CN109207561A - 基于dna-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法 - Google Patents
基于dna-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于分析检测领域，涉及一种基于DNA‑银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法。该检测方法包括如下步骤：a)以发卡状DNA为模板，加入硝酸银、硼氢化钠，使其原位还原生成DNA‑银纳米簇变构探针AgSwitch；b)将多个不同浓度的转录因子溶液与步骤a)得到的AgSwitch孵育反应；c)测定体系的荧光值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系，绘制标准曲线；d)在与步骤c)同样的条件下测定待测样品的荧光强度，根据步骤c)的标准曲线，得到待测样品中转录因子的浓度。本发明的转录因子检测方法具有免标记，无酶，灵敏度高的优点，能够实现生物样品中转录因子的高效检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测领域，更具体地，涉及一种基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法。
背景技术
转录因子(Transcription factors，TFs)是细胞中的DNA结合蛋白，这类蛋白在调控细胞的增殖、凋亡、转化等方面具有至关重要的作用。当细胞收到来自细胞内或细胞外的信号时，信号通路中各种信号分子的表达发生变化，最终这些信号分子逐级将信息传递至位于细胞核外的处于静息态的转录因子，这些转录因子被激活而入核，与靶基因上的转录因子结合区结合，启动转录过程。转录过程起到调节细胞蛋白质表达的作用，能够改变整个细胞的转录状态，从而起到调控生命过程的作用，这些生命过程既包括炎症、癌变、自身免疫疾病，也包括对这些疾病的治疗或抵抗。当前，大量的临床检测或药物开发针对的是信号通路中的上游分子，但是这些分子种类繁多，很难选择其中的少部分作为有力的靶点或目标物。与之相比，转录因子的数量远远小于信号分子，并且信号分子的改变最终会汇集于转录因子，因此，转录因子既可以成为临床治疗的靶点，又可以作为一种潜在的诊断标志物。但是目前尚缺乏高效检测TFs，实验室应用的方法由于通量低、难以定量检测等缺点而无法应用于临床，而新近发表的研究大多应用了昂贵的荧光素修饰的核酸、价格贵且保存条件苛刻的工具酶，或是复杂的分析步骤，使得这些技术难以在临床应用上推广。
近期基于变构效应的仿生探针有一些研究，这类探针中含有能够识别目标物的区域，当目标物与其结合时，探针的构象发生改变，并且同时产生能够用于检测的信号，包括电化学信号、荧光信号等。其中，能够产生荧光信号的变构探针由于其检测手段简单，灵敏度高，因而备受关注。但是目前，大部分荧光变构探针的构建仍然需要较为昂贵的荧光化学基团的修饰，少数免标记(label-free)的变构探针灵敏度较低，只能实现μM级别的检测。因此，开发高灵敏的免标记变构探针仍然具有很强的科学意义。
综上所述，实现转录因子的快速检测能够强有力地辅助临床检测以及基础研究的转化，因此，开发高灵敏低成本的变构探针具有重要的科学意义。将低成本的变构探针应用于转录因子的检测，不仅是一种新颖的检测手段，也将为变构探针的设计开发带来新的切入点。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法。本发明的转录因子检测方法具有免标记，无酶，灵敏度高的优点，能够实现生物样品中转录因子的高效检测。
为了实现上述目的，本发明提供一种基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，该检测方法包括如下步骤：
a)以发卡状DNA为模板，加入硝酸银、硼氢化钠，使其原位还原生成DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch；发卡状DNA中含有G增强序列，变构探针AgSwitch中的DNA-银纳米簇与所述G增强序列的距离变化使得体系荧光发生变化；
b)将多个不同浓度的转录因子溶液与步骤a)得到的AgSwitch孵育反应，所述转录因子能够与变构探针AgSwitch特异性结合；
c)测定体系的荧光值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系，绘制标准曲线；
d)在与步骤c)同样的条件下测定待测样品的荧光强度，根据步骤c)的标准曲线，得到待测样品中转录因子的浓度。
本发明的原理如图1所示，该探针利用平衡移动原理，探针的构象在双茎-环结构与单茎-环结构中处于动态平衡，其中双茎-结构是其优势构象。称双茎-环结构为off-state，而单茎-环结构为on-state。在on-state下，探针中的DNA-银纳米簇与其G增强序列(GRS)互相远离，使其处于弱荧光状态。而在off-state下，DNA-银纳米簇与GRS互相靠近，使其处于强荧光状态。当没有转录因子存在时，off-state占绝对多数，因此体系呈现弱荧光；当转录因子存在时，转录因子与off-state的单茎-环结合，使得探针的构象平衡向off-state的方向移动，从而使得体系的荧光大大上升，这一荧光变化可以用于对转录因子进行定量分析。
本发明设计了AgSwitch的模板序列，在这一模板序列上成功合成了银纳米簇，从而得到了AgSwitch。所得到的AgSwitch能够实现转录因子的检测，且该检测方法便捷、灵敏、低成本，为转录因子的快速检测提供了新的有效方案。
根据本发明，优选地，所述发卡状DNA选自以下序列中的一种；
DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch-p50的模板序列，其具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列，可与转录因子p50特异性结合：
5’-CCCTTAATCCCCGGGGTGGGGACTTTCCCCCCACCCCGGAAAGTCCCCACCCCGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3’(SEQ ID NO：1)
DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch-TBP的模板序列，其具有SEQ ID NO：2所示的碱基序列，可与转录因子TBP特异性结合：
5’-CCCTTAATCCCCGGTGGGGATTTAAACTCCCCACCTTTAAATCCCCACCGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3’(SEQ ID NO：2)
DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch-MITF的模板序列，其具有SEQ ID NO：3所示的碱基序列，可与转录因子MITF特异性结合：
5’-CCCTTAATCCCCGGGGTGGGGCACGTGAAACCCCACCCCCACGTGCCCCACCCCGGGTGGGGTGGGGTGGGG-3’(SEQ ID NO：3)。
根据本发明，所述DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch的制备可采用现有技术中的方法进行，如参考已有的文献报道(Journal of the American Chemical Society,2013,135(32),11832-11839)。也可在此基础上进行进一步改进，根据本发明一种优选实施方式，所述DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch通过以下步骤制备得到：将1OD的发卡状DNA模板溶解于900μL缓冲液1中，加热至90℃，维持15min后阶梯降温至37℃，降温持续时间为45min，随后加入15μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光在冰水混合物中反应30min，接着，迅速加入20μL，10mM新制硼氢化钠溶液，在涡旋混合仪上剧烈涡旋30s，沉浸入冰水混合物中10s，再涡旋30s，反复至少三次，然后避光在冰水混合物中反应过夜；所述缓冲液1的配方为：柠檬酸盐缓冲液，如10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.8。其中，优选地，所述硼氢化钠溶液用冰水配制。
通过该方法，基于AgSwitch-p50的模板能够合成AgSwitch-p50，基于AgSwitch-TBP的模板能够合成AgSwitch-TBP，基于AgSwitch-MITF的模板能够合成AgSwitch-MITF。这三种AgSwitch分别能够特异性地检测p50，TBP以及MITF。
根据本发明，优选地，步骤b)中，所述孵育在结合缓冲液中进行，所述结合缓冲液的配方为：10mM Na2HPO4/NaH2PO4，100mM CH3COONa，10mM Mg(CH3COOH)2，15％甘油，0.08mg/mL poly(dI-dC)，pH＝7.4。其中15％glycerol和0.08mg/mL poly(dI-dC)对于探针与目标物的高效结合有重要作用。
根据本发明，优选地，多个不同浓度的转录因子溶液由转录因子的母液稀释制得，所述稀释液为结合缓冲液。具体地，多个不同浓度的转录因子溶液的浓度为0.5nM-1.25μM，例如为0.5nM,1nM,1.5nM,2.5nM,4nM,5nM,10nM,50nM,100nM,250nM,500nM,750nM,1μM,1.25μM。
根据本发明，优选地，步骤b)的孵育反应体系中，结合缓冲液、转录因子溶液与AgSwitch溶液的体积比为40-50：4-6：1；AgSwitch溶液的浓度为4.5-5.5μM；孵育反应在37℃下进行1h。根据本发明一种具体实施方式，每88μL结合缓冲液与步骤a)获得的AgSwitch(2μL，5μM)混合，再加入10μL转录因子溶液，在37℃下反应1h。
根据本发明，优选地，所述步骤c)包括：将孵育反应后所得样品离心，然后装入石英比色皿进行荧光检测，荧光检测条件包括：激发波长为561nm，扫描速度为1000nm/min，光电倍增管电压为800V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
根据本发明，所述待测样品为从实际细胞或组织样品中获得的核蛋白提取物，可用成品化试剂盒提取细胞或组织的核蛋白。
本发明的有益效果：
1)本方法采用AgSwitch作为荧光探针，进行转录因子的检测。这种荧光探针与常用的有机荧光分子相比，具有低成本、荧光强的优点。
2)虽然现在已经有一些变构探针的研究，但是免标记(label-free)且高灵敏的变构探针尚且缺乏。本发明首次将银纳米簇设计进变构探针的结构，巧妙操控银纳米簇与GRS之间的空间位置，使之在两种构象之间转换。
3)与现有的其它变构探针相比，本发明探针的荧光信号响应强(信号响应>700％)，因此其同时具有高灵敏度的特点，是对现有技术的重要改进。
综上，与现有技术相比，本发明具有对转录因子进行免标记、无酶、高灵敏、低成本、高通量检测的优势，具有良好的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为本发明检测方法的流程图以及原理图。其中下图为本发明方案设计的AgSwitch的二级结构模拟图。
