待测样品液)。
2)检测待测样品液的荧光光谱
第(4)-1)步完成后，按照第(1)步配制的四苯基五氟锌卟啉溶液∶第(4)-1)步选取的有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的小麦待测样品液的体积比为1∶2.5∶1.5的比例，将卟啉溶液和有机溶剂乙腈及小麦待测样品液，混合搅拌均匀后，放入荧光分光光度计的检测池中，通过荧光分光光度计的程序测量其荧光光谱，并记录保存及打印。
(5)分析判断
1)定性判断
第(4)步完成后，装载有程序的荧光分光光度计，自动将第(4)-2)步测量的荧光光谱与其保存的第(3)步测量的已知有机磷农药的基本光谱进行分析比较并判断：当第(4)-2)测得的荧光光谱与第(3)步测量的四苯基五氟锌卟啉-毒死蜱液态卟啉检测溶液的荧光光谱完全一致，则待测样品小麦中残留有有机磷农药，且残留的有机磷农药为毒死蜱。
2)定量分析
第(5)-1)步完成后，当待测样品小麦中残留有毒死蜱时，将第(3)步测得的已知有机磷农药毒死蜱的5个不同浓度梯度的荧光光谱的最高峰的荧光强度F作标准工作曲线，得到线性回归方程F＝1.187logC+65.391，然后将第(4)-2)步测得的小麦待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度F＝62.5代入线性回归方程，从而可以确定待测样品小麦中残留的有机磷农药毒死蜱的量C＝0.0037μl/L。
实施例2
一种快速检测有机磷农药残留的方法，其具体方法步骤同实施例1，其中：
第(1)步中：以四苯基锌卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶295.5的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基锌卟啉溶液。在3.5℃下避光保存。
第(2)-1)步中：有机磷农药为敌敌畏，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶1010，配制浓度为1x10-4μl/L的敌敌畏农药母液。
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的敌敌畏农药母液的体积比为1∶2，浓度为4x10-6μl/L、4x10-5μl/L、4x10-4μl/L、4x10-3μl/L、4x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置5分钟。
第(3)步中：相应的激发波长为421nm。
第(4)-1)步中：待测样品为高粱，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶2.5。
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的高粱待测样品液的体积比为1∶2.0∶2.0。
第(5)-1)步中：待测样品为高粱中残留有有机磷农药敌敌畏。
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝0.6757logC+55.528，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝54.235，待测样品高粱中残留的有机磷农药敌敌畏的量为C＝0.012μl/L。
实施例3
一种快速检测有机磷农药残留的方法，其具体方法步骤同实施例1，其中：
第(1)步中：以四苯基铕卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶262.0的比例，制得浓度为0.004g/L的四苯基铕卟啉溶液。在4℃下避光保存。
第(2)-1)步中：有机磷农药为水胺硫磷，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的水胺硫磷农药母液。
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的水胺硫磷农药母液的体积比为1∶2.5，浓度为5x10-7μl/L、5x10-6μl/L、5x10-5μl/L、5x10-4μl/L、5x10-3μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置15分钟。
第(3)步中：相应的激发波长为423nm。
第(4)-1)步中：待测样品为玉米，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1.5。
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的玉米待测样品液的体积比为1∶1.0∶3.0。
第(5)-1)步中：待测样品为玉米中残留有有机磷农药水胺硫磷。
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝1.6581logC+53.992，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝52.208，待测样品玉米中残留的有机磷农药敌敌畏的量为C＝0.083μl/L。
实施例4
一种快速检测有机磷农药残留的方法，其具体方法步骤同实施例1，其中：
第(1)步中：以四苯基卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶325.5的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基卟啉溶液。在4℃下避光保存。
第(2)-1)步中：有机磷农药为氧化乐果，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶104，配制浓度为1x102μl/L的氧化乐果农药母液。
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的氧化乐果农药母液的体积比为1∶1，浓度为2x10-6μl/L、2x10-5μl/L、2x10-4μl/L、2x10-3μl/L、2x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟。
第(3)步中：相应的激发波长为414nm。
第(4)-1)步中：待测样品为大米，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1.5。
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的大米待测样品液的体积比为1∶2.5∶1.5。
