CN104972135A - 近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法及对糖蛋白的检测方法。它通过“一锅法”合成近红外荧光铜纳米簇，进而用间氨基苯硼酸对已合成的铜纳米簇进行功能化改造，得到能化的铜纳米簇。由于间氨基苯硼酸上的硼酸基团与糖蛋白中顺式二醇的特异性作用，猝灭铜纳米簇荧光强度，该荧光探针能够实现高特异性、高灵敏检测糖蛋白。糖蛋白广泛存在于粘液、血浆、细胞质及细胞膜中，与生物机体有着密切的联系，是一类重要生理活性物质,而且糖蛋白与某些遗传疾病密切相关，所以检测糖蛋白是具有很重要的实际意义的。

Description

近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法及其应用

本专利受到国家自然科学基金面上项目21375095、全国优秀博士学位论文作者专项资助资金FANEDD-201023、天津市应用基础研究计划重点项目12JCZDJC21700和天津市“131”创新型人才培养工程第一层次项目ZX110185的资助。

技术领域

本发明属于生物分析检测技术领域，涉及一种近红外荧光探针铜纳米簇的“绿色”合成方法和对其功能化以及功能化后的铜纳米簇对糖蛋白检测的应用。

背景技术

金属纳米簇是光致发光的半导体纳米团簇，主要有金纳米簇，银纳米簇，铂纳米簇及铜纳米簇等。金属纳米团簇是由Au、Ag、Pt等金属的几个至几十个原子组成的具荧光、水溶性的分子级聚集体。相比金纳米簇，银纳米簇和铂纳米簇，铜纳米簇具有资源丰富，成本低廉，可广泛应用于企业等优点。铜纳米簇的直径在～2 nm左右，自铜纳米簇被发现以来，由于其具有独特的荧光性质，无毒性，尺寸较小且均匀，水溶性好现已广泛应用于检测各种负离子、重金属离子和生物小分子。然而，铜纳米簇在分析检测糖蛋白方便得到关注较少。

糖蛋白，由寡糖链与肽链中的一定氨基酸残基以糖苷键共价连接而成的一类重要的生理活性物质，存在于粘液、血浆、细胞膜及细胞间质中。糖蛋白有着各种功能，尤其在生物体系中更为重要。糖蛋白的功能不仅仅是作为细胞外基质的结构成分起支持、连接及缓冲作用，更重要的是参与细胞的识别、粘着及迁移，物质转运，信息传递，神经传导，并调控细胞的增殖及分化。而且糖蛋白与很多疾病如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病、糖尿病以及某些遗传性疾病等的发生、发展有关。再者，肿瘤细胞表面的糖蛋白可整个地或部分地脱落，进入血循环，可以作为异常的标志为临床诊断提供信息，因此可用于临床诊断及病情监测。因此，对于糖蛋白的研究具有十分重要的生物学意义和临床应用价值，目前已成为蛋白质组学研究的活跃领域。

目前选择性分离富集糖蛋白的方法主要有凝集素亲和技术、肼腙化学反应法、硼酸亲和色谱、亲水作用法、免疫亲和色谱法、体积排阻法等。这些方法存在检测时间长、检测过程复杂、仪器昂贵等不足，本发明利用具有独特的光学性质的功能化后的铜纳米簇和糖蛋白中硼酸基团之间的亲合作用，检测体系中的糖蛋白，可通过反应体系荧光光谱变化实现对糖蛋白的快速灵敏检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水溶的、无毒性的、荧光寿命长的、易储存的、近红外的荧光铜纳米簇合成方法且在室温下利用荧光强度变化对溶液中糖蛋白的操作简单、反应快速、成本低廉、高灵敏度和高选择性的检测方法。

为实现上述目的，本发明公开了一种“一锅法”绿色合成近红外荧光铜纳米簇（APBA-Cu NCs）的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）铜纳米簇的制备：称取60-160 mg牛血清蛋白（BSA）溶解于装有10 mL高纯水的烧杯中，用移液枪取250 μL氯化铜溶液（0.1 M）注入溶液中，室温搅拌；此时溶液呈现白色水凝胶的状态，是由于铜离子和牛血清蛋白（BSA）上的–NH,–OH,和–SH基团间的配位。待体系反应20-30 min，用移液枪移取0.2-1.5 mL水合肼（80 %）慢慢注射到反应体系中，快速补水至40mL,再在室温搅拌5 h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成。

（2）纯化：用透析袋（截留分子量6000-8000，直径25 mm）对制得铜纳米簇进行纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35 ℃干燥，得到在330 nm光的激发下，发射在620 nm近红外区域的荧光铜纳米簇。