图2A为加入不同浓度p50检测荧光所得到的标准曲线图，图2B为加入不同浓度TBP检测荧光所得到的标准曲线图，图2C为加入不同浓度MITF检测荧光所得到的标准曲线图。
图3示出了本发明的检测方法对于p50选择性的结果。其中，Blank是空白样品，BSA是牛血清白蛋白，HSA是人血清白蛋白，Insulin是人胰岛素，humanα-thrombin是人凝血酶，p53是一种与癌症相关的转录因子，p65是p50结合序列不同的同家族转录因子。含有p50的混合样品指的是p50与上述干扰物的混合物，不含p50的混合样品指的是上述干扰物的混合物。
图4示出了用AgSwitch-p50检测经H2O2和TNF-α处理过的DLD-1细胞核蛋白提取物的结果。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
药品和试剂：实验中使用的DNA均由生工生物工程(上海，中国)合成，并且经HPLC纯化。分析纯的AgNO3、NaBH4购买自阿拉丁试剂(上海，中国)。荧光读数数据获得自TECANInfinite M200多功能酶标仪(瑞士)。核蛋白提取试剂盒购买自生工生物工程(上海，中国)。其他试剂均购买自麦克林(上海，中国)，并且均为生物试剂级(BR grade)。
实施例1
用于说明本发明的转录因子的检测方法，包括以下步骤：
1)参考已有的文献报道(Journal of the American Chemical Society,2013,135(32),11832-11839)，并进行改进，在DNA模板上原位合成制备DNA银纳米簇。将1OD的DNA模板溶解于900μL缓冲液1(10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.8)中，加热至90℃，维持15min后阶梯降温至37℃，降温持续时间为45min，随后加入15μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光在冰水混合物中反应30min，接着，迅速加入20μL，10mM新制硼氢化钠溶液(硼氢化钠溶液需用冰水配置)，在涡旋混合仪上剧烈涡旋30s，沉浸入冰水混合物中10s，再涡旋30s，反复至少三次。然后避光在冰水混合物中反应过夜。通过该方法，基于AgSwitch-p50的模板合成AgSwitch-p50，基于AgSwitch-TBP的模板合成AgSwitch-TBP，基于AgSwitch-MITF的模板合成AgSwitch-MITF。这三种AgSwitch分别能够特异性地检测p50，TBP以及MITF。
2)用缓冲液2(10mM Na2HPO4/NaH2PO4,100mM CH3COONa,10mM Mg(CH3COOH)2,15％甘油,0.08mg/mL poly(dI-dC),pH＝7.4)将p50、TBP以及MITF转录因子的母液进行稀释，稀释至0.5nM、1nM、1.5nM、2.5nM、4nM、5nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、1.25μM。每88μL缓冲液2与步骤a)获得的AgSwitch(2μL，5μM)混合，再加入10μL本步骤得到的转录因子溶液，在37℃下反应1h。
3)将样品离心(1000rpm，5min)后，装入石英比色皿进行荧光检测，检测条件为：激发波长为561nm，扫描速度为1000nm/min，光电倍增管电压为800V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。根据I627的荧光读数与p50的浓度关系，获得对p50的线性方程。根据I627的荧光读数与TBP的浓度关系，获得对TBP的线性方程。根据I627的荧光读数与MITF的浓度关系，获得对MITF的线性方程。分别如图2A、图2B和图2C所示。
4)实际样品中NF-κB p50的检测：每2μL的AgSwitch-p50与体积为10μL的核蛋白提取物混合，再加入88μL缓冲液2，在37℃下反应1h。将I627的荧光读数代入步骤3)得到的p50的线性方程，得到p50的浓度。
实施例2
本发明检测方法的选择性实验
重复实施例1中的步骤1)-2)，将步骤2)中的转录因子溶液更换为相应浓度的BSA、HAS、Humanα-thrombin、p53等干扰物，并且将干扰物混合，制备混合干扰溶液，其它条件不变，检测荧光，得到本发明方法检测目标p50的选择性结果，如图3所示。从图3中可以看出本发明的方法对目标转录因子具有良好的选择性。
实施例3
本发明检测方法的回收率实验
重复实施例1中的步骤1)-4)，在步骤4)中，进行加样检测，分别添加15nM、25nM、40nM、50nM、200nM、500nM的p50，进行检测，获得本发明的方法在实际样品检测中的回收率，结果见表1。
表1本发明方法检测DLD-1细胞提取物中p50的回收率
实施例4
本发明方法用于检测经H2O2和TNF-α处理的DLD-1细胞核蛋白提取物中的p50，在培养DLD-1细胞的过程中，分别加入H2O2和TNF-α处理45min，提取其核蛋白。
重复实施例1中的步骤1)-4)，在步骤4)中，将上述处理后的样品的荧光值代入线性方程，得到相对应的p50的表达水平的变化图，做出热度图，如图4。
实施例5
本实施例用于说明本发明与已报道的基于空间位阻效应的转录因子检测方法在分析性能上的比较，结果见表2。
由表2的比较结果可以看出，本发明方法的信号增益(探针与目标物结合后的信号响应)高于已有的报道，这与本发明探针所使用的银纳米簇的特性有关。本发明探针与目标物的亲和力与已有的有标记的探针相当，同时远高于之前已经报道的免标记的方法。可见，本发明的探针不仅具有出色的分析性能，同时兼具免标记探针的价格低廉的特点。
