CN104101584A - 金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针的应用 - Google Patents
金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针的应用,其中,所述金纳米簇由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。本发明将金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针、在谷胱甘肽检测和癌细胞识别方面的应用,可以有效避免半胱氨酸和同型半胱氨酸等各种常见生物分子对谷胱甘肽检测的影响,方法简单、检测范围宽和灵敏度高。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,特别涉及金纳米簇在谷胱甘肽检测中的应用。
背景技术
谷胱甘肽是重要的抗氧化剂,也是体内含量最多(1–15mM)的小分子巯基分子。它能防止细胞成分被活性氧(ROS)破坏,同时谷胱甘肽参与很多生理过程包括异生物质代谢、细胞内信号传导和基因调控。更重要的是,谷胱甘肽参与调控癌细胞死亡,包括凋亡、坏死和自噬。癌细胞谷胱甘肽含量的提高能够引发癌细胞对化疗药物(例如阿霉素)的抗性。因为谷胱甘肽的重要性,所以需要一种高灵敏、高选择检测谷胱甘肽的方法。
荧光检测法由于其在研究中不会破坏样品、灵敏度高,被人们广泛采用。Yang等设计了一种基于BODIPY(氟化硼二吡咯)分子的荧光探针用来检测谷胱甘肽,并且应用到活细胞中检测(J Am Chem Soc,2012,134,18928)。Yoon等成功合成两种基于青色素的荧光探针检测细胞培养液和活小鼠组织中的谷胱甘肽(J Am Chem Soc,2014,136,5351)。
除了利用有机荧光探针检测谷胱甘肽,量子点和金属纳米簇也被用于谷胱甘肽检测。利用包括谷胱甘肽的生物巯基分子能够使“金纳米簇–汞离子”(Langmuir,2012,28,3945)和“碲化镉/硒化镉量子点–汞离子”(Anal Chem,2009,81,5569)系统荧光恢复,可以检测谷胱甘肽。
然而,以上现有技术检测谷胱甘肽的方法复杂、样品具有毒性、无法有效区分半胱甘酸和同型半胱氨酸对检测谷胱甘肽的干扰等问题。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷,本发明的目的是提供金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针的应用,其中,所述金纳米簇由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。
优选地,所述氯金酸和组氨酸的摩尔比为1:20–1:60。
本发明还提供了金纳米簇在谷胱甘肽含量检测中的应用,其中,所述金纳米簇由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。
优选地,所述氯金酸和组氨酸的摩尔比为1:20–1:60。
所述应用,包括以下步骤:
(1)将样品加入到金纳米簇水溶液中,混匀后室温静置6–48小时;
(2)采用荧光分光光度计测定金纳米簇在414nm激发时的荧光发射光谱,通过与标准回归曲线对比,即得样品谷胱甘肽的浓度。
本发明还提供了一种肿瘤靶向荧光探针,该荧光探针为金纳米簇,其由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。
优选地,所述氯金酸和组氨酸的摩尔比为1:20–1:60。
有益效果:本发明提供了金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针、在谷胱甘肽检测和癌细胞识别方面的应用,可以有效避免半胱氨酸和同型半胱氨酸等各种常见生物分子对谷胱甘肽检测的影响,方法简单、检测范围宽和灵敏度高。此外,由于该金纳米簇具有显著增强的荧光特性,可有效区分正常细胞和癌细胞,尤其对肝癌细胞具有很好的区分效果。相对于现有技术,本发明具有以下突出的优势:
(1)该探针的合成方法简单,仅需要将氯金酸和组氨酸在室温下,即可制得,整个实验过程中没有复杂的有机合成、纯化、分离等步骤,工艺简单。
(2)该探针不含有毒的重金属离子。之前的文献(Langmuir,2012,28,3945;AnalChem,2009,81,5569)报道过,用重金属离子(例如汞离子)将金纳米簇或量子点的荧光淬灭,然后通过重金属离子和谷胱甘肽的高亲和性,恢复其原有荧光,以这种方法来检测谷胱甘肽。但是很多金属离子都是有毒的,并通过富集作用引起疾病,因此本发明方法更加安全。
(3)本发明提供的方法能够特异地、灵敏地检测谷胱甘肽。培养基中的其他常见物质对谷胱甘肽检测造成的影响很小,包括生物巯基分子半胱氨酸、同型半胱氨酸(这两种物质对生物体内谷胱甘肽检测有很大影响),且产生的荧光强度与谷胱甘肽的浓度呈线性关系。
(4)谷胱甘肽能选择性、特异性地增强由氯金酸和组氨酸混合制得的金纳米簇的荧光,本发明利用谷胱甘肽能选择性地增强该金纳米簇荧光强度的原理,该金纳米簇能够有效地区分正常细胞和癌细胞,尤其是谷胱甘肽含量最高的肝癌细胞。
附图说明
图1为金纳米簇制备过程及谷胱甘肽增强金纳米簇荧光的机制示意图;
图2为本发明制得的金纳米簇在加入谷胱甘肽前(A)、加入谷胱甘肽后(C)的透射电子显微镜(TEM)图、加入谷胱甘肽前(B)的粒径分布图、加入谷胱甘肽后(D)的粒径分布图;