（3）功能化：

①将真空干燥得到的铜纳米簇溶于40 mL高纯水中（浓度为1 mg/mL）；

②称取10-30 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和5-15 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于5 mL高纯水中，待溶解后，向溶液中加入10-30 mg 间氨基苯硼酸（APBA），室温搅拌1 h，活化间氨基苯硼酸上的氨基；

③加入向活化体系加入3-8 mL铜纳米簇（1 mg/mL），室温下搅拌4 h；

④待体系反应结束，将溶液在室温下5000 rpm离心，除去未反应的间氨基苯硼酸；

⑤上清液放入透析袋中透析,每4 h换一次高纯水，透析24 h，得到间氨基苯硼酸功能化的铜纳米簇（APBA-Cu NCs）。

本发明进一步公开了近红外荧光探针铜纳米簇合成方法及其检测溶液中糖蛋白方面的应用。实验结果显示：

（1）本发明所提供的检测方法有较宽的检测范围和较低的检出限。

（2）本发明利用铜纳米簇检测卵清蛋白过程简单，易于操作。

（3）本发明采用荧光检测，非常直观，非常方便，有利于今后的推广。

本发明更进一步公开了采用近红外荧光探针铜纳米簇合成方法及其对溶液中糖蛋白进行检测的方法：

（1）0.1 mol/L，25 ℃ ， pH= 7.4 PBS缓冲溶液的配置：

0.2 mol/L Na₂HPO₄溶液 称取0.716 g Na₂HPO₄·12H₂O溶于10 mL高纯水中；

0.2 mol/L NaH₂PO₄溶液 称取0.312 g NaH₂PO₄·2H₂O溶于10 mL高纯水中；

取1.9 mL NaH₂PO₄溶液和8.1 mL Na₂HPO₄溶液，定容到20 mL（0.02 mol/L），保存于冰箱中，用时稀释至0.01 mol/L；

（2）一系列浓度OB（卵清蛋白）溶液配置：

2.0 μmol·L^-1 OB溶液：称取0.0009 g卵清蛋白溶于高纯水中，定容10.0mL；

以2.0 μmol·L^-1 OB溶液稀释配制10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM、100 nM、110 nM、120 nM、130 nM、140 nM、150 nM、160 nM、170 nM的OB溶液；

（3）铜簇检测卵清蛋白：移取0.01 mol/L PBS溶液3.9 mL，加入50-100 μL功能化后的铜纳米簇，再加入20 μL卵清蛋白，用荧光光度计检测荧光强度，根据其荧光强度的变化检测卵清蛋白的量。

（1）称取60-160 mg 牛血清蛋白（BSA）溶解于装有10 mL高纯水的烧杯中，用移液枪取0.25 mL氯化铜溶液（0.1 mol/L）注入溶液中，室温搅拌30 min。由于铜离子和牛血清蛋白上的–NH, –OH, 和 –SH基团间的配位，溶液呈现白色水凝胶的状态。

（2）待体系反应30 min，用移液枪吸取0.2-1.5 mL水合肼（N₂H₄·2H₂O）（wt=80%）慢慢注射到反应体系中，快速补水至40 mL,再在室温搅拌5 h。待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。用透析

本发明的优点和积极效果：

（1）本发明公开了一种用水合肼作还原剂的铜纳米簇制备方法，此制备方法制得的铜纳米簇具有良好水溶性好、无毒性、尺寸较小且均匀，在水溶液中且较为稳定。

（2）本发明所提供的制备方法制备的铜纳米簇制备具有良好的生物相容性，形成一种近红外荧光探针。

（3）本发明合成出的铜纳米簇可以发展成为一种指示生物体系糖蛋白的近红外荧光探针。并将其应用于实际样品中，根据铜纳米簇的荧光强度检测出样品中的糖蛋白含量。

（4）本发明利用间氨基苯硼酸与糖蛋白上的顺式二醇的亲和作用，在室温下对溶液中的糖蛋白简单、快速、经济、灵敏和高选择性的检测方法。用于检测糖蛋白的线性范围为5-170 nM，检出限为2.0 nM。

