CN106970229A - 一种基于dna‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶iii循环信号放大的转录因子检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于DNA‑银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，首次将DNA‑银纳米簇分子信标这种新型纳米材料作为荧光探针应用于转录因子的检测。并且，基于DNA‑银纳米簇分子信标的荧光调节是由可以被酶切割的DNA片段这一特征，加入了核酸外切酶III，既参与了信号的转化，又参与了检测信号的增强。本发明中转录因子的检测方法具有免标记，选择性高，低成本，灵敏度高的优点，能够实现生物样品中转录因子的高通量检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉以基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶 III循环放大的转录因子检测方法。
背景技术
转录因子(Transcription factors,TFs)是细胞中的一种调控蛋白，通过与基因中的DNA顺式作用元件结合，来启动和调节基因的转录过程。研究认为，转录因子决定了被调控基因的开启、关闭以及表达量，因此在基因表达中起着至关重要的作用。与此同时，也有大量研究指出，转录因子的非正常表达与活化，广泛的存在于人体的病理过程中，这些病理过程包括癌症的产生于转移、病毒感染、自身免疫疾病等，因此，转录因子既可以作为一种潜在的诊断标志物，又可以成为临床治疗的靶点。同时转录因子的表达水平也是基础生物医学研究中的一项重要参数。
综上所述，实现免标记，快速、灵敏、高通量检测转录因子是现在研究的热点之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种已DNA-银纳米簇分子信标(DNA-Ag nanoclustersmolecular beacons，AgMBs)为荧光探针，并且由核酸外切酶III(Exonuclease III， ExoIII)辅助循环信号放大的转录因子检测新方法，从而达到快速、灵敏并且高选择性的目的，克服现有转录因子检测方法灵敏度低，检测耗时，成本过高以及步骤繁琐的缺点。
一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其包括如下步骤：
a)将单链DNA reporter与其互补单链s-reporter在Tris-Ac缓冲液中杂交形成双链探针 dsNF-κB p50 probe；
b)将不同浓度的转录因子与dsNF-κB p50 probe孵育，再加入Exo III进行酶切，酶切后加入AgMBs，孵育反应；
c)荧光检测：测定样品在561nm激发波长下，620nm处的荧光值。利用测得的I620的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系。
d)从实际细胞或组织样品中获得核蛋白提取物作为待测样品，根据所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，得到待测样品中转录因子的浓度。
在步骤a)之前，配置Tris-Ac缓冲液，具体配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。市售购买本发明所需要的所有DNA寡核苷酸。具体见表1：
表1本发明中使用的DNA序列
步骤a)具体为：用Tris-Ac缓冲液溶解冻干的寡核苷酸，得到100μM的reporter与s-reporter，随后将二者等体积涡旋，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至室温，降温过程维持至少一小时。
在步骤b)之前，根据已有文献报道的方法制备AgMBs(Cao,Q.,et al.,Biosensorsand Bioelectronics,2015:p.318–321.)，具体方法为将1OD的AgMBs模板溶解于975μL缓冲液中(10mM Na2HPO4/NaH2PO4,100mMCH3COONa,5mM Mg(CH3COO)2,pH7.5)，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h。随后加入12μL，10mM 新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min。接着，迅速加入12μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜。
步骤b)具体为：10μL，50nM的dsNF-κB probe与不同浓度的NF-κB p50溶液(体积都是5μL)混合，随后加入Exo III(Exonuclease III)(10U/μL，3μL)，在37℃下反应 30min。反应缓冲体系：10mM Tris–Ac,pH7.5,100mM KCl,2mM MgCl2,0.1mM EDTA,10％ glycerol。30min后，向上述反应体系中加入20μL，1μM的AgMBs。37℃下反应2h。
步骤c)具体为：将样品低速离心后，装入石英比色皿进行荧光检测，检测条件是激发波长为561nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