第(5)-1)步中：待测样品为大米中残留有有机磷农药氧化乐果。
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝1.1653logC+53.218，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝51.755，待测样品大米中残留的有机磷农药氧化乐果的量为C＝0.055μl/L。
实施例5
一种快速检测有机磷农药残留的方法，其具体方法步骤同实施例1，其中：
第(1)步中：以四苯基单羟基卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶318.0的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基单羟基卟啉溶液。在4℃下避光保存。
第(2)-1)步中：有机磷农药为氧化乐果，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的氧化乐果农药母液。
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的氧化乐果农药母液的体积比为1∶1，浓度为2x10-6μl/L、2x10-5μl/L、2x10-4μl/L、2x10-3μl/L、2x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟。
第(3)步中：相应的激发波长为418nm。
第(4)-1)步中：待测样品为小麦，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1.5。
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的小麦待测样品液的体积比为1∶2.5∶1.5。
第(5)-1)步中：待测样品为小麦中残留有有机磷农药氧化乐果。
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝0.4787logC+51.732，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝50.762，待测样品小麦中残留的有机磷农药氧化乐果的量为C＝0.009μl/L。
实施例6
一种快速检测有机磷农药残留的方法，其具体方法步骤同实施例1，其中：
第(1)步中：以四苯基锰卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶300.0的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基锰卟啉溶液。在3℃下避光保存。
第(2)-1)步中：有机磷农药为敌敌畏，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的敌敌畏农药母液。
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的敌敌畏农药母液的体积比为1∶2，浓度为4x10-6μl/L、4x10-5μl/L、4x10-4μl/L、4x10-3μl/L、4x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟。
第(3)步中：相应的激发波长为452nm。
第(4)-1)步中：待测样品为高粱，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶2.5。
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的高粱待测样品液的体积比为1∶2.0∶2.0。
第(5)-1)步中：待测样品为高粱中残留有有机磷农药敌敌畏。
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝0.6308logC+26.441，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝23.065，待测样品高粱中残留的有机磷农药敌敌畏的量为C＝4.4x10-6μl/L。
实验结果分析：
从图1及图2中看到四苯基五氟锌卟啉对不同浓度的毒死蜱的荧光光谱具有显著区别，根据590nm附近的特征峰强度可以对不同浓度的毒死蜱进行定量检测，根据不同浓度梯度的荧光特征峰处的荧光强度F作出毒死蜱的标准导数工作曲线F＝1.187logC+65.391，待加入待测样品后得到的590nm附近的荧光强度F与标准工作曲线上的点作比较分析就可以实现对毒死蜱的定量检测。
综上所述，本发明的方法可以实现对有机磷农药的定量检测，且检测的重复性和稳定性好、准确度高，检测的灵敏度好，而且本发明具有操作简便，、快速，成本低等特点，可以广泛应用于粮食，食品等易含有有机磷农药残留的微痕量检测，也可用于蔬菜、水果等食品安全评估和环境监测，具有广泛的应用前景。
Claims (7)
1.一种快速检测有机磷农药的方法，其特征在于具体步骤如下：
(1)卟啉溶液的配制
以卟啉，即四苯基卟啉、单羟基四苯基卟啉、四苯基锌卟啉、四苯基五氟锌卟啉、四苯基铕卟啉、四苯基锰卟啉中的1种为荧光指示剂和显色剂，以有机溶剂乙腈为定容剂，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶259.0～325.5的比例，分别将卟啉加入有机溶剂乙腈中，搅拌溶解后，就分别制备出6种卟啉质量浓度为0.003～0.004g/L的卟啉溶液，在3～4℃下避光保存；
(2)配制已知有机磷农药溶液
1)配制农药母液
选取市售的有机磷农药，即氧化乐果、敌敌畏、水胺硫磷、毒死蜱，分别加入有机溶剂乙腈中，搅拌均匀，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶104～1010；
2)配制液态卟啉检测溶液
第(2)-1)步完成后，按照第(1)步制备出的1种卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的1种已知有机磷农药母液的体积比为1∶1～2.5的比例，在第(1)步制备出的1种卟啉溶液中加入第(2)-1)步制备出的1种已知有机磷农药母液，搅拌均匀，直至在第(1)步制备出的6种卟啉溶液中，分别加入完第(2)-1)步制备出的4种已知有机磷农药母液为止，然后对每种液态卟啉检测溶液，用有机溶剂乙腈进行稀释，再分别配制出浓度的梯度从小到大为2x10-7μl/L～0.2μl/L的5个液态卟啉检测溶液，分别静置5～15分钟；
(3)检测已知有机磷农药的基本荧光光谱
