CN107389646B - 一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测转录因子NF‑κBp50的荧光化学传感器及其检测方法，该传感器以2‑氨基嘌呤(2‑AP)为荧光基，采用目标驱动的自发的等温扩增、核酸外切酶辅助荧光信放大策略，且没有任何额外的引物和模板的参与的情况下实现对转录因子的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。经试验验证，本发明技术方案检测极限达到4.04×10‑4毫克每毫升，可与实时荧光定量PCR法相媲美。
Description
技术领域
本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器及其检测方法。
背景技术
DNA结合蛋白在基因组复制，基因转录，细胞分裂和DNA修复过程中起着至关重要的作用。而大部分的DNA结合蛋白都扮演着转录因子的角色，调节着细胞的发育，分化和增殖，由此转录因子也已经成为临床诊断和药物筛选中的靶点。因此，开展对DNA结合蛋白的超灵敏检测不仅对基础生物化学的深入研究有很大帮助，同时对发展人类疾病的新的治疗方法和策略具有重大意义。
迄今为止，在DNA结合蛋白检测方法中，传统的电泳迁移法(EMSA)和DNA酶足迹法检测灵敏度偏低，而且同位素标记探针会引起放射性污染。而酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹法(Western Blotting)需要与蛋白结合的特异性抗体，操作步骤繁琐。基于荧光能量共振转移(FRET)的方法需要有双荧光标记的DNA探针，大大增加了实验的成本。为了提高检测的灵敏度，各种转录因子检测方法中引入了核酸扩增策略，如实时聚合酶链反应(PCR)，指数扩增反应(EXPAR)，解旋酶依赖性扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)，和近红外荧光固相滚环扩增(NIRF sRCA)法。在这些方法中，实时荧光定量PCR技术由于它的高灵敏度和实用性得到了越来越多的关注，但它需要的温度循环的精确控制与参与的荧光标记探针(TaqMan probe)和DNA结合的特异性抗体。虽然指数扩增EXPAR可能几分钟内提供高扩增效率，它涉及到复杂的反应原理。基于指数扩增(EXPAR)的比色分析法需要用DNA修饰纳米金粒子，指数扩增诱导的化学发光分析法需要DNA的转录，双指数扩增反应和G-四链体脱氧核酶驱动化学发光反应一系列复杂步骤。近红外荧光固相滚环扩增(NIRF sRCA)包含蛋白结合DNA探针的细致划分并且需要捕获探针和滚动圆模板的复杂制备。因此，亟需开发一种新的方法用于快速、灵敏、简便、廉价地检测转录因子。
发明内容
针对上述现有技术的不足，发明人经长期的技术与实践探索，提供一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，该传感器以2-氨基嘌呤(2-AP)为荧光基，采用目标驱动的自发的等温扩增、核酸外切酶辅助荧光信放大策略，且没有任何额外的引物和模板的参与的情况下实现对转录因子的超灵敏检测，操作简便、快速，试验结果准确、可靠。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：转录因子NF-κBp50结合探针和辅助探针；
其中，转录因子NF-κBp50结合探针由一个p50-s探针与p50-anti反探针杂化组成，p50-s探针与p50-anti反探针序列上有两个不相邻的转录因子识别位点，所述p50-s探针转录因子识别位点序列为5'-GGG ACT TTC C-3'，两个转录因子识别位点之间存在磷酸二酯键为硫代修饰；所述p50-s探针与p50-anti反探针上均设计有2-氨基嘌呤(2-AP)荧光基；所述p50-s探针与p50-anti反探针5'端的磷酸二酯键均为硫代修饰；
所述辅助探针为与p50-s探针、p50-anti反探针近5'端的部分碱基序列互补，从而在检测过程中减少背景荧光信号；
所述荧光化学传感器还包括核酸外切酶III，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶和KF聚合酶；
本发明荧光化学传感器在检测时所用的荧光基团2-AP不需要额外的猝灭基团标记而是通过相邻碱基堆积作用来达到猝灭的目的，不需任何外部引物和模板就可引发核酸扩增，同时未被转录因子NF-κBp50结合的探针被充分利用参与信号循环放大，从而加大提高本发明荧光化学传感器的灵敏度，降低其制备难度。
优选的，所述p50-s探针长度为66nt，所述p50-s探针的碱基序列为：
