CN115165833A - 基于点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，属于化学分析检测领域。先将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板修饰了荧光基团的长链核酸溶解在纯水中配制成核酸混合溶液；向混合溶液中加入测试样品、抗坏血酸、水和Tris‑HCl缓冲溶液，形成反应体系；再向反应体系中加入水、氧化石墨烯和Tris‑HCl缓冲溶液，形成检测体系，对检测体系的荧光强度进行检测；以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，再根据测试样品对应的荧光强度计算得出其中铜离子的浓度。本发明的检测方法稳定性好、灵敏度高、抗干扰能力强，在0~900 nM范围内有很好的响应关系，检测限低至0.25 nM。

Description

基于点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法

技术领域

本发明涉及检测技术和分析化学技术领域，具体为一种基于点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法。

背景技术

铜是生物体所必需微量元素之一，在人体必要营养成分中占据着重要地位。它不仅是某些酶的组成成分或者激活剂，而且具备辅助造血的功能以及可以参与合成黑色素和某些胶原物质，与血液、骨骼、生殖系统的发育密切相关。因此，当体内缺乏铜元素时，会导致人体内某些重要的酶活性降低，从而使得骨骼生成障碍，造成骨质疏松，缺铜还会导致白癜风、白化病、脱发、贫血症、心血管损伤等症状。然而，铜是重金属离子，当体内铜过多时，会产生一些铜中毒症状，比如黄疸、溶血性贫血、肝组织坏死等症状。因此，与人体健康相关的环境水中铜离子检测或人体内铜离子的检测具有重要意义。

铜离子的检测方法有很多，其中最常见的方法有沉淀法、配位滴定法、原子吸收法、比色法、荧光法等。沉淀法应用广泛，但是需样量大、灵敏度低；配位滴定法是针对稳定性差、反应物复杂的混合体，但灵敏度低；原子吸收法具有灵敏度高、选择性强、抗干扰能力强等特点，但其设备复杂；比色法灵敏度不高，多与光学仪器配合使用；而荧光法由于具有较高的灵敏度、很好的选择性、制备方法简单价格低廉以及样品量少等优点，一直是学者们研究的热点，并已被广泛应用于铜离子的检测。

石墨烯是由安德烈·海姆等人于2004年首次制备得到的，它是由一层密集的、处于蜂巢晶体点阵上的碳原子以sp2杂化连接形成的单原子层二维原子晶体。氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）由于拥有丰富的氧官能团（包括端口上的羧基和环氧基）在表面之间的水溶液和其他溶剂中表现出巨大的分散性和溶解性，能有效猝灭荧光基团，在分析方法的构建中作为荧光猝灭剂而被广泛应用。氧化石墨烯因其具有良好的的吸附能力和猝灭效果，该试剂在荧光传感方面有着巨大的应用前景，尤其是氧化石墨烯对单链DNA具有较强的吸附性能力，而对双链吸附能力较弱。

点击化学(Click Chemistry)是在2001年由化学家K.B. Sharpless引入的一个通过小单元拼接，来快速可靠地完成化学合成的一种合成概念，这类反应具有产率高、副产物无害、原料试剂易得、合成反应快速等优点，对化学合成、药物开发、生物医用材料等诸多方面得到广泛的应用。最为经典的代表反应就是铜催化的叠氮炔基环加成反应(Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloadddition)。铜催化的点击化学反应在化学生物传感器方面也具有极大的应用前景，对于微量、超微量化学分析实验而言，仅仅只需要少量的铜离子作为催化剂，叠氮炔环加成反应就可以进行，且作为反应的催化剂，其特异性和灵敏度优势是利用该反应设计实验方案的一大亮点。而现实中铜离子往往是以Ⅱ价铜形式存在，利用抗坏血酸、半腕氨酸，蛋白质等物质都可以还原变成开启点击化学反应的钥匙。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术基于点击化学荧光检测铜离子的方法需要加入重金属或有毒染料等物质，且检测步骤繁琐灵敏度低的问题，而提供一种基于点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法。

