CN104749151A - 一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用,其中,谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒是由氯金酸溶液和谷胱甘肽溶液制备得到的,其中氯金酸:谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5至1:1之间。利用谷胱甘肽稳定的金纳米簇在加入巯基化合物后荧光的增强特性,通过检测已知浓度的巯基化合物在与谷胱甘肽稳定的金纳米簇作用前后荧光强度的改变,绘制线性的标准曲线图,并采用线性拟合获得校准关系式从而用于检测未知浓度的巯基化合物。
Description
技术领域
本发明涉及巯基化合物检测技术领域,尤其涉及一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用。
背景技术
巯基化合物是维持生理环境的重要抗氧化剂,负责清除组织和细胞内自由基,防止细胞内蛋白分子中自由巯基形成二硫键。巯基化合物如谷胱甘肽等还可以抑制表皮的酪氨酸酶活性,减少黑色素生成,因此在美容医学方面具有较大意义。鉴于其重要的实用价值,准确、迅速定量巯基化合物意义重大。
巯基化合物的检测方法主要包括比色法、质谱法、荧光法等。经典的埃尔曼试剂法属于比色法,该方法利用巯基化合物和二硫二硝基苯甲酸进行反应,然后检测反应溶液在波长412 nm处的吸光度来对巯基化合物进行定量。然而该方法的缺点是一些样品 (尤其血样) 可能有很大背景吸收,会造成检测干扰。荧光法灵敏度高,且易于可视化定量,已成为目前巯基化合物检测的主流方法之一。但是该方法大多数检测试剂是有机小分子,其光漂白问题比较严重,且探针斯托克斯位移较小,可能会导致严重的荧光自猝灭和激发背景干扰。本发明以蛋白质、多肽等天然高分子作为稳定剂设计选择性好、灵敏度高、分析速度快、抗光漂白、生物相容性好的纳米荧光探针能够有效解决上述问题,为发展新型、高效的生物检测技术开辟了广阔的前景。
发明内容
本发明所解决的技术问题是:
提供一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒用于检测巯基化合物,从而解决现有技术中存在的不足。
为了解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:
提供一种谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用,所述谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒是由氯金酸溶液和谷胱甘肽溶液制备得到的,其中氯金酸:谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5至1:1之间,而所述巯基化合物可以是谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸等多种巯基化合物。
此外,所述谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒检测巯基化合物是通过以下步骤完成的:
Ⅰ利用氯金酸溶液与谷胱甘肽水溶液制备谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒,保证氯金酸:谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5至1:1之间;
Ⅱ利用谷胱甘肽稳定的金纳米簇在加入巯基化合物前后荧光的增强特性,通过检测已知浓度的巯基化合物在与谷胱甘肽稳定的金纳米簇作用前后荧光强度的改变,绘制线性的标准曲线图,并采用线性拟合获得校准关系式检测未知浓度的巯基化合物。
本发明的有益效果是:与现有技术相比,本发明的优点如下:
传统的用于检测巯基化合物的荧光探针(通常为有机荧光物质)的制备过程较繁杂、易于发生光漂白,导致荧光自猝灭和激发背景干扰。本发明利用金纳米簇在加入巯基化合物前后荧光的增强特性来检测巯基化合物。该检测方法能够有效解决现有技术中的缺陷,相对于其他巯基化合物的检测方法,具有以下特点:
(1) 操作简单,金纳米簇的制备工作属于简单成熟的技术,无需苛刻的反应设备,检测操作均以计算机进行程序化控制,无需熟练操作人员。
(2) 分析时间短,金纳米簇在加入巯基化合物后作用时间仅需10分钟。可以较快获得所需工作曲线,迅速完成样品检测。
(3) 特异性好。试验表明一旦化合物的巯基发生聚合形成二硫键,则不再表现出增强荧光的特性,因此该方法具有较显著的特异性。
附图说明
图1是荧光增强倍数与待测谷胱甘肽浓度的线性关系曲线图。