附图说明：

图1为功能化后铜纳米簇的TEM图，说明铜纳米簇已经成功被合成；

图2为铜纳米簇及功能化后铜纳米簇的FTIR图，说明铜纳米簇已经成功接上间氨基苯硼酸；

图3为铜纳米簇及功能化后铜纳米簇的紫外吸收图，说明铜纳米簇已经成功接上间氨基苯硼酸；

图4为功能化后铜纳米簇的荧光谱图；

图5为功能化铜纳米簇检测卵清蛋白的线性范围图，说明了在卵清蛋白浓度为10-170 nM范围内，反应体系中卵清蛋白的浓度与荧光光谱强度呈线性关系。

具体实施方式

通过下面结合附图对其示例性实施例进行的描述，本发明上述特征和优点将会变得更加清晰和容易理解。下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明。

本发明所述的高纯水购买于天津师范大学水资源与水环境重点实验室（对外有售），所述的透析袋（截留分子量6000-8000，直径25 mm）购买于北京普博生物科技有限公司，牛血清蛋白（BSA）购买于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，间氨基苯硼酸（APBA）购买于北京百灵威有限公司,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购买于上海晶纯生化科技股份有限公司（阿拉丁），卵清蛋白（OB）购买于天津市韵尼科技有限公司，其他无机试剂均购买于天津市科威有限公司。

试剂名称的英文缩写

 实施例1

铜纳米簇的合成

称取60 mg牛血清蛋白溶于呈有10 mL高纯水的烧杯中，待溶解后，移取0.25 mL CuCl₂溶液(0.1 mol/L)加入到反应体系中。溶液呈现乳白色水凝胶状态，室温下，搅拌30 min。移取0.5 mL水合肼（pH=8），缓慢注射到反应容器中，继续室温搅拌5 h。溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。将合成好的铜纳米簇移到与处理好的透析袋中纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。纯化完成后，35 ℃真空干燥，得到铜纳米簇，检测其荧光强度。

实施例2

铜纳米簇的合成

称取100 mg牛血清蛋白溶于呈有10 mL高纯水的烧杯中，待溶解后，移取0.25 mL CuCl₂溶液(0.1 mol/L)加入到反应体系中。溶液呈现乳白色水凝胶状态，室温下，搅拌30 min。移取0.5 mL水合肼（pH=8），缓慢注射到反应容器中，继续室温搅拌5 h。溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。将合成好的铜纳米簇移到与处理好的透析袋中纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。纯化完成后，35 ℃真空干燥，得到铜纳米簇，检测其荧光强度。

实施例3

铜纳米簇的合成

称取160 mg牛血清蛋白溶于呈有10 mL高纯水的烧杯中，待溶解后，移取0.25 mL CuCl₂溶液(0.1 mol/L)加入到反应体系中。溶液呈现乳白色水凝胶状态，室温下，搅拌30 min。移取0.5 mL水合肼（pH=8），缓慢注射到反应容器中，继续室温搅拌5 h。溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。将合成好的铜纳米簇移到与处理好的透析袋中纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。纯化完成后，35 ℃真空干燥，得到铜纳米簇，检测其荧光强度。制得的铜纳米簇荧光强度最高。

实施例4

铜纳米簇的合成

称取100 mg牛血清蛋白溶于呈有10 mL高纯水的烧杯中，待溶解后，移取0.25 mL CuCl₂ 溶液(0.1 mol/L)加入到反应体系中。溶液呈现乳白色水凝胶状态，室温下，搅拌30 min。移取0.2 mL水合肼（pH=8），缓慢注射到反应容器中，继续室温搅拌5 h。溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。将合成好的铜纳米簇移到与处理好的透析袋中纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。纯化完成后，35 ℃真空干燥，得到铜纳米簇，检测其荧光强度。

实施例5

铜纳米簇的合成

称取100 mg牛血清蛋白溶于呈有10 mL高纯水的烧杯中，待溶解后，移取0.25 mL CuCl₂溶液(0.1 mol/L)加入到反应体系中。溶液呈现乳白色水凝胶状态，室温下，搅拌30 min。移取0.5 mL水合肼（pH=8），缓慢注射到反应容器中，继续室温搅拌5 h。溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。将合成好的铜纳米簇移到与处理好的透析袋中纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。纯化完成后，35 ℃真空干燥，得到铜纳米簇，检测其荧光强度。

实施例6

称取100 mg牛血清蛋白溶于呈有10 mL高纯水的烧杯中，待溶解后，移取0.25 mL CuCl₂溶液(0.1 mol/L)加入到反应体系中。溶液呈现乳白色水凝胶状态，室温下，搅拌30 min。移取1.5 mL水合肼（pH=8），缓慢注射到反应容器中，继续室温搅拌5 h。溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇生成。将合成好的铜纳米簇移到与处理好的透析袋中纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。纯化完成后，35 ℃真空干燥，得到铜纳米簇，检测其荧光强度。

