CN103558196A - 基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法 - Google Patents

基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法 Download PDF

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刘绍琴
果崇申
颜美
郑兆柱
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Abstract

基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，属于纳米生物传感器技术领域。所述方法为：配制带有负电荷的量子点溶液和带有正电荷的聚电解质溶液；将量子点溶液与聚电解质溶液交替打印到基底材料上，得到聚电解质/量子点多层薄膜；在聚电解质/量子点多层薄膜上交替滴加聚电解质和乙酰胆碱酯酶。本发明采用办公用喷墨打印机在基底材料上制备可视化生物芯片并应用于有机农药残留检测，通过控制打印次数，可以获得不同信号强度的量子点多层薄膜，通过控制酶的组装浓度和蛋白质层数还可以进一步改善传感器性能。本发明的制备方法简单、操作容易、重复性好、精度高、检测限低、传感器结构可控、可进行现地快速检测。

Description

基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法
技术领域
本发明属于纳米生物传感器技术领域，涉及一种基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的制备方法。
背景技术
有机磷农药作为杀除农作物生长中害虫的有效方法被广泛地应用于全球的农业生产中，它保证农作物产量的同时也给人类带来很多的麻烦。因此，对残余在农作物中农药的检测十分的重要。目前的检测方法中，气相色谱-质谱联用技术使用最为广泛，其结果准确、灵敏度高，但是设备体积大、需要专业人员操作、样品前处理繁琐、检测时间长、不能进行现地检测和大量样品筛选。同样，其它的一些传感器，如电化学传感器和等离子体传感器，也存在过度依赖仪器设备不能现地快速检测等缺点。新兴的纳米生物芯片技术为解决此类问题提供了契机，利用纳米材料与生物酶复合的光学生物传感器可以摆脱传统技术带来的局限。但此方法现在面临准确性低、应用范围窄、组装步骤繁琐且酶易失活等缺点。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于量子点荧光机制检测有机磷农药残留的可视化生物芯片，用于检测有机磷农药残留量。与传统的传感器相比，本发明样品预处理简单、成本低、灵敏度高、可进行快速现地检测。
本发明利用喷墨打印技术将带正电聚电解质和带负电量子点，通过静电作用，印刷在基底表面，预先制备多层薄膜结构，然后在基底表面继续组装乙酰胆碱酯酶制备可视化生物芯片并用于有机磷农药残留检测，具体步骤如下：
（1）分别配制带有负电荷的量子点溶液和带有正电荷的聚电解质溶液；
（2）将步骤（1）配制的量子点溶液与聚电解质溶液通过普通打印机交替打印到基底材料上，得到聚电解质/量子点多层薄膜；
（3）在聚电解质/量子点多层薄膜上交替滴加蛋白质和聚电解质；
（4）在步骤（3）中所获得的多层薄膜上继续交替滴加聚电解质和乙酰胆碱酯酶。
本发明制备的生物活性多层薄膜中的乙酰胆碱酯酶催化水解底物硫代乙酰胆碱产生乙酸和巯基胆碱，后者可以抑制量子点荧光，导致荧光强度降低和颜色变化。这种变化是巯基胆碱浓度依赖的，点阵颜色和亮度变化裸眼可辨。当接触到农药时，乙酰胆碱酯酶活力被抑制，巯基胆碱的产量变低，点阵颜色和亮度变化程度变小，因此，可以通过点阵颜色变化实现有机磷农药残留分析。
本发明采用办公用喷墨打印机在基底材料上制备可视化生物芯片并应用于有机农药残留检测，通过控制打印次数，可以获得不同信号强度的量子点多层薄膜，通过控制酶的组装浓度和蛋白质层数还可以进一步改善传感器性能。这种可视化生物芯片的制备方法简单、操作容易、重复性好、精度高、检测限低、传感器结构可控、可进行现地快速检测。
如图1~4所示，本发明制备的可视化生物芯片可以通过量子点的亮度变化响应指示有机磷农药的量，结果既可以裸眼直接分辨进行定性分析，也可结合数码照相和图像分析软件对样品进行定量分析，该生物芯片对有机磷农药对氧磷和敌敌畏具有较高的灵敏度，对对氧磷的检测下限为1.45ppb，对敌敌畏的检测下限为0.81ppb，可用于实际果蔬样品的精准检测，相对标准偏差小于16%，农药回收率在95.00~123.20%之间，符合国家对农残检测生物传感器法规定。
附图说明
图1为可视化生物芯片对不同浓度对氧磷的荧光响应；
图2为可视化生物芯片对不同浓度对敌敌畏的荧光响应；
图3为可视化生物芯片百分抑制率与对氧磷浓度曲线；
图4为可视化生物芯片百分抑制率与敌畏浓度曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
实施例1：
（1）去离子水梯度稀释阳离子型聚电解质溶液，终质量浓度0.007～0.35%，0.22 μm滤膜过滤；
（2）离心浓缩新制备量子点溶液，除去溶液中多余的稳定剂和离子；
（3）将普通办公用打印机改装为供墨系统，通过打印机对应的软件设计不同图案，墨盒中注入阳离子型聚电解质溶液和量子点溶液；
（4）在基底材料上交替打印沉积聚电解质和量子点溶液，制备10～100双层的聚电解质/量子点多层薄膜，室温干燥，待测；
（5）然后，在步骤（4）制备的多层薄膜上交替滴加聚电解质和蛋白质溶液，制备0～5个双层的(聚电解质/蛋白质)多层薄膜，最后继续交替滴加的聚电解质和乙酰胆碱酯酶溶液（0.0025～0.5 mg/mL）制备1～5个双层的(聚电解质/乙酰胆碱酯酶)多层薄膜。
本实施例中，所述的量子点为CdTe、CdS或CdSe。
本实施例中，所述阳离子型聚电解质为聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）、聚烯丙基铵盐酸盐(PAH)或聚醚亚酰胺(PEI)。
本实施例中，所述的基底材料可以是滤纸、玻璃板、石英板或硅片。
本实施例中，所述的打印机为普通办公打印机。
实施例2：
本实施例与实施例1不同的是，步骤（5）中，在步骤（4）制备的多层薄膜上交替滴加的聚电解质和乙酰胆碱酯酶溶液（0.0025～0.5 mg/mL）制备1～5个双层的(聚电解质/乙酰胆碱酯酶)多层薄膜。
实施例3：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例4：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印50个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)50(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例5：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.007%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印75个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后整列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE）,继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)75(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例6：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.007%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印100个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE）,继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)100(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例7：
去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积1个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为 滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)1(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例8：
去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积5个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)5(PDDA/AChE)2的生物传感器。
实施例9：