为达到上述目的，采用的技术方案为：

一种基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，该方法包括：

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团的核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；

步骤二：将步骤一配制的三种核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入测试样品、抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成反应体系，反应一定时间，测试样品包含已知浓度铜离子的试剂；

步骤三：向步骤二的反应体系中加入水、氧化石墨烯、Tris-HCl缓冲溶液，升温后对检测体系的荧光强度进行检测；

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，对应的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到铜离子浓度和荧光强度之间的线性关系方程，然后根据测试样品的荧光强度，计算得出对应的测试样品中铜离子的浓度；

所述作为连接模板的核酸选用标记有荧光基团的核酸链。

优选的是，所述反应体系中的核酸包括两条短单链和作为模板的一条长单链，其中短链的融解温度（Tm值）低于长链的Tm值。

优选的是，所述步骤二中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸的浓度比例为（1~6）：（1~6）：1。

优选的是，所述步骤二的反应体系中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸的终浓度相同，都为10 nM~80 nM；作为连接模板的修饰了荧光基团的核酸的终浓度为5 nM~30 nM。

优选的是，所述步骤二的反应体系中，抗坏血酸的浓度为100~1000 μM；所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10 mM~60 mM，pH 6.6~8.2。

优选的是，所述步骤二形成反应体系的反应时间为20 min~5 h。

优选的是，所述步骤三的氧化石墨烯为荧光猝灭剂，其用量为2 μL 0.5 mg/mL~20μL0.5 mg/mL。

优选的是，所述步骤二形成反应体系的反应温度为10-40 ℃，所述步骤三的检测温度为20-50 ℃，其中检测温度高于反应温度。

优选的是，所述的步骤三的检测时间为10-50 min。

本发明提供一种基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，该方法先将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；然后将核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液混合，配制成混合溶液，向混合溶液中加入测试样品、抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成反应体系；在适宜的温度下反应一段时间后，向反应体系中加入水、氧化石墨烯和Tris-HCl缓冲溶液，形成检测体系，升高温度，对检测体系的荧光强度进行检测；以已知铜离子浓度为横坐标，相对的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到铜离子浓度和荧光强度之间的线性关系方程，然后根据测试样品的荧光强度，计算得出对应的测试样品中铜离子的浓度。和现有技术相对比，本发明利用点击化学来连接核酸的反应和氧化石墨烯的猝灭作用，反应条件温和、抗干扰能力强、稳定性好、灵敏度高；本发明所用材料试剂均为市售，成本低、性质稳定，不需要复杂繁琐的制备过程和预处理过程，只需要简单的溶液混合和溶液的温育过程，操作简便、采用的是标记了广泛应用的荧光基团的DNA长单链，生物适应性强，基本无毒害，检测过程简单；同时，本发明采用的是荧光增强模式，能大大降低出现假阳性信号的可能性；本发明的检测方法稳定性好、灵敏度高，在0~900 nM范围内有很好的线性响应，检测限低至0.25 nM。

附图说明

图1为本发明实施例1中的反应体系随反应时间变化的荧光光谱图。

图2为本发明实施例1中的反应体系中不同情况下检测的荧光光谱图和365 nm紫外光照射图片。

图3为本发明实施例2中加入不同浓度的铜离子的响应曲线。

图4为本发明实施例3的铜离子检测方法的特异性考察图。

具体实施方式

下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，该方法包括：

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团的核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液，所述作为连接模板的核酸选用标记有荧光基团的核酸链。

步骤二：将步骤一配制的三种核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入测试样品、抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成反应体系，反应一定的时间，测试样品包含已知浓度铜离子的试剂。

步骤三：向步骤二的反应体系中加入水、氧化石墨烯、Tris-HCl缓冲溶液，升温后对检测体系的荧光强度进行检测。

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，对应的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到铜离子浓度和荧光强度之间的线性关系方程，然后根据测试样品的荧光强度，计算得出对应的测试样品中铜离子的浓度。