其中，*代表硫代修饰；双下划线碱基代表NF-κB p50结合位点；下划线斜体碱基代表2-氨基嘌呤取代碱基；斜体区域碱基代表辅助探针结合序列；箭头代表Nb.BtsI的剪切位点。
优选的，所述p50-anti反探针长度为66nt，所述p50-anti反探针的碱基序列为：
其中，*代表硫代修饰；双下划线碱基代表NF-κB p50结合位点；下划线斜体碱基代表2-氨基嘌呤取代碱基；斜体区域碱基代表辅助探针结合序列；箭头代表Nb.BtsI的剪切位点。
优选的，所述辅助探针长度为16nt，所述辅助探针的碱基序列为：5'-T*TC GATCGA GTG CA*C*A-3'；
其中，*代表硫代修饰；斜体区域碱基代表与p50-s和p50-anti反探针的结合序列；
优选的，所述荧光化学传感还包括转录因子NF-κBp50结合探针和NF-κBp50结合时的反应缓冲液，所述反应缓冲液包括：10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10％甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇；
本发明还公开了所述荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法，具体包括：
1)将待测样品加入所述转录因子NF-κBp50结合探针反应溶液中孵育反应，而后加入外切酶III进行消化；
2)向步骤1)消化后溶液中加入dNTP，KF聚合酶，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶进行孵育反应；
3)对步骤2)孵育反应后的溶液中的荧光光谱进行检测，实现对待测样品中的转录因子NF-κBp50的定量分析。
其中，步骤1)中孵育反应条件为：35-40℃(优选为37℃)，反应时间为20～60min(优选为30min)；
消化反应条件为：37℃消化10min，然后在80℃条件下加热10min终止消化反应；
步骤2)中孵育反应条件为：35-40℃(优选为37℃)，反应时间为40～70min(优选为50min)；
步骤3)中采用荧光分光光度计对荧光光谱进行检测，在激发波长为310nm，在365nm处的荧光强度进行数据分析。
本发明还公开了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测转录因子NF-κBp50和/或筛选转录因子NF-κBp50抑制剂/激活剂中的应用。
本发明所述荧光化学传感器检测方法的原理为：本发明以2-AP作为荧光基团，采用目标驱动的自发的等温扩增和核酸外切酶辅助循环信号放大的方式实现对转录因子的检测。转录因子与线性转录因子结合探针的特异性结合可以阻止外切酶III的消化，在聚合酶存在条件下，可以引发两个方向上的扩增反应，产生带有剪切酶识别位点的DNA双链。随后DNA双链被剪切酶切出磷酸基团，最后被外切酶消化释放2-氨基嘌呤和新合成的单链DNA，而一些没有结合转录因子的探针将会由于两个转录因子结合位点之间的硫代修饰被部分消化，剩余探针分离成两部分，剩余部分可与新合成的单链DNA互补，引发一系列剪切-消化-杂交的循环，释放2-氨基嘌呤分子与新和成的单链DNA，大大增强了荧光信号。实现对转录因子的检测，并提高了检测的灵敏度。
本发明的有益效果如下：
(1)不需额外的荧光染料标记
传统的检测因子的荧光探针往往需要荧光基团与猝灭基团标记，操作程序复杂，与之相比，本发明中所用的荧光基团2-AP不需要额外的猝灭基团标记而是通过相邻碱基堆积作用来达到猝灭的目的，避免了使用较大的有机猝灭剂。同时，2-氨基嘌呤可以标记在信号探针的任何位置，操作简单；
(2)本发明不需任何外部引物和模板就可引发核酸扩增
为了提高检测的灵敏度，各种检测转录因子的方法中引入了核酸扩增策略，如实时聚合酶链反应(PCR)，指数扩增反应(EXPAR)，解旋酶依赖性扩增(HDA)、滚环扩增(RCA)，和近红外荧光固相滚环扩增(NIRF SRCA)法，所有这些扩增策略都需要额外的引物和/或模板来启动核酸扩增，这些引入扩增的检测方法往往需要复杂的引物和模板的设计。而本发明通过合理设计，在不涉及复杂引物和模板设计的情况下，开发得到一种特异、灵敏的检测转录因子NF-κBp50的方法；
(3)未被转录因子结合的探针被充分利用参与信号循环放大
该方法不像已报道的转录因子检测方法，多余的检测探针被外切酶III完全消化，在这个技术中，多余的转录因子结合探针由于硫代修饰产生空间位阻阻止外切酶III的消化，导致p50-s探针-辅助探针杂交链和p50-anti反探针-辅助探针杂交链的释放。新合成的单链DNA可以代替辅助DNA探针杂交，分别与p50-s探针和p50-anti反探针形成带有Nb.BtsI内切酶识别位点的完整双链DNA，启动第二步循环反应，达到循环放大信号的目的，大大提高了检测的灵敏度。
