CN111206074A - Dna纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法 - Google Patents
Dna纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，该方法为：先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合，将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放；然后核酸信号在对应扩增模板、Bst 2.0 DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增，产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA；最后采用高效液相色谱检测信号DNA，得到待测转录因子的浓度。本发明检测方法过程简单，能够一次性同时检测多种待测转录因子，实现了多目标检测，在多通路检测中获得良好的检测结果，本发明检测方法方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析，提高了检测效率。
Description
技术领域
本发明涉及分析技术检测领域，更具体地，涉及一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法。
背景技术
转录因子(Transcription factors，TFs)是细胞中的一种调控蛋白，通过与基因中的DNA顺式作用元件结合，来启动和调节基因的转录过程。与此同时，也有大量研究指出，转录因子的非正常表达与活化，广泛的存在于人体的病理过程，这些病理过程包括癌症的产生与转移、病毒感染、自身免疫疾病等。因此转录因子既可以作为一种潜在的诊断标志物，又可以成为临床治疗的靶点。然而，对TFs传统的检测技术通常为免疫印迹法、DNA足迹法、核染色质免疫共沉淀等方法，这些方法存在检测过程较为繁琐、效率低下，应用面窄，无法实现多目标检测的技术问题，导致TFs作为诊断指标在临床上的应用尚不成熟。综上所述，实现快速、灵敏、低成本、多重检测转录因子是现在的研究热点之一。
发明内容
本发明的目的是针对上述不足，提出一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法。本发明检测方法过程简单，能够一次性同时检测多种待测转录因子，实现了多目标检测，在多通路检测中获得良好的检测结果，本发明检测方法方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析，有效的提高了检测效率。
本发明的技术方案是：
本发明提供一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，该方法为：先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合，将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放；然后核酸信号在对应扩增模板、Bst 2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增，产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA；最后采用高效液相色谱检测信号DNA，得到待测转录因子的浓度。
所述待测转录因子为p50、p53、AP-1、MITF、c-Myc中的任意一种或多种。
该方法包括以下步骤：
(1)掩蔽链信号转导：将捕获有待测转录因子的探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，冷却至室温后，与磁珠进行孵育，得到捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠；用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，并添加45nM待测转录因子对应的掩蔽链，孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；所述柠檬酸缓冲液的PH为7.4，待测转录因子对应的掩蔽链的添加量为100uL；
(2)等温扩增：将上述上清液与待测转录因子对应的扩增模板、Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应80-100分钟，然后再加热至85℃反应5-15分钟，终止后离心，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；其中，Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液体积均为10uL；
(3)HPLC分析：将上述得到的信号DNA进行高效液相色谱检测；高效液相色谱检测的条件为：流动相A为醋酸己铵溶液，固定相B为乙腈；梯度洗脱条件为：梯度从31％B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33％B，15-20分钟为38％B，21-24分钟为41％B。
步骤(1)中，优选孵育的条件为：温度为30-45℃，时间为20-40分钟；孵育混匀的条件为：温度为30-45℃，时间为20-40分钟。
步骤(2)中，优选对应DNA信号的扩增模板为100nm。
步骤(2)中，优选Nt.BstNBI核酸内切酶浓度为2-8u/μL，Bst2.0DNA聚合酶浓度为0.5-1.5u/μL，dNTPs混合物浓度为50-150μM。
步骤(2)中，优选离心条件为以8000-15000转/分离心1-5分钟。
步骤(3)中，优选高效液相色谱分析的色谱柱为C18柱，采用的色谱温度为60℃；紫外检测波长为260nm。
步骤(3)中，优选醋酸己铵的浓度为100mM，pH值为7.0。
本发明的有益效果：
