CN107586827A - 一种基于核酸外切酶iii的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法，属于重金属检测技术领域。本发明提供的基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组，包括发夹DNA探针和汞离子识别探针。本发明提供的探针组和试剂盒能够实现汞离子在水体样本和尿液样本中的超高灵敏检测，特异性强且稳定性高，不受其他金属离子影响。

Description

一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离 子检测方法

技术领域

本发明涉及重金属检测技术领域，具体涉及一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法。

背景技术

Hg²⁺属于重金属，本身及其化合物对生物存在危害，在自然环境中非常难降解，同时，动物无法通过排泄系统将其顺利的排除体外，通过食物链的富集作用，可以从生物体内转移到人体，最终导致人体的一系列疾病的产生，甚至可能导致恶性肿瘤的产生。传统的检测方法大多是仪器分析法，例如原子吸收光谱法、原子发射光谱法等，这些方法设备仪器造价昂贵，实验过程繁琐，不利于发展现场、迅速检测技术等缺点。近年来，发展了许多利用核酸外切酶作为辅助手段进行酶切循环信号放大并应用于金属离子的高灵敏检测(Biosensors andBioelectronics,2015,68,266-271；Analytical Chemistry,2014, 86,3108-3114；Sensors&Actuators:B.Chemical,2017,246:896-903)，但普遍灵敏度不高或者检测体系较为复杂，而且只能应用于水体样品，不能应用于生物医学领域的复杂样品，如尿液，在实际应用领域受到了较大的局限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法。本发明提供的探针组和试剂盒能够实现汞离子在水体样本和尿液样本中的超高灵敏检测，特异性强且稳定性高，不受其他金属离子影响。

本发明提供了一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组，包括发夹 DNA探针和汞离子识别探针；

所述发夹DNA探针为3’末端为单链游离端的茎环结构，包括G-四链体形成序列、互补序列和3’末端单链游离序列；所述G-四链体形成序列的5’端部分序列和5’端上游序列与G-四链体形成序列的3’端下游序列通过互补序列形成茎状区，所述发夹DNA探针的3’末端含2组重复序列，一组处于茎状区，另一组为3’末端单链游离序列；所述3’末端单链游离序列含有2～4个连续的T碱基；

所述汞离子识别探针5’端含有2～4个连续的T碱基，所述T碱基在汞离子存在的情况下能够与发夹DNA探针3’末端单链游离序列中的T碱基形成T-Hg²⁺- T结构，且在所述发夹DNA探针的3’末端形成平末端。

优选的是，所述发夹DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述汞离子识别探针的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了基于上述技术方案所述探针组的汞离子检测试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的探针组和核酸外切酶III。

本发明还提供了基于上述技术方案所述探针组或上述技术方案所述试剂盒的汞离子检测方法，包括以下步骤：

1)将所述发夹DNA探针和汞离子识别探针混合于Tris-HCl缓冲液中，90℃保持10～20min，冷却后，加入待测样品和核酸外切酶III，25℃自循环反应 60～100min；

2)将所述步骤1)的自循环反应产物在80℃处理10min，使核酸外切酶III 失活；

3)在所述步骤2)的失活体系中加入血红素和ABTS-H₂O₂，产生G-四链体-血红素DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成ABTS^●+，对汞离子进行吸光度检测。

优选的是，步骤1)所述冷却的条件为：70℃保持10～15min；50℃保持 25～30min；30℃保持10～15min；20～25℃保持20～30min。

优选的是，步骤1)发夹DNA探针在自循环反应体系中的浓度为 0.10～0.25μM；汞离子识别探针在自循环反应体系中的浓度为0.03～0.10μM；发夹DNA探针和汞离子识别探针混合的浓度比为5:(1～3)。