按照本发明，所述的修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸没有特殊限制，只要是具有修饰了叠氮基团和炔基基团的短的单链核酸的序列结构都能实现本发明，所述的两条短单链，Tm值在10-40 ℃：修饰了叠氮基团的短的单链核酸优选如SEQ ID No:1(5’-GAT CTA AAT TCC AA-叠氮-3’)、SEQ ID No:2（5’-叠氮- TGG CAACAG C-3’）、SEQ ID No:3（5'-GAC GGG AAC T-叠氮-3'）、SEQ ID No:4（5'-叠氮-T ACA AGACAC GG-3'）所示的核苷酸序列；所述的修饰了炔基基团的短的单链核酸优选如SEQ ID No:5(5’-炔基-CAA ACT GAT AG-3’)、SEQ ID No:6（5’-GGG AGC TAG AG –炔基-3’）、SEQ IDNo:7（5'-炔基-ACA AGA CAC G-3'）、SEQ ID No:8（5'-CTG ACG GGA AG-炔基-3'）所示的核苷酸序列。所述作为连接模板的核酸包括一条长单链，Tm值在20-50 ℃：修饰了荧光基团的长链核酸应是带有荧光基团的核酸，优选的如SEQ ID No:9(5’-FAM-ATT CTA TCA GTT TCTTGG AAT TTA GCG A-3’)、SEQ ID No:10（5’- CATATA TGT TGC CAC TCT AGC GGC CGT GG-TAMRA-3’）、SEQ ID No:11（5'-FAM-CCG TGC CGT GTC TTG TAG TTC CCG TCG AAT CG-3'）、SEQ ID No:12（5'- TAMRA -CCT CTA CGT GTC TTG TAC TTC GGA TCA GAG AGG-3’）所示的核苷酸序列

按照本发明，所述步骤二中，反应体系中修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸的浓度比例为（1~6）：（1~6）：1。所述步骤二的反应体系中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸的终浓度相同，都为10 nM~80 nM；作为连接模板的修饰了荧光基团的核酸的终浓度为5 nM~30 nM。所述步骤二的反应体系中，抗坏血酸的浓度为100~1000 μM；所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10 mM~60 mM，pH 6.6~8.2。所述步骤二形成反应体系的反应时间为20 min~5 h。

按照本发明，所述步骤三的氧化石墨烯为荧光猝灭剂，其用量为2 μL0.5 mg/mL~20 μL0.5 mg/mL。所述步骤二形成反应体系的反应温度为10-40 ℃，所述步骤三的检测温度为20-50 ℃。所述的步骤三的检测时间为10-50 min。

实施例1

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:1（5’-CTA AAT TCCAA-叠氮-3’）所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:5（5’-炔基-GAA ACTGAT AG-3’）所示，和作为连接模板的核酸，如SEQ ID No:9（5’-FAM-TCG CTA TCA GTT TCTTGG AAT TTA GCG A-3’）所示，分别溶解在纯水中，均配制成终浓度为200 nM的核酸溶液。

步骤二：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸的核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入500 nM铜离子、500 μM抗坏血酸、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲溶液，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20 nM，作为连接模板的核酸溶液的终浓度为10nM。将反应体系置于20 ℃水浴中分别反应0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h。

步骤三：向反应体系中加入3 μL 0.5 mg/mL GO、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4），升温至35℃，10 min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。

如图1为本发明实施例1中的反应体系中加入浓度500 nM铜离子后，检测体系荧光强度随反应时间变化的荧光光谱图，图1说明在加入铜离子之后体系的荧光强度随时间逐渐增强。

如图2为本发明实施例1中的反应体系中加入500 nM铜离子和不加入铜离子情况下检测体系荧光光谱图，图2说明在不加铜离子时，荧光强度没有明显变化，而加入500 nM铜离子之后荧光强度随时间逐渐增强，图1和图2能很好的说明用本发明的检测方法可以通过监测铜离子催化的核酸连接反应来检测铜离子。