本发明的检测方法将DNA纳米技术与色谱分析技术联用，实现了TFs的多通路检测，有利于目标检测降低多成分比较的系统误差，提高临床检测效率，实现了一种检测方法同时检测多项指标，方便简捷。由生物素修饰的捕获探针(捕获有待测转录因子的探针)与掩蔽链相互作用，实现了TFs信号的转化，TFs的加入，既参与了信号的转导，又实现了检测信号增强。将核酸等温扩增技术应用其中，提高了检测的灵敏度。本发明与现有技术相比，本发明具有对转录因子免标记，高选择，高灵敏，快速、低成本，高通量、多重检测的优势，具有良好的应用前景，并且本发明能够实现生物样品中多种TFs的高通量检测。根据本方法得到的检测限低，检测线最低可达0.5pM，线性范围广，线性范围为10pM-8nM，且可用于癌细胞、实体瘤细胞和血液样本中TFs的多重定量检测。
附图说明
图1为实施例1中加入不同浓度p50检测后浓度与色谱信号的线性关系图。
图2是本发明实施例2中本发明检测方法对p50检测的选择性结果图。
图3是本发明实施例3中对比样品1-对比样品5以及五种TFs的混合样品的色谱图。
图4是本发明实施例4中对经四种处理方式处理后的DLD-1细胞核蛋白提取物中的p-50、p53、AP-1、MITF、c-Myc的光谱结果统计结果图。
具体实施方式
下面实施例中所有寡核苷酸均采用高效液相色谱法纯化，所有寡核苷酸均由上海生工生物科技有限公司提供，各寡核苷酸的序列见表1。本发明实施例中：捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠购自于英芮诚生化科技(上海)有限公司，1×恒温扩增缓冲液购自于New England Biolabs；柠檬酸缓冲液是用分子生物学级试剂(BBI，中国上海)制备的。高效液相色谱级乙腈(ACN)从泰迪亚公司(美国俄亥俄州费尔菲尔德)获得。高效液相色谱级醋酸和己胺分别由阿拉丁(中国上海)和Sigma Aldrich(美国MO)提供。纯化的重组p50(41kDa)、p53(82kDa)购自美国Enzo Life Sciences。小眼畸形相关转录因子(MITF，46.8kDa)购自OriGene科技公司，牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HSA)、凝血酶(thrombin)、γ-干扰素(IFN-γ)、AP-1、c-Myc均购自于Sigma Aldrich(美国MO)，Bst 2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI、dNTPs购自于New England Biolabs。
表1.本发明使用的寡核苷酸序列表
实施例1
本发明检测方法用于检测待测转录因子p50，检测方法包括以下步骤：
(1)掩蔽链信号转导：将捕获有待测转录因子的探针(p50-捕获探针)用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，10分钟后冷却至室温后(至少1h)，与磁珠在37℃下孵育30分钟，得到p50-捕获探针修饰的磁珠；用p50-捕获探针修饰的磁珠捕获p50，并添加10uL、45nM的p50-掩蔽链，在37℃下分散培养30分钟孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；
(2)等温扩增：将上述上清液与p50-模板(100nm)、5u/μL的Nt.BstNBI核酸内切酶、0.8u/μL的Bst 2.0dna聚合酶、100μM的dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应90分钟然后加热至85℃进行10分钟，反应终止后，以12000转/分离心2分钟，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；其中，Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液体积均为10uL；
(3)对样品进行HPLC分析：HPLC实验是在LC-20系统(日本岛津)上进行的。将上述得到的信号DNA在60℃色谱条件下用Hypersil BDS C18柱(5μm，4.6mm×150mm；Elite，China)进行高效液相色谱检测。高效液相色谱检测的条件为：流动相A:100mM醋酸己铵溶液，pH值7.0；固定相B：乙腈(ACN)；梯度洗脱条件为：梯度从31％B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33％B，15-20分钟为38％B，21-24分钟为41％B(4分钟的再生过程)。将分离出的DNA报告分子洗脱，然后在260nm处进行紫外检测。
用上述方法分别对10pM,50pM,200pM,600pM,1000pM,2000pM,3000pM,4000pM,6000pM和8000pM浓度的待测转录因子p50进行检测，得到的待测转录因子p50的浓度与色谱信号的线性关系图，如图1所示。结果显示，本方法可以对不同浓度的待测转录因子进行准确的定量检测。
其中，100mM醋酸己铵溶液由醋酸和己胺配制，配制方法为向100mM的正己铵中加入冰醋酸，使pH为7.0。
实施例2本发明检测方法对待测转录因子的高选择性实验
以牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HAS)，凝血酶(thrombin)，γ-干扰素(IFN-γ)，p53、AP-1、MITF、c-Myc作为对比样品，以相同浓度的缓冲液作为空白样品，用本发明检测方法检测待测转录因子p50，检测方法包括以下步骤：
(1)掩蔽链信号转导：将捕获有待测转录因子的探针(p50-捕获探针)用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，10分钟后冷却至室温后(至少1h)，与磁珠在37℃下孵育30分钟，得到p50-捕获探针修饰的磁珠；用p50-捕获探针修饰的磁珠捕获p50、牛血清蛋白(BSA)、人血清蛋白(HAS)，凝血酶(thrombin)，γ-干扰素(IFN-γ)，p53、AP-1、MITF、c-Myc，并添加10uL、45nM的p50-掩蔽链，在37℃下分散培养30分钟孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；