综上，本发明荧光化学传感器制备及检测方法简单，无需大型昂贵仪器设备，同时由于我们对本发明中的各反应条件也都进行了细致优化，因此在检测过程中，大大降低了非特异性反应，实验结果精准可靠，检测极限达到4.04×10-4毫克每毫升，可与实时荧光定量PCR法相媲美。因此，本发明技术方案极具推广应用之价值。
附图说明
图1为本发明基于等温扩增的利用固有荧光核苷酸检测转录因子NF-κBp50原理说明示意图；
图2A为非变性聚丙烯酰氨凝胶电泳分析的转录因子结合探针被外切酶III消化产物，其中泳道M为Marker，泳道1为10微克核提取物+200纳摩尔每升NF-κB p50的特异性探针，泳道2为200纳摩尔每升的NF-κB p50特异探针没有核提取物；图2B为在5.5毫克每毫升核提取物、5.5毫克每毫升灭活核提取物和没有核提取物的情况下，反应产物的归一化荧光发射光谱；
优化；图3A为不同反应缓冲液中所对应的(F-F0)/F0的值。图3B为在固定数量的Nb.BtsI(2U)条件下不同量的λ核酸外切酶所对应的(F-F0)/F0的值；图3C为在固定量的λ核酸外切酶(1U)条件下不同量的Nb.BtsI所对应(F-F0)/F0的值，图3D为不同的反应时间所对应的(F-F0)/F0的值。F和F0分别是在存在和不存在核提取物的情况下的荧光信号。核提取物的浓度为0.55毫克每毫升。误差棒为三组实验的标准偏差。
图4A为不同浓度的细胞核提取物所对应的荧光发射光谱；图4B为在365纳米处归一化荧光强度与核提物浓度的对数之间的线性关系，核提取物浓度范围从5.5×10-4毫克每毫升到5.5毫克每毫升。误差棒为三组实验的标准偏差。
图5为该方法对核提取物中NF-κB p50测定的特异性分析。其中NF-κB p50组为0.55毫克每毫升核提取物+1微摩尔每升特异性探针，BSA组为1毫克每毫升BSA+特异性探针，Control组为0.55毫克每毫升核提取物+1微摩尔每升非特异性探针。误差棒为三组实验的标准偏差。
图6为有无NF-κB p50抑制剂的荧光强度分析，其中-Inhibitor组为在没有冬凌草甲素时(F-F0)/F0的值，+Inhibitor组为存在20微摩尔每升冬凌草甲素时(F-F0)/F0的值，F和F0分别是在存在和不存在0.25毫克每毫升核提取物的情况下的荧光强度。误差棒为三次实验的标准偏差。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所介绍的，现有技术对转录因子测定存在灵敏度偏低、检测方法繁琐、所需仪器昂贵等各种问题；
有鉴于此，本发明的一个典型实施方式中，提供一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，所述荧光化学传感器包括：转录因子NF-κBp50结合探针和辅助探针；
其中，转录因子NF-κBp50结合探针由一个p50-s探针与p50-anti反探针杂化组成，p50-s探针与p50-anti反探针序列上有两个不相邻的TF转录因子识别位点，所述p50-s探针转录因子识别位点序列为5'-GGG ACT TTC C-3'，两个转录因子识别位点之间存在磷酸二酯键为硫代修饰；所述p50-s探针与p50-anti反探针上均设计有2-氨基嘌呤(2-AP)荧光基；所述p50-s探针与p50-anti反探针5'端的磷酸二酯键均为硫代修饰；
所述辅助探针为与p50-s探针、p50-anti反探针近5'端的部分碱基序列互补，从而在检测过程中减少背景荧光信号；
所述荧光化学传感器还包括核酸外切酶III，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶和KF聚合酶；
本发明的又一具体实施方式中，所述p50-s探针长度为66nt，所述p50-s探针的碱基序列为： 其中，*代表硫代修饰；双下划线碱基代表NF-κB p50结合位点；下划线斜体碱基代表2-氨基嘌呤取代碱基；斜体区域代表辅助探针结合序列；箭头代表Nb.BtsI的剪切位点。
本发明的又一具体实施方式中，所述p50-anti反探针长度为66nt，所述p50反探针的碱基序列为： 其中，*代表硫代修饰；双下划线碱基代表NF-κB p50结合位点；下划线斜体碱基代表2-氨基嘌呤取代碱基；斜体区域代表辅助探针结合序列；箭头代表Nb.BtsI的剪切位点。
本发明的又一具体实施方式中，所述辅助探针长度为16nt，所述辅助探针的碱基序列为：5'-T*TC GAT CGA GTG CA*C*A-3'；其中，*代表硫代修饰，斜体碱基区域代表与p50-s和p50-anti反探针的结合序列；