优选的是，步骤1)核酸外切酶III在自循环反应体系中的浓度为 0.10～0.20U/μL；发夹DNA探针与核酸外切酶III的体积比为(25～100):1。

优选的是，步骤3)催化ABTS-H₂O₂反应的催化条件为37℃反应8min。

优选的是，步骤3)所述吸光度检测为在420nm波长下进行。

本发明提供了一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组。本发明提供的探针组中，发夹DNA探针为3’末端为单链游离端的茎环结构；该探针包含 G-四链体形成序列，部分G-四链体形成序列与探针内部设计的互补序列杂交形成茎状区；发夹DNA探针3’末端含有2组重复序列，一组处于单链游离状态，一组处于茎状区为杂交状态；其特殊的设计构建了一种新型的单发夹双循环指数扩增自引发信号放大技术，能够形成两个循环：1)在汞离子存在时，汞离子识别探针能与发夹DNA探针的3’单链游离末端序列杂交，与汞离子一起形成2～4个T-Hg²⁺-T结构组建杂交二聚体，所述杂交二聚体的3’末端具有平末端；所述核酸外切酶III结合杂交二聚体的3’平末端并切割反应，释放单核苷酸、汞离子、汞离子识别探针以及带有与发夹DNA探针3’单链游离末端互补序列的G-四链体形成序列，释放的汞离子识别探针和汞离子开始下一轮反应循环，形成循环1；2)循环1释放的带有发夹DNA探针3’单链游离末端互补序列的G-四链体形成序列与发夹DNA探针的3’单链游离末端序列杂交，形成具有3’平末端的杂交二聚体，所述核酸外切酶III再次催化水解DNA 双链，重新释放单核苷酸、2个带有发夹DNA探针3’单链游离末端互补序列的G-四链体形成序列，释放的带有发夹探针3’单链游离末端互补序列的G- 四链体形成序列能引发新的反应循环，形成循环2。循环1每次循环反应都能释放1个G-四链体形成序列，循环2释放G-四链体形成序列按照2ⁿ指数增长。本发明提供的探针组能够实现汞离子在水体样本和尿液样本中的超高灵敏检测，特异性强且稳定性高，不受其他金属离子影响。试验结果表明，本发明探针检测对水体样品中汞离子的检测限为0.02pmol/L，对尿液中汞离子的检测限为0.07pmol/L，灵敏度高；特异性强，不受Pb²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、 Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺等金属离子的影响。

附图说明

图1为本发明提供的基于核酸外切酶III的汞离子检测方法示意图；

图2为本发明实施例3提供的检测水体样品及尿液样品中不同浓度汞离子的结果图，其中图2A针对的是水体样品，图2B针对的是尿液样品；

图3为本发明实施例4提供的抗干扰能力分析结果图，其中，图3(黑色柱状图)为无汞离子情况下对其它金属离子检测结果图，图3(白色柱状图) 为有汞离子情况下对其它金属离子检测结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组，包括发夹 DNA探针和汞离子识别探针；

所述发夹DNA探针为3’末端为单链游离端的茎环结构，包括G-四链体形成序列、互补序列和3’末端单链游离序列；所述G-四链体形成序列的5’端部分序列和5’端上游序列与G-四链体形成序列的3’端下游序列通过互补序列形成茎状区，所述发夹DNA探针的3’末端含2组重复序列，一组处于茎状区，另一组为3’末端单链游离序列；所述3’末端单链游离序列含有2～4个连续的T碱基；在本发明中，所述发夹DNA探针G-四链体两端连有互补序列，且3’端互补序列相比5’端多一段重复序列，整条DNA探针序列能够形成含有3’末端单链游离序列的茎环结构。

在本发明中，所述发夹DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示： 5’-CGAAAAGTGTGGGTAGGGCGGGTTGGGACCCTACCCACACTTTTCG ACTTTTCG-3’。其中，加粗部分序列(GGGTAGGGCGGGTTGGG)为G-四链体形成序列，G-四链体形成序列5’端部分序列及其5’端上游序列 (CGAAAAGTGTGGGTAGGG)和G-四链体形成序列的3’端下游序列(CCCTACCCACACTTTTCG)为互补序列(G-四链体形成序列有部分序列通过杂交存在于茎状区，不能形成G-四链体，没有DNA酶活性，没有汞离子时不会引发核酸外切酶III的切割，背景很低，有利于实现高灵敏汞离子检测)， 3’末端序列(ACTTTTCG)为3’末端单链游离序列。本发明所述发夹DNA探针3’端含有2组重复序列，且序列中含有2～4个T碱基，能够结合后续的汞离子识别探针实现两个循环，对信号进行放大。在本发明中，所述3’末端单链游离序列优选含有2个连续的T碱基，当连续的T碱基为2个时，检测最为灵敏。