与现有技术比较本发明的有益效果：本方法首次采用AgMBs作为荧光探针，参与TFs的检测。这种荧光探针与常用的有机荧光分子相比，具有低成本、强荧光的优点。同时，基于DNA-银纳米簇分子信标的荧光调节是由可以被酶切割的DNA片段，加入了核酸外切酶III，既参与了信号的转化，又参与了检测信号的增强。将酶信号放大等策略应用其中，增加检测的灵敏度。并且，本分析方法不需要复杂的温度控制，只需要简单的两步加样就能在均相溶液中检测转录因子，因此具有高通量检测的潜力。根据本方法得到的检测限为10pM，线性范围是30pM-1.5nM，线性范围广，检测限低，且可以用于癌细胞中TFs的定量检测，具有良好的回收率。
与现有技术相比，本发明具有对转录因子进行免标记，选择性高，高灵敏、快速、低成本、高通量检测的优势，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法的原理图；
图2是实施例加入不同浓度NF-κB p50检测荧光所得到的线性；
图3本发明实施例检测方法对于NF-κB p50的选择性；
图中，Blank是空白样品，BSA是牛血清白蛋白，HAS是人血清白蛋白，Insulin是人胰岛素，NF-κB p65是与NF-κB p50结合序列不同的同家族转录因子。从图中可以看出本方法对NF-κB p50具有良好的选择性。
图4是本发明检测方法检测经H2O2和TNF-α处理过的DLD-1细胞核蛋白提取物的结果。
图中，Deactivated是将细胞核蛋白加热失活的样品，Untreated是未经处理的细胞核蛋白，H2O2和TNF-α组是分别用这两种刺激物处理细胞30min后提取核蛋白的样品。
具体实施方式
以下通过具体实施例说明本发明，但本发明并不仅仅限定于这些实施例。
药品和试剂：实验中使用的DNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。分析纯的AgNO3、NaBH4购买自阿拉丁试剂(上海，中国)。荧光光谱实验由HITACHI F-4600荧光分光光度计获得(日本)，荧光读数数据获得自TECAN Infinite M200多功能酶标仪(瑞士)。核蛋白提取试剂盒购买自生工生物工程(上海，中国)。其他试剂均购买自国药试剂(上海，中国)，并且均为分析纯。
配置Tris-Ac缓冲液，具体配方是10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。所需要的DNA寡核苷酸。具体见表1：
表1本发明中使用的DNA序列
实施例1
一种转录因子的检测方法，包括以下步骤：
1)AgMBs的合成：AgMBs根据文献提供的方法合成。具体为：将1OD模板DNA 溶解于975μL缓冲液中(10mM Na2HPO4/NaH2PO4,100mMCH3COONa,5mM Mg(CH3COO)2,pH7.5)，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为 1h。随后加入12μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min。接着，迅速加入12μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜。
2)dsNF-κB p50probe的制备：用缓冲液(10mM Tris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc)溶解冻干的寡核苷酸，得到100μM的reporter与s-reporter，随后将二者等体积涡旋，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至室温，降温过程维持至少一小时。
3)检测NF-κB p50的线性：10μL，50nM的dsNF-κB probe与30pM,100pM,200pM,的350pM,500pM,800pM,1nM,1.3nM,1.5nM,2nM,2.5nM的NF-κB p50溶液(体积都是5μL) 混合，随后加入Exo III(10U/μL，3μL)，在37℃下反应30min。反应缓冲体系：10mM Tris-Ac,pH7.5,100mM KCl,2mM MgCl2,0.1mM EDTA,10％glycerol。30min后，向上述反应体系中加入20μL，1μM的AgMBs。37℃下反应2h。根据I620的荧光读数与NF-κB p50 的浓度关系，获得线性方程。
4)实际样品中NF-κB p50的检测：10μL，50nM的dsNF-κB probe与5μL细胞核蛋白提取物混合，随后加入Exo III(10U/μL，3μL)，在37℃下反应30min。反应缓冲体系： 10mMTris-Ac,pH7.5,100mM KCl,2mM MgCl2,0.1mM EDTA,10％glycerol。30min后，向上述反应体系中加入20μL，1μM的AgMBs。37℃下反应2h。根据I620的荧光读数代入步骤3)获得的线性方程，得到NF-κB p50的浓度。
5)重复1)-4)，将步骤2)中dsNF-κB p50probe的转录因子结合区更换为其它转录因子的结合序列，将步骤3)中30pM-3nM的NF-κB p50溶液更换为相同浓度的其它转录因子的溶液，从而实现其它转录因子的检测。
实施例2
本发明检测方法的选择性实验
重复实施例1中的步骤1)-4)，将步骤3)中的NF-κB p50更换为牛血清白蛋白、人胰岛素、人血清白蛋白、NF-κB p65等干扰物，其它条件不变，检测荧光，得到本方法检测NF-κBp50的选择性结果图，见图3。
实施例3
本发明检测方法的回收率实验