(2)等温扩增：将上述上清液与p50-模板(100nm)、5u/μL的Nt.BstNBI核酸内切酶、0.8u/μL的Bst 2.0dna聚合酶、100μM的dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应90分钟然后加热至85℃进行10分钟，反应终止后，以12000转/分离心2分钟，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；其中，Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液体积均为10uL；
(3)对样品进行HPLC分析：HPLC实验是在LC-20系统(日本岛津)上进行的。将上述得到的信号DNA在60℃色谱条件下用Hypersil BDS C18柱(5μm，4.6mm×150mm；Elite，China)进行高效液相色谱检测。高效液相色谱检测的条件为：流动相A:100mM醋酸己铵溶液，pH值7.0；固定相B：乙腈(ACN)；梯度洗脱条件为：梯度从31％B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33％B，15-20分钟为38％B，21-24分钟为41％B(4分钟的再生过程)。将分离出的DNA报告分子洗脱，然后在260nm处进行紫外检测。
待测转录因子p50、空白样品和对比样品经HPLC检测后，得到待测转录因子p-50的选择性结果。如图2所示，各对比样品和空白样品的峰强度均较低，只有待测转录因子p-50的峰强度较大，结果说明即使是在多杂质转录因子存在的条件下，甚至有同家族转录因子杂质时，本发明检测方法依然能够较准较好的测出目标待测转录因子p-50指标，对待测转录因子p-50具有较高的选择性，灵敏度较高。
其中，上述p53、AP-1、MITF、c-Myc都是与p50掩蔽链序列不同的同家族转录因子。
实施例3本发明检测方法用于检测多种待测转录因子
对比样品1的检测：对比样品1为p53；将实施例1中的待测转录因子p50换为p53，p50-捕获探针换成p53-捕获探针，p50-掩蔽链换成p53-掩蔽链，p50-模板换成p53-模板，其余步骤和条件均同实施例1；
对比样品2的检测：对比样品1为p53；将实施例1中的待测转录因子p50换为p53，p50-捕获探针换成p53-捕获探针，p50-掩蔽链换成p53-掩蔽链，p50-模板换成p53-模板，其余步骤和条件均同实施例1；
对比样品3的检测：对比样品1为MITF；将实施例1中的待测转录因子p50换为MITF，p50-捕获探针换成MITF-捕获探针，p50-掩蔽链换成MITF-掩蔽链，p50-模板换成MITF-模板，其余步骤和条件均同实施例1；
对比样品4的检测：对比样品1为c-Myc；将实施例1中的待测转录因子p50换为c-Myc，p50-捕获探针换成c-Myc-捕获探针，p50-掩蔽链换成c-Myc-掩蔽链，p50-模板换成c-Myc-模板，其余步骤和条件均同实施例1；
对比样品5的检测：对比样品5为p50；检测方法同实施例1；
五种TFs的混合样品的检测：(1)掩蔽链信号转导：将p50-捕获探针、p53-捕获探针、AP1-捕获探针、MITF-捕获探针和c-Myc-捕获探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，10分钟后冷却至室温后(至少1h)，与磁珠在37℃下孵育30分钟，得到5种捕获探针修饰的磁珠；用5种捕获探针修饰的磁珠捕获p50、p53、AP-1、MITF和c-Myc五种TFs的混合样品，并分别添加10uL、45nM的p50-掩蔽链、p53-掩蔽链、AP1-掩蔽链、MITF-掩蔽链和c-Myc-掩蔽链，在37℃下分散培养30分钟孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；
(2)等温扩增：将上述上清液与p50-模板、p53-模板、AP1-模板、MITF-模板、c-Myc-模板(模板均为100nm)、5u/μL的Nt.BstNBI核酸内切酶、0.8u/μL的Bst 2.0dna聚合酶、100μM的dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应90分钟然后加热至85℃进行10分钟，反应终止后，以12000转/分离心2分钟，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；
(3)对样品进行HPLC分析：HPLC实验是在LC-20系统(日本岛津)上进行的。将上述得到的信号DNA在60℃色谱条件下用Hypersil BDS C18柱(5μm，4.6mm×150mm；Elite，China)进行高效液相色谱检测。高效液相色谱检测的条件为：流动相A:100mM醋酸己铵溶液，pH值7.0；固定相B：乙腈(ACN)；梯度洗脱条件为：梯度从31％B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33％B，15-20分钟为38％B，21-24分钟为41％B(4分钟的再生过程)。将分离出的DNA报告分子洗脱，然后在260nm处进行紫外检测。
检测结果如图3所示，对比样品1-对比样品5在260nm波长下HPLC检测结果为：MITF所对应的DNA信号分子出峰时间为3.90分钟，p53所对应的DNA信号分子出峰时间为5.54分钟，c-Myc所对应的DNA信号分子出峰时间为6.51分钟，p50所对应的DNA信号分子出峰时间为7.91分钟，AP-1所对应的DNA信号分子出峰时间为9.95分钟，五种TFs的混合样品与对比样品1-对比样品5检测结果相比较，混合样品中各信号分子的峰面积、出峰时间和出峰位置与对比样品1-对比样品5中单一样品的峰面积、出峰时间和出峰位置均相似，检测结果较准确。因此，本方法能够较为准确的一次性进行多个目标物的检测，并且在多通路检测中获得良好的检测结果。