图3为加入谷胱甘肽后金纳米簇的紫外-可见吸收光谱图(A);365nm紫外光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的照片图(B);414nm光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的荧光发射光谱图(C);谷胱甘肽浓度与金纳米簇荧光强度(496nm处)的关系图(D);
图4为金纳米簇荧光对生物体内常见小分子和离子的响应;
图5正常肺细胞(ATII)和肺癌细胞(A549)加入金纳米簇前(A&B)和加入100μM的金纳米簇后(C&D)的共聚焦显微镜照片图;
图6正常肝细胞(L02)和肝癌细胞(Hep G2)加入金纳米簇前(A&B)和加入100μM的金纳米簇后(C&D)的共聚焦显微镜照片图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做出进一步说明。
实施例1
该金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:5mL 10mM的氯金酸和15mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应2h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液,其TEM结果见图2(A),粒径分布结果见图2(B)。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:30。
实施例2
该金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:5mL 10mM的氯金酸和10mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应8h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液,其TEM结果与实施例1一致。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:20。
实施例3
该金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:0.25mL 10mM的氯金酸和1.5mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应5h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液,其TEM结果与实施例1一致。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:60。
实施例4
包含谷胱甘肽的金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:
1mL 10mM的氯金酸和3mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应4h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:30。
加入4mL 15mM的谷胱甘肽水溶液,混合后静置12h。其中金/谷胱甘肽的物质的量比为1:6。
其透射电子显微镜结果见图2(C),粒径分布结果见图2(D);
其紫外–可见吸收光谱图见图3(A);
其365nm紫外光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的照片图见图3(B);
其414nm光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的荧光发射光谱图见图3(C)。
实施例5
包含谷胱甘肽的金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:
1mL 10mM的氯金酸和3mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应4h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:30。
加入4mL 30mM的谷胱甘肽水溶液,混合后静置12h。其中金/谷胱甘肽的物质的量比为1:12。
其TEM图、紫外–可见吸收光谱图、365nm紫外光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的照片图、414nm光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的荧光发射光谱图与实施例4一致。
实施例6
包含谷胱甘肽的金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:
1mL 10mM的氯金酸和3mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应4h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:30。
加入4mL 2.5mM的谷胱甘肽水溶液,混合后静置48h。其中金/谷胱甘肽的物质的量比为1:1。