实施例2

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:1（5’-CTA AAT TCCAA-叠氮-3’）所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:5（5’-炔基-GAA ACTGAT AG-3’）所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如SEQ ID No:9（5’-FAM-TCG CTA TCA GTT TCT TGG AAT TTA GCG A-Dabcyl-3’）所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200 nM的核酸溶液。

步骤二：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入纯水和不同浓度的铜离子（0 nM、100 nM、200 nM、300 nM、400nM、500 nM、600 nM、700 nM、800 nM、900 nM、1000 nM、1500 nM、2000 nM）、500 μM抗坏血酸、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲溶液，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20 nM，作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液的终浓度为10 nM，20℃温育3 h。

步骤三：向反应体系中加入3 μL 0.5 mg/mL GO、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4），升温至35℃，10 min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。

步骤四：以已知铜离子浓度为横坐标，对应的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到铜离子浓度和荧光强度之间的曲线关系图，在铜离子浓度在0-900 nM的区间里，铜离子浓度与荧光强度呈现良好的线性关系，符合线性方程y=510.564x+20567.3（y代表检测体系的荧光强度，x代表以nM为单位的检测体系中铜离子浓度），其R²=0.981，通过计算（3S/N）本方法对水中铜离子的检测限约为0.25 nM。

如图3为本发明实施例2加入不同浓度的铜离子的响应曲线。图3说明，从0 ~ 900nM，检测体系的荧光强度随浓度升高而增强，并且体系的荧光强度在900 nM时到达一个平台，说明随着铜离子的增加，连接反应的效率/速率增强；另外，检测体系在0 ~ 900 nM范围内与荧光强度有良好的线性关系和较小的数据偏差，说明本方法在检测铜离子方面具有很好的重现性。

实施例3

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:1（5’-CTA AAT TCCAA-叠氮-3’）所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:5（5’-炔基-GAA ACTGAT AG-3’）所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如SEQ ID No:9（5’-FAM-TCG CTA TCA GTT TCT TGG AAT TTA GCG A-3’）所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200nM的核酸溶液。

步骤二：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液混合，形成配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入不同种类的金属离子（其中铜离子的浓度为1 μM，干扰离子浓度为10 μM，干扰离子分别为（Mg²⁺, Ag⁺, NH₄ ⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Ca^{2 +}, Zn²⁺, Mn²⁺, K⁺）、500 μM抗坏血酸、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲溶液，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20 nM，作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液的终浓度为10 nM，反应体系在20 ℃温育3 h。

步骤三：向反应体系中加入3 μL 0.5 mg/mL GO、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4），升温至35℃，10 min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。

如图4为本发明实施例3对铜离子检测特异性曲线。其中I是检测体系温育后的荧光强度，I₀是温育之前的荧光强度，（I- I₀）/ I₀是代表检测体系温育之后荧光强度增加的倍数；图4说明，在温育之后，含有1 μM铜离子的检测体系荧光增强了18倍左右，而分别含有浓度千倍于铜离子（10 μM）的干扰离子的检测体系的荧光强度没有明显变化，这说明检测体系中干扰离子的存在不影响铜离子的检测。

实施例4

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:1（5’-CTA AAT TCCAA-叠氮-3’）所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:5（5’-炔基-GAA ACTGAT AG-3’）所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如SEQ ID No:9（5’-FAM-TCG CTA TCA GTT TCT TGG AAT TTA GCG A -3’）所示，分别溶解在纯水中配制成浓度都为200 nM的核酸溶液；实际样品为湖水，使用离心机12000 rpm离心10 min，将上清液用0.25μm微孔滤膜过滤除去细小颗粒物和悬浮物，滤液认为均是可溶物，置于低温保存待用。

步骤二：按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液混合，形成配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入湖水和低（300 nM）、中（400 nM）、高(500 nM)三个不同浓度的铜离子，500 μM抗坏血酸、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲溶液，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20 nM，作为作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸连接模板的核酸溶液的终浓度为10 nM，反应体系在20 ℃温育3 h。

步骤三：向反应体系中加入3 μL 0.5 mg/mL GO、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4），升温至35℃，10 min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。

步骤四：记录荧光强度结果，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。实验结果表明，所有回收率均在95%-105%的范围内。