所述汞离子识别探针5’端含有2～4个连续的T碱基，所述T碱基在汞离子存在的情况下能够与发夹DNA探针3’末端单链游离序列中的T碱基形成T-Hg²⁺- T结构，且在所述发夹DNA探针的3’末端形成平末端。

在本发明中，所述汞离子识别探针的序列如SEQ ID NO.2所示： 5’-CGTTAAGTTTGT-3’。本发明所述汞离子识别探针5’-CGTTAAGTTTGT-3’中CGTTAAGT与发夹DNA探针部分互补，能够在汞离子存在的情况下与发夹 DNA探针形成T-Hg²⁺-T结构，且在发夹DNA探针的3’末端形成平末端，引发核酸外切酶III的外切酶活性。在本发明中，所述汞离子识别探针5’端优选含有 2个连续的T碱基，当连续的T碱基为2个时，检测最为灵敏。

本发明对所述探针的制备方法没有特殊的限定，委托本领域技术人员熟知的生物公司进行合成即可。

本发明还提供了基于上述技术方案所述探针组的汞离子检测试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的探针组和核酸外切酶III。在本发明中，所述试剂盒优选还包括Tris-HCl缓冲液，所述Tris-HCl缓冲液用于作为反应溶剂；所述试剂盒优选还包括血红素、ABTS和H₂O₂，所述血红素、ABTS和H₂O₂能够实现检测过程中由于汞离子存在而解离的G-四链体形成序列，进而实现汞离子的检测。

本发明还提供了基于上述技术方案所述探针组或上述技术方案所述试剂盒的汞离子检测方法，包括以下步骤：

1)将所述发夹DNA探针和汞离子识别探针混合于Tris-HCl缓冲液中，90℃保持10～20min，冷却后，加入待测样品和核酸外切酶III，25℃自循环反应 60～100min；

2)将所述步骤1)的反应产物在80℃处理10min，使核酸外切酶III失活；

3)在所述步骤2)的失活体系中加入血红素和ABTS-H₂O₂，产生G-四链体-血红素DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成浅绿色的ABTS^●+，对汞离子进行吸光度检测。

本发明将所述发夹DNA探针和汞离子识别探针混合于Tris-HCl缓冲液中， 90℃保持10～20min，冷却后，加入待测样品和核酸外切酶III，25℃自循环反应60～100min。在本发明中，所述发夹DNA探针在自循环反应体系中的浓度为0.10～0.25μM，更优选为0.15μM；所述汞离子识别探针在自循环反应体系中的浓度为0.03～0.10μM，更优选为0.06μM。所述发夹DNA探针与汞离子识别探针混合的浓度比为5:(1～3)，更优选为5:2。在本发明中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度优选为20mM，pH值优选为7.4，优选包含70mM的NaCl和10mM MgCl₂的20mM的KCl。

在本发明中，90℃保持10～20min的作用为使得发夹DNA探针形成的非茎环结构二聚体变性，并在逐步退火过程中形成茎环发夹结构。

在本发明中，所述冷却的条件为：70℃保持10～15min；50℃保持25～30min； 30℃保持10～15min；20～25℃保持20～30min，所述冷却条件的设置的作用是使发夹DNA探针形成更多的茎环结构而不是非茎环结构二聚体。(该温度条件的设置是依据设计的探针序列及茎状区序列的碱基组成摸索建立的，能够保证更多的发夹DNA探针能形成茎环结构，提高灵敏度)。