第(2)步完成后，对市购的装载有程序的荧光分光光度计通电预热后，打开荧光分光光度计并设定扫描范围为350nm-700nm、狭缝宽度为5nm、扫描速度为1000nm/min，再根据第(1)步制备出的1种卟啉溶液，即四苯基卟啉、单羟基四苯基卟啉、四苯基锌卟啉、四苯基五氟锌卟啉、四苯基铕卟啉、四苯基锰卟啉溶液中的1种设定相应的激发波长414nm～452nm，然后在荧光分光光度计的检测池中，再将第(2)-2)步制备出的1种相应的液态卟啉检测溶液，按照浓度从低到高的顺序，依次加入，分别进行测量和记录相应的荧光光谱，并通过荧光分光光度计的信号处理系统分别将其基本荧光光谱保存和打印输出，直至测量出第(2)-2)步制备出的120种液态卟啉检测溶液的基本荧光光谱为止，并保存和打印输出；
(4)检测待测样品的荧光光谱
1)待测样品液的配制
第(3)步完成后，按照待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1～2.5的比例，用有机溶剂乙腈对待测样品即小麦、高粱、玉米、大米进行冲洗，收集冲洗液；
2)检测待测样品液的荧光光谱
第(4)-1)步完成后，按照第(1)步配制的1种卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的待测样品液的体积比为1∶1～2.5∶1.5～3.0的比例，将卟啉溶液和有机溶剂及待测样品液混合搅拌均匀后，放入荧光分光光度计的检测池中，通过荧光分光光度计的程序测量其荧光光谱，并记录保存及打印；
(5)分析判断
1)定性判断
第(4)步完成后，装载有程序的荧光分光光度计自动将第(4)-2)步测量的荧光光谱与其保存的第(3)步测量出的24种已知有机磷农药的基本光谱逐一进行分析比较并判断：当第(4)-2)测得的荧光光谱与第(3)步测量的某一已知有机磷农药的荧光光谱完全一致时，则待测样品中残留有有机磷农药，且残留的有机磷农药为该已知的有机磷农药；否则，该待测样品中不含有该已知有机磷农药；
2)定量分析
第(5)-1)步完成后，当待测样品中残留有有机磷农药时，再将第(3)步测得的对应的卟啉-已知有机磷农药的5种不同浓度梯度的荧光光谱的最高峰的荧光强度，作标准导数工作曲线，得到线性回归方程F＝klogC+b，然后将第(4)-2)步测得的待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度F代入线性回归方程，就精确确定待测样品中残留的有机磷农药的量C。
2.按照权利要求1所述的一种快速检测农药残留的方法，其特征在于具体步骤中：
第(1)步中：以四苯基五氟锌卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶259.0的比例，制得浓度为0.004g/L的四苯基五氟锌卟啉溶液，在3℃下避光保存；
第(2)-1)步中：有机磷农药为毒死蜱，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的毒死蜱农药母液；
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的毒死蜱农药母液的体积比为1∶1，浓度为2x10-7μl/L、2x10-6μl/L、2x10-5μl/L、2x10-4μl/L、2x10-3μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟；
第(3)步中：相应的激发波长为416nm；
第(4)-1)步中：待测样品为小麦，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1；
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的小麦待测样品液的体积比为1∶2.5∶1.5；
第(5)-1)步中：待测样品为小麦中残留有有机磷农药毒死蜱；
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝1.187logC+65.391，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝62.5，待测样品小麦中残留的有机磷农药毒死蜱的量为C＝0.0037μl/L。
3.按照权利要求1所述的一种快速检测农药残留的方法，其特征在于具体步骤中：
第(1)步中：以四苯基锌卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶295.5的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基锌卟啉溶液，在3.5℃下避光保存；
第(2)-1)步中：有机磷农药为敌敌畏，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶1010，配制浓度为1x10-4μl/L的敌敌畏农药母液；
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的敌敌畏农药母液的体积比为1∶2，浓度为4x10-6μl/L、4x10-5μl/L、4x10-4μl/L、4x10-3μl/L、4x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置5分钟；
第(3)步中：相应的激发波长为421nm；
第(4)-1)步中：待测样品为高粱，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶2.5；
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的高粱待测样品液的体积比为1∶2.0∶2.0；
第(5)-1)步中：待测样品为高粱中残留有有机磷农药敌敌畏；
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝0.6757logC+55.528，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝54.235，待测样品高粱中残留的有机磷农药敌敌畏的量为C＝0.012μl/L。
4.按照权利要求1所述的一种快速检测农药残留的方法，其特征在于具体步骤中：
第(1)步中：以四苯基铕卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶262.0的比例，制得浓度为0.004g/L的四苯基铕卟啉溶液，在4℃下避光保存；
第(2)-1)步中：有机磷农药为水胺硫磷，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的水胺硫磷农药母液；