结果表明，本发明检测方法很好的分离出五种DNA信号分子的色谱峰，本发明检测方法能够一次性同时检测多种转录因子，方便、可靠地对不同保留行为的DNA报告进行定量定性分析。
实施例4
将本发明检测方法用于检测分别经H2O2和TNF-α处理的DLD-1细胞核蛋白提取物中的p-50、p53、AP-1、MITF、c-Myc五种TFs。
其中，第一份DLD-1细胞在培养的过程中，加入10μM H2O2处理30min，提取其核蛋白，得到H2O2处理后的样品；第二份DLD-1细胞在培养的过程中，加入10μM TNF-α处理30min，提取其核蛋白，得到TNF-α处理后的样品；第三份DLD-1细胞未经处理，为未经处理的细胞核蛋白样品(Untreated)；第四份DLD-1细胞未经处理，但是是测样前加热至75℃的核蛋白失活样品(Deactivation)。
将上述四份样品用实施例3中五种TFs的混合样品的检测方法进行检测，其中，将p50、p53、AP-1、MITF和c-Myc五种TFs的混合样品分别换成上述四份样品，对上述四份样品分别进行检测。其余步骤和条件均同实施例3中五种TFs的混合样品的检测方法。
检测后得到四种处理方式处理后的DLD-1细胞核蛋白提取物中的p-50、p53、AP-1、MITF、c-Myc的光谱结果统计结果。如图4所示，检测结果说明本方法对转录因子的定量分析结果可靠，本发明检测方法可以用于反映不同条件处理后转录因子浓度的变化。
以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> DNA纳米技术与液相色谱联用的转录因子多通路检测方法
<140> 2020100151492
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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ccg 63
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<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (9)
1.一种DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，该方法为：先用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，将捕获的待测转录因子与对应掩蔽链序列结合，将待测转录因子的信号转化为核酸信号的释放；然后核酸信号在对应扩增模板、Bst2.0DNA聚合酶、Nt.BstNBI核酸内切酶的作用下触发多通路等温扩增，产生具有多种编码的寡核苷酸作为信号DNA；最后采用高效液相色谱检测信号DNA，得到待测转录因子的浓度。
2.根据权利要求1所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，所述待测转录因子为p50、p53、AP-1、MITF、c-Myc中的任意一种或多种。
3.根据权利要求1所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)掩蔽链信号转导：将捕获有待测转录因子的探针用柠檬酸缓冲液溶解至5μM，并加热至95℃，冷却至室温后，与磁珠进行孵育，得到捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠；用捕获有待测转录因子的探针修饰的磁珠捕获待测转录因子，并添加45nM待测转录因子对应的掩蔽链，孵育混匀，磁分离悬浮液，收集上清液；
(2)等温扩增：将上述上清液与待测转录因子对应的扩增模板、Nt.BstNBI核酸内切酶、Bst 2.0DNA聚合酶、dNTPs混合物和1×恒温扩增缓冲液混合，在60℃下反应80-100分钟，然后再加热至85℃反应5-15分钟，终止后离心，保留上清液，得到具有多种编码寡核苷酸的信号DNA；
(3)HPLC分析：将上述得到的信号DNA进行高效液相色谱检测；高效液相色谱检测的条件为：流动相A为醋酸己铵溶液，固定相B为乙腈；梯度洗脱条件为：梯度从31％B开始，B以体积百分比匀速增加，在14分钟时到达33％B，15-20分钟为38％B，21-24分钟为41％B。
4.根据权利要求3所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤(1)中，孵育的条件为：温度为30-45℃，时间为20-40分钟；孵育混匀的条件为：温度为30-45℃，时间为20-40分钟。
5.根据权利要求3所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述对应DNA信号的扩增模板为100nm。
6.根据权利要求3所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的Nt.BstNBI核酸内切酶浓度为2-8u/μL，Bst 2.0DNA聚合酶浓度为0.5-1.5u/μL，dNTPs混合物浓度为50-150μM。、
7.根据权利要求3所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤(2)中，离心条件为以8000-15000转/分离心1-5分钟。
8.根据权利要求3所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述高效液相色谱分析的色谱柱为C18柱，采用的色谱温度为60℃；紫外检测波长为260nm。
9.根据权利要求3所述的DNA纳米技术与液相色谱技术联用的转录因子多通路检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述醋酸己铵的浓度为100mM，pH值为7.0。
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