在本发明中，所述检测方法优选检测汞离子的浓度在0.001pmol/L～1 pmol/L之间的待测样品。

在本发明中，所述核酸外切酶III在自循环反应体系中的浓度为 0.10～0.20U/μL，更优选为0.15U/μL；所述发夹DNA探针与核酸外切酶混合的体积比为(25～100):1，更优选为50：1。在本发明中，加入待测样品和核酸外切酶III后，若待测样品中含有汞离子，25℃反应60min的过程中会发生自循环反应，产生大量的G-四链体形成序列。

本发明所述待测样品的种类包括水液样品和尿液样品。在本发明中，所述水液样品和尿液样品优选进行过滤后再进行检测，所述过滤优选使用 0.22μm滤膜过滤。得到水液样品和尿液样品后，本发明优选将样品保存在4℃。

在本发明中，基于核酸外切酶III的汞离子检测方法，即单发夹双循环指数扩增自引发信号放大检测方法的检测原理示意图如图1所示。在本发明中，所述自循环反应产生(即本申请汞离子检测)的原理如下：在汞离子存在时，汞离子识别探针的5’端与发夹DNA探针的3’末端单链游离序列通过形成2～4个个T-Hg²⁺-T结构而结合在一起，且在发夹DNA探针的3’末端形成平末端。加入核酸外切酶III(Exo III)开始信号放大，核酸外切酶III能与形成的3’平末端结合并开始切割反应，释放单核苷酸、汞离子、汞离子识别探针以及带有与发夹DNA探针3’末端单链游离序列互补序列的G-四链体形成序列(说明：发夹探针3’末端含2组重复序列，一组处于茎状区，另一组为3’末端单链游离序列，在汞离子存在时，形成平末端后，2组重复序列都会被切割成单核苷酸，但茎状区重复序列的互补序列能保留下来，可以与另外一个发夹DNA探针的 3’末端单链游离序列互补，自发的启动Exo III的切割)。释放的汞离子识别探针和汞离子开始下一轮反应循环(循环1)。释放的带有发夹DNA探针3’末端单链游离序列互补序列的G-四链体形成序列与发夹DNA探针的3’末端单链游离序列杂交，形成具有3’平末端的杂交二聚体，核酸外切酶III再次催化水解 DNA双链，重新释放单核苷酸、2个带有与发夹DNA探针3’末端单链游离序列互补序列的G-四链体形成序列(该序列包含2部分：G-四链体形成序列和与发夹DNA探针3’末端单链游离序列完全匹配的互补序列)，释放的带有发夹DNA 探针3’末端单链游离序列互补序列的G-四链体形成序列能引发新的结合、切割、释放循环(循环2)。在少量汞离子引发后，循环1每次循环反应都能释放1个G-四链体形成序列，循环2释放G-四链体形成序列按照2ⁿ指数增长，释放的G-四链体形成序列与血红素结合产生G-四链体-血红素(hemin)DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成浅绿色的ABTS^●+，在420nm处有紫外吸收，可通过肉眼观察或分光光度法测定。

自循环反应完成后，本发明80℃处理10min，使核酸外切酶III失活，终止循环反应。

自循环反应终止后，本发明加入血红素和ABTS-H₂O₂，产生G-四链体-血红素DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成浅绿色的ABTS^●+，对汞离子进行检测。在本发明中，催化ABTS-H₂O₂反应的催化反应条件为37℃反应8min。本发明所述检测优选为紫外吸收检测法。在本发明中，所述检测优选在420nm波长下对吸光度进行检测。

本发明提供的检测方法和检测体系非常简单，只包含一个发夹DNA探针，一个汞离子识别探针，能实现水体样品及尿液样本中汞离子的超高灵敏检测，其检测技术体系对水体样品中汞离子的检测限为0.02pmol/L，对尿液中汞离子的检测限为0.07pmol/L，检测能力高于TCP-MS的检测能力。本发明所述的汞离子检测技术具有很好的特异性，常见的其他金属离子(Pb²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、 Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺)与汞离子共存时对检测产生的影响极小。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

发夹DNA探针以及汞离子识别探针的设计

发夹DNA探针序列结构如下(5’-3’)：

5’-CGAAAAGTGTGGGTAGGGCGGGTTGGGACCCTACCCACACTTT TCGACTTTTCG-3’