其TEM图、紫外–可见吸收光谱图、365nm紫外光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的照片图、414nm光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的荧光发射光谱图与实施例4一致。
实施例7
包含谷胱甘肽的金纳米簇的制备方法,包括以下步骤:
1mL 10mM的氯金酸和3mL 100mM的组氨酸在常温下避光反应4h,得到具有蓝绿色荧光的金纳米簇溶液。其中氯金酸和组氨酸的物质的量比为1:30。
加入4mL 80mM的谷胱甘肽水溶液,混合后静置6h。其中金/谷胱甘肽的物质的量比为1:32。
其TEM图、紫外–可见吸收光谱图、365nm紫外光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的照片图、414nm光激发下不同比例金/谷胱甘肽的样品的荧光发射光谱图与实施例4一致。
实施例8
制备包含不同比例金/谷胱甘肽的金纳米簇的方法,包括以下步骤:
(1)制备一组混合液:将0.25mL10mM的氯金酸和0.75mL100mM的组氨酸,在常温下避光反应4h;
(2)取5份步骤(1)的混合液,分别加入1mL浓度分别为3.75mM、7.5mM、15mM、30mM和60mM的谷胱甘肽水溶液,摇晃后室温静置12h后,用365nm紫外灯激发,得到如图3(B)的荧光照片图;
(3)取9份步骤(1)的混合液稀释25倍,取稀释后的混合液1mL,分别加入1mL不同浓度的谷胱甘肽水溶液(其中,谷胱甘肽含量依次为0,50,100,150,200,300,600,1200和2400μM),摇晃后静置12h;用荧光分光光度计测定这些样品的荧光发射光谱图,激发波长为414nm,结果见图3(C)。图3(D)为按照图3(C)方法制得的包含不同谷胱甘肽浓度的金纳米簇样品在496nm处的相对荧光发射光谱强度变化值。
标准曲线:
谷胱甘肽为50–150μM时,拟合直线为:
ΔI/I0=-3.66+0.0732×[谷胱甘肽](R2=0.9945);
其检测限为4.1μM(信噪比为3);
谷胱甘肽为150–1200μM时,拟合直线为:
ΔI/I0=2.17+0.0301×[谷胱甘肽](R2=0.9982);
其检测限为10.0μM。
其中,[谷胱甘肽]表示谷胱甘肽的浓度,单位为μM。
实施例9
分别将1mL 100μM金纳米簇与1mL 1200μM谷氨酸、甘氨酸、同型半胱氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、二硫苏糖醇、葡萄糖、钾离子、钠离子、钙离子和谷胱甘肽混合,常温避光孵育12h。
测量它们用414nm激发下、496nm发射处的荧光光谱,结果见图4。结果显示,谷氨酸、甘氨酸、同型半胱氨酸、色氨酸、精氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、二硫苏糖醇、葡萄糖、钾离子、钠离子、钙离子对金纳米簇的荧光强度影响不大,而谷胱甘肽能够大大增强金纳米簇的荧光强度。
实施例10
分别将100μM的金纳米簇与正常肺细胞ATII和肺癌细胞A549共同孵育24h。
图5分别显示了:共聚焦显微镜观察ATII细胞未加入金纳米簇(A)、ATII细胞加入金纳米簇(C)和A549细胞未加入金纳米簇(B)、A549细胞加入金纳米簇(D)的结果。
结果显示:该金纳米簇能够作为肿瘤靶向荧光探针。
因为癌细胞中的谷胱甘肽含量一般远高于正常细胞中的含量。因此,常见癌细胞(如肺癌细胞和肝癌细胞),均可在405nm激发的共聚焦显微镜观察中出现绿色荧光亮点。尤其是肝癌细胞,由于其谷胱甘肽含量比其他类型细胞高很多,因此绿色荧光亮点出现最多,成像效果最好。
实施例11
将分别将100μM的金纳米簇与正常肝细胞L02和肝癌细胞Hep G2共同孵育24h。
图6分别显示了:共聚焦显微镜观察L02细胞未加入金纳米簇(A)、L02细胞加入金纳米簇(C)和Hep G2细胞未加入金纳米簇(B)、Hep G2细胞加入金纳米簇(D)的结果。
结果显示:该金纳米簇能够作为肿瘤靶向荧光探针。
Claims (7)
1.金纳米簇作为谷胱甘肽荧光探针的应用,其特征在于:所述金纳米簇由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于:所述氯金酸和组氨酸的摩尔比为1:20–1:60。
3.金纳米簇在谷胱甘肽含量检测中的应用,其特征在于:所述金纳米簇由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于:所述氯金酸和组氨酸的摩尔比为1:20–1:60。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将样品加入到金纳米簇水溶液中,混匀后室温静置6–48小时;
(2)采用荧光分光光度计测定金纳米簇在414nm激发时的荧光发射光谱,通过与标准回归曲线对比,即得样品谷胱甘肽的浓度。
6.一种肿瘤靶向荧光探针,其特征在于:该荧光探针为金纳米簇,其由以下方法制成:氯金酸和组氨酸在常温下避光反应2–8h,即得金纳米簇。
7.根据权利要求6所述的肿瘤靶向荧光探针,其特征在于:所述氯金酸和组氨酸的摩尔比为1:20–1:60。
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