本发明的又一具体实施方式中，所述荧光化学传感还包括转录因子NF-κBp50结合探针和NF-κBp50结合时的反应缓冲液，所述反应缓冲液包括：10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10％甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇；
本发明的又一具体实施方式中，提供了所述荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法，具体包括：
1)将待测样品加入所述转录因子NF-κBp50结合探针反应溶液中孵育反应，而后加入外切酶III进行消化；
2)向步骤1)消化后溶液中加入dNTP，KF聚合酶，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶进行孵育反应；
3)对步骤2)孵育反应后的溶液中的荧光光谱进行检测，实现对待测样品中的转录因子NF-κBp50的定量分析。
其中，步骤1)中孵育反应条件为：35-40℃(优选为37℃)，反应时间为20～60min(优选为30min)；
消化反应条件为：37℃消化10min，然后在80℃条件下加热10min终止消化反应；
步骤2)中孵育反应条件为：35-40℃(优选为37℃)，反应时间为40～70min(优选为50min)；
步骤3)中采用荧光分光光度计对荧光光谱进行检测，在激发波长为310nm，在365nm处的荧光强度进行数据分析。
本发明的又一具体实施方式中，提供了上述荧光化学传感器和/或检测方法在定量检测转录因子NF-κBp50和/或筛选转录因子NF-κBp50抑制剂/激活剂中的应用。
本发明检测原理如图1所示：线性转录因子结合的探针由一个p50-s探针和p50-anti反探针杂化组成，轴承有两特异性转录因子识别位点。p50-s探针和p50-anti反探针的5′末端含有相同的序列并用2-AP分子代替腺嘌呤。为了减少背景荧光信号，我们设计了与转录因子结合探针互补的辅助DNA探针。此外，硫代修饰(图1，星号)可以有效地防止核酸外切酶对探针的非特异性消化。
当存在NF-κB p50时，转录因子结合探针与NF-κBp50结合可以启动第一步扩增反应(图1，右圈右侧)，其产物可与没有与NF-κBp50结合探针结合启动第二步扩增结合反应(图1，右圈左侧)，因此大大放大检测信号。在第一步扩增中，NF-κBp50与线性探针的结合可以阻止外切酶III对寡核苷酸的消化。在聚合酶存在的条件下，转录因子结合探针的3′端可以作为启动双向延伸反应的引物，延伸的产物可以替换辅助DNA探针，产生一个带有Nb.BtsI识别位点的完整的DNA双链。通过Nb.BtsI内切酶的切割，DNA随后裂解产生磷酸集团(PO4)作为λ外切酶催化位点，从5′到3′方向去除DNA单核苷酸。值得注意的是，转录因子结合探针的两个结合位点之间的硫代修饰可以防止λ核酸外切酶对探针的不断消化，剩余新合成的单链DNA。因此，自由的2-AP分子和新合成的单链DNA分子被释放，从而导致2-AP的荧光增强。该方法不像已报道的转录因子检测方法，多余的检测探针被外切酶III完全消化，在这个技术中，多余的转录因子结合探针由于硫代修饰产生空间位阻阻止外切酶III的消化，导致p50-s探针-辅助探针杂交链和和p50-anti反探针-辅助探针杂交链的释放。新合成的单链DNA可以代替辅助DNA探针杂交，分别与p50-s探针和p50-anti反探针形成带有Nb.BtsI内切酶识别位点的完整双链DNA，启动第二步扩增反应。随着每个循环的切割消化，新合成的单链DNA被释放，随后与新p50-s探针和p50-anti反探针发起新的切割消化的循环，释放大量自由的2-AP分子进而增强荧光信号。因此，从第一步扩增反应产生的单链DNA能与未结合转录因子的p50-s探针和p50-anti反探针杂交，启动一系列剪切-消化-杂交循环，极大增强了荧光信号。而在没有转录因子与转录因子探针结合的情况下，探针将被外切酶III消化，导致p50-s-p50-anti杂交链分离(图1，左圈)。因此，既不发生扩增应也不发生消化反应，也没有明显的荧光增强现现象。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。
实施例
实验方法步骤
1.细胞培养和核提取物的制备
Hela细胞(人宫颈癌细胞系)培养在DMEM培养基中，其中包含10％胎牛血清和1％青霉素链霉素置于37℃含有5％二氧化碳的培养箱中。加入20纳克每毫升肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激Hela细胞，在培养箱中孵育30min。使用核提取试剂盒(ActiveMotif)根据说明书进行细胞提取物的提取。采用Bradford法定量蛋白浓度。细胞提取物最终冻存于负80℃冰箱中备用。
