CN106191042B

CN106191042B - 基于核酸外切酶iii辅助的双循环串联信号放大dna组合探针组合物及制备方法与应用

Info

Publication number: CN106191042B
Application number: CN201610564293.5A
Authority: CN
Inventors: 张何; 傅昕; 邓星臣
Original assignee: Hunan Institute of Engineering
Current assignee: Hunan Institute of Engineering
Priority date: 2016-07-16
Filing date: 2016-07-16
Publication date: 2018-10-19
Anticipated expiration: 2036-07-16
Also published as: CN106191042A

Abstract

一种基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大DNA组合探针组合，包括：包含G‑四链体形成序列的引发DNA探针；发卡DNA探针，3′端与5′端互补形成茎状区，环状区序列与所述引发DNA探针互补；汞离子识别探针，和核酸外切酶III。在少量Hg²⁺引发后，两个自发循环过程可产生大量的G‑四链体DNA探针，与血红素结合产生G‑四链体‑血红素DNA酶，催化ABTS‑H₂O₂反应，生成可通过肉眼观察或分光光度法测定的浅绿色的ABTS^●＋。该方法具有极高的灵敏度和特异性、检测快速、操作简单，适合发展为环境监测现场实时分析技术；特别适合多种重金属离子同时存在的环境，适合应用于多种金属污染物存在时监测Hg离子的环境。

Description

基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大DNA组合探针组合物及制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大DNA组合探针组合物及制备方法与应用

背景技术

近年来由于汞和汞盐的大量生产、使用和不当排放，汞污染已成为全球性重大环境问题之一。水、土壤及大气中的汞，通过食物链在生物和人体内不断富集，可损害中枢和末梢神经，引发水俣病、运动失调、胎儿脑损伤等多种疾病，严重危害着人类的生存和健康。目前比较成熟的汞检测技术多为仪器分析方法，如原子荧光光谱法、电化学法、原子吸收及原子发射光谱、电感耦合等离子体-质谱法等。这些方法具有较好的特异性、准确性及灵敏性，但该类技术依赖大型仪器、样品前处理步骤复杂、不适合廉价快速的现场实时检测。

近年来，DNA生物传感技术用于汞离子检测成为该领域的热点方向， 2004年，Ono等首次报道了Hg²⁺能插入Thymine-Thymine碱基形成稳定的 Thymine-Hg²⁺-Thymine(T-Hg² ⁺-T)配位，为Hg²⁺的检测提供了新思路(Ono A,Togashi H.Angew.Chem.Int.Ed.,2004,43(33):4300～4302)，虽然发展的汞离子均相(液相)DNA生物传感技术具有经济、简便和高选择性等优点，适合于现场和在线监测，但普遍灵敏度不高，对于样品中微量及痕量汞离子检测的灵敏度低于仪器检测方法，在实际应用领域受到了较大的局限。

因此，现实中迫切需要一种快速廉价、无需复杂设备而特异性、准确性及灵敏性俱佳的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明首先提供了一种基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大DNA组合探针组合，包括以下组分：

1)引发DNA探针，所述的引发DNA探针包含G-四链体形成序列；

2)发卡DNA探针，所述的发卡DNA探针为茎环结构，其3′端与5′端互补形成茎状区，环状区序列与所述引发DNA探针互补；

3)汞离子识别探针，所述汞离子识别探针的5′端含有3个连续T碱基，在汞离子存在时，所述汞离子识别探针的5′端与所述发卡探针的3′端通过形成3个T-Hg²⁺-T结构而结合在一起，且在所述发卡DNA探针的3′末端形成平末端；

4)核酸外切酶III。

优选地，本发明所述的DNA探针组合中，所述引发DNA探针具有5’到 3’的序列：CACTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTT。

优选地，本发明所述的DNA探针组合中，所述发卡DNA探针为茎环结构，其3′端与5′端互补形成茎状区，环状区序列与所述引发DNA探针互补。

更优选地，本发明所述的DNA探针组合中，所述发卡DNA探针具有5’到3’的序列：CGAAAAGTATGTTATCCCGCCCAACCCAGTGACTTTTCG。

更优选地，本发明所述的DNA探针组合中，所述引发DNA探针与所述发卡DNA探针的环状区识别形成杂交双链，其中所述环状区序列的5′端具有至少4个碱基以上的单链。

优选地，本发明所述的DNA探针组合中，当汞离子存在时，所述引发 DNA探针、所述汞离子识别探针或释放的发卡DNA探针的5′茎状区序列与发卡DNA探针识别形成杂交三聚体，其中所述引发DNA探针、所述汞离子识别探针或释放的发卡DNA探针的5′茎状区序列的3′末端有至少4个碱基不能与所述发卡DNA探针互补形成平末端。