去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积5个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积1个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)5(PDDA/AChE)1的生物传感器。
实施例10：
去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积5个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积5个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)5(PDDA/AChE)5的生物传感器。
实施例11：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25 (PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例12：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积1个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)1的生物传感器。
实施例13：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积5个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)5的生物传感器。
实施例14：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在清洁的玻璃基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为玻璃板/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例15：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在清洁的硅片基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE）,继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为硅片/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例16：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在清洁的石英基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为石英板/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例17：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdSe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdSe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例18：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdS量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdS)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例19：
    去离子水稀释聚烯丙基铵盐酸盐(PAH)溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PAH/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PAH和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PAH和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PAH/CdTe)25(PAHA/BSA)2(PAH/ AChE)2的生物传感器。
实施例20：
    去离子水稀释聚醚亚酰胺(PEI)溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PEI/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PEI和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PEI /BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PEI和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PEI / AChE）双层，获得结构为滤纸/(PEI/CdTe)25(PEI /BSA)2(PEI / AChE)2的生物传感器。
实施例21：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.007%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.007%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.007%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例22：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.35%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.35%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.35%的PDDA和0.25mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例23：
    去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后阵列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.0025mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例24：
去离子水稀释聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐（PDDA）溶液至浓度0.07%，再用0.22 μm滤膜过滤；超滤浓缩新制备CdTe量子点溶液（超滤管截留分子量为30 kDa），除去溶液中多余的稳定剂和离子，最后配制浓度为5x10-4 mol/L量子点溶液；分别将上述两种溶液加入普通办公用喷墨打印机中，然后在丙酮超声处理过的滤纸基底上交替打印25个（PDDA/CdTe）双层，室温干燥(根据所需可打印不同图案，本实例中为点阵)；然后，在打印后整列上交替滴加0.07%的PDDA和0.5mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，沉积2个（PDDA/BSA）双层；最后，继续滴加0.07%的PDDA和0.5 mg/ml乙酰胆碱酯酶（AChE），继续沉积2个（PDDA/ AChE）双层，获得结构为滤纸/(PDDA/CdTe)25(PDDA/BSA)2(PDDA/ AChE)2的生物传感器。
实施例25：
本实例为本发明制备的生物传感器（实施例3制备的传感器）对有机磷农药标准品的可视化和定量分析。
本部分采用巯基乙酰胆碱为底物，对氧磷和敌敌畏为农残标准品，通过目测红色荧光强度考察本发明中生物传感器的可视化性能。同时，配制6个浓度系列的标准系列样品，以浓度由低到高的顺序，按优化的实验条件进行测试（每份样品测试6次）。以测定的百分抑制率（I%）为纵坐标（Y），样品浓度（ppb）为横坐标（X），求得分析样品的线性回归方程、相关系数及线性范围，用于定量分析。
    结果表明（见图1和2），磷农药与生物芯片作用后，随着农药浓度的增加，阵列红色荧光强度明显增强，可以通过裸眼进行定性的分析。同时，农药浓度的增加也使得酶的百分抑制率增加，两种农药在1～5000ppb范围内呈现较好的线性关系。根据标准曲线计算，本发明可视化生物芯片对对氧磷的检测下限为1.45ppb，对敌敌畏的检测下限为0.81ppb，均低于欧洲标准（10ppb）。
实施例26：
    本实例通过应用本发明中可视化生物芯片（实施例3制备的传感器）对实验室自来水和市场上销售的苹果进行了检测，同时也选用业界公认的农残检测方法—气相色谱-质谱法作为评判依据，结果列于表1。市场上购置的苹果切碎后加入PBS溶液超声提取15min，然后过滤、定容，完成样品的前处理。可以看出，本发明中可视化生物检测器对实际样品的精密度和准确性均达到农药残留检测的国家标准，又由于其成本地，样品前处理简单，更适合用于农药残留大规模检测和现场实时检测。
表1 实际样品中农药残留可视化生物芯片法和GC-MS法检测值
Figure 244710DEST_PATH_IMAGE001