其中加粗划线部分序列(GGGTAGGGCGGGTTGGG)为G-四链体形成序列，G-四链体形成序列5’端部分序列及其5’端上游序列(CGAAAAGTGTGGGTAGGG)和G-四链体形成序列的3’端下游序列 (CCCTACCCACACTTTTCG)为互补序列，形成茎状区，发夹DNA探针3’末端含有2组重复序列(ACTTTTCG)，一组处于单链游离状态，另一组处于茎状区为杂交状态，分别与信号放大循环1和循环2过程相关。

汞离子识别探针序列结构如下(5’-3’)：

5’-CGTTAAGTTTGT-3’

其中划线序列(CGTTAAGT)与发夹DNA探针的3’游离末端序列 (CTTTTCG)互补，汞离子识别探针加粗部分的TT在汞离子存在时，能与发夹DNA探针的3’游离末端序列的TT形成两个T-Hg²⁺-T结构，在发夹DNA探针的3’末端形成平末端，引发核酸外切酶III的外切酶活性。

实施例2

对水体样品中不同浓度汞离子的检测

取一支已灭菌的0.5mL的离心管，分别取25μL实施例1中发夹DNA探针 (0.5μM)、25μL实施例1中汞离子识别探针(0.2μM)于20mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4,70mMNaCl，10mMMgCl₂，20mM KCl)中加热至90℃保持 10～20min，然后逐渐冷却至室温(温度设置：70℃保持10～15min，50℃保持 25～30min，30℃保持10～15min，取出20～25℃下放置20～30min)。25μL检测试样(汞离子浓度在0.001pmol/L～1pmol/L之间)与10U Exo III加入上述溶液中搅拌均匀后于25℃条件下反应60min，使其进入自发循环过程，产生大量的 G-四链体形成序列。80℃处理10min，使Exo III酶失活。反应完成后，加入0.5 μL 0.4μmol/L的hemin于37℃条件下避光反应1h，产生G-四链体-血红素 (hemin)DNA酶。取10μL上述反应液，加入4mmol/LABTS和4mmol/LH₂O₂各45μL，37℃催化反应8min后，直接进行紫外吸收检测。选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm－A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为汞离子浓度为0时的背景值。当汞离子浓度在0.001pmol/L～1pmol/L之间时，呈良好的线性关系(图2A)，回归方程为A_420nm＝2.4179C_Hg ²⁺+0.0575，线性相关系数R²＝0.998。以空白组的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为0.02pmol/L。

实施例3

对尿液样品中不同浓度汞离子的检测

取干净已灭菌的0.5mL Eppendorf管7支，分别加入100μL不同浓度的汞离子，加入100μL无汞离子尿液，摇匀并贴好标签，此时各管的汞离子浓度为 0.5pM、0.1pM、0.05pM、0.01pM、0.005pM、0.001pM、0pM。

取一支已灭菌的0.5mL的离心管，分别取25μL实施例1中的发夹DNA探针 (0.5μM)、25μL实施例1中的汞离子识别探针(0.2μM)于20mM Tris-HCl buffer(pH＝7.4,70mMNaCl，10mM MgCl₂，20mM KCl)中加热至90℃保持 10min，然后逐渐冷却至室温(温度设置：70℃10～15min，50℃25～30min， 30℃10～15min，取出20～25℃下反应20～30min)。25μL检测试样(汞离子浓度在0.001pmol/L～0.5pmol/L之间)与10U Exo III加入上述溶液中搅拌均匀后于 25℃条件下反应60min，使其进入自发循环过程，产生大量的G-四链体形成序列。80℃处理10min，使Exo III酶失活。反应完成后，加入0.5μL 0.4μmol/L 的hemin于37℃条件下避光反应1h，产生G-四链体-血红素(hemin)DNA酶。取10μL上述反应液，加入4mmol/LABTS和4mmol/LH₂O₂各45μL，37℃反应 8min后，直接进行紫外吸收检测。选择420nm处的吸光度作为测量值，定义ΔA_420nm＝A_420nm－A₀，其中A_420nm为样品测量值，A₀为汞离子浓度为0时的背景值。当汞离子浓度在0.001pmol/L～0.5pmol/L之间时，呈良好的线性关系(图2B)，回归方程为A_420nm＝1.4724C_Hg ²⁺+0.0371，线性相关系数R²＝0.994。以空白组的3倍标准偏差除以标准曲线的斜率得到本方法的检出限为0.07 pmol/L。