更优选地，本发明所述的DNA探针组合中，所述汞离子识别探针的5′端和所述发卡DNA探针的3′茎状区序列都含有3-5个连续的T碱基。

最优选地，本发明所述的DNA探针组合中，所述汞离子识别探针具有5’到3’的序列：CGTTTAGTTTGT。

本发明还提供了一种基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大用于免标记Hg²⁺检测方法，包括以下步骤：

1)、构建引发DNA探针，所述的引发DNA探针包含G-四链体形成序列；

2)、构建发卡DNA探针，所述的发卡DNA探针为茎环结构，其3′端与 5′端互补形成茎状区，环状区序列与引发DNA探针互补。当引发DNA探针与发卡DNA探针杂交后，将发卡DNA探针的茎环结构打开，形成杂交二聚体；

3)、构建汞离子识别探针，所述汞离子识别探针的5′端含有3个连续T 碱基，在汞离子存在时，能与所述发卡探针的3′端通过的形成3个T-Hg²⁺- T结构而结合在一起，且在所述发卡DNA探针的3′末端形成平末端；

4)将所述引发DNA探针、所述发卡DNA探针以及所述汞离子识别探针混合后为反应液，所述引发DNA探针与所述发卡DNA探针形成杂交二聚体；

5)往所述步骤4)的反应液中加入待测样品和核酸外切酶III，在汞离子存在时，汞离子识别探针能与所述步骤4)形成的杂交二聚体的3′端序列杂交，通过形成3个T-Hg²⁺-T结构组建杂交三聚体，所述杂交三聚体的3′末端具有平末端；所述核酸外切酶III结合杂交三聚体的3′平末端并切割反应，释放单核苷酸、Hg²⁺、引发DNA探针、汞离子识别探针以及发卡DNA探针的5′茎状区序列，释放的汞离子识别探针和Hg²⁺开始下一轮步骤(5)反应循环，形成循环1；

6)所述步骤5)释放的发卡DNA探针的5′茎状区序列与所述步骤4) 形成的杂交二聚体的3′茎状区序列杂交，形成具有3′平末端的杂交三聚体，所述核酸外切酶III再次催化水解DNA双链，重新释放单核苷酸、引发DNA 探针、2个发卡DNA探针的5′茎状区序列，释放的发卡DNA探针的5′茎状区序列能引发新的步骤(6)反应循环，形成循环2；

7)所述循环1和循环2的每次循环反应都能释放1个引发DNA探针，所述引发DNA探针含有G-四链体形成序列，与血红素结合可产生G-四链体- 血红素DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成浅绿色的ABTS^●+，可通过检测反应判断待测样品中是否含有汞离子。

优选地，本发明所述的基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大用于免标记Hg²⁺检测方法中，所述步骤4)混合后反应液的处理条件为：90℃保持10min，然后在30min内逐渐冷却到室温。

优选地，本发明所述的基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大用于免标记Hg²⁺检测方法中，所述步骤7)的检测方法为在420nm的吸光度判断待测样品中是否含有汞离子。

优选地，本发明所述的基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大用于免标记Hg²⁺检测方法中，所述步骤5)和所述步骤6)核酸外切酶III的反应温度为25℃。

由上可知，本发明的优点至少在于：

1)通过基于T-Hg²⁺-T结构的汞离子特异性识别、核酸外切酶III介导的酶切割信号放大、由三种特殊设计的DNA探针构建的双重串联信号放大以及G- 四链体-血红素DNA酶的催化显色信号放大技术相结合，构建一种可用于实际样品中痕量汞离子高灵敏均相(液相)DNA生物传感新技术。该方法具有极高的灵敏度和特异性、检测快速、操作简单，适合发展为环境监测现场实时分析技术。

2)本发明的方法不需要对底物或待检测物进行标记，处理方便，也避免了可能出现的干扰；

3)本发明的方法抗杂质干扰能力强，特别适合多种重金属离子同时存在的环境，适合应用于多种金属污染物存在时监测Hg离子的环境。

附图说明

图1为核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大示意图；

图2为检测不同浓度汞离子的结果图；

图3为抗干扰能力分析结果图。

具体实施方式

本发明实施例中设计了三种DNA探针，分别为引发DNA探针(以下称为 P1)、发卡DNA探针(以下称为P2)、汞离子识别探针(以下称为P3)。

图1所示：引发DNA探针P1包含G-四链体形成序列。发卡DNA探针P2包含3个功能区，分别是I、II、I*，其中I和I*是互补序列，形成茎环结构的茎状区，包含8对互补碱基且I*含有4个T碱基可用于汞离子识别，II为茎环结构的环状区，II与P1是互补的，两者杂交后，能将P2的茎环结构打开，I和I*区域去杂交，形成的杂交二聚体(P1-P2)，杂交后P1带有3′游离末端和5′互补末端(图1，反应A)。