实施例7

功能化

称取10 mg EDC和5 mg NHS溶于反应容器中，待溶解完全加入10 mg APBA，溶液呈现无色透明状态开始搅拌，室温搅拌1 h，活化APBA上的氨基。体系反应1 h后，加入已优化荧光强度最高的铜纳米簇5 mL，继续室温搅拌3 h。得到的溶液5000 rpm离心10 min，除去未反应的间氨基苯硼酸。将功能化的铜纳米簇透析纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。此方法得到的功能化的铜簇荧光强度较高。

实施例8

功能化

称取20 mg EDC和10 mg NHS溶于反应容器中，待溶解完全加入20 mg APBA，溶液呈现无色透明状态开始搅拌，室温搅拌1 h，活化APBA上的氨基。体系反应1 h后，加入已优化荧光强度最高的铜纳米簇5 mL，继续室温搅拌3 h。得到的溶液5000 rpm离心10 min，除去未反应的间氨基苯硼酸。将功能化的铜纳米簇透析纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。

实施例9

功能化

称取30 mg EDC和15 mg NHS溶于反应容器中，待溶解完全加入30 mg APBA，溶液呈现无色透明状态开始搅拌，室温搅拌1 h，活化APBA上的氨基。体系反应1 h后，加入已优化荧光强度最高的铜纳米簇5 mL，继续室温搅拌3 h。得到的溶液5000 rpm离心10 min，除去未反应的间氨基苯硼酸。将功能化的铜纳米簇透析纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。此方法得到的功能化的铜簇荧光强度较高。

实施例10

功能化

称取10 mg APBA溶于反应容器中，待溶解完全加入10 mg EDC和5 mg NHS，溶液呈现无色透明状态开始搅拌，室温搅拌1 h，活化APBA上的氨基。体系反应1 h后，加入已优化荧光强度最高的铜纳米簇5 mL，继续室温搅拌3 h。得到的溶液5000 rpm离心10 min，除去未反应的间氨基苯硼酸。将功能化的铜纳米簇透析纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。

实施例11

功能化

称取20 mg APBA溶于反应容器中，待溶解完全加入20 mg EDC和10 mg NHS，溶液呈现无色透明状态开始搅拌，室温搅拌1 h，活化APBA上的氨基。体系反应1 h后，加入已优化荧光强度最高的铜纳米簇5 mL，继续室温搅拌3 h。得到的溶液5000 rpm离心10 min，除去未反应的间氨基苯硼酸。将功能化的铜纳米簇透析纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。

实施例12

功能化

称取30 mg APBA溶于反应容器中，待溶解完全加入30 mg EDC和15 mg NHS，溶液呈现无色透明状态开始搅拌，室温搅拌1 h，活化APBA上的氨基。体系反应1 h后，加入已优化荧光强度最高的铜纳米簇5 mL，继续室温搅拌3 h。得到的溶液5000 rpm离心10 min，除去未反应的间氨基苯硼酸。将功能化的铜纳米簇透析纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h。

实施例13

将APBA功能化的近红外的铜纳米簇荧光探针材料，定容0.5 mg/mL的溶液，用于检测OB，其方法如下：

（1）0.1 mol/L，25 ℃ ， pH= 7.4 PBS缓冲溶液的配置：

0.2 mol/L Na₂HPO₄溶液 称取0.716 g Na₂HPO₄·12H₂O溶于10 mL高纯水中；

0.2 mol/L NaH₂PO₄溶液 称取0.312g NaH₂PO₄·2H₂O溶于10 mL高纯水中；

取1.9 mL NaH₂PO₄溶液和8.1 mL Na₂HPO₄溶液，定容到20 mL（0.02 mol/L），保存于冰箱中，用时稀释至0.01 mol/L。

（2）一系列浓度OB溶液配置：

2.0 μmol·L^-1 OB溶液：称取0.0009 g卵清蛋白溶于高纯水中，定容10.0 mL；

以2.0 μmol·L^-1 OB溶液稀释配制10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM、100 nM、110 nM、120 nM、130 nM、140 nM、150 nM、160 nM、170 nM的OB溶液。

（3）铜簇检测卵清蛋白OB：移取0.01 mol/L PBS溶液3.9 mL，加入80 μL功能化后的铜纳米簇，再加入20 μL卵清蛋白(OB)，用荧光光度计检测荧光强度，根据其荧光强度的变化检测卵清蛋白的量。

本方法的分析特征量如表1，说明了本方法有较宽的检测范围和较低的检出限：

 