Claims (10)

1.基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述方法步骤如下：
（1）分别配制带有负电荷的量子点溶液和带有正电荷的聚电解质溶液；
（2）将步骤（1）配制的量子点溶液与聚电解质溶液通过普通打印机交替打印到基底材料上，得到聚电解质/量子点多层薄膜；
（3）在聚电解质/量子点多层薄膜上交替滴加聚电解质和蛋白质溶液，制备聚电解质/蛋白质多层薄膜，然后在聚电解质/蛋白质多层薄膜上交替滴加聚电解质和乙酰胆碱酯酶，制备聚电解质/乙酰胆碱酯酶多层薄膜。
2.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述聚电解质溶液的配制方法为：去离子水梯度稀释带有正电荷的聚电解质溶液，终质量浓度0.007～0.35%，0.22 μm滤膜过滤。
3.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述量子点溶液在打印之前，需要进行离心浓缩。
4.根据权利要求1或3所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述量子点为CdTe、CdS或CdSe。
5.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述聚电解质为聚二烯丙基二甲基铵盐酸盐、聚烯丙基铵盐酸盐或聚醚亚酰胺。
6.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述基底材料为滤纸、玻璃板、石英板或硅片。
7.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述聚电解质/量子点多层薄膜的层数为10～100个双层。
8.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述聚电解质/蛋白质多层薄膜的层数为0～5个双层。
9.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述聚电解质/乙酰胆碱酯酶多层薄膜的层数为1～5个双层。
10.根据权利要求1所述的基于喷墨打印技术制备有机磷农药检测用可视化生物传感器的方法，其特征在于所述乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.0025～0.5 mg/mL。
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