图2 是波长为350、370、390、410、430、450、470、490 nm的不同波长激发光激发下的发射光谱图。
图3 谷胱甘肽稳定的金纳米簇(1#)、1#加入谷胱甘肽(2#)和1#加入N-乙酰半胱氨酸(3#)后的基质辅助激光解吸附质谱图。其中:1#样峰1对应的[Au15(SG)6]4-(质荷比 1198.6)结合N-乙酰半胱氨酸转变为3#样峰11 对应的[Au15(SG)6(NAC)4]4(质荷比1361.2);1#样峰2对应的[Au19(SG)20]8-(质荷比1234.3) 结合谷胱甘肽转变为2#样峰9 对应的[Au19(SG)22]8-(质荷比1309.3),结合N-乙酰半胱氨酸转变为3#样峰13对应的[Au19(SG)20(NAC)24]8-(质荷比1719.5);1#样峰5 对应的[Au19(SG)10]4-(质荷比1700.6) 结合N-乙酰半胱氨酸转变为3#样峰14对应的[Au19(SG)10(NAC)4]4-(质荷比1863.3)。上述分子式中,SG代表谷胱甘肽,NAC代表N-乙酰半胱氨酸。
具体实施方式
下面将结合说明书附图,对本发明作进一步的说明。
实施例中采用的氯金酸、谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸和其它试剂购于中国上海国药集团化学试剂有限公司,去离子水由Millipore公司Milli-Q集成纯水系统制造。通过调节0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L NaH2PO4的比例来配制0.1 mol/L pH 7.0磷酸盐缓冲溶液。
实施例1 谷胱甘肽稳定的金纳米簇的制备
25 ℃下,取5 mL浓度为1.0~10.0 mmol/ L的氯金酸水溶液至15 mL塑料离心管中,向该氯金酸溶液中加入5 mL 0.8~10.0 mmol/ L谷胱甘肽水溶液并混合均匀,保证氯金酸:谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5至1:1之间。10~15 min后,待混合物颜色变为无色,调节pH值至 2~3。并置于60~80 oC水浴1~2小时,得深黄色透明溶液。将该溶液冷却至25 ℃,利用0.22 微米滤膜过滤,向滤液中加入同体积的无水乙醇,充分混匀,10000 rpm离心10~20分钟,沉积物干燥后称重,加入5~100 mmol/ L磷酸盐缓冲溶液,超声波(40 W,40 KHz)作用2 min,使沉积物溶于磷酸盐缓冲溶液中,得到浓度为1.0 mg/mL金纳米簇溶液。
实施例2 巯基化合物引发金纳米簇的荧光增强
取0.5 mL实施例1中制备好的谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,用去离子水稀释至1.0 mL,记录350~490 nm的不同波长激发光下,波长范围在500 ~680 nm的荧光光谱。如图2所示波长为350、370、390、410、430、450、470、490 nm的不同波长激发光激发下的发射光谱图,在波长为450 nm的激发光下,谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液具有最强的荧光强度,其发射光峰值位于570 nm处。
取两份0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL去离子水和已知浓度的谷胱甘肽水溶液,各自混匀15分钟后,记录在波长范围350~490 nm的激发光下,波长范围为500 ~680 nm的荧光强度。观察发现谷胱甘肽水溶液可使谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液荧光增强。
实施例3 荧光增强倍数与谷胱甘肽浓度的标准关系曲线的绘制
取10份0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的谷胱甘肽水溶液,依次编注1~10号,各自混匀15分钟后,分别记录1~10号样在波长为450 nm的激发光下,发射光波长570 nm处的荧光强度。计算2~10号样与1号样的荧光强度比值,即荧光增强倍数F。以谷胱甘肽浓度[thiol]为横坐标、荧光增强倍数F为纵坐标,绘制线性的标准曲线图,并采用线性拟合获得校准关系式:F= 1.39+ 1.44×[thiol] (mmol/L),该拟合方程式的线性相关系数 0.996,线性范围在0.1~5.0 mmol/L。
实施例4未知浓度谷胱甘肽的检测
取0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL去离子水和未知浓度的谷胱甘肽样品,各自混匀15分钟后,记录各混合液在波长为450 nm的激发光下,波长570 nm处的荧光强度。计算荧光强度增强倍数,将此倍数代入实施例4中所得校准关系式,即可计算出谷胱甘肽样品的浓度。