P3含有3个T碱基，在Hg²⁺存在时，P3通过形成T-Hg²⁺-T结构与P2中的I* 区结合构成杂交三聚体，且在P2探针的3′末端形成平末端，结合后P3带有3′游离末端。加入核酸外切酶III(Exo III)开始信号放大，核酸外切酶III能与 P3与I*区形成的部分互补的3′平末端结合并开始切割反应，释放单核苷酸、 Hg²⁺、P1探针、P3探针以及P2的I区。由于在杂交三聚体中，P1和P3带有3′游离末端，P2的I区为游离序列，不能被Exo III切割并释放出来。释放的P3和 Hg²⁺开始下一轮反应循环(图1，反应B，循环1)。

释放的P2探针的I区能与P1-P2杂交二聚体的I*区互补形成3′平末端，这样ExoIII可再次催化水解DNA双链，重新释放P1、P2的I区探针以及新P2的I 区探针，释放的P2I区探针能引发新的结合、切割、释放循环(图2，反应B，循环2)，释放P1。

在少量Hg²⁺引发后，两个自发循环过程可产生大量的P1(G-四链体)，与血红素结合产生G-四链体-血红素(hemin)DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成浅绿色的ABTS^●+，在420nm处有紫外吸收，可通过肉眼观察或分光光度法测定(图1，反应C)。

以下为本发明的具体实施方式，应理解以下仅为本发明示例性说明，并不视为对本发明技术内容的任何形式限制。

实施例1核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大技术检测不同浓度的汞离子

1、引发DNA探针、发卡DNA探针以及汞离子识别探针的设计：

1)引发DNA探针(P1)序列结构如下(5’-3’)：

其中划线序列与发卡DNA探针(P2)的II区互补，加粗部分为G-四链体形成序列(包含4组连续的GGG)。

2)发卡DNA探针(P2)序列结构如下(5’-3’)：

其中I和I*是互补的，形成茎环结构的茎状区，包含8对互补碱基且I*含有 4个T碱基；II为茎环结构的环状区，II与P1是互补的，两者杂交后，能将P2的茎环结构打开，I和I*区域去杂交，形成的杂交二聚体(P1-P2)。

3)汞离子识别探针(P3)序列结构如下(5’-3’)：

其中划线序列与发卡DNA探针(P2)的I*区部分互补，加粗部分的TTT 在汞离子存在时，能与I*区的TTT形成三个T-Hg²⁺-T结构(三个TTT时最灵敏)，在P2探针的3’末端形成平末端，引发Exo III的外切酶活性。

设计后的序列使用化学合成法或DNA自动合成仪等常规方法合成。

2、对不同浓度汞离子的检测：

取一支已灭菌的0.5mL的离心管，分别取50μL P1(0.5μM)、50μL P2 (0.5μM)和50μL P3(0.2μM)于20mM Tris-HCl buffer(pH＝7.4,70mM NaCl，10mM MgCl₂，20mM KCl)中加热至90℃保持10min，然后在30min 内逐渐冷却到室温，使其充分杂交。

50μL检测试样(Hg²⁺浓度在2pmol/L～50nmol/L之间)与20U Exo III 加入上述溶液中搅拌均匀后于25℃条件下反应110min，使其进入自发循环过程，产生大量的P1(G-四链体)。反应完成后，加入1μL 40μmol/L的血红素 (hemin)于37℃条件下避光反应1h，产生G-四链体-血红素(hemin)DNA 酶。

取10μL上述反应液，加入4mmol/LABTS和4mmol/L H₂O₂各45μL， 37℃反应8min后，直接进行紫外吸收检测。我们选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm-A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为Hg²⁺浓度为0时的背景值。信号值随着Hg²⁺离子浓度的升高而变大，当Hg²⁺浓度达到一定时(大于4nmol/L)，吸光值随Hg²⁺浓度的增加几乎不再变化，这表明该体系已经到达了饱和(图2A)。当Hg²⁺浓度在2pmol/L～100pmol/L之间时，呈良好的线性关系(图2B)，回归方程为A_420nm＝0.21456+0.00012962C_Hg ²⁺，线性相关系数R²＝0.9961。以空白组的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为0.5pmol/L。

实施例2核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大技术抗干扰能力分析

为了检验传感体系对Hg²⁺检测的选择性，我们选择了9种其他的金属离子(Pb²⁺、Cd² ⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺)，并分别检验了它们对Hg²⁺检测的干扰程度。在无Hg²⁺存在条件下，按照实施例1的方法，分别向体系中加入400nM上述其他金属离子后，在最优条件下，体系的吸光值(420nm)没有太大的变化(图3，黑色柱状条)。相对标准偏差在2.4％～3.2％之间，这就表明了该生物传感体系对Hg²⁺具有很高的选择性。另外，向体系中同时加入4nM Hg²⁺和400nM上述其他金属离子时，该生物传感体系的吸光值和只加入4nM Hg²⁺的吸光值相近，相对标准偏差在-1.5％～5.7％之间，这就表明，这些金属离子对Hg²⁺的检测干扰较小(图3，白色柱状条)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于免标记Hg²⁺检测的DNA探针组合，包括以下组分：