实施例5

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:1（5’-CTA AAT TCCAA-叠氮-3’）所示，修饰了炔基基团的短的单链核酸，如SEQ ID No:5（5’-炔基-GAA ACTGAT AG-3’）所示，和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸，如SEQ ID No:9（5’-FAM-TCG CTA TCA GTT TCT TGG AAT TTA GCG A -3’）所示，分别溶解在20 mM Tris-HCl（pH7.4）缓冲溶液中配制成浓度都为200 nM的核酸溶液；牛血清样为市售试剂，低温-20 ℃保存，使用时稀释500倍。

步骤二、按2：2：1的比例将修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液、修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液和作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸作为连接模板的核酸溶液混合，形成混合溶液，然后向混合溶液中加入0.2％小牛血清和低（300 nM）、中（400nM）、高(500 nM)三个种不同浓度的铜离子样品在检测线性范围内取铜离子浓度低、中、高(300 nM、400 nM、500 nM)三个浓度点、500 μM抗坏血酸、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4）缓冲溶液，形成反应体系，其中修饰了叠氮基团的短的单链核酸溶液和修饰了炔基基团的短的单链核酸溶液的终浓度为20 nM，作为连接模板的修饰了荧光基团的长链核酸溶液的终浓度为10 nM，反应体系在20 ℃温育3 h。

步骤三：向反应体系中加入3 μL 0.5 mg/mL GO、水和20 mM Tris-HCl（pH 7.4），升温至35℃，10 min后用荧光光谱仪检测升温条件下检测体系的荧光强度。

步骤四：记录荧光强度结果，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。实验结果表明，所有回收率均在95%-105%的范围内。

以上数据表明，我们的检测方法具备在实际水样、血清等复杂样品中检测铜离子的能力。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (9)

1.基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，该方法包括：

步骤一：将修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的修饰了荧光基团的长的单链核酸分别溶解在纯水中配制成核酸溶液；

步骤二：将步骤一配制的三种核酸溶液混合，配制成混合溶液，然后向混合溶液中加入测试样品、抗坏血酸、水和Tris-HCl缓冲溶液，形成反应体系，反应一定时间，测试样品包含已知浓度铜离子的试剂；

步骤三：向步骤二的反应体系中加入水、氧化石墨烯、Tris-HCl缓冲溶液，升温后对检测体系的荧光强度进行检测；

步骤四：将本发明中先前实验得到的结果以已知铜离子浓度为横坐标，对应的荧光强度值为纵坐标，绘制标准曲线，得到铜离子浓度和荧光强度之间的线性关系方程，然后根据待测样品的荧光强度，计算得出对应的测试样品中铜离子的浓度；

所述作为连接模板的核酸选用标记有荧光基团的核酸链。

2.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述反应体系中的核酸包括两条短单链和作为模板的一条长单链，其中短链的融解温度（Tm值）低于长链的Tm值。

3.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤二中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸、修饰了炔基基团的短的单链核酸和作为连接模板的长链核酸的浓度比例为（1~6）：（1~6）：1。

4.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤二的反应体系中，修饰了叠氮基团的短的单链核酸和修饰了炔基基团的短的单链核酸的终浓度相同，都为10 nM~80 nM；作为连接模板的修饰了荧光基团的核酸的终浓度为5 nM~30 nM。

5.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤二的反应体系中，抗坏血酸的浓度为100~1000 μM；所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10 mM~60 mM，pH 6.6~8.2。

6.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤二形成反应体系的反应时间为20 min~5 h。

7.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤三的氧化石墨烯为荧光猝灭剂，其用量为2 μL 0.5 mg/mL~20 μL0.5 mg/mL。

8.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述步骤二形成反应体系的反应温度为10-40℃，所述步骤三的检测温度为20-50 ℃，其中检测温度高于反应温度。

9.根据权利要求1所述的基于模板依赖的点击化学和氧化石墨烯检测铜离子的方法，其特征在于，所述的步骤三的检测时间为10-50 min。

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