2.蛋白质和DNA的相互作用与核酸外切酶III消化
首先制备双链探针检测，10微摩尔每升p50-s探针，10微摩尔每升p50反探针和20微摩尔每升辅助探针在含有10毫摩尔每升Tris-HCl，100毫摩尔每升氯化钠，pH为8的缓冲液中95℃加热5分钟，随后缓慢冷却至室温。所获得的探针原液保存在-20℃以供进一步使用。1微升不同浓度核提取物和1微摩尔每升转录因子结合探针在10微升蛋白结合液中37℃孵育30分钟，10微升结合缓冲液中含有蛋白结合液中含有10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液,100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10％甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇。然后加入10U的外切酶III和1微升10×的NEB缓冲液1，在37℃消化10min，最后在80℃就热10min终止消化反应。终浓度1微克/毫升的SYBR Gold加入到样品中，然后将混合物装入10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中，电压为110V，加入1×Tris-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液，凝胶电泳图像由ChemiDocMP成像系统成像。
3.荧光测量NF-κB p50
实验是在20微升体系中反应，包含2微升混合液，250微摩尔每升dNTP、1UKF聚合酶，1U Nb.BtsI内切酶，1Uλ核酸外切酶，1×NEBλ缓冲溶液(67毫摩尔每升甘氨酸氢氧化钾，2.5毫摩尔每升氯化镁，50微克每毫升BSA)，1×NEBuffer2(50毫摩尔每升氯化钠，10毫摩尔每升tris-盐酸，10毫摩尔每升氯化镁，10毫摩尔每升二硫苏糖醇)在37℃孵育50分钟，反应产物的20微升加入超纯水稀释至最终体积60微升。使用石英比色皿在日立F-7000荧光分光光度计测定荧光光谱，在激发波长为310nm，在365nm处的荧光强度进行数据分析。
4.抑制剂实验
20微摩尔每升冬凌草甲素、0.25毫克每毫升的核提取物和1微摩尔升转录因子结合探针在10微升结合缓冲液中37℃孵育30分钟。随后的反应遵循以上步骤，测定荧光强度。
结果分析与讨论
1.检测NF-κB p50可行性实验
在本发明中，用肿瘤坏死因子(TNF-α)处理Hela细胞来增加量NF-κB的含量。凝胶电泳分析用来分析外切酶III对转录因子结合探针的消化情况(图2A)，当核提取物存在时，NF-κBp50与转录因子结合探针的结合保护探针被外切酶III消化。相反，没有NF-κBp50结合的裸露探针将会由于两个结合位点之间的硫代修饰引起的空间位阻被外切酶III部分降解(图1)。因此，当核提取物存在时，就有两个不同的DNA条带包括TF结合探针和部分消化的探针(图2A，泳道1)，而没有核提取物时，只有一个带即为部分消化的探针(图2A，泳道2)。我们还利用荧光测量验证了该方法的可行性。(图2B)。当核提取物的存在时，在波长为365nm处观察到强烈的2-AP的荧光信号特征发射峰。然而，在灭活核提取物和无核提取物对照组的存在下，没有观察到明显的荧光信号。这些结果表明，NF-κBp50与转录因子结合探针结合可以保护探针消化的Exo III并随后开始的两步扩增反应增强荧光信号。重要的是，该方法可直接对粗核提取物中DNA结合蛋白的活性进行测量。
2.优化实验条件
我们分别研究了该法在CutSmart缓溶液+NEBbuffer2，λ缓冲溶液+NEBbuffer2和三者混合缓冲溶液中的性能。如图3A所示，(F-F0)/F0的值在λ缓冲液+NEBbuffer2中是远远高于在CutSmart缓冲液+NEBbuffer2和混合缓冲液中的。其中F和F0分别是存在和不存在细胞核提取物的荧光强度。因此，λ缓冲液+NEBbuffer2用于后续研究。信号放大依赖于剪切酶和λ核酸外切酶，从而Nb.BtsI和λ核酸外切酶的数量应仔细优化。我们固定Nb.BtsI(2U)的数量研究了λ核酸外切酶对荧光信号的影响。如图3B所示，最大值(F-F0)/F0是1Uλ核酸外切酶获得的(F和F0分别是存在和不存在核提取物时的荧光值。)。因此，1Uλ核酸外切酶是用于后续研究。我们进一步对Nb.BtsI影响荧光信号与一个固定数量的λ核酸外切酶(1U)。如图3C所示，(F-F0)/F0的值随Nb.BtsI量从0.1增加到1是增加的，当Nb.BtsI的量超过1U，(F-F0)/F0的值是降低的。(F和F0分别是存在和不存在核提取物时的荧光值。)。因此，1UNb.BtsI用于后续研究。我们进一步考察了反应时间对荧光信号的影响。如图3D所示，(F-F0)/F0的值随反应时间从10分钟到50分钟是增加的，并在50分钟达到一个平台(F和F0分别是存在和不存在核提取物时的荧光值)。因此，使用50分钟反应时间用于后续研究。