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的水胺硫磷农药母液的体积比为1∶2.5，浓度为5x10-7μl/L、5x10-6μl/L、5x10-5μl/L、5x10-4μl/L、5x10-3μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置15分钟；
第(3)步中：相应的激发波长为423nm；
第(4)-1)步中：待测样品为玉米，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1.5；
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的玉米待测样品液的体积比为1∶1.0∶3.0；
第(5)-1)步中：待测样品为玉米中残留有有机磷农药水胺硫磷；
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝1.6581logC+53.992，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝52.208，待测样品玉米中残留的有机磷农药敌敌畏的量为C＝0.083μl/L。
5.按照权利要求1所述的一种快速检测农药残留的方法，其特征在于具体步骤中：
第(1)步中：以四苯基卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶325.5的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基卟啉溶液，在4℃下避光保存；
第(2)-1)步中：有机磷农药为氧化乐果，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶104，配制浓度为1x102μl/L的氧化乐果农药母液；
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的氧化乐果农药母液的体积比为1∶1，浓度为2x10-6μl/L、2x10-5μl/L、2x10-4μl/L、2x10-3μl/L、2x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟；
第(3)步中：相应的激发波长为414nm；
第(4)-1)步中：待测样品为大米，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1.5；
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的大米待测样品液的体积比为1∶2.5∶1.5；
第(5)-1)步中：待测样品为大米中残留有有机磷农药氧化乐果；
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝1.1653logC+53.218，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝51.755，待测样品大米中残留的有机磷农药氧化乐果的量为C＝0.055μl/L。
6.按照权利要求1所述的一种快速检测农药残留的方法，其特征在于具体步骤中：
第(1)步中：以四苯基单羟基卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶318.0的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基单羟基卟啉溶液，在4℃下避光保存；
第(2)-1)步中：有机磷农药为氧化乐果，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的氧化乐果农药母液；
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的氧化乐果农药母液的体积比为1∶1，浓度为2x10-6μl/L、2x10-5μl/L、2x10-4μl/L、2x10-3μl/L、2x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟；
第(3)步中：相应的激发波长为418nm；
第(4)-1)步中：待测样品为小麦，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶1.5；
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的小麦待测样品液的体积比为1∶2.5∶1.5；
第(5)-1)步中：待测样品为小麦中残留有有机磷农药氧化乐果；
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝0.4787logC+51.732，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝50.762，待测样品小麦中残留的有机磷农药氧化乐果的量为C＝0.009μl/L。
7.按照权利要求1所述的一种快速检测农药残留的方法，其特征在于具体步骤中：
第(1)步中：以四苯基锰卟啉为原料，按卟啉的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶300.0的比例，制得浓度为0.003g/L的四苯基锰卟啉溶液，在3℃下避光保存；
第(2)-1)步中：有机磷农药为敌敌畏，其有机磷农药∶有机溶剂乙腈的体积比1∶108，配制浓度为1x10-2μl/L的敌敌畏农药母液；
第(2)-2)步中：其第(1)步制备出的卟啉溶液体积∶第(2)-1)步制备出的敌敌畏农药母液的体积比为1∶2，浓度为4x10-6μl/L、4x10-5μl/L、4x10-4μl/L、4x10-3μl/L、4x10-2μl/L的5个梯度的液态卟啉检测溶液，静置10分钟；
第(3)步中：相应的激发波长为452nm；
第(4)-1)步中：待测样品为高粱，待测样品的质量∶有机溶剂乙腈的体积比为1∶2.5；
第(4)-2)步中：第(1)步配制的卟啉溶液∶有机溶剂乙腈∶第(4)-1)步制备出的高粱待测样品液的体积比为1∶2.0∶2.0；
第(5)-1)步中：待测样品为高粱中残留有有机磷农药敌敌畏；
第(5)-2)步中：线性回归方程为F＝0.6308logC+26.441，待测样品液的荧光光谱的最高峰的荧光强度为F＝23.065，待测样品高粱中残留的有机磷农药敌敌畏的量为C＝4.4x10-6μl/L。
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