重复实施例中1)的步骤1)-4)，在步骤4)中，进行加样检测，分别添加10、50、 200、500、1000、1500pM的NF-κB p50，进行检测，获得本方法在实际样品检测中的回收率，结果见表2。
表2本方法检测NF-κB p50的回收率
实施例4
本发明方法用于检测经H2O2和TNF-α处理的DLD-1细胞核蛋白提取物中的NF-κBp50在培养DLD-1细胞的过程中，分别加入10μM H2O2和10μMTNF-α处理30min，提取其核蛋白。并另外提前一份未经处理的细胞核蛋白，以及一份未经处理，但是测样前加热至75℃失活的核蛋白。
重复实施例1)中的步骤1)-4)，在步骤4)中，将上述四个样品的荧光值代入线性方程，得到相对应的NF-κB p50的浓度，分别为61nM(untreated),74pM(deactivated), 318nM(H2O2),406nM(TNF-α)。见图4。
Claims (9)
1.一种基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于检测方法包括如下步骤：
a)将单链DNA reporter与其互补单链s-reporter在Tris-Ac缓冲液中杂交形成双链探针dsNF-κB p50probe；
b)将多个不同浓度的转录因子与dsNF-κB p50probe孵育，再加入Exo III进行酶切，酶切后加入AgMBs，孵育反应得到样品；
c)测定样品在561nm激发波长下，620nm处的荧光值，利用测得的I620的值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系；
d)从实际细胞或组织样品中获得核蛋白提取物作为待测样品，根据步骤c)所得到的线性关系与待测样品获得的荧光强度，得到待测样品中转录因子的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于：在步骤a)之前，配置Tris-Ac缓冲液，具体配方是10mMTris-Ac,0.1mM EDTA,100mM NaAc。
3.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于：
Reporter：GAGGGGACTTTCCCAGCCCCACCCCACCCCACCCTCGTCATCAGATACTTA
s-reporter：ATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGGCTGGGAAAGTCCCCTC
制备AgMBs时所用的AgMBs模板的序列为：
CCCTTAATCCCCTCGTCAATGCGATCTGATGACGAGGGTGGGGTGGGGTGGGG。
4.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于：步骤a)具体为：用Tris-Ac缓冲液溶解冻干的寡核苷酸，得到100μM的reporter与s-reporter，随后将二者等体积涡旋，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至室温，降温过程维持至少一小时。
5.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，步骤b)所述的AgMBs是通过以下步骤制备得到的：将1OD的AgMBs模板溶解于975μL缓冲液中，加热至95℃，维持10min后缓慢降温至37℃，降温持续时间为1h，随后加入12μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光4℃反应30min，接着，迅速加入12μL，10mM新制硼氢化钠溶液，充分振摇混合1min，然后避光4℃反应过夜；其中，所述的缓冲液中为10mM Na2HPO4/NaH2PO4,100mMCH3COONa,5mM Mg(CH3COO)2,pH7.5。
6.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，步骤b)具体为：10μL，50nM的dsNF-κB probe与体积都是5μL的30nM-2500nM的转录因子NF-κB p50的溶液混合，随后加入3μL，10U/μL的Exo III，在37℃下反应30min。反应缓冲体系：10mM Tris–Ac,pH7.5,100mM KCl,2mM MgCl2,0.1mMEDTA,10％(v/v)glycerol，30min后，向上述反应体系中加入20μL，1μM的AgMBs，37℃下反应2h。
7.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，步骤c)具体为：将样品低速离心后，装入石英比色皿进行荧光检测，检测条件是激发波长为561nm，扫描速度为1200nm min-1，光电倍增管电压为700V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
8.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，模型转录因子为NF-κB p50。
9.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇分子信标与核酸外切酶III循环信号放大的转录因子检测方法，其特征在于，转录因子NF-κB p50的浓度范围是30pM-2.5nM。
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