实施例14

检测实际样品

（1）将APBA功能化的近红外的铜纳米簇荧光探针材料，定容0.5 mg/mL的溶液，用于检测实际样品，其方法如下：

0.1 mol/L，25 ℃ ， pH= 7.4 PBS缓冲溶液的配置：

0.2 mol/L Na₂HPO₄溶液 称取0.716 g Na₂HPO₄·12H₂O溶于10 mL高纯水中；

0.2 mol/L NaH₂PO₄溶液 称取0.312 g NaH₂PO₄·2H₂O溶于10 mL高纯水中；

取1.9 mL NaH₂PO₄溶液和8.1 mL Na₂HPO₄溶液，定容到20 mL（0.02 mol/L），保存于冰箱中，用时稀释至0.01 mol/L。

（2）实际样品预处理

本实验所用的人体尿液样品均由身体健康的志愿者提供，所用的样品稀释100倍后备用，没有经过其他的方法进行处理。

（3）铜簇检测实际样品：移取0.01 mol/L PBS溶液3.9 mL，加入80μL功能化后的铜纳米簇，再加入20 μL，用荧光光度计检测荧光强度，根据其荧光强度的变化检测实际样品中卵清蛋白的量：

结论：说明了本方法可以用于实际样品中卵清蛋白的高选择性检测。

实施例15

比较试验：

 

Claims (3)

1.近红外荧光探针铜纳米簇的合成方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）铜纳米簇的制备：称取60-160 mg牛血清蛋白溶解于装有10 mL高纯水的烧杯中，用移液枪取250 μL氯化铜溶液（0.1 M）注入溶液中，室温搅拌；待体系反应30 min，用移液枪移取0.2-1.5 mL 80 %水合肼（w/w）慢慢注射到反应体系中，快速补水至40mL,再在室温搅拌5 h，待溶液呈现淡黄色，说明铜纳米簇的生成；

（2）纯化：用截留分子量6000-8000，直径25 mm透析袋对制得铜纳米簇进行纯化，每4 h换一次高纯水，透析24 h，待透析完成后将纯化的铜纳米簇真空35℃干燥，得到在330 nm光的激发下，发射在620 nm近红外区域的荧光铜纳米簇；

（3）功能化：

①将真空干燥得到的铜纳米簇溶于40 mL高纯水中（浓度为1 mg/mL）；

②称取10-30 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和5-15 mg N-羟基琥珀酰亚胺溶于5 mL高纯水中，待溶解后，向溶液中加入10-30 mg 间氨基苯硼酸，室温搅拌1 h，活化间氨基苯硼酸上的氨基；

③向活化体系加入3-8 mL铜纳米簇（1 mg/mL），室温下搅拌4 h；

④待体系反应结束，将溶液在室温下5000 rpm离心，除去未反应的间氨基苯硼酸；

⑤上清液放入透析袋中透析,每4 h换一次高纯水，透析24 h，得到间氨基苯硼酸功能化的铜纳米簇。

2.权利要求1所述近红外荧光探针铜纳米簇合成方法在制备检测溶液中糖蛋白方面的应用。

3.权利要求2所述的应用，其中对溶液中糖蛋白进行检测的方法如下：

（1）0.1 mol/L，25 ℃ ，pH= 7.4 PBS缓冲溶液的配置：

0.2 mol/L Na₂HPO₄溶液 称取0.716 g Na₂HPO₄·12H₂O溶于10 mL高纯水中；

0.2 mol/L NaH₂PO₄溶液 称取0.312 g NaH₂PO₄·2H₂O溶于10 mL高纯水中；

取1.9 mL NaH₂PO₄溶液和8.1 mL Na₂HPO₄溶液，定容到20 mL（0.02 mol/L），保存于冰箱中，用时稀释至0.01 mol/L；

（2）一系列浓度OB溶液配置：

2.0 μmol·L^-1 OB溶液：称取0.0009 g卵清蛋白溶于高纯水中，定容10.0mL；

以2.0 μmol·L^-1 OB溶液稀释配制10 nM、20 nM、30 nM、40 nM、50 nM、60 nM、70 nM、80 nM、90 nM、100 nM、110 nM、120 nM、130 nM、140 nM、150 nM、160 nM、170 nM的OB溶液；

（3）铜簇检测卵清蛋白：移取0.01 mol/L PBS溶液3.9 mL，加入50-100 μL功能化后的铜纳米簇，再加入20 μL卵清蛋白，用荧光光度计检测荧光强度，根据其荧光强度的变化检测卵清蛋白的量。