实施例5荧光增强倍数与半胱氨酸浓度的标准关系曲线的绘制
取10份0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的半胱氨酸水溶液,依次编注1~10号样,各自混匀15分钟后,分别记录1~10号样在波长为450 nm的激发光下,发射光波长570 nm处的荧光强度。计算2~10号样与1号样的荧光强度比值,即荧光增强倍数F。以半胱氨酸浓度为横坐标、荧光增强倍数F为纵坐标,根据上述数据绘制线性的标准曲线图,并采用线性拟合获得校准关系式
实施例6未知浓度半胱氨酸的检测
取0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL去离子水和未知浓度的半胱氨酸样品,各自混匀15分钟后,记录各混合液在波长为450 nm的激发光下,波长570 nm处的荧光强度。计算荧光强度增强倍数,将此倍数代入实施例5中所得校准关系式,即可计算出半胱氨酸样品的浓度。
实施例7 荧光增强倍数与N-乙酰半胱氨酸浓度的标准关系曲线的绘制
取10份0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL浓度分别为0、0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L的N-乙酰半胱氨酸水溶液,依次编注1~10号样,各自混匀15分钟后,分别记录1~10号样在波长为450 nm的激发光下,发射光波长570 nm处的荧光强度。计算2~10号样与1号样的荧光强度比值,即荧光增强倍数F。以N-乙酰半胱氨酸浓度为横坐标、荧光增强倍数F为纵坐标,根据上述数据绘制线性的标准曲线图,并采用线性拟合获得校准关系式
实施例8 未知浓度N-乙酰半胱氨酸的检测
取0.5 mL上述谷胱甘肽稳定的金纳米簇溶液,分别加入0.5 mL去离子水和未知浓度的N-乙酰半胱氨酸样品,各自混匀15分钟后,记录各混合液在波长为450 nm的激发光下,波长570 nm处的荧光强度。计算荧光强度增强倍数,将此倍数代入实施例7中所得校准关系式,即可计算出N-乙酰半胱氨酸样品的浓度。
本发明中巯基化合物谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸能够引发金纳米簇荧光增强的原因在于,上述述实施例1制备的谷胱甘肽稳定的金纳米簇具有较多表面缺陷,淬灭了荧光的发射;由图3所示质谱数据证实,加入的巯基化合物中的巯基能快速吸附到金纳米簇表面,减少表面缺陷,因而荧光发射得以大幅增强。由于仅有巯基能够快速吸附到金纳米簇表面引发金纳米簇荧光增强,因此谷胱甘肽稳定的金纳米簇可应用于所有巯基化合物的检测。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定 。
Claims (4)
1.一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用。
2.根据权利要求1所述一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用,其特征在于,所述谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒是由氯金酸溶液和谷胱甘肽溶液制备得到的,其中氯金酸:谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5至1:1之间。
3.根据权利要求1所述一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用,其特征在于,所述巯基化合物为谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸。
4.根据权利要求1所述一种基于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒在检测巯基化合物方面的应用,其特征在于谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒检测巯基化合物是通过以下步骤完成的:
Ⅰ利用氯金酸溶液与谷胱甘肽水溶液制备谷胱甘肽稳定的金纳米簇颗粒,保证氯金酸:谷胱甘肽的摩尔比为1:0.5至1:1之间;
Ⅱ利用谷胱甘肽稳定的金纳米簇在加入巯基化合物前后荧光的增强特性,通过检测已知浓度的巯基化合物在与谷胱甘肽稳定的金纳米簇作用前后荧光强度的改变,绘制线性的标准曲线图,并采用线性拟合获得校准关系式检测未知浓度的巯基化合物。
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