3.DNA结合蛋白灵敏度检测
为了说明该方法对HeLa细胞的核提取物NF-κB p50灵敏度的提高，我们在优化的实验条件下测得的不同浓度的核提取物的荧光强度。图4A所示，不同浓度的核提取物与其对应的荧光发射光谱。在发射波长365纳米处归一化荧光强度随核提取物浓度的增加而增加。如图4B所示，归一化荧光强度与核提取物的浓度呈线性相关，线性范围从5.5×10-4毫克每毫升5.5毫克每毫升，且线性关系覆盖3个数量级。回归方程为F＝0.847+0.211log10C(R2＝0.993)，其中F是归一化荧光强度，C是核提取物浓度。检测限4.04×10-4毫克每毫升是在空白信号的基础上加上三倍标准差计算而来。与近红外荧光固相滚环扩增法(NIRF-sRCA)(6.25×10-2毫克每毫升)法和荧光共振能量转移法(FRET)(5×10-2毫克每毫升)相比该方法的灵敏度提高了2个数量级。该方法可与实时荧光定量PCR法(5×10-4毫克每毫升)相媲美。
4.DNA结合蛋白特异性检测
我们探讨了该方法的特异性，使用的牛血清白蛋白(BSA)和非特异性检测探针，该探针是用序列CTC ACT TTC C代替转录因子p50结合位点的GGG ACTTTC C。如图4所示，在核提取物和特异结合的探针的存在时有明显的荧光信号，而非特异性探针和牛血清白蛋白蛋白BSA却没有显著荧光信号。这些结果清楚地表明，即使在肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导HeLa细胞的核提取物的样品中该方法仍然有良好的特异性。
5.抑制剂分析
在静息细胞中，在细胞质中NF-κB受到IκB家族成员的抑制。经紫外线照射、细胞因子、细菌和病毒的产物激活后，NF-κB从IκB中释放。过度活化的NF-κB一直与自身免疫性疾病和炎症性疾病有关，因此它被认为是一个重要的药物靶点。发展特异性可阻断NF-κB的活化抑制剂对抑制某些类型肿瘤生长以及改善癌症治疗起着重要的作用。为了验证该方法对NF-κBp50抑制剂分析的可行性，我们用冬凌草甲素为NF-κB的抑制剂。如图6所示，与无抑制剂对照比较加入冬凌草甲素导致的荧光强度显著降低，表明冬凌草甲素可抑制NF-κB p50和转录因子结合探针的结合。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东师范大学
<120> 一种检测转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器及其检测方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 66
<212> DNA
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ccaata 66
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaactcact gcactcgatc ggactattgg aaagtccccc aggtcctatc aaggaaagtc 60
ccatct 66
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcgatcgag tgcaca 16
Claims (14)
1.一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器包括：转录因子NF-κBp50结合探针和辅助探针；
其中，转录因子NF-κBp50结合探针由一个p50-s探针与p50反探针杂化组成，p50-s探针与p50反探针序列上有两个不相邻的转录因子识别位点，所述p50-s探针转录因子识别位点序列为5'-GGG ACT TTC C-3'，两个转录因子识别位点之间的存在磷酸二酯键为硫代修饰；所述p50-s探针与p50反探针上均设计有2-氨基嘌呤荧光基；所述p50-s探针与p50反探针5'端的磷酸二酯键均为硫代修饰；
所述辅助探针为与p50-s探针、p50反探针近5'端的部分碱基序列互补。