1)引发DNA探针，所述的引发DNA探针包含G-四链体形成序列；

2)发卡DNA探针，所述发卡DNA探针为茎环结构，其3’端与5’端互补形成茎状区，环状区序列与所述引发DNA探针互补；

3)汞离子识别探针，所述汞离子识别探针的5’端含有3个连续T碱基，在汞离子存在时，所述汞离子识别探针的5’端与发卡探针的3’端通过形成3个T-Hg²⁺-T结构而结合在一起，且在所述发卡DNA探针的3’末端形成平末端；

4)核酸外切酶III。

2.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其特征在于，所述引发DNA探针为5’到3’的序列：CACTGGGTTGGGCGGGATGGGTTTT。

3.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其特征在于，所述发卡DNA探针为5’到3’的序列：CGAAAAGTATGTTATCCCGCCCAACCCAGTGACTTTTCG。

4.根据权利要求1-3任一项所述的DNA探针组合，其特征在于，所述引发DNA探针与所述发卡DNA探针的环状区识别形成杂交双链，其中所述环状区序列的5’端具有至少4个碱基以上的单链。

5.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其特征在于，当汞离子存在时，所述引发DNA探针、所述汞离子识别探针以及释放的发卡DNA探针的5’茎状区序列与发卡DNA探针识别形成杂交三聚体，其中所述引发DNA探针、所述汞离子识别探针或释放的发卡DNA探针的5’茎状区序列的3’末端有至少4个碱基不能与所述发卡DNA探针互补形成平末端。

6.根据权利要求1所述的DNA探针组合，其特征在于，所述汞离子识别探针的5’端和所述发卡DNA探针的3’茎状区序列都含有3-5个连续的T碱基。

7.根据权利要求5或6所述的DNA探针组合，其特征在于，所述汞离子识别探针为5’到3’的序列：CGTTTAGTTTGT。

8.一种基于核酸外切酶III辅助的双循环串联信号放大用于免标记Hg²⁺检测方法，包括以下步骤：

2)、构建发卡DNA探针，所述的发卡DNA探针为茎环结构，其3’端与5’端互补形成茎状区，环状区序列与引发DNA探针互补；当引发DNA探针与发卡DNA探针杂交后，将发卡DNA探针的茎环结构打开，形成杂交二聚体；

3)、构建汞离子识别探针，所述汞离子识别探针的5’端含有3个连续T碱基，在汞离子存在时，能与所述发卡探针的3’端通过的形成3个T-Hg²⁺-T结构而结合在一起，且在所述发卡DNA探针的3’末端形成平末端；

5)往所述步骤4)的反应液中加入待测样品和核酸外切酶III，在汞离子存在时，汞离子识别探针能与所述步骤4)形成的杂交二聚体的3’端序列杂交，通过形成3个T-Hg²⁺-T结构组建杂交三聚体，所述杂交三聚体的3’末端具有平末端；所述核酸外切酶III结合杂交三聚体的3’平末端并切割反应，释放单核苷酸、Hg²⁺、引发DNA探针、汞离子识别探针以及发卡DNA探针的5’茎状区序列，释放的汞离子识别探针和Hg²⁺开始下一轮步骤(5)反应循环，形成循环1；

6)所述步骤5)释放的发卡DNA探针的5’茎状区序列与所述步骤4)形成的杂交二聚体的3’茎状区序列杂交，形成具有3’平末端的杂交三聚体，所述核酸外切酶III再次催化水解DNA双链，重新释放单核苷酸、引发DNA探针、2个发卡DNA探针的5’茎状区序列，释放的发卡DNA探针的5’茎状区序列能引发新的步骤(6)反应循环，形成循环2；

7)所述循环1和循环2的每次循环反应都能释放1个引发DNA探针，所述引发DNA探针含有G-四链体形成序列，与血红素结合可产生G-四链体-血红素DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成浅绿色的ABTS^●+，可通过检测反应判断待测样品中是否含有汞离子。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述步骤4)混合后反应液的处理条件为：90℃保持10min，然后在30min内逐渐冷却到室温；所述步骤7)的检测方法为在420nm的吸光度判断待测样品中是否含有汞离子；所述步骤5)和所述步骤6)核酸外切酶III的反应温度为25℃。

10.根据权利要求1所述的DNA探针组合在免标记Hg²⁺检测中的应用。