实施例4

基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组检测汞离子抗干扰能力分析

为了检验传感体系对汞离子检测的选择性，选取九种其他金属离子(Pb²⁺、 Cd²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Mn²⁺)，并分别检验了它们对汞离子检测的干扰程度。在无汞离子存在条件下，分别向体系中加入2pM上述其他金属离子后，在与实施例1和实施例2一致的检测条件下，体系的吸光值没有太大的变化(如图3，黑色柱状条)，相对标准偏差在2.1％～3.3％之间，表明了该生物传感体系对汞离子具有很高的选择性。而且，向体系中同时加入0.02pM汞离子和2pM上述其他金属离子时，该生物传感体系的吸光值和只加入0.02pM汞离子的吸光值相差不多。相对标准偏差在1.2％～4.7％之间，这些金属离子对汞离子的检测干扰较小(图3，白色柱状条)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 湖南工程学院

<120> 一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组、试剂盒及汞离子检测方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgaaaagtgt gggtagggcg ggttgggacc ctacccacac ttttcgactt ttcg 54

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgttaagttt gt 12

Claims (10)

1.一种基于核酸外切酶III的汞离子检测探针组，其特征在于，包括发夹DNA探针和汞离子识别探针；

所述发夹DNA探针为3’末端为单链游离端的茎环结构，包括G-四链体形成序列、互补序列和3’末端单链游离序列；所述G-四链体形成序列的5’端部分序列和5’端上游序列与G-四链体形成序列的3’端下游序列通过互补序列形成茎状区，所述发夹DNA探针的3’末端含2组重复序列，一组处于茎状区，另一组为3’末端单链游离序列；所述3’末端单链游离序列含有2～4个连续的T碱基；

所述汞离子识别探针5’端含有2～4个连续的T碱基，所述T碱基在汞离子存在的情况下能够与发夹DNA探针3’末端单链游离序列中的T碱基形成T-Hg²⁺-T结构，且在所述发夹DNA探针的3’末端形成平末端。

2.根据权利要求1所述的探针组，其特征在于，所述发夹DNA探针的序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的探针组，其特征在于，所述汞离子识别探针的序列如SEQID NO.2所示。

4.基于权利要求1～3任意一项所述探针组的汞离子检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任意一项所述的探针组和核酸外切酶III。

5.基于权利要求1～3任意一项所述探针组或权利要求4所述试剂盒的汞离子检测方法，包括以下步骤：

1)将所述发夹DNA探针和汞离子识别探针混合于Tris-HCl缓冲液中，90℃保持10～20min，冷却后，加入待测样品和核酸外切酶III，25℃自循环反应60～100min；

2)将所述步骤1)的自循环反应产物在80℃处理10min，使核酸外切酶III失活；

3)在所述步骤2)的失活体系中加入血红素和ABTS-H₂O₂，产生G-四链体-血红素DNA酶，催化ABTS-H₂O₂反应，生成ABTS^●+，对汞离子进行吸光度检测。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述冷却的条件为：70℃保持10～15min；50℃保持25～30min；30℃保持10～15min；20～25℃保持20～30min。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)发夹DNA探针在自循环反应体系中的浓度为0.10～0.25μM；汞离子识别探针在自循环反应体系中的浓度为0.03～0.10μM；发夹DNA探针和汞离子识别探针混合的浓度比为5:(1～3)。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1)核酸外切酶III在自循环反应体系中的浓度为0.10～0.20U/μL；发夹DNA探针与核酸外切酶III的体积比为(25～100):1。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤3)催化ABTS-H₂O₂反应的催化条件为37℃反应8min。

10.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤3)所述吸光度检测为在420nm波长下进行。