2.如权利要求1所述的一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感器还包括核酸外切酶III，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶和KF聚合酶。
3.如权利要求1所述的一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，其特征在于，所述p50-s探针长度为66nt，所述p50-s探针的碱基序列为：5'-A*A*A ACT CAC TGCACT CGA TCG GAC AGA TGG GAC TTT CCT TGA TA*G*GAC CTG GGG GAC TTT CCAATA-3'，其中，*代表硫代修饰，A代表2-氨基嘌呤取代碱基。
4.如权利要求1所述的一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，其特征在于，所述p50反探针长度为66nt，所述p50反探针的碱基序列为：5'-A*A*A ACT CAC TGCACT CGA TCG GAC TAT TGG AAA GTC CCC CAG GT*C*CTA TCA AGG AAAGTC CCA TCT-3'，其中，*代表硫代修饰，A代表2-氨基嘌呤取代碱基。
5.如权利要求1所述的一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，其特征在于，所述辅助探针长度为16nt，所述辅助探针的碱基序列为：5'-T*TC GAT CGA GTG CA*C*A-3'，其中，*代表硫代修饰。
6.如权利要求1所述的一种检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器，其特征在于，所述荧光化学传感还包括转录因子NF-κBp50结合探针和NF-κBp50结合时的反应缓冲液，所述反应缓冲液包括：10毫摩尔每升pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，100毫摩尔每升氯化钾，2毫摩尔每升氯化镁，0.1毫摩尔每升乙二胺四乙酸，0.1毫克每毫升的酵母tRNA，10％甘油，0.25毫摩尔每升二硫苏糖醇。
7.权利要求1-6任一项所述荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法，其特征在于，具体包括：
1)将待测样品加入所述转录因子NF-κBp50结合探针反应溶液中孵育反应，而后加入外切酶III进行消化；
2)向步骤1)消化后溶液中加入dNTP，KF聚合酶，Nb.BtsI内切酶，λ核酸外切酶进行孵育反应；
3)对步骤2)孵育反应后的溶液中的荧光光谱进行检测，实现对待测样品中的转录因子NF-κBp50的定量分析。
8.如权利要求7所述的荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法，其特征在于，步骤1)中孵育反应条件为：35-40℃，反应时间为20～60min；消化反应条件为：37℃消化10min，然后在80℃条件下加热10min终止消化反应；
步骤2)中孵育反应条件为：35-40℃，反应时间为40～70min；
步骤3)中采用荧光分光光度计对荧光光谱进行检测，在激发波长为310nm，在365nm处的荧光强度进行数据分析。
9.如权利要求8所述的荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法，其特征在于，步骤1)中：反应温度为37℃，反应时间为30min。
10.如权利要求8所述的荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法，其特征在于，步骤2)中：反应温度为37℃，反应时间为50min。
11.权利要求1-6任一项所述检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器在定量检测转录因子NF-κBp50中的应用。
12.权利要求7-10任一项所述荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法在定量检测转录因子NF-κBp50中的应用。
13.权利要求1-6任一项所述检测细胞内转录因子NF-κBp50的荧光化学传感器在筛选转录因子NF-κBp50抑制剂和/或激活剂中的应用。
14.权利要求7-10任一项所述荧光化学传感器用于检测转录因子NF-κBp50的方法在筛选转录因子NF-κBp50抑制剂和/或激活剂中的应用。
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