表2本发明探针与已报道的基于变构效应的转录因子探针的比较
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cccttaatcc ccggggtggg gactttcccc ccaccccgga aagtccccac cccgggtggg 60
gtggggtggg g 71
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccttaatcc ccggtgggga tttaaactcc ccacctttaa atccccaccg ggtggggtgg 60
ggtgggg 67
<210> 3
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccttaatcc ccggggtggg gcacgtgaaa ccccaccccc acgtgcccca ccccgggtgg 60
ggtggggtgg gg 72
Claims (10)
1.一种基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：
a)以发卡状DNA为模板，加入硝酸银、硼氢化钠，使其原位还原生成DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch；发卡状DNA中含有G增强序列，变构探针AgSwitch中的DNA-银纳米簇与所述G增强序列的距离变化使得体系荧光发生变化；
b)将多个不同浓度的转录因子溶液与步骤a)得到的AgSwitch孵育反应，所述转录因子能够与变构探针AgSwitch特异性结合；
c)测定体系的荧光值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系，绘制标准曲线；
d)在与步骤c)同样的条件下测定待测样品的荧光强度，根据步骤c)的标准曲线，得到待测样品中转录因子的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，所述发卡状DNA选自以下序列中的一种；
AgSwitch-p50的模板序列，其具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列，可与转录因子p50特异性结合；
AgSwitch-TBP的模板序列，其具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列，可与转录因子TBP特异性结合；
AgSwitch-MITF的模板序列，其具有如SEQ ID NO：3所示的碱基序列，可与转录因子MITF特异性结合。
3.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤a)中，所述DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch通过以下步骤制备得到：将1OD的发卡状DNA模板溶解于900μL缓冲液1中，加热至90℃，维持15min后阶梯降温至37℃，降温持续时间为45min，随后加入15μL，10mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光在冰水混合物中反应30min，接着，迅速加入20μL，10mM新制硼氢化钠溶液，在涡旋混合仪上剧烈涡旋30s，沉浸入冰水混合物中10s，再涡旋30s，反复至少三次，然后避光在冰水混合物中反应过夜；所述缓冲液1为柠檬酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，所述硼氢化钠溶液用冰水配制。
5.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤b)中，所述孵育在结合缓冲液中进行，所述结合缓冲液的配方为：10mMNa2HPO4/NaH2PO4，100mM CH3COONa，10mM Mg(CH3COOH)2，15％甘油，0.08mg/mL poly(dI-dC)，pH＝7.4。
6.根据权利要求5所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤b)中，多个不同浓度的转录因子溶液由转录因子的母液稀释制得，所述稀释液为结合缓冲液。
7.根据权利要求6所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，多个不同浓度的转录因子溶液的浓度为0.5nM-1.25μM。
8.根据权利要求7所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤b)的孵育反应体系中，结合缓冲液、转录因子溶液与AgSwitch溶液的体积比为40-50：4-6：1；AgSwitch溶液的浓度为4.5-5.5μM；孵育反应在37℃下进行1h。
9.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤c)包括：将孵育反应后所得样品离心，然后装入石英比色皿进行荧光检测，荧光检测条件包括：激发波长为561nm，扫描速度为1000nm/min，光电倍增管电压为800V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5nm。
10.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，所述待测样品为从实际细胞或组织样品中获得的